CN112608734A - 一种检测碱性磷酸酶的复合荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测碱性磷酸酶的复合荧光探针及其制备方法与应用,属于荧光分析技术领域。本发明荧光探针为硫量子点‑纳米MnO2‑L‑抗坏血酸‑2‑磷酸三钠盐复合荧光探针。本发明将硫量子点‑MnO2纳米复合体系‑L‑抗坏血酸‑2‑磷酸三钠盐与不同浓度的碱性磷酸酶标准溶液混合反应,通过荧光法获得碱性磷酸酶的标准工作曲线,构建一种检测碱性磷酸酶的荧光传感器,从而建立一种基于硫量子点荧光信号变化的碱性磷酸酶快速检测新方法。本发明的检测方法具有简单、快速、可靠、成本低等优点,可实现实际样品中碱性磷酸酶的检测。
Description
技术领域
本发明属于荧光分析技术领域,具体涉及一种检测碱性磷酸酶的复合荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。这种酶能催化核酸分子脱掉5’-磷酸基团,从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。其直接参加磷代谢,在钙、磷的消化、吸收、分泌及骨化过程中发挥着重要的作用。作为临床常规检测项目之一,碱性磷酸酶主要用于诊断肝脏和骨骼系统疾病。由于它在许多疾病的诊断中都可以作为重要的生物指标,如原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎、纤维性骨炎、骨软化病等疾病的检查。如果血清中ALP值不正常,会导致某些疾病的发生,例如,骨疾病、肝癌、乳腺癌、前列腺癌症和糖尿病。因此,开发一种快速、简便、灵敏的碱性磷酸酶检测方法具有重要的现实意义。
近年来,已有多种方法用于碱性磷酸酶活性检测,包括比色法、荧光法、表面增强拉曼光谱法、电化学、化学发光方法等。在这些方法中,荧光法引起了人们相当大的关注,主要是由于方法的灵敏度高,操作方便,成本效率低,并且很容易达到一种高通量的筛选模式,其已广泛应用于生物、医药、农业生产、环境科学等研究领域。
作为一种新颖的半导体纳米材料,量子点具有许多独特的光学性质,诸如发光效率高、发射光谱可调、抗光漂白能力强等特点。与含金属元素的荧光量子点相比,不含金属元素的荧光量子点具有更好的生物相容性,更适宜实际应用。硫量子点是一种典型的不含金属元素的荧光量子点材料,具有良好的生物相容性,其在生物医药分析领域具有潜在的应用价值,但单质硫的水溶性较差限制了其在亲水体系中的应用。目前,有关纯硫量子点的报道尚不多,其合成多集中于硫化镉刻蚀法、一锅水热法、界面反应等。工艺繁琐、安全性低、制得的硫量子点生物相容性差。
发明内容
针对上述问题本发明提供了一种检测碱性磷酸酶的复合荧光探针及其制备方法与应用。
为了达到上述目的,本发明采用了下列技术方案:
一种检测碱性磷酸酶的复合荧光探针,所述荧光探针为硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐复合荧光探针。
一种检测碱性磷酸酶的复合荧光荧光探针的制备方法,包括如下步骤:
(1)硫量子点的合成:将硫粉、分散剂加入到碱性溶液中,制得混合液;超声反应,得硫纳米粒子溶液;将得到的硫纳米粒子溶液用透析袋除去杂质,得到黄色荧光硫量子点溶液;
(2)纳米MnO2的合成:十二烷基硫酸钠溶液、硫酸加入超纯水混合均匀制得混合溶液,水浴反应;随后,加入高锰酸钾溶液,继续反应,得到MnO2纳米片溶液;所合成的MnO2纳米片经超纯水洗涤、过滤,冷冻干燥,得到MnO2纳米片;
(3)配制L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐溶液:配制浓度为0.1M/L的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐水溶液,4℃条件下保存;
(4)将硫量子点、MnO2纳米片和L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐加入缓冲溶液中,孵化,制得硫量子点-纳米MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐复合荧光探针。
进一步,所述步骤(1)中硫粉为升华硫、单质硫、斜方硫和硫磺粉中的一种;
所述步骤(1)中分散剂为β-环糊精;
所述步骤(1)中硫粉与分散剂的质量比为1.2-1.6:2.5-4.5;
所述步骤(1)中碱性溶液为氢氧化钠溶液,浓度为1-2mol/L;
所述步骤(1)中超声反应时间为2-4h;
进一步,所述步骤(2)混合溶液中十二烷基硫酸钠和硫酸浓度比为7-10:0.04-0.06;
所述步骤(2)中水浴反应温度为75-95℃,反应时间为10-30min;
所述步骤(2)中高锰酸钾溶液的浓度为1-2mmol/L;
进一步,所述步骤(4)中缓冲溶液为磷酸缓冲或Tris-HCl中的一种;
所述步骤(4)中缓冲溶液的pH为4-10;
所述步骤(4)中硫量子点、MnO2纳米片、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐和缓冲溶液的体积比为1-2:2-2.5:2-5:100-500。
一种利用复合荧光探针检测碱性磷酸酶的方法,包括如下步骤:
(1)将硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐复合荧光探针与不同浓度的碱性磷酸酶标准溶液混合后进行反应,得到含有不同碱性磷酸酶的硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐-碱性磷酸酶体系;
(2)采用荧光法进行测定,得到不同浓度碱性磷酸酶的硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐-碱性磷酸酶体系的荧光光谱图;
(3)以各荧光光谱图中硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐-碱性磷酸酶与空白对照在440nm处的荧光强度的比值为纵坐标,碱性磷酸酶标准溶液的浓度为横坐标,绘制检测碱性磷酸酶的标准工作曲线。
(4)将缓冲溶液、硫量子点溶液、纳米MnO2、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐溶液、样品溶液混合均匀后进行反应,然后采用荧光法测得到相应的荧光强度,最后根据检测碱性磷酸酶的标准工作曲线计算得到样品中碱性磷酸酶的浓度。
进一步,所述碱性磷酸酶标准溶液的浓度分别为0,0.01,0.1,0.2,0.5,0.7,0.9,1.2,1.4,1.8,2.3,3.2mg/mL,其中浓度为0mg/mL的碱性磷酸酶溶液为空白对照溶液;所述反应的时间为20-50min。
进一步,所述线检测碱性磷酸酶的标准工作曲线的性方程表示为:
F/F0=2.6997c+0.9284(r2=0.991),
其中,F为所述硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐-碱性磷酸酶体系在激发波长为322nm,狭缝宽度为5nm的条件下测得的440nm处的荧光强度,F0为相同条件下空白对照的荧光强度,c为碱性磷酸酶的浓度;
进一步,所述检测碱性磷酸酶标准工作曲线的线性范围为0-1.2μg/mL,检出限为4.4ng/mL。
进一步,所述反应的时间为20-50min;所述样品选自血清、尿样中的至少一种;所述样品经过预处理后再使用,样品的预处理方式为稀释;样品稀释为原液的20-100倍。
本发明以β-环糊精分散的硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐为复合荧光探针,建立了一种检测碱性磷酸酶的新方法,其检测原理如下:硫量子点具有很强的光致发光特性,在紫外光(340nm)激发下能发出蓝光;而MnO2纳米材料能通过内滤作用,使硫量子点的蓝色发光强烈猝灭;但在碱性磷酸酶存在下,L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐能水解形成抗坏血酸,与MnO2纳米材料发生反应,从而抑制MnO2纳米材料对硫量子点的内滤作用,使体系荧光再次恢复。
与现有技术相比本发明具有以下优点:
(1)本发明中硫量子点制备步骤简单,合成条件温和,不需要有机溶剂,制得的荧光硫量子点具有良好的生物相溶性,在狭缝宽度为5nm的条件下测得的最大激发波长为322nm,最大发射波长为440nm,荧光强度在900000左右,具有良好的荧光性能;
(2)分散剂β-环糊精具有良好的超分子组装特性,更有利于开发基于硫量子点的荧光传感体系。
(3)硫量子点在322nm激发下能发出蓝光,而MnO2纳米片能通过内滤作用,使硫量子点的荧光发生强烈猝灭;在碱性磷酸酶存在下,L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐能水解形成抗坏血酸与MnO2纳米片发生反应,从而抑制MnO2纳米材料对硫量子点的内滤作用,使体系的荧光再次恢复。本发明建立的检测方法简便、快速、可靠、低成本等优点。
(4)本发明建立的检测方法可成功地应用于血清和尿液中碱性磷酸酶的检测,可为临床诊断的快速分析和鉴定提供新的思路。
(5)本发明采用超声法,具有工艺简便、易得、制备要求低等优势,为获得具有良好水溶性的硫量子点,在报道的硫量子点制备中,其分散剂多集中于聚乙二醇与纤维素等富羟基分子,与这些直链分子相比,环糊精分子不仅同样含有多个羟基基团,而且,其分子具有内腔疏水、外腔亲水的立体锥形环状结构,这样的结构特点使得环糊精分子具有独特的超分子组装特性。因此,环糊精分子不仅可为硫量子点提供良好的保护作用,防止量子点聚集,更可结合硫量子点优良的荧光特性,进一步开发集富集与检测于一体的荧光传感体系。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的荧光硫量子点的透射电镜图;
图2为本发明实施例1制备的荧光硫量子点的XPS图;
图3为本发明实施例1制备的MnO2纳米片的扫描电镜图400nm;
图4为本发明实施例1制备的MnO2纳米片的扫描电镜图200nm;
图5为本发明实施例1制备的样品1、2、3、4、5的荧光光谱图,其中曲线a指样品1:单独的硫量子点,曲线b指样品2:硫量子点-纳米MnO2,曲线c指样品3:硫量子点-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐,曲线d指样品4:硫量子点-纳米MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐,曲线e指样品5:硫量子点-纳米MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐-碱性磷酸酶;
图6为荧光硫量子点与MnO2纳米片的紫外吸收光谱及荧光发射光谱;
图7为本发明实施例1制备的复合荧光硫量子点检测碱性磷酸酶的荧光发射光谱图。
具体实施方式
实施例1
一种检测碱性磷酸酶的复合荧光荧光探针的制备方法,包括如下步骤:
1、荧光硫量子点的合成:
(1)将1.4g硫粉、3.7gβ-环糊精、3m L 0.1M NaOH溶液加入100mL烧杯中,制得混合液;
(2)将上述混合溶液超声反应3h,得硫纳米粒子溶液;
(3)将得到的硫纳米粒子溶液用透析袋除去杂质,得到黄色荧光硫量子点溶液;紫外灯(365nm)照射下产品显蓝色,即发蓝色荧光的硫量子点溶液成功制备。将产品置于冰箱4℃待用。
(4)将步骤(3)得到的黄色荧光硫量子点冷冻干燥后得到目标荧光硫量子点。其荧光量子产率(以硫酸奎宁为标准)为5.06%。
将实施例1制备的荧光硫量子点与纳米MnO2进行TEM和XPS表征(见图1~5),结果表明制备的硫量子点为单分散准球形颗粒,主要含有C、O、Na、S四种元素;制备的纳米MnO2呈片状结构。制备的荧光硫量子点的荧光发射光谱图见图5,激发波长为322nm,发射波长为440nm。
2、MnO2纳米片的合成:
(1)0.1mol/L的十二烷基硫酸钠溶液10mL、0.1mol/L的硫酸500μL加入38.5mL超纯水混合均匀制得混合溶液,95℃水浴加热反应15min;
(2)加入0.05mol/L高锰酸钾溶液1mL,继续反应30min,随后,得到MnO2纳米片溶液;
(3)所合成的MnO2纳米片经超纯水洗涤、过滤,冷冻干燥,得到MnO2纳米片。
3、溶液的配制
实验过程所有溶液的配制均以去离子水为溶剂,均采用现配现用的方式。
4、硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐复合荧光探针的构建
样品1:在2.5mL离心管中加入1mL pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液,20μL硫量子点溶液,最后补足去离子水至2mL。
样品2:在2.5mL离心管中依次加入1mL Tris-HCl缓冲溶液,20μL硫量子点溶液,45μL的MnO2纳米片悬浮液,最后补足去离子水至2mL。
样品3:在2.5mL离心管中依次加入1mL Tris-HCl缓冲溶液,20μL硫量子点溶液,10μL的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐溶液,最后补足去离子水至2mL。
样品4:在2.5mL离心管中依次加入1mL Tris-HCl缓冲溶液,20μL硫量子点溶液,45μL的MnO2纳米片悬浮液,10μL L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐,最后补足去离子水至2mL。
样品5:在2.5mL离心管中依次加入1mL Tris-HCl缓冲溶液,20μL硫量子点溶液,45μL的MnO2纳米片悬浮液,10μL L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐,25μL碱性磷酸酶溶液,最后补足去离子水至2mL。
在激发波长为322nm,激发、发射狭缝宽度均为2nm的条件下,测试上述五个样品的荧光光谱图,结果如图5所示。由图5可知,纳米MnO2对硫量子点的荧光具有良好的猝灭作用,L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐对硫量子点及硫量子点-MnO2复合体系的荧光没有影响;碱性磷酸酶又能再一次使硫量子点的荧光恢复。由图6可知,纳米MnO2的吸收光谱与硫量子点的荧光光谱重叠,纳米MnO2对硫量子点的荧光猝灭作用主要来自于内滤效应。上述结果表明已成功构建检测碱性磷酸酶的硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐复合荧光探针。
实施例2
1、荧光硫量子点的合成:
(1)将1.4g硫粉、2gβ-环糊精、3m L 2M NaOH溶液加入100m L圆底烧瓶中,制得混合液;
(2)将上述混合溶液超声反应3h,得硫纳米粒子溶液;
(3)将得到的硫纳米粒子溶液用透析袋除去杂质,得到黄色荧光硫量子点溶液;紫外灯(365nm)照射下产品显蓝色,即发蓝色荧光的硫量子点溶液成功制备。将产品置于冰箱4℃待用。
(4)将步骤(3)得到的黄色荧光硫量子点冷冻干燥后得到目标荧光硫量子点。其荧光量子产率(以硫酸奎宁为标准)为4.05%。
2、MnO2纳米片的合成:
(1)0.1mol/L的十二烷基硫酸钠溶液12mL、0.1mol/L的硫酸800μL加入40mL超纯水混合均匀制得混合溶液,95℃水浴加热反应15min;
(2)加入0.05mol/L高锰酸钾溶液1mL,继续反应50min,随后,得到MnO2纳米片溶液。
(3)所合成的MnO2纳米片经超纯水洗涤、过滤,冷冻干燥,得到MnO2纳米片。
3、溶液的配制
实验过程所有溶液的配制均以去离子水为溶剂,均采用现配现用的方式。
4、硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐复合荧光探针的构建
将20μL硫量子点溶液、45μLMnO2纳米片悬浮液和10μL L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐溶液加入1000μL Tris-HCl缓冲溶液中,孵化,制得硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐复合荧光探针。
实施例3
5、碱性磷酸酶标准工作曲线
(1)将硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐复合荧光探针与不同浓度的碱性磷酸酶标准溶液混合,分别得到含0,0.01,0.1,0.2,0.5,0.7,0.9,1.2,1.4,1.8,2.3,3.2μg/mL的碱性磷酸酶的硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐-碱性磷酸酶体系,混合溶液反应20min;
(2)采用荧光法进行测定,得到不同浓度碱性磷酸酶的硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐-碱性磷酸酶体系的荧光光谱图,见图7;
(3)以各荧光光谱图中硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐-碱性磷酸酶与空白对照在440nm处的荧光强度的比值为纵坐标,碱性磷酸酶标准溶液的浓度为横坐标,绘制检测碱性磷酸酶的标准工作曲线。
线检测碱性磷酸酶的标准工作曲线的性方程表示为:F/F0=2.6997c+0.9284(r2=0.991),其中F为所述硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐-碱性磷酸酶体系在激发波长为322nm,狭缝宽度为5nm的条件下测得的440nm处的荧光强度,F0为相同条件下空白对照的荧光强度,c为碱性磷酸酶的浓度。标准工作曲线检测碱性磷酸酶的线性范围为0.01-1.2μg/mL。
实施例4
实际样品中碱性磷酸酶的测定
分别以血清和尿样为实际样品,采用稀释(逐级稀释至原液的50倍)方式对血清和尿样进行预处理。
在2.5mL离心管中依次加入1mL pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液,稀释了500倍的血清溶液500μL,75μL硫量子点溶液,90μL MnO2纳米片悬浮液,90μL(0.01mol/L)的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐溶液,混合溶液放置反应25min。在激发波长为322nm,激发、发射狭缝宽度为2nm的条件下,测试样品的荧光光谱,并记录440nm处的荧光强度。每个样品平行测定三次,因为含有碱性磷酸酶样本的荧光强度会高于无碱性磷酸酶样本的磷光强度,据此判断样品中是否含有碱性磷酸酶。并与标准曲线比对,确定样品中碱性磷酸酶的含量。
在2.5mL离心管中依次加入1mL pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液,稀释了50倍的尿样溶液500μL,75μL硫量子点溶液,90μL MnO2纳米片悬浮液,90μL(0.01mol/L)的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐溶液,混合溶液放置反应25min。在激发波长为322nm,激发、发射狭缝宽度为2nm的条件下,测试样品的荧光光谱,并记录440nm处的荧光强度。每个样品平行测定三次,并与标准曲线比对,判断样品中是否含碱性磷酸酶,并确定样品中碱性磷酸酶的含量。
实施例5
实际样品中碱性磷酸酶的测定
分别以血清和尿样为实际样品,采用稀释(逐级稀释至原液的50倍)方式对血清和尿样进行预处理。
在2.5mL离心管中依次加入1mL pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液,稀释了50倍的血清溶液500μL,20μL硫量子点溶液,90μL MnO2纳米片悬浮液,90μL(0.05mg/mL)以及不同浓度的碱性磷酸酶标准溶液。碱性磷酸酶标准溶液的终浓度分别为:0.33,0.5,0.90μg/mL。的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐溶液,混合溶液放置反应25min。在激发波长为322nm,激发、发射狭缝宽度为5nm的条件下,测试样品的荧光光谱,并记录440nm处的荧光强度。每个样品平行测定三次,计算加标回收率。见表1,碱性磷酸酶在人血清和尿液中的加标回收率为96.00-103.03%。
表1人血清中碱性磷酸酶加标回收实验
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述,以便于本技术领的技术人员理解本发明,但应该清楚,本发明不限于具体实施方式的范围,对本技术领域的普通技术人员来讲,只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内,这些变化是显而易见的,一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
Claims (10)
1.一种检测碱性磷酸酶的复合荧光探针,其特征在于:所述荧光探针为硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐复合荧光探针。
2.一种检测碱性磷酸酶的复合荧光荧光探针的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)硫量子点的合成:将硫粉、分散剂加入到碱性溶液中,制得混合液;超声反应,得硫纳米粒子溶液;将得到的硫纳米粒子溶液用透析袋除去杂质,得到黄色荧光硫量子点溶液;
(2)纳米MnO2的合成:十二烷基硫酸钠溶液、硫酸加入超纯水混合均匀制得混合溶液,水浴反应;随后,加入高锰酸钾溶液,继续反应,得到MnO2纳米片溶液;所合成的MnO2纳米片经超纯水洗涤、过滤,冷冻干燥,得到MnO2纳米片;
(3)配制L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐溶液:配制浓度为0.1M/L的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐水溶液,4℃条件下保存;
(4)将硫量子点、MnO2纳米片和L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐加入缓冲溶液中,孵化,制得硫量子点-纳米MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐复合荧光探针。
3.根据权利要求2所述的一种检测碱性磷酸酶的复合荧光荧光探针的制备方法,其特征在于:
所述步骤(1)中硫粉为升华硫、单质硫、斜方硫和硫磺粉中的一种;
所述步骤(1)中分散剂为β-环糊精;
所述步骤(1)中硫粉与分散剂的质量比为1.2-1.6:2.5-4.5;
所述步骤(1)中碱性溶液为氢氧化钠溶液,浓度为1-2mol/L;
所述步骤(1)中超声反应时间为2-4h。
4.根据权利要求3所述的一种检测碱性磷酸酶的复合荧光荧光探针的制备方法,其特征在于:
所述步骤(2)混合溶液中十二烷基硫酸钠和硫酸浓度比为7-10:0.04-0.06;
所述步骤(2)中水浴反应温度为75-95℃,反应时间为10-30min;
所述步骤(2)中高锰酸钾溶液的浓度为1-2mmol/L。
5.根据权利要求4所述的一种检测碱性磷酸酶的复合荧光荧光探针的制备方法,其特征在于:
所述步骤(4)中缓冲溶液为磷酸缓冲或Tris-HCl中的一种;
所述步骤(4)中缓冲溶液的pH为4-10;
所述步骤(4)中硫量子点、MnO2纳米片、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐和缓冲溶液的体积比为1-2:2-2.5:2-5:100-500。
6.一种利用权利要求1所述的复合荧光探针检测碱性磷酸酶的方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)将硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐复合荧光探针与不同浓度的碱性磷酸酶标准溶液混合后进行反应,得到含有不同碱性磷酸酶的硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐-碱性磷酸酶体系;
(2)采用荧光法进行测定,得到不同浓度碱性磷酸酶的硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐-碱性磷酸酶体系的荧光光谱图;
(3)以各荧光光谱图中硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐-碱性磷酸酶与空白对照在440nm处的荧光强度的比值为纵坐标,碱性磷酸酶标准溶液的浓度为横坐标,绘制检测碱性磷酸酶的标准工作曲线;
(4)将缓冲溶液、硫量子点溶液、纳米MnO2、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐溶液、样品溶液混合均匀后进行反应,然后采用荧光法测得到相应的荧光强度,最后根据检测碱性磷酸酶的标准工作曲线计算得到样品中碱性磷酸酶的浓度。
7.根据权利要求6所述的一种复合荧光探针检测碱性磷酸酶的方法,其特征在于:所述碱性磷酸酶标准溶液的浓度分别为0,0.01,0.1,0.2,0.5,0.7,0.9,1.2,1.4,1.8,2.3,3.2μg/mL,其中浓度为0mg/mL的碱性磷酸酶溶液为空白对照溶液;所述混合后进行反应的时间为20-50min。
8.根据权利要求7所述的一种复合荧光探针检测碱性磷酸酶的方法,其特征在于:所述线检测碱性磷酸酶的标准工作曲线的性方程表示为:
F/F0=2.6997c+0.9284(r2=0.991),
其中,F为所述硫量子点-MnO2-L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐-碱性磷酸酶体系在激发波长为322nm,狭缝宽度为5nm的条件下测得的440nm处的荧光强度,F0为相同条件下空白对照的荧光强度,c为碱性磷酸酶的浓度。
9.根据权利要求8所述的一种复合荧光探针检测碱性磷酸酶的方法,其特征在于:所述检测碱性磷酸酶标准工作曲线的线性范围为0-1.2μg/mL,检出限为4.4ng/mL。
10.根据权利要求9所述的一种复合荧光探针检测碱性磷酸酶的方法,其特征在于:所述反应的时间为20-50min;所述样品选自血清、尿样中的一种;所述样品经过预处理后再使用,样品的预处理方式为稀释,样品稀释为原液的20-100倍。
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