CN110501317A - 一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，将4‑羟基苯基磷酸钠(4‑HPP)作为底物，在水溶液中，该底物分子经碱性磷酸酶的催化水解生成1,4‑苯二酚(HQ)，1,4‑苯二酚可以与后续加入的3‑(2‑氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷(DAMO)发生反应，生成绿色荧光发射的硅纳米粒子(SiNPs)。体系中的碱性磷酸酶活性越高，生成的荧光硅纳米粒子就越多，荧光强度就越大，根据检测溶液的荧光强度变化，进行碱性磷酸酶活性的定量分析检测。与现有技术相比，本发明所需试剂药品简单易得，操作方便，快速准确，为临床样品中碱性磷酸酶活性定量检测提供了一种灵敏可靠的方法。本发明的荧光检测方法，检出限为0.1mU/mL，具有高灵敏度，高选择性，宽线性范围等优点。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法。
背景技术
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP，EC 3.1.3.1)是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶，可以催化多种含磷酸酯基底物的去磷酸化过程，对于细胞生长、凋亡进程中的信号传导和细胞内调节有极其重要的作用。碱性磷酸酶是反映肝胆、骨骼等系统疾病的重要指标，当人体患有黄疽、肝癌、胆汁淤积性肝炎等疾病时，血清中的碱性磷酸酶含量将会明显升高；当发生骨折或患有骨软化症、佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松等骨胳疾病时，血清中的碱性磷酸酶含量也会升高。因此，建立灵敏高效并能在临床血液中进行检测的碱性磷酸酶活性测定方法显得尤为重要。
一直以来，许多分析化学和检测技术的研究者致力于发展性能优良的分析方法用于碱性磷酸酶活性检测。传统检测碱性磷酸酶活性的方法包括同位素标记法，操作复杂，耗时低效，且需要危害较大的放射性同位素标记物。之后，研究者又基于色谱法，比色法，化学发光法，电化学法，荧光法，表面增强共振拉曼散射等不同的分析技术创建了一系列碱性磷酸酶活性的检测新方法。其中，荧光传感技术由于其简单灵敏、实时性和在体检测等优势，一直是人们的研究重点。目前的碱性磷酸酶荧光检测方法，大多数通过繁琐的有机合成，制备出较为复杂的底物分子，通过底物分子和碱性磷酸酶酶解产物之间的荧光差别来进行检测。然而，基于商业化的简单小分子，反应生成荧光物质的过程，构建的荧光“点亮”型生物分析技术，通常操作更加简便，背景干扰更低，检测灵敏度更高，因此基于这一原理发展的碱性磷酸酶检测技术具有更好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，该检测方法所用试剂简单易得，操作方便，快速准确，灵敏度高。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
本发明提供一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，包括以下步骤：
步骤一：将4-羟基苯基磷酸钠(4-HPP)水溶液分别与不同已知活性的碱性磷酸酶(ALP)标准溶液在缓冲溶液中混合孵育，得到一系列混合溶液；
步骤二：在步骤一制备的一系列混合溶液中分别加入3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷(DAMO)水溶液，进一步混合孵育，进行荧光光谱测试；
步骤三：利用碱性磷酸酶标准溶液活性和荧光光谱强度的线性关系，绘制标准曲线；
步骤四：将4-羟基苯基磷酸钠(4-HPP)水溶液与待测碱性磷酸酶溶液在缓冲溶液中混合孵育，得到待测碱性磷酸酶混合溶液；
步骤五：在步骤四制备的待测碱性磷酸酶混合溶液中加入3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷(DAMO)水溶液，进一步混合孵育，进行荧光光谱测试，得到待测碱性磷酸酶的荧光光谱强度；
步骤六：利用步骤三的标准曲线及步骤五测得的荧光光谱强度，计算得到待测碱性磷酸酶的活性。
在上述技术方案中，优选碱性磷酸酶标准溶液的活性范围为：0～50mU/mL。
在上述技术方案中，优选步骤一和四中4-羟基苯基磷酸钠水溶液的浓度为0.1～1.5mM。
在上述技术方案中，优选步骤一和四中缓冲溶液是pH＝7.5～10.5的10～100mMTris-HCl溶液，并含有MgCl2浓度为20～500μM。
在上述技术方案中，优选步骤一和四中孵育温度为20～37℃，时间为10～90min。
在上述技术方案中，优选步骤二和五中3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷水溶液的浓度为质量分数1％～5％(g/g)。
在上述技术方案中，优选步骤二和五中孵育温度为20～37℃，时间为20～120min。
本发明的有益效果是：
本发明的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，将4-羟基苯基磷酸钠(4-HPP)作为底物，在水溶液中，该底物分子经碱性磷酸酶的催化水解生成1,4-苯二酚(HQ)，1,4-苯二酚可以与后续加入的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷(DAMO)发生反应，生成绿色荧光发射的硅纳米粒子(SiNPs)。体系中的碱性磷酸酶活性越高，生成的荧光硅纳米粒子就越多，荧光强度就越大，根据检测溶液的荧光强度变化，进行碱性磷酸酶活性的定量分析检测。与现有技术相比，本发明所需试剂药品简单易得，操作方便，快速准确，为临床样品中碱性磷酸酶活性定量检测提供了一种灵敏可靠的方法。
本发明的荧光检测方法能够对碱性磷酸酶活性进行荧光定量检测，检出限为0.1mU/mL，具有高灵敏度，高选择性，宽线性范围等优点。
本发明的荧光检测方法能够在稀释人血清样品中进行检测，因此有潜力应用于临床样品中碱性磷酸酶活性的准确快速检测。
本发明对操作人员无特殊技术要求，所需仪器普及程度较高，所需试剂均为商业化产品，所需操作简单、重复性好。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明碱性磷酸酶活性的荧光检测方法示意图。
图2为本发明利用荧光光谱检测碱性磷酸酶可行性分析图。
图3为1,4-苯二酚(HQ)与DAMO合成的荧光硅纳米粒子光谱图(A),透射电镜图(B)，傅里叶变换红外谱图(C)和X光电子能谱图(D)(其中a,b,c分别为HQ、DAMO和硅纳米粒子吸收光谱；d,e分别为硅纳米粒子的荧光激发和发射光谱)。
图4为本发明中溶液荧光光谱随碱性磷酸酶活性的变化曲线(A)及标准工作曲线(B)；控制碱性磷酸酶活性为0，0.1mU/mL，0.2mU/mL，0.3mU/mL，0.5mU/mL，0.7mU/mL，0.9mU/mL，1mU/mL，2mU/mL，3mU/mL，5mU/mL，10mU/mL，15mU/mL，20mU/mL，30mU/mL，40mU/mL，50mU/mL。
图5为本发明用于检测碱性磷酸酶活性的特异性结果图；选择的潜在干扰酶或蛋白质包括溶菌酶LZM，人血清白蛋白HSA，葡萄糖氧化酶GOx，核酸内切酶EcoR I，牛血清白蛋白BSA和胰蛋白酶Trypsin。
图6为本发明在稀释人血清样品(1％)中的碱性磷酸酶活性检测结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例与附图对本发明作进一步阐述，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。所述方法均为常规方法，所述原料均能从公开商业途径获得。
实施例1
本发明方法的原理和可行性验证
附图1为本发明的碱性磷酸酶活性荧光检测方法原理示意图。首先验证本发明的可行性，如图2所示，1,4-苯二酚HQ与DAMO的混合溶液，37℃孵育60min，用荧光分光光度计测量体系的荧光，以370nm激发，在520nm处有明显的荧光发射(f)；而4-HPP水溶液(a)在520nm附近没有荧光发射；在4-HPP溶液中单独加入DAMO(b)或者碱性磷酸酶(d)，37℃孵育60min，也没有明显的荧光；DAMO和碱性磷酸酶的混合溶液(c)孵育之后同样没有荧光；只有当4-HPP和碱性磷酸酶共同孵育后，再加入DAMO孵育才有明显的荧光(e)，其荧光发射峰位置与f几乎相同。因此，可以将4-HPP作为底物，利用碱性磷酸酶酶解产物HQ与DAMO特异性反应生成荧光产物的事实，来进行碱性磷酸酶活性的荧光检测。
实施例2
荧光硅纳米粒子的合成与性质表征
将100mg HQ溶解到95mL超纯水中，加入5mL的DAMO，混合均匀后在室温(～25℃)孵育80min，得到的粗产品经过冷冻干燥后用乙醇洗三次，转速4000r/min离心15min，去除上清并冷冻干燥后溶于超纯水放4℃冰箱待用。如图3所示，合成的硅纳米粒子有明显区别于两种初始反应物HQ和DAMO的吸收光谱，且有明显的荧光，最大荧光激发峰和发射峰分别位于370nm和520nm附近。透射电镜显示硅纳米粒子的形貌是平均粒径约70纳米的球形。另外红外光谱和X光电子能谱的测试结果也确认了荧光硅纳米粒子的存在。
实施例3
一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法
首先将225μL，2.0mM的4-HPP和405μL的超纯水加入到180μL的Tris-HCl(50mM，pH8.5，含有50μM MgCl2)缓冲溶液中，之后将配制好的4-HPP混合溶液分别与90μL的不同活性碱性磷酸酶标准溶液(0，0.1mU/mL，0.2mU/mL，0.3mU/mL，0.5mU/mL，0.7mU/mL，0.9mU/mL，1mU/mL，2mU/mL，3mU/mL，5mU/mL，10mU/mL，15mU/mL，20mU/mL，30mU/mL，40mU/mL，50mU/mL)、及待测碱性磷酸酶溶液，在37℃酶解孵育60min，之后加入100μL的DAMO(50％水溶液)，得到的混合溶液在室温(～25℃)继续荧光反应孵育80min，之后用荧光分光光度计测量溶液的荧光。如图4所示，所得溶液的荧光发射光谱强度随碱性磷酸酶活性的增强而上升，利用520nm处的相对荧光强度随碱性磷酸酶活性的变化绘制标准曲线。在碱性磷酸酶活性范围0.7-50mU/mL之间，拟合的线性方程为I＝-4.25+19.12CALP(mU/mL)，R2＝0.996。
利用线性关系，根据待检测溶液的荧光强度值可以计算得到待测溶液碱性磷酸酶的活性值。该检测方法能特异性检出0.1mU/mL的碱性磷酸酶，能够满足测试血清中碱性磷酸酶含量的需求。
实施例4
一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法的抗干扰性
为了检测本发明方法检测碱性磷酸酶的抗干扰能力，选择的潜在干扰酶或蛋白质包括溶菌酶LZM，人血清白蛋白HSA，葡萄糖氧化酶GOx，核酸内切酶EcoR I，牛血清白蛋白BSA和胰蛋白酶Trypsin。抗干扰能力的测试与实施例3中的碱性磷酸酶活性检测方法基本相同，不同之处在于用上述潜在干扰酶或蛋白质代替实施例3中的待测碱性磷酸酶溶液，其中，潜在干扰酶或蛋白质的终浓度是碱性磷酸酶的10倍，结果如图5所示，不论这些潜在干扰酶或蛋白质单独存在时或者与碱性磷酸酶共存时，都不影响体系的荧光，本发明方法对碱性磷酸酶活性的检测抗干扰能力很好。
实施例5
一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法检测人血清中的碱性磷酸酶活性
正常人的临床血清样本由吉林大学第二医院提供，血清中的碱性磷酸酶活性检测方法与实施例3中的碱性磷酸酶活性检测方法基本相同，不同之处在于用添加了碱性磷酸酶的稀释临床血清样品代替实施例3中的待测碱性磷酸酶溶液。如图6所示，稀释临床血清样品中的检测结果表明，本发明的一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法能够在稀释的血清样品中进行检测，因此可用于临床样品中碱性磷酸酶活性的灵敏准确快速检测。
还需要说明的是，本发明的具体实施例只是用来示例性说明，并不以任何方式限定本发明的保护范围，本领域的相关技术人员可以根据上述一些说明加以改进或变化，但所有这些改进和变化都应属于本发明权利要求的保护范围。
Claims (7)
1.一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将4-羟基苯基磷酸钠水溶液分别与不同已知活性的碱性磷酸酶标准溶液在缓冲溶液中混合孵育，得到一系列混合溶液；
步骤二：在步骤一制备的一系列混合溶液中分别加入3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷水溶液，进一步混合孵育，进行荧光光谱测试；
步骤三：利用碱性磷酸酶标准溶液活性和荧光光谱强度的线性关系，绘制标准曲线；
步骤四：将4-羟基苯基磷酸钠水溶液与待测碱性磷酸酶溶液在缓冲溶液中混合孵育，得到待测碱性磷酸酶混合溶液；
步骤五：在步骤四制备的待测碱性磷酸酶混合溶液中加入3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷水溶液，进一步混合孵育，进行荧光光谱测试，得到待测碱性磷酸酶的荧光光谱强度；
步骤六：利用步骤三的标准曲线及步骤五测得的荧光光谱强度，计算得到待测碱性磷酸酶的活性。
2.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，其特征在于，碱性磷酸酶标准溶液的活性范围为：0～50mU/mL。
3.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，其特征在于，步骤一和四中4-羟基苯基磷酸钠水溶液的浓度为0.1～1.5mM。
4.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，其特征在于，步骤一和四中缓冲溶液是pH＝7.5～10.5的10～100mM Tris-HCl溶液，并含有MgCl2浓度为20～500μM。
5.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，其特征在于，步骤一和四中孵育温度为20～37℃，时间为10～90min。
6.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，其特征在于，步骤二和五中3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷水溶液的浓度为质量分数1％～5％。
7.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，其特征在于，步骤二和五中孵育温度为20～37℃，时间为20～120min。
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