CN113956871B - 一种具有红色荧光的硅纳米颗粒的制备及在检测酸性磷酸酶中的应用 - Google Patents

一种具有红色荧光的硅纳米颗粒的制备及在检测酸性磷酸酶中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有红色荧光的硅纳米颗粒的制备方法，是以N‑(2‑氨乙基)‑3‑氨丙基三甲氧基硅烷（DAMO）作为硅源，2,4‑二氨基苯酚盐酸盐为还原剂制备得到水溶性的硅纳米颗粒（R‑SiNPs），制备方法简单、温和。制备的R‑SiNPs可用于酸性磷酸酶（ACP）的检测，单独的ACP不会引起R‑SiNPs荧光强度变化，但KMnO4可以猝灭R‑SiNPs的荧光，在R‑SiNPs和KMnO4溶液体系中加入L‑抗坏血酸‑2‑磷酸三钠盐（AA2P）和ACP的混合液后，由ACP水解AA2P产生的抗坏血酸将KMnO4还原为Mn2+，使R‑SiNPs的荧光恢复，且随着ACP浓度的增加，体系的荧光恢复强度不断增强，因此可实现对ACP的定量检测和可视化检测，检测选择性好，灵敏度高。

Description

一种具有红色荧光的硅纳米颗粒的制备及在检测酸性磷酸酶 中的应用
技术领域
本发明属于化学化工领域，具体涉及一种具有红色荧光的硅纳米颗粒的制备及在检测酸性磷酸酶中的应用。
背景技术
酸性磷酸酶（ACP）是一种能够水解各种磷酸酯的非特异性溶酶体酶。通常，在pH为4.0-7.0的酸性条件下，ACP可以催化磷酸单酯水解。ACP在动物、植物、细菌和真菌的代谢中起着非常重要的作用。在哺乳动物中，ACP水平与初级免疫反应、骨骼重塑和信号传导途径等病理过程密切相关。另外，前列腺患者及出现肝炎、甲状旁腺机能亢进、红血球病变等疾病时，血清中ACP的表达量偏高。目前，ACP已被认定为转移性前列腺癌的标志物。因此，ACP活性检测对于病理诊断、抗肿瘤药物筛选和预后评估等具有十分重要的意义。
目前，已经建立了基于L-cys-CuInS2 QDs、Lys-Au/AgNCs、Au-NCs/MnO2等金属纳米材料检测ACP活性的方法。然而，这些金属纳米材料通常具有较高的毒性，限制了它们的广泛使用。硅纳米颗粒（SiNPs）具有毒性低、易降解、易排出体外、易合成和易功能化等特点，受到了研究者的广泛关注。而发射红色荧光的纳米探针具有较低的光子散射和光吸收水平，因而可以有效避免生物组织自吸收、生物分子自荧光、潜在光损伤以及较低组织渗透等缺点，实现复杂生物组织中标志物的选择性和灵敏检测。因此，建立一种基于R-SiNPs检测ACP活性的荧光方法具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有红色荧光的硅纳米颗粒的制备方法；
本发明的另一个目的在于提供该硅纳米颗粒在检测酸性磷酸酶中的应用。
一、R-SiNPs的制备
本发明具有红色荧光的硅纳米颗粒的制备方法，是将2,4-二氨基苯酚盐酸盐加入去离子水中，在搅拌过程中加入N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷，于室温下反应2~9h，将得到的溶液透析3~5 h，冷冻干燥，得到具有红色荧光的硅纳米颗粒R-SiNPs。其中，所述N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷与2,4-二氨基苯酚盐酸盐的质量比为29:1~600:1；所述透析是在分子截留量为1000 Da的透析袋中进行透析。
二、R-SiNPs的结构
利用透射电子显微镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）对R-SiNPs的形貌和结构进行表征。
图1为R-SiNPs的TEM图，从图中可以看出R-SiNPs为颗粒状结构，并具有良好的分散性，其粒径分布范围为14.1 nm~16.5 nm，平均粒径为15.1 nm。
图2为R-SiNPs的荧光激发、发射谱图和紫外-可见吸收光谱图。从图中可以看出，R-SiNPs的最佳激发和发射波长分别为555 nm和627 nm。紫外-可见吸收谱图中250 nm处的峰由苯环结构中双键的π-π*跃迁引起，460 nm处的峰由R-SiNPs表面结构中孤对电子与双键基团的n-π*跃迁引起。
图3为R-SiNPs的傅里叶变换红外光谱图。从图中可以看出，R-SiNPs中保留了原料2,4-二氨基苯酚盐酸盐的苯环结构，并且表面含有丰富的氨基和羟基。这些官能团使得R-SiNPs具有红光发射的性质，也使其具有良好的水溶性。
三、R-SiNPs对ACP的检测
1、R-SiNPs在不同pH下的荧光强度
对R-SiNPs在不同pH下的荧光强度进行考察。pH对R-SiNPs归一化荧光强度的影响如图4，R-SiNPs具有红色荧光，且pH变化对R-SiNPs的荧光强度的影响极弱。
2、R-SiNP对ACP的定量检测
将L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐（AA2P）与ACP孵育20 min，随后将18 μL用去离子水稀释18倍的R-SiNPs加入到1.0 mL的50 mM Tris-HCl（pH = 5.0）中，然后加入150 μMKMnO4溶液，R-SiNPs的红色荧光被淬灭，测得此时荧光强度F 0 。最后将200 μM AA2P和1.0~50mU/L不同浓度ACP的混合溶液加入到上述体系中，R-SiNPs的红色荧光恢复，测得此时荧光强度F。荧光强度在激发波长为555 nm，发射波长为627 nm时测得；激发波长和发射波长的狭缝宽度为10 nm和15 nm。根据R-SiNPs的荧光恢复信号log(F-F 0 )值与酸性磷酸酶浓度的对数值之间的线性关系，即可对酸性磷酸酶进行定量检测。
图5为加入不同浓度酸性磷酸酶R-SiNPs的荧光强度（a）及线性关系图（b）。从图5中可以看出，随着酸性磷酸酶浓度的增加，体系的荧光不断增强，酸性磷酸酶浓度在1.0~50mU/L范围内，R-SiNPs的荧光恢复信号log(F-F 0 )值与酸性磷酸酶浓度的对数值呈现良好的线性关系（图5（b）），线性方程为 [log(F-F 0 ) = 0.671 logX + 1.26，R2 = 0.989，其中，X为ACP的浓度。检测限低至0.3 mU/L，表明具有较宽的线性范围和较低的检测限。
3、R-SiNP对ACP的选择性检测
将AA2P与ACP共同孵育20 min，随后将18 μL用去离子水稀释18倍的R-SiNPs加入到1.0 mL的50 mM Tris-HCl（pH = 5.0）中，然后加入150 μM KMnO4溶液，R-SiNPs的红色荧光淬灭，再分别加入AA2P+ACP、AA2P+K+、AA2P+Mg2+、AA2P+SO3 2-、AA2P+NO2 -、AA2P+Cl-、AA2P+Pb2+、AA2P+Cr2O7 2-、AA2P+ClO-、AA2P+Fe3+、AA2P+Mn2+、AA2P+CO3 2-、AA2P+Ba2+、AA2P+Zn2+、AA2P+尿素、AA2P+Cr3+、AA2P+Al3+、AA2P+HCO3 -、AA2P+Cd2+、AA2P+Na+的混合溶液，其中，AA2P的浓度为200 μM，ACP的浓度为20 mU/L，干扰物的浓度均为500 μM。
图6为R-SiNPs+KMnO4体系中加入ACP和其它干扰物质的荧光强度信号柱状图。其中，F为在R-SiNPs+KMnO4体系中加入AA2P+ACP或其它干扰物质时测得的荧光强度，F 0 为R-SiNPs+KMnO4体系的荧光强度。只有ACP+AA2P可以使R-SiNPs的红色荧光恢复，且加入ACP+AA2P的荧光强度F与不加ACP+AA2P的荧光强度F0比值最大。表明本发明检测ACP具有良好的选择性。
4、ACP检测试剂盒的制备
(a) 试剂I的制备
将36 μL用去离子水稀释18倍的R-SiNPs加入到2.0 mL的50 mM Tris-HCl（pH =5.0）中，随后加入150 μM KMnO4，以此为试剂I。
(b) 试剂II的制备
将200 μM AA2P加入到2.0 mL的50 mM Tris-HCl（pH = 5.0）中，随后加入检测样品，上述混合物孵育20 min，以此为试剂II。
(c) 试剂盒的应用
将试剂II与试剂I混合，根据混合液颜色的变化即可判断检测样品中是否含有ACP，若混合体系溶液具有红色荧光，则说明检测样品中含有ACP。制备成ACP检测试剂盒，有效实现了对ACP的可视化检测。
5、R-SiNPs检测ACP的机理
R-SiNPs具有红色荧光，在R-SiNPs中加入KMnO4，由于KMnO4的紫外-可见吸收光谱与R-SiNPs的荧光激发光谱有大面积的重叠，可以将R-SiNPs的能量吸收，使得R-SiNPs的荧光被猝灭。加入L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐（AA2P）和ACP的混合液后，由ACP水解AA2P产生的抗坏血酸（AA）将KMnO4还原为Mn2+，因此使R-SiNPs的荧光恢复，R-SiNPs检测ACP的机理示意图如图8。
本发明的有益效果在于：
本发明以N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷（DAMO）作为硅源，2,4-二氨基苯酚盐酸盐为还原剂制备得到水溶性的荧光硅纳米颗粒（R-SiNPs），制备方法简单、温和，相比现有技术避免了多步且耗时的制备过程。所制备的R-SiNPs具有良好的热稳定性、较强的耐盐性、较低的毒性和优异的光学性质，R-SiNPs用于ACP检测选择性好，灵敏度高，可实现对ACP的定量检测和可视化检测。
附图说明
图1为R-SiNPs的透射电子显微镜图；
图2为R-SiNPs的荧光激发、发射谱图和紫外-可见吸收光谱图；
图3为R-SiNPs的傅里叶变换红外光谱图；
图4为pH对R-SiNPs归一化荧光强度的影响；
图5为加入不同浓度酸性磷酸酶R-SiNPs的荧光强度（a）及线性关系图（b）；
图6为R-SiNPs+KMnO4体系中加入ACP和其它干扰物质的荧光强度信号柱状图；
图7为酸性磷酸酶检测试剂盒检测血清样品的颜色变化；
图8为R-SiNPs检测ACP的机理示意图。
具体实施方式
实施例1 R-SiNPs的制备
将10 mg 2,4-二氨基苯酚盐酸盐加入到10 mL去离子水中，在搅拌过程中逐滴加入1.0 mL N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷（DAMO），将上述混合物在室温下反应4 h。然后将制备好的R-SiNPs溶液在1000 Da（分子量筛截）的透析袋中透析4 h。最后，将透析好的R-SiNPs溶液储存在4 ℃的冰箱中备用。获得的R-SiNPs的粒径较小。
实施例2 R-SiNPs的制备
将35 mg 2,4-二氨基苯酚盐酸盐加入到10 mL去离子水中，在搅拌过程中逐滴加入1.0 mL N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷（DAMO），将上述混合物在室温下反应2 h。然后将制备好的R-SiNPs溶液在1000 Da（分子量筛截）的透析袋中透析4 h。最后，将透析好的R-SiNPs溶液储存在4 ℃的冰箱中备用。获得的R-SiNPs的粒径均一。
实施例3 R-SiNPs的制备
将5 mg 2,4-二氨基苯酚盐酸盐加入到20 mL去离子水中，在搅拌过程中逐滴加入3.0 mL N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷（DAMO），将上述混合物在室温下反应5 h。然后将制备好的R-SiNPs溶液在1000 Da（分子量筛截）的透析袋中透析4 h。最后，将透析好的R-SiNPs溶液储存在4 ℃的冰箱中备用。获得的R-SiNPs的粒径分布不均匀。
实施例4 R-SiNPs的制备
将15 mg 2,4-二氨基苯酚盐酸盐加入到15 mL去离子水中，在搅拌过程中逐滴加入1.0 mL N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷（DAMO），将上述混合物在室温下反应8 h。然后将制备好的R-SiNPs溶液在1000 Da（分子量筛截）的透析袋中透析4 h。最后，将透析好的R-SiNPs溶液储存在4 ℃的冰箱中备用。获得的R-SiNPs的粒径分布不均匀。
实施例5 R-SiNPs的制备
将20 mg 2,4-二氨基苯酚盐酸盐加入到10 mL去离子水中，在搅拌过程中逐滴加入3.0 mL N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷（DAMO），将上述混合物在室温下反应9 h。然后将制备好的R-SiNPs溶液在1000 Da（分子量筛截）的透析袋中透析4 h。最后，将透析好的R-SiNPs溶液储存在4 ℃的冰箱中备用。
实施例6 ACP的定量检测
1、水样中ACP的检测
取实施例5得到的R-SiNPs用去离子水稀释18倍，将18 μL稀释后的R-SiNPs加入到1.0 mL的50 mM Tris-HCl（pH = 5.0）中，然后加入150 μM KMnO4溶液，R-SiNPs的红色荧光被淬灭，测得此时荧光强度F 0 。最后将200 μM AA2P和1.0~50 mU/L不同浓度ACP的混合溶液加入到上述体系中，R-SiNPs的红色荧光恢复，测得此时荧光强度F。荧光强度是在激发波长为555 nm，发射波长为627 nm时测得；激发波长和发射波长的狭缝宽度为10 nm和15 nm。随着酸性磷酸酶浓度的增加，体系的荧光恢复强度不断增强，如图5。酸性磷酸酶浓度在1.0~50 mU/L范围内，R-SiNPs的荧光恢复信号log(F-F 0 )值与ACP浓度的对数值之间的线性关系：[log(F-F 0 ) = 0.671 logX + 1.26，R2 = 0.989，其中，X为酸性磷酸酶的浓度。
2、复杂生物样品中ACP的检测
取相同体积的血清样品按照水样中ACP的检测过程进行检测，计算测定结果、回收率及相对标准偏差，结果如表1所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例7 ACP的选择性检测
将AA2P与ACP共同孵育20 min，随后将18 μL用去离子水稀释18倍的R-SiNPs加入到1.0 mL的50 mM Tris-HCl（pH = 5.0）中，然后加入150 μM KMnO4溶液，R-SiNPs的红色荧光淬灭，再分别加入AA2P+ACP、AA2P+K+、AA2P+Mg2+、AA2P+SO3 2-、AA2P+NO2 -、AA2P+Cl-、AA2P+Pb2+、AA2P+Cr2O7 2-、AA2P+ClO-、AA2P+Fe3+、AA2P+Mn2+、AA2P+CO3 2-、AA2P+Ba2+、AA2P+Zn2+、AA2P+尿素、AA2P+Cr3+、AA2P+Al3+、AA2P+HCO3 -、AA2P+Cd2+、AA2P+Na+的混合液，其中，AA2P的浓度为200 μM，ACP的浓度为20 mU/L，干扰物的浓度均为500 μM。若混合体系的红色荧光恢复，说明加入的是AA2P+ACP；若混合体系的红色荧光没有恢复，说明加入的是其他干扰物质。
实施例8 ACP试剂盒的制备及检测
将36 μL用去离子水稀释18倍的R-SiNPs加入到2.0 mL的50 mM Tris-HCl（pH =5.0）中，随后加入150 μM KMnO4，以此为试剂I。将200 μM AA2P加入到2.0 mL的50 mMTris-HCl（pH = 5.0）中，随后加入血清样品，上述混合物孵育20 min，以此为试剂II。将试剂I与试剂II混合，结果如图7。其中，空白为SiNPs；试剂I为SiNPs+KMnO4；试剂II为AA2P+ACP。根据图7所示的颜色变化，说明血清中有极大可能性存在ACP，应当及时就诊，避免病情进一步恶化。

Claims (7)

1.一种具有红色荧光的硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于：是将2,4-二氨基苯酚盐酸盐加入去离子水中，在搅拌过程中加入N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷，于室温下反应2~9 h，将得到的溶液透析3~5 h，冷冻干燥，得到具有红色荧光的硅纳米颗粒R-SiNPs；所述2,4-二氨基苯酚盐酸盐与N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷的质量体积比为35mg/mL。
2.根据权利要求1所述的具有红色荧光的硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述透析是在分子截留量为1000 Da的透析袋中进行透析。
3.根据权利要求1所述方法制备的具有红色荧光的硅纳米颗粒在检测酸性磷酸酶中的应用。
4.根据权利要求3所述具有红色荧光的硅纳米颗粒在检测酸性磷酸酶中的应用，其特征在于：在R-SiNPs的Tris-HCl溶液中，加入KMnO4溶液，R-SiNPs的红色荧光淬灭，测得此时荧光强度为F 0 ，再加入L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐与不同浓度酸性磷酸酶的混合溶液，R-SiNPs的红色荧光恢复，测得此时荧光强度为F，荧光强度是在激发波长为555 nm，发射波长为627 nm下测得；根据R-SiNPs的荧光恢复信号log(F-F 0 )值与酸性磷酸酶浓度的对数值之间的线性关系，即可对酸性磷酸酶进行定量检测；所述Tris-HCl溶液的pH为4.0~7.0。
5.根据权利要求4所述具有红色荧光的硅纳米颗粒在检测酸性磷酸酶中的应用，其特征在于：酸性磷酸酶浓度在1.0-50 mU/L范围内，R-SiNPs的荧光恢复信号log(F-F 0 )值与酸性磷酸酶浓度的对数值存在以下线性关系：
log(F-F 0 ) = 0.671 logX + 1.26，R2 = 0.989，其中，X为酸性磷酸酶的浓度。
6.根据权利要求3所述具有红色荧光的硅纳米颗粒在检测酸性磷酸酶中的应用，其特征在于：在R-SiNPs的Tris-HCl溶液中，加入KMnO4溶液，R-SiNPs的红色荧光淬灭，再分别加入AA2P+ACP、AA2P+K+、AA2P+Mg2+、AA2P+SO3 2-、AA2P+NO2 -、AA2P+Cl-、AA2P+Pb2+、AA2P+Cr2O7 2-、AA2P+ClO-、AA2P+Fe3+、AA2P+Mn2+、AA2P+CO3 2-、AA2P+Ba2+、AA2P+Zn2+、AA2P+尿素、AA2P+Cr3+、AA2P+Al3+、AA2P+HCO3 -、AA2P+Cd2+、AA2P+Na+的混合溶液，只有AA2P与ACP的混合溶液的加入可以使R-SiNPs的红色荧光恢复；所述Tris-HCl溶液的pH为4.0~7.0；所述AA2P为L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐。
7.根据权利要求1所述方法制备的具有红色荧光的硅纳米颗粒在制备酸性磷酸酶检测试剂盒中的应用。
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