CN109580958A - 一种心肌肌钙蛋白i的荧光和比色双信号检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
一种心肌肌钙蛋白i的荧光和比色双信号检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109580958A CN109580958A CN201811480062.1A CN201811480062A CN109580958A CN 109580958 A CN109580958 A CN 109580958A CN 201811480062 A CN201811480062 A CN 201811480062A CN 109580958 A CN109580958 A CN 109580958A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ctni
- solution
- liquid
- antibody
- hole
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 102000013394 Troponin I Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 108010065729 Troponin I Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 title claims abstract description 26
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 title claims description 13
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 101100537532 Rattus norvegicus Tnni3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 150000005204 hydroxybenzenes Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 83
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 59
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 39
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 29
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 19
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 14
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 14
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 13
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 11
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 10
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 10
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 9
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 9
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 7
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 7
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims description 7
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 claims description 6
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 claims description 5
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 3
- -1 phosphoric acid hydrogen Chemical class 0.000 claims description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Substances OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 abstract description 6
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 abstract description 4
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 3
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 abstract description 3
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 229940043237 diethanolamine Drugs 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- ZZVUWRFHKOJYTH-UHFFFAOYSA-N diphenhydramine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(OCCN(C)C)C1=CC=CC=C1 ZZVUWRFHKOJYTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003291 dopaminomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
- G01N21/33—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using ultraviolet light
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/32—Cardiovascular disorders
- G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction
Abstract
本发明提供一种心肌肌钙蛋白I荧光和比色检测试剂盒及检测方法，属于免疫分析领域。该试剂盒包括心肌肌钙蛋白I、cTnI捕获抗体、cTnI检测一抗、碱性磷酸酶标记的二抗、间羟基苯磷酸二钠盐、多巴胺。该试剂盒是通过在孔酶标板上依次吸附cTnI捕获抗体、cTnI和检测一抗形成类似三明治的结构，加入的碱性磷酸酶标记的二抗特异性地与检测一抗结合，最后加入底物间羟基苯磷酸二钠盐，在碱性磷酸酶的脱磷酸作用下生成间苯二酚，与多巴胺发生反应生成具有强紫外吸收和荧光发射的基团，进而实现对cTnI的定量检测。该试剂盒的检测结果与商品化的cTnI ELISA试剂盒的检测结果相符，可通过荧光激活和显色反应灵敏检测cTnI。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析领域，具体涉及一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒及检测方法。
背景技术
酶联免疫吸附分析(ELISA)基于抗原抗体特异性识别作用，并以酶作为信号输出单元而实现抗原高灵敏检测的技术，是生物样品分析中的一个重要的免疫方法。酶广泛地作为免疫分析中的标记物，基于酶高效的生物催化活性，一个酶分子可以在短时间内将大量的酶底物转化成产物，从而发挥信号放大的作用，这为分析物的灵敏检测奠定基础。碱性磷酸酶(ALP)是一种磷酸水解酶，该酶广泛分布于人体组织和体液。在碱性环境中，ALP能水解磷酸单酯化合物，切断底物分子中的磷酸酯键，从而脱掉底物中的磷酸基团。该酶的用途广泛，它可以作为某些疾病的标志物，包括骨病，糖尿病，乳腺癌和前列腺癌和肝炎。此外，ALP由于其较高的催化活性、较好的稳定性、易于和抗体偶联等特点，也经常作为ELISA的信号输出酶。
生物标志物可客观测定和评价普通生理、病理或治疗过程中的某种特征性，指示不同的疾病导致的致病过程，生物标志物的监测是基础和临床研究中的重要手段。检查一种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到重要作用。心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心肌梗死患者血清中的一个重要标志物，正常成年人血清中cTnI浓度通常低于0.2ng/mL，而心肌梗死爆发后，患者血清中cTnI含量在3-6小时内上升至50ng/mL，最后升至550ng/mL左右。因此，cTnI的准确定量对心肌梗死疾病的诊断和监控具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种心肌肌钙蛋白I荧光和比色双信号检测试剂盒及检测方法，该检测方法准确方便，具有普适性。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
本发明首先提供一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，包括：
心肌肌钙蛋白I(cTnI)、cTnI捕获抗体、cTnI检测一抗、碱性磷酸酶标记的二抗、包被缓冲液、洗涤液、抗体稀释液、样品稀释液、间羟基苯磷酸二钠盐(m-HPP)、多巴胺、封闭液、二乙醇胺(DEA)缓冲液和MgCl2溶液。
在上述技术方案中，所述的包被缓冲液是pH＝8.0～9.6的10～100mM碳酸盐溶液。
在上述技术方案中，所述的洗涤液是pH＝7.4的含有0.01～0.5％Tween-20和10～100mM磷酸根/磷酸氢根/磷酸二氢根的混合溶液。
在上述技术方案中，所述的抗体稀释液是pH＝7.4的含有0.01～0.2％Tween-20和0.1-2％牛血清蛋白的缓冲溶液；所述的样品稀释液是含有0.1-2％牛血清蛋白的缓冲溶液。
在上述技术方案中，所述的封闭液是用抗体稀释液溶解的牛血清蛋白浓度为0.1～5％的溶液。
在上述技术方案中，所述的间羟基苯磷酸二钠盐(m-HPP)的浓度为50～500μM，多巴胺的浓度为20～200μM。
在上述技术方案中，所述的DEA缓冲液是浓度为10～200mM、pH 9.5～12.0的溶液，所述的MgCl2溶液的浓度是0.25～5mM。
本发明还提供一种心肌肌钙蛋白I的检测方法，包括以下步骤：
步骤一：将cTnI捕获抗体用包被缓冲液稀释后加入酶标板后进行孵育，然后弃去孔内液体并用洗涤液清洗，再向孔内加入封闭液，孵育后弃去孔内液体，再用洗涤液清洗，之后加入用样品稀释液稀释的不同浓度的的cTnI标准溶液并进行孵育，接着弃去孔内液体后用洗涤液清洗，加入用抗体稀释液稀释后的cTnI检测一抗接着进行孵育后，弃去孔内液体后并用洗涤液清洗，加入用抗体稀释液稀释后的碱性磷酸酶标记的二抗，孵育后弃去孔内液体后并用洗涤液清洗；
步骤二：在孔内加入m-HPP溶液，MgCl2溶液，DEA缓冲溶液，孵育后再加入多巴胺溶液，孵育后进行荧光和紫外光谱测试。
在上述技术方案中，所述心肌肌钙蛋白I的检测方法具体包括以下步骤：
步骤一：将cTnI捕获抗体用包被缓冲液稀释200倍，取100μL加入酶标板后在4℃孵育过夜或者室温孵育2.5h，弃去孔内液体并用300μL洗涤液洗3次，在孔内加入200μL封闭液，37℃孵育1h后弃去孔内液体，再用300μL洗涤液洗3次，之后加入不同浓度的用样品稀释液稀释后的cTnI标准溶液并在37℃孵育1h，弃去孔内液体后用300μL洗涤液洗3次，加入100μL用抗体稀释液稀释后的cTnI检测一抗，37℃孵育1h后弃去孔内液体后并用洗涤液洗涤3次，加入100μL用抗体稀释液稀释后的碱性磷酸酶标记的二抗，37℃孵育1h后弃去孔内液体后并用洗涤液洗涤3次；
步骤二：在孔内加入30μL 1mM m-HPP溶液，30μL MgCl2溶液，150μL DEA缓冲溶液，37℃孵育60min后再加入30μL 0.5mM多巴胺溶液，37℃孵育20min后进行荧光(激发波长415nm)和紫外光谱测试。
在上述技术方案中，步骤一中的cTnI捕获抗体的浓度为1～50μg/mL，cTnI检测一抗的浓度为0.5～20μg/mL，碱性磷酸酶标记的二抗的浓度为0.01～1μg/mL。
本发明的有益效果
本发明提供一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，该试剂盒是基于碱性磷酸酶引发的原位荧光和显色反应检测心肌梗死标志物cTnI，其原理是基于抗原抗体特异性作用和酶的信号放大效应，通过在酶标板上依次吸附捕获抗体、cTnI和cTnI检测一抗来形成类似三明治的结构，后续加入的碱性磷酸酶标记的二抗特异性地与cTnI检测一抗结合，最后加入底物m-HPP，在碱性磷酸酶的脱磷酸作用下，m-HPP被脱磷酸化生成间苯二酚阴离子，与后续加入的多巴胺发生反应生成具有强紫外吸收和荧光发射的基团，体系的吸光度和荧光强度与碱性磷酸酶的浓度成正相关，而cTnI浓度与碱性磷酸酶浓度正相关，进而实现对cTnI的定量检测。碱性磷酸酶作为连接cTnI浓度和光谱信号的桥梁，利用碱性磷酸酶引发的反应作为输出信号，将该试剂盒用于血清基质中cTnI含量的检测，结果表明该试剂盒的检测结果正好与基于pNPP的比色ELISA方法相符，该试剂盒可通过荧光激活和显色反应而检测cTnI。同时，该方法具有普适性，只需根据不同的靶标抗原更换相应的捕获抗体和检测一抗，就可将其应用拓展到其他癌症标志物的检测。
本发明提供的cTnI检测方法，该方法是以碱性磷酸酶作为ELISA信号输出酶来提供一种荧光的信号输出模式，碱性磷酸酶具有的脱磷酸作用将m-HPP转变成间苯二酚，然后加入多巴胺溶液，间苯二酚和多巴胺能发生反应产生具有强吸收和荧光发射的基团，最终通过荧光和显色反应来检测肿瘤标志物cTnI。
附图说明
图1为本发明实施例1基于碱性磷酸酶引发的原位荧光和显色反应检测心肌梗死标志物cTnI的酶联免疫方法示意图。
图2为本发明实施例1-2中的ELISA的荧光强度和紫外吸收强度和cTnI浓度的曲线关系图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做以详细说明。
本发明提供一种心肌肌钙蛋白I荧光检测试剂盒，包括：
心肌肌钙蛋白I(cTnI)、cTnI捕获抗体、cTnI检测一抗、碱性磷酸酶标记的二抗、包被缓冲液、洗涤液、抗体稀释液、样品稀释液、间羟基苯磷酸二钠盐(m-HPP)、多巴胺、封闭液、碳酸钠溶液、二乙醇胺(DEA)缓冲液和MgCl2溶液。
本发明所述的cTnI捕获抗体、cTnI检测一抗、碱性磷酸酶标记的二抗的来源为商购，所述的cTnI捕获抗体优选为cTnI的鼠单抗，cTnI检测一抗优选为cTnI的兔多抗，碱性磷酸酶标记的二抗优选为碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG。
按照本发明，所述的包被缓冲液优选是pH＝8.0～9.6的10～100mM碳酸盐溶液；所述的洗涤液优选是pH＝7.4的含有0.01～0.5％Tween-20和10～100mM磷酸根/磷酸氢根/磷酸二氢根的混合溶液；所述的抗体稀释液优选是pH＝7.4的含有0.05～0.2％Tween-20和0.1-2％牛血清蛋白的缓冲溶液；所述的样品稀释液优选是含有0.1-2％牛血清蛋白的缓冲溶液；所述的封闭液优选是用抗体稀释液溶解的牛血清蛋白浓度为0.1～5％的溶液；所述的DEA缓冲液优选是浓度为10～200mM、pH 9.5～12.0的溶液，所述的MgCl2溶液的浓度优选为0.25～5mM。
本发明还提供一种心肌肌钙蛋白I的检测方法，具体包括以下步骤：
步骤一：将cTnI捕获抗体用包被缓冲液稀释200倍，取100μL加入酶标板后在4℃孵育过夜或者室温孵育2.5h，弃去孔内液体并用300μL洗涤液洗3次，在孔内加入200μL封闭液，37℃孵育1h后弃去孔内液体，再用300μL洗涤液洗3次，之后加入不同浓度的用样品稀释液稀释后的cTnI标准溶液并在37℃孵育1h，弃去孔内液体后用300μL洗涤液洗3次，加入100μL用抗体稀释液稀释后的cTnI检测一抗，37℃孵育1h后弃去孔内液体后并用洗涤液洗涤3次，加入100μL用抗体稀释液稀释后的碱性磷酸酶标记的二抗，37℃孵育1h后弃去孔内液体后并用洗涤液洗涤3次；
步骤二：在孔内加入30μL 1mM m-HPP溶液，30μL MgCl2溶液，150μL DEA缓冲溶液，37℃孵育60min后依次加入30μL 0.5mM多巴胺溶液，37℃孵育20min后进行荧光和紫外光谱测试。
按照本发明，所述的步骤一中的cTnI捕获抗体的浓度优选为1～50μg/mL，cTnI检测一抗的浓度优选为0.5～20μg/mL，碱性磷酸酶标记的二抗的浓度优选为0.01～1μg/mL。
上述检测方法中：所述的包被缓冲液优选是pH＝8.0～9.6的10～100mM碳酸盐溶液；所述的洗涤液优选是pH＝7.4的含有0.01～0.5％Tween-20和10～100mM磷酸根/磷酸氢根/磷酸二氢根的混合溶液；所述的抗体稀释液优选是pH＝7.4的含有0.01～0.2％Tween-20和0.1-2％牛血清蛋白的缓冲溶液；所述的样品稀释液是优选含有0.1-1％牛血清蛋白的缓冲溶液；所述的封闭液优选是用抗体稀释液溶解的牛血清蛋白浓度为0.1～5％的溶液；所述的DEA缓冲液是优选浓度为10～200mM、pH 10.5的溶液；所述的MgCl2溶液的浓度优选为0.25～5mM；所述的间羟基苯磷酸二钠盐(m-HPP)浓度优选为50～500μM，多巴胺浓度优选为20～200μM。
下面的实施案例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。需要说明的是，实施例中涉及到的原料均为商购获得。
实施例1
夹心式ELISA操作步骤：
首先，选用鼠单抗作为cTnI的捕获抗体，用pH＝9.0的50mM碳酸盐溶液稀释至5μg/mL后，取100μL加入酶标板后在4℃静置包被过夜。弃去孔内液体并用300μL洗涤液(pH＝7.4的含有0.05Tween-20和20mM磷酸根/磷酸氢根/磷酸二氢根的混合溶液)清洗三次并拍干，在孔内加入200μL 1％牛血清蛋白溶液，37℃封闭1h后弃去孔内液体，再用300μL洗涤液洗涤，之后加入用pH＝7.4的含有0.1％牛血清蛋白的磷酸盐缓冲溶液稀释后的100μL不同浓度cTnI标准溶液(0,0.125,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0ng/mL)并在37℃孵育1h，弃去孔内液体后用300μL洗涤液清洗酶标板。加入100μL用pH＝7.4的含有0.1％Tween-20和0.5％牛血清蛋白的磷酸盐缓冲溶液稀释后的兔多抗(抗cTnI，1μg/mL)，37℃孵育1h后弃去孔内液体后并用洗涤液清洗。加入用pH＝7.4的含有0.1％Tween-20和0.5％牛血清蛋白的磷酸盐缓冲溶液稀释后的100μL碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗(200ng/mL)，37℃孵育1h后弃去孔内液体后并用洗涤液清洗。此夹心式ELISA方法的模型示意图如图1所示。
实施例2
碱性磷酸酶引发的原位荧光和显色反应
在实施例1中得到的酶标板孔内加入30μL 1mM m-HPP溶液，30μL 0.25mM MgCl2溶液，150μL 20mM DEA缓冲溶液(pH＝10.5)，37℃孵育60min后依次加入30μL 0.5mM多巴胺溶液，37℃孵育20min后进行荧光和紫外光谱测试。
图2为本发明实施例1，2中的夹心式ELISA体系的荧光发射和紫外吸收信号随cTnI浓度变化的曲线关系图，其中图2(A)(C)分别为该ELISA体系的荧光发射光谱(激发波长为415nm)和紫外吸收光谱随cTnI浓度增加的变化曲线图；图2(B)(D)分别为460nm处的荧光发射强度(I460)和420nm处的吸光度(A420)随cTnI浓度的线性响应关系。图2的实验结果说明，随着cTnI浓度的升高(0～8.0ng/mL)，体系荧光强度I460和吸光度A420与cTnI浓度在0.125-8.0ng/mL之间呈现较好的线性关系，拟合的线性方程分别为I460＝201.0+28.2CcTnI(ng/mL)，R2＝0.951；A420＝0.01+0.0015CcTnI,R2＝0.978。该方法能特异性检出0.03ng/mL的cTnI，能够满足测试血清中cTnI含量的需求。
实施例3
血清基质中cTnI含量检测：
正常人的临床血清样本由吉林大学第二医院提供，血清的夹心式ELISA方法与实施例1，2中的cTnI测定方法基本相同，不同之处在于用添加了cTnI的稀释临床血清样品代替实施例1的cTnI标准溶液。同时以商品化的cTnI ELISA检测试剂盒(TMB-HRP)的方法作为对照。
如表1所示，血清中cTnI含量的检测结果表明，本发明试剂盒的检测结果和商品化的cTnI ELISA试剂盒的检测结果相当，表明本发明的试剂盒检测结果可靠。
表1.血清中的cTnI检测结果(mean±SD；n＝3).
表1中a比色模式检测结果，b荧光模式检测结果，c商品化的TMB-HRP ELISA检测结果(ng/mL)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，其特征在于，包括：
心肌肌钙蛋白I、cTnI捕获抗体、cTnI检测一抗、碱性磷酸酶标记的二抗、包被缓冲液、洗涤液、抗体稀释液、样品稀释液、间羟基苯磷酸二钠盐、多巴胺、封闭液、二乙醇胺缓冲液和MgCl2溶液。
2.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，其特征在于，所述的包被缓冲液是pH＝8.0～9.6的10～100mM碳酸盐溶液。
3.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液是pH＝7.4的含有0.01～0.5％Tween-20和10～100mM磷酸根/磷酸氢根/磷酸二氢根的混合溶液。
4.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，其特征在于，所述的抗体稀释液是pH＝7.4的含有0.01～0.2％Tween-20和0.1-2％牛血清蛋白的缓冲溶液；所述的样品稀释液是含有0.1-2％牛血清蛋白的缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，其特征在于，所述的封闭液是用抗体稀释液溶解的牛血清蛋白浓度为0.1～5％的溶液。
6.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，其特征在于，所述的间羟基苯磷酸二钠盐(m-HPP)的浓度为50～500μM，多巴胺的浓度为20～200μM。
7.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，其特征在于，所述的DEA缓冲液是浓度为10～200mM、pH 9.5～12.0的溶液，所述的MgCl2溶液的浓度是0.25～5mM。
8.如权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将cTnI捕获抗体用包被缓冲液稀释后加入酶标板后进行孵育，然后弃去孔内液体并用洗涤液清洗，再向孔内加入封闭液，孵育后弃去孔内液体，再用洗涤液清洗，之后加入用样品稀释液稀释的不同浓度的的cTnI标准溶液并进行孵育，接着弃去孔内液体后用洗涤液清洗，加入用抗体稀释液稀释后的cTnI检测一抗接着进行孵育后，弃去孔内液体后并用洗涤液清洗，加入用抗体稀释液稀释后的碱性磷酸酶标记的二抗，孵育后弃去孔内液体后并用洗涤液清洗；
步骤二：在孔内加入m-HPP溶液，MgCl2溶液，DEA缓冲溶液，孵育后再加入多巴胺溶液，孵育后进行荧光和紫外光谱测试。
9.根据权利要求8所述的一种心肌肌钙蛋白I的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤一：将cTnI捕获抗体用包被缓冲液稀释200倍，取100μL加入酶标板后在4℃孵育过夜或者室温孵育2.5h，弃去孔内液体并用300μL洗涤液洗3次，在孔内加入200μL封闭液，37℃孵育1h后弃去孔内液体，再用300μL洗涤液洗3次，之后加入不同浓度的用样品稀释液稀释后的cTnI标准溶液并在37℃孵育1h，弃去孔内液体后用300μL洗涤液洗3次，加入100μL用抗体稀释液稀释后的cTnI检测一抗，37℃孵育1h后弃去孔内液体后并用洗涤液洗涤3次，加入100μL用抗体稀释液稀释后的碱性磷酸酶标记的二抗，37℃孵育1h后弃去孔内液体后并用洗涤液洗涤3次；
步骤二：在孔内加入30μL 1mM m-HPP溶液，30μL MgCl2溶液，150μL DEA缓冲溶液，37℃孵育60min后再加入30μL 0.5mM多巴胺溶液，37℃孵育20min后进行荧光(激发波长415nm)和紫外光谱测试。
10.根据权利要求9所述的一种心肌肌钙蛋白I的检测方法，其特征在于，步骤一中的cTnI捕获抗体的浓度为1～50μg/mL，cTnI检测一抗的浓度为0.5～20μg/mL，碱性磷酸酶标记的二抗的浓度为0.01～1μg/mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811480062.1A CN109580958B (zh) | 2018-12-05 | 2018-12-05 | 一种心肌肌钙蛋白i的荧光和比色双信号检测试剂盒及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811480062.1A CN109580958B (zh) | 2018-12-05 | 2018-12-05 | 一种心肌肌钙蛋白i的荧光和比色双信号检测试剂盒及检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109580958A true CN109580958A (zh) | 2019-04-05 |
| CN109580958B CN109580958B (zh) | 2022-02-01 |
Family
ID=65927246
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811480062.1A Active CN109580958B (zh) | 2018-12-05 | 2018-12-05 | 一种心肌肌钙蛋白i的荧光和比色双信号检测试剂盒及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109580958B (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110501318A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-11-26 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法 |
| CN110501317A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-11-26 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法 |
| CN112067823A (zh) * | 2020-09-14 | 2020-12-11 | 华南农业大学 | 一种鸡心肌肌钙蛋白i双抗体夹心elisa检测方法的建立 |
| CN112285346A (zh) * | 2020-07-25 | 2021-01-29 | 四川大学华西医院 | 基于量子点选择性阳离子交换反应的HIV p24高灵敏检测方法 |
| CN113406330A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-09-17 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 一种用于检测诺氟沙星的试剂盒及检测方法 |
| CN113607702A (zh) * | 2021-07-21 | 2021-11-05 | 南京工业大学 | 一种基于锰离子诱导的比率型荧光反应检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白活性的方法和应用 |
| CN113702630A (zh) * | 2021-07-08 | 2021-11-26 | 南京工业大学 | 一种铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白i型的方法和应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5840963A (en) * | 1997-05-13 | 1998-11-24 | Lumigen, Inc. | Chemiluminescent reactions using dihydroxyaromatic compounds and heterocyclic enol phosphates |
| CN104991074A (zh) * | 2015-06-23 | 2015-10-21 | 江南大学 | 一种基于金纳米簇的荧光增强型甲胎蛋白免疫测定方法 |
| CN106753341A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-05-31 | 湘潭大学 | 一种近红外碱性磷酸酶荧光探针的制备方法和应用 |
| CN107084966A (zh) * | 2017-06-14 | 2017-08-22 | 北京理工大学 | 一种心肌肌钙蛋白i的高灵敏定量检测方法 |
| CN107894503A (zh) * | 2017-09-28 | 2018-04-10 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种甲胎蛋白检测试剂盒及其检测方法 |
| WO2018081757A1 (en) * | 2016-10-28 | 2018-05-03 | University Of Washington | Rapid polymerization of polyphenols |
| CN108410449A (zh) * | 2018-01-31 | 2018-08-17 | 兰州大学 | 一种检测碱性磷酸酶的水溶性荧光硅纳米颗粒的制备及其应用 |
-
2018
- 2018-12-05 CN CN201811480062.1A patent/CN109580958B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5840963A (en) * | 1997-05-13 | 1998-11-24 | Lumigen, Inc. | Chemiluminescent reactions using dihydroxyaromatic compounds and heterocyclic enol phosphates |
| CN104991074A (zh) * | 2015-06-23 | 2015-10-21 | 江南大学 | 一种基于金纳米簇的荧光增强型甲胎蛋白免疫测定方法 |
| WO2018081757A1 (en) * | 2016-10-28 | 2018-05-03 | University Of Washington | Rapid polymerization of polyphenols |
| CN106753341A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-05-31 | 湘潭大学 | 一种近红外碱性磷酸酶荧光探针的制备方法和应用 |
| CN107084966A (zh) * | 2017-06-14 | 2017-08-22 | 北京理工大学 | 一种心肌肌钙蛋白i的高灵敏定量检测方法 |
| CN107894503A (zh) * | 2017-09-28 | 2018-04-10 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种甲胎蛋白检测试剂盒及其检测方法 |
| CN108410449A (zh) * | 2018-01-31 | 2018-08-17 | 兰州大学 | 一种检测碱性磷酸酶的水溶性荧光硅纳米颗粒的制备及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JIAHUI ZHAO ET AL.: "An Enzyme Cascade-Triggered Fluorogenic and Chromogenic Reaction Applied in Enzyme Activity Assay and Immunoassay", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110501318A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-11-26 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法 |
| CN110501317A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-11-26 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法 |
| CN110501318B (zh) * | 2019-08-27 | 2020-11-13 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法 |
| CN110501317B (zh) * | 2019-08-27 | 2020-11-17 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法 |
| CN112285346A (zh) * | 2020-07-25 | 2021-01-29 | 四川大学华西医院 | 基于量子点选择性阳离子交换反应的HIV p24高灵敏检测方法 |
| CN112285346B (zh) * | 2020-07-25 | 2024-02-13 | 四川大学华西医院 | 基于量子点选择性阳离子交换反应的HIV p24高灵敏检测方法 |
| CN112067823A (zh) * | 2020-09-14 | 2020-12-11 | 华南农业大学 | 一种鸡心肌肌钙蛋白i双抗体夹心elisa检测方法的建立 |
| CN113406330A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-09-17 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 一种用于检测诺氟沙星的试剂盒及检测方法 |
| CN113406330B (zh) * | 2021-06-30 | 2024-01-02 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 一种用于检测诺氟沙星的试剂盒及检测方法 |
| CN113702630A (zh) * | 2021-07-08 | 2021-11-26 | 南京工业大学 | 一种铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白i型的方法和应用 |
| CN113702630B (zh) * | 2021-07-08 | 2023-10-03 | 南京工业大学 | 一种铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白i型的方法和应用 |
| CN113607702A (zh) * | 2021-07-21 | 2021-11-05 | 南京工业大学 | 一种基于锰离子诱导的比率型荧光反应检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白活性的方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109580958B (zh) | 2022-02-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109580958A (zh) | 一种心肌肌钙蛋白i的荧光和比色双信号检测试剂盒及检测方法 | |
| CN101178405B (zh) | 肿瘤相关抗原50化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法 | |
| CN108333357A (zh) | 一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测ck-mb试剂盒 | |
| CN101377501A (zh) | 细胞角蛋白19片段化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 | |
| CN109212219A (zh) | 一种甲胎蛋白荧光检测试剂盒及检测方法 | |
| CN102226808A (zh) | 胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN107727864A (zh) | 一种检测血清中异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片、试剂盒及其制备方法 | |
| US10921322B2 (en) | Methods for detecting a marker for active tuberculosis | |
| CN109307765A (zh) | 胃蛋白酶原ⅱ检测试剂盒 | |
| CN101363861A (zh) | 乙型肝炎病毒表面抗原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 | |
| CN111273017A (zh) | 一种快速检测新型冠状病毒的荧光免疫层析试剂盒 | |
| CN102043058A (zh) | 用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺的检测试剂盒 | |
| CN101377496A (zh) | 一种检测甲状腺过氧化物酶自身抗体的化学发光免疫分析测定试剂盒 | |
| CN103149359A (zh) | 一种时间分辨荧光法综合检测胰腺癌试剂盒及其应用 | |
| CN101373188A (zh) | 肿瘤相关抗原19-9化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 | |
| CN106501529A (zh) | 一种检测原癌基因her2的化学发光酶免疫检测试剂盒及应用 | |
| CN101377498A (zh) | 前列腺特异性抗原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 | |
| CN106645065A (zh) | 一种特异性识别及灵敏检测人血清蛋白的荧光试剂合成方法及应用 | |
| EP3640644B1 (en) | Target marker gp73 for detecting steatohepatitis and detection application method | |
| CN105758832A (zh) | 一种基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原分析试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN103116025A (zh) | 一种时间分辨荧光法综合检测胃癌试剂盒及其应用 | |
| CN106771259A (zh) | 用于检测人血清中Pygo2蛋白含量的ELISA试剂盒、使用方法及用途 | |
| CN107894503A (zh) | 一种甲胎蛋白检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN102095868A (zh) | 甲胎蛋白化学发光定量检测试剂盒 | |
| CN102818892A (zh) | 一种前列腺特异性抗原检测试剂盒及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |