CN116891737A - 一种荧光硅点的合成方法、荧光硅点及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供的荧光硅点的合成方法，以3‑氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)作为硅源，葡萄糖作为还原剂，通过微波辅助的荧光硅点，合成的硅点荧光强度是水浴法制备的硅点的17倍，具有较高的量子产率、良好的光稳定性、pH稳定性、良好的保存稳定性。此外，本申请制备得到的荧光硅点，可进行人血清中ALP的检测中，在临床诊断中显示出巨大的潜力。

Description

一种荧光硅点的合成方法、荧光硅点及应用
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域，特别涉及一种荧光硅点的合成方法、荧光硅点及应用。
背景技术
ALP是一种膜结合酶，能够有效地催化各种磷酸单酯底物的去磷酸化，包括碳水化合物、蛋白质或核酸。据报道，ALP参与肝、肾、肠、骨、胎盘中磷酸基团的转移和代谢，并在肝功能和骨发育中发挥重要作用。ALP也被广泛用于生物学应用领域，如基因表达和抗体偶联免疫分析等，被认为是临床上的重要诊断或治疗性生物标志物。因此，开发一种新颖、简单、灵敏、可靠的ALP活性检测方法具有重要意义和实用价值。
研究人员已经发展了许多方法分析ALP的活性，比如荧光法、比色法、表面增强拉曼散射法、化学发光和电化学等方法。荧光法因其操作方便、灵敏度高、响应速度快而被认为是最实用的方法。量子点(QDs)是生物传感器系统中重要的荧光材料。然而，由于量子点的高毒性的缺点，具有更好的生物相容性的硅基荧光纳米材料正逐渐受到关注。
发明内容
鉴于此，有必要针对现有技术中存在的缺陷提供一种速度更快、更高效、操作更方便的荧光硅点的合成方法、荧光硅点及应用。
为解决上述问题，本申请采用下述技术方案：
本申请目的之一，提供了一种荧光硅点的合成方法，包括下述步骤：
将葡萄糖溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷混合后溶解于ddH2O中形成混合溶液；
将所述混合溶液进行搅拌反应，得到反应产物；
将所述反应产物与乙腈混合后离心处理，弃上清，重复上述洗涤步骤；
将洗涤后的产物进行干燥处理，得到纯化的硅点晶体。
在其中一些实施例中，在将葡萄糖溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷混合后溶解于ddH2O中形成混合溶液的步骤中，葡萄糖溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷比例为1:0.5-1:5。
在其中一些实施例中，在将所述混合溶液进行搅拌反应，得到反应产物的步骤中，具体包括下述步骤：
将所述混合溶液转移到微波合成仪器中进行反应，所述微波合成器的程序设置为：预搅拌1-5min，反应温度40-80℃，反应时间4-28min。
在其中一些实施例中，在将所述反应产物与乙腈混合后离心处理，弃上清，重复上述洗涤步骤的步骤中，所述反应物与乙腈体积比为1:1-1:3。
在其中一些实施例中，在将洗涤后的产物进行干燥处理，得到纯化的硅点晶体的步骤中，所述干燥的温度为30～60℃，所述干燥的时间为4-12小时。
本申请目的之二，提供了一种荧光硅点，由所述的荧光硅点的合成方法制备得到。
本申请目的之三，提供了一种所述的荧光硅点在人血清中ALP检测中的应用。
本申请采用上述技术方案，其有益效果如下：
本申请提供的荧光硅点的合成方法，以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)作为硅源，葡萄糖作为还原剂，通过微波辅助的荧光硅点，合成的硅点荧光强度是水浴法制备的硅点的17倍，具有较高的量子产率、良好的光稳定性、pH稳定性、良好的保存稳定性。此外，本申请制备得到的荧光硅点，可进行人血清中ALP的检测中，在临床诊断中显示出巨大的潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请提供的荧光硅点的合成方法的原理示意图。
图2为本申请实施例1提供的荧光硅点的合成方法的步骤流程图。
图3为本申请实施例1提供的硅点的紫外-可见吸收光谱、荧光发射光谱和荧光激发光谱的曲线图。
图4为本申请实施例1提供的微波辅助制备硅点条件的优化示意图。
图5为本申请实施例1提供的微波法和水浴法合成的硅点的荧光光谱比较示意图。
图6为本申请实施例1提供的硅点的元素组成和结构表征示意图。
图7为本申请实施例1提供的微波法合成的硅点的C1、N1、O1和Si2p分析示意图。
图8为本申请实施例1提供的用微波合成法和水浴合成法合成的硅点的特征示意图。
图9为本申请实施例1提供的水浴法合成的硅点的C1、N1、O1和Si2p的分析示意图。
图10为本申请实施例1提供的硅点的稳定性研究示意图。
图11中(A)为本申请实施例1提供的“turn on”模式下硅点对不同浓度ALP响应的荧光光谱；(B)为“turn on”模式检测ALP的标准曲线；(C)为“turn off”模式下硅点对不同浓度ALP响应的荧光光谱；(D)为“turn off”模式检测低浓度ALP的标准曲线；(E)为“turnoff”模式检测高浓度ALP的标准曲线；(F)为两种ALP检测模式的比较，箭头表示相应的ALP浓度。
图12为本申请实施例1提供的不同浓度(A)pNPP或(B)pNP作用下硅点的荧光光谱示意图。
图13为本申请实施例2提供的ALP检测条件的优化曲线图。
图14中(A)本申请实施例2提供的ALP检测的选择性示意图；(B)为在人血清和Tris缓冲液中检测ALP的比较示意图。
具体实施方式
下面详细描述本申请的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本申请的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本申请以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)作为硅源，葡萄糖作为还原剂，通过微波辅助方法制备了青色发射的荧光硅点，其荧光强度是水浴法制备的17倍。如图1所示，其中(A)为硅点的制备示意图，(B)为利用PET和IFE协同效应检测ALP的示意图。405nm激发的硅点荧光被pNP猝灭，可以归因于pNP在400nm处的IFE。然后通过荧光寿命和zeta电位测定，证明了从pNP到硅点的PET，并通过紫外-可见吸收光谱和循环伏安法详细讨论了PET的机理。IFE和PET的协同猝灭作用使ALP检测的“turn-off”模式检测更加灵敏，并且显著简化了检测过程，因为pNP是IFE和PET的共同猝灭剂，这不同于其他协同作用生物传感器需要多个荧光团和猝灭剂。
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。
实施例1
请参阅图2，为本实施例1提供的一种荧光硅点的合成方法的步骤流程图，包括下述步骤S110至S130，以下详细说明各个步骤的实现方式。
步骤S110：将葡萄糖溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷混合后溶解于ddH2O中形成混合溶液。
在本实施例中，将葡萄糖溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷混合后溶解于ddH2O中形成混合溶液的步骤中，所述葡萄糖溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷比例为1:0.5-1:5。
步骤S120:将所述混合溶液进行搅拌反应，得到反应产物。
在其中一些实施例中，在将所述混合溶液进行搅拌反应，得到反应产物的步骤中，具体包括下述步骤：将所述混合溶液转移到微波合成仪器中进行反应，所述微波合成器的程序设置为：预搅拌1-5min，反应温度40-80℃，反应时间4-28min。
步骤S130：将所述反应产物与乙腈混合后离心处理，弃上清，重复上述洗涤步骤。
在本实施例中，在将所述反应产物与乙腈混合后离心处理，弃上清，重复上述洗涤步骤的步骤中，所述反应物与乙腈体积比为1:1-1:3。
步骤S140：将洗涤后的产物进行干燥处理，得到纯化的硅点晶体。
在本实施例中，在将洗涤后的产物进行干燥处理，得到纯化的硅点晶体的步骤中，所述干燥的温度为30～60℃，所述干燥的时间为4-12小时。
可以理解，通过上述步骤S110～S140可以完成荧光硅点的合成方法。
以下结合具体实施例进行详细说明。
首先将1.135g葡萄糖溶解于10mL ddH2O中来制备630mM的葡萄糖溶液。取100μL葡萄糖溶液与200μL APTES混合溶解在700μL ddH2O中，然后转移到微波合成仪器的玻璃瓶中。微波合成器程序设置为：预搅拌2min，反应温度60℃，反应时间24min。反应结束后将产物与乙腈在按体积比1：4混合，以8000rpm离心15min，弃上清，重复上述洗涤步骤2次。洗涤后的产物在40℃的烘箱中干燥约5小时，得到纯化的硅点晶体。取50mg纯化的硅点晶体溶解在1mL的ddH2O中，并存储在4℃下，用于后续实验。
如图4所示，当葡萄糖浓度为63mM时(图4中A)，反应温度为60℃(图4中B)，反应时间为24min(图4中C)和反应总体积为1mL(图4中D)时，上述实施例制备的硅点荧光强度最高。
进一步地，本实施例研究了硅点的光学性质，硅点在302nm处有一个明显的吸收峰，这可能是与C＝O键的n-π*跃迁有关。此外，硅点在302nm和405nm两处有明显的激发峰，在478nm处有一个强发射峰(图3)。相同条件下微波辅助法制备的硅点的荧光强度是水浴法的17.2倍(图5表示微波法和水浴法合成的硅点的荧光光谱比较)。用硫酸奎宁(溶解在0.1MH2SO4)作为参照，在405nm激发下，计算硅点的量子产率为28.5％，高于之前报道的大多数硅点。
请参阅图6为本实施例制备的硅点的元素组成和结构表征。其中，(A)为TEM图像，插图：HRTEM图像。(B)为硅点基于TEM的尺寸分布直方图。(C)XRD光谱。(D)FT-IR光谱。(E)XPS光谱。(F)Zeta电位分析。
请再参阅图6中A-B所示，制备的硅点接近球形，平均直径为2.42nm，具有均匀色散度。此外，通过XRD测定了硅点的结构和结晶度(图6中C)。FT-IR结果表明，在3218cm-1吸收属于O-H伸缩振动，吸收带在2840cm-1是由于C-H伸缩振动，在1700cm-1吸收对应于N-H伸缩振动，在984cm-1处吸收是由于Si-O的伸缩振动，结果表明-OH和-NH2存在于硅点的表面(图6中D)。
使用XPS进一步研究了元素组成和价态，如图6中E所示，在102.4eV，152.1eV，285eV，400eV，531eV处的峰分别对应S2p，Si2s，C1s，N1s和O1s，这表明硅点由Si、C、N和O元素组成。
请参阅图7表示为微波法合成的硅点的C1、N1、O1和Si2p示意图。使用高分辨XPS谱图进行元素价态分析，如图7中所示，高分辨率的Si2p峰显示，在硅点中存在Si-O键(102.36eV)；C1s的XPS谱可以有效地分解成三个不同的峰，分别为284.84eV(C-C)、286.3eV(C-N/C-O)和288.52eV(C＝O)；图7中B中的N1s峰可分解为位于399.17eV和400.97eV处的两个不同组分，分别对应为C＝N-C和C-N；O1s峰分解成了C＝O(530.9eV)、Si-O(532.17eV)和C-O(533.59eV)。通过FTIR和XPS的结果，总的来说，Si-O、N-H、O-H、C＝N、C-N、C＝O、C-O等化学键可能存在于硅点中。用zeta电位研究了硅点的表面，表面电位为0.308eV，这可能是由于表面上存在氨基基团(图6中F)。
请参阅图8，表示为用微波合成法和水浴合成法合成的硅点的(A)XRD光谱、(B)XPS光谱、(C)FTIR光谱和(D)Zeta电位分析示意图。将水浴法制备的与微波辅助法制备的硅点的晶格、组成和表面进行了比较，XRD和FTIR的变化不大(图8)，说明这两个硅点具有相似的晶格和化学价。
请参阅图9，表示为水浴法合成的硅点的C1、N1、O1和Si2p的分析示意图。在XPS中，C1s、O1s和Si2p变化不大，而N1s有一点变化(图9)，水浴法制备的硅点中存在R4N+基团，这可能是由于氨基的氧化所致。此外，水浴法制备的硅点的表面电位(4.86eV)大于微波辅助法制备的硅点，这可能是由于水浴法制备的硅点中存在更多的氨基。
请参阅图10，为本实施例合成的硅点的稳定性研究示意图。其中图10中(A)表示硅点、CdTe量子点和CdTeSe量子点的光稳定性比较；(B)表示不同pH条件下硅点的荧光强度；(C)表示为不同离子、氨基酸和生物小分子对硅点荧光强度的干扰；(D)表示为硅点存储在4℃不同时间下的的荧光强度。
进一步地，以蓝色CdZnSe量子点和红色CdTe量子点作为对照，分析了硅点的光稳定性。在405nm连续照射60min后，硅点的荧光强度仍保持在80％，光稳定性高于其他两种量子点，说明硅点具有良好的光稳定性(图10中A)。之后检测硅点的pH稳定性，其荧光在pH5.0-11.0范围内基本没有变化(图10中B)。较宽的pH稳定性范围可能是由于硅点的表面存在中性的-NH2。进一步研究了一些分子和离子对硅点的影响，大部分金属离子和氨基酸对硅点的荧光无明显干扰，表明硅点具有良好的化学稳定性(图10中C)。最后，硅点在4℃下保存20天，荧光几乎没有下降，这证明了硅点保存的稳定性(图10中D)。以上结果表明，硅点具有良好的光学、化学稳定性和在复杂体系中分析的巨大应用潜力。
本申请上述实施例提供的荧光硅点的合成方法，以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)作为硅源，葡萄糖作为还原剂，通过微波辅助的荧光硅点，合成的硅点荧光强度是水浴法制备的硅点的17倍，具有较高的量子产率、良好的光稳定性、pH稳定性、良好的保存稳定性。
实施例2
本申请上述实施例提供的所述的荧光硅点可在人血清中ALP检测中的应用。
在本实施例中，临床样本取自深圳大学第一附属医院，然后将样品以10000rpm离心10min，获得人血清，稀释至1％，减弱血清的干扰。将不同浓度的ALP加入到人血清中，以Tris缓冲液中检测ALP为对照，并按照与ALP检测相同的程序进行分析。
在本实施例中，在最佳优化条件下进行ALP检测，在“turn-off”模式下，将不同浓度的ALP加入到含有300μM pNPP的Tris缓冲液中(浓度为20mM，pH＝9.5)，混合溶液在37℃下反应30min，然后加入5μL的硅点(终浓度为0.25mg/mL)，总体积为200μL，在405nm激发波长下采集了溶液的荧光光谱。在“turn-on”模式下，pNPP浓度为200μM，激发波长设置为302nm，通过用相同方法检测ALP。使用Lys、Try、BSA和HRP蛋白取代ALP，验证了该方法的选择性。
请参阅图11为本实施例提供的硅点对不同浓度ALP响应的荧光光谱，其中(A)为“turn on”模式下硅点对不同浓度ALP响应的荧光光谱。(B)为“turn on”模式检测ALP的标准曲线。(C)为“turn off”模式下硅点对不同浓度ALP响应的荧光光谱。(D)为“turn off”模式检测低浓度ALP的标准曲线。(E)为“turn off”模式检测高浓度ALP的标准曲线。(F)为两种ALP检测模式的比较。箭头表示相应的ALP浓度。
如图12所示，表示不同浓度(A)pNPP或(B)pNP作用下硅点的荧光光谱。在ALP水解pNPP生成pNP的反应中，pNPP在302nm处猝灭硅点的荧光激发，pNP在405nm处猝灭硅点荧光激发。因此，为了方便ALP的灵敏度检测，首先对分析系统进行了优化。
如图13所示，表示ALP检测条件的优化示意图。其中(A)表示为不同浓度pNPP作用下硅点荧光强度的变化，ALP为100U/L。(B)表示为不同pH条件下硅点荧光强度的变化，ALP为100U/L。(C)表示为不同反应时间下硅点荧光强度的变化。ALP浓度分别为5、20和100U/L。
从上图可知，硅点荧光改变值ΔF(ΔF＝F0-F，其中F0和F分别为硅点在无ALP和有ALP下的荧光强度)随着pNPP的增加而增加，ΔF在300μMpNPP时达到平衡；然后对反应pH进行了优化，ΔF在pH值为9.5时达到峰值(图13中B)；最后，确定了反应时间为30min时的ΔF达到平衡(图13中C)。在基于pNPP猝灭激发的ALP检测的“turn-on”模式下，硅点的荧光随着ALP浓度从0到500U/L的增加而增加(图11中A)。在1U/L-100U/L建立了线性关系为lgΔF＝0.8146*lgCALP–0.477(CALP代表ALP的浓度)(图11中B)，检测限为0.3U/L。在基于pNP猝灭硅点的“turn-off”模式下，随着ALP浓度从0增加到500U/L，荧光强度逐渐下降(图11中C)。在0.05U/L-5U/L与5U/L至80U/L范围内分别建立了线性关系为ΔF＝为1.716*CALP+1.473和ΔF＝15.41*lgCALP-0.6415(图11中D-E)，检出限为0.01U/L。如图11中F所示，由于IFE和PET的协同猝灭效应，“turn-off”模式的灵敏度比“turn-on”模式高30倍。
请参阅图14，其中，(A)为ALP检测的选择性，ALP浓度为50U/L；干扰蛋白浓度为500U/L。(B)为在人血清和Tris缓冲液中检测ALP的比较。
对ALP选择性检测的研究结果表明，浓度为10倍ALP的多个蛋白，包括溶菌酶(Lys)、胰蛋白酶(Try)、BSA和HRP，对硅点的荧光和ALP诱导的猝灭没有显著干扰(图5A)。之后将我们建立的方法应用于实际样品，如图5B所示，在人血清和Tris缓冲液中检测ALP得到两种线性关系是相似的，证明了该方法对真实样品的检测具有很高的可行性。
可以理解，以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上仅为本申请的较佳实施例而已，仅具体描述了本申请的技术原理，这些描述只是为了解释本申请的原理，不能以任何方式解释为对本申请保护范围的限制。基于此处解释，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进，及本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本申请的其他具体实施方式，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种荧光硅点的合成方法，其特征在于，包括下述步骤：
将葡萄糖溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷混合后溶解于ddH2O中形成混合溶液；
将所述混合溶液进行搅拌反应，得到反应产物；
将所述反应产物与乙腈混合后离心处理，弃上清，重复上述洗涤步骤；
将洗涤后的产物进行干燥处理，得到纯化的硅点晶体。
2.如权利要求1所述的荧光硅点的合成方法，其特征在于，在将葡萄糖溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷混合后溶解于ddH2O中形成混合溶液的步骤中，所述葡萄糖溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷比例为1:0.5-1:5。
3.如权利要求1所述的荧光硅点的合成方法，其特征在于，在将所述混合溶液进行搅拌反应，得到反应产物的步骤中，具体包括下述步骤：
将所述混合溶液转移到微波合成仪器中进行反应，所述微波合成器的程序设置为：预搅拌1-5min，反应温度40-80℃，反应时间4-28min。
4.如权利要求1所述的荧光硅点的合成方法，其特征在于，在将所述反应产物与乙腈混合后离心处理，弃上清，重复上述洗涤步骤的步骤中，所述反应物与乙腈体积比为1:1-1:3。
5.如权利要求1所述的荧光硅点的合成方法，其特征在于，在将洗涤后的产物进行干燥处理，得到纯化的硅点晶体的步骤中，所述干燥的温度为30-60℃，所述干燥的时间为4-12小时。
6.一种荧光硅点，其特征在于，由权利要求1至5任一项所述的荧光硅点的合成方法制备得到。
7.一种如权利要求6所述的荧光硅点在人血清中ALP检测中的应用。
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