CN112285346A - 基于量子点选择性阳离子交换反应的HIV p24高灵敏检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于量子点选择性阳离子交换反应的HIV p24高灵敏检测方法，包括采用识别抗体、待测样品和检测抗体制备得到一抗‑p24‑检测抗体‑生物素三明治夹心复合物；将一抗‑p24‑检测抗体‑生物素三明治夹心复合物与链霉亲和素‑碱性磷酸酶进行连接，得到一抗‑p24‑检测抗体‑ALP复合物；向一抗‑p24‑检测抗体‑ALP复合物中加入维生素C‑2‑磷酸盐孵育，再加入硝酸银溶液进行反应，加入量子点原液进行反应，对荧光信号进行分析得到检测结果。本发明引入发光量子点选择性阳离子交换反应信号放大技术，提高分析灵敏度；发光量子点颜色在可见光范围内，易于实现人眼可视化分析；荧光分析灵敏度高、样品需求量少、抗干扰能力强、分析速度快，且小型化荧光光度计便于携带。
Description
技术领域
本发明属于生物医学诊断领域，具体涉及一种基于量子点选择性阳离子交换反应的HIV p24高灵敏检测方法、试剂盒及其应用。
背景技术
艾滋病(AIDS)是由HIV引起的严重威胁人类健康重大传染病，其死亡数和死亡率居我国法定传染病的首位。据世界卫生组织报告，到2018年，艾滋病毒携带者(PLWH)已超过3790万，其中只有75％的人知道自己的感染状况。HIV感染可分为三个阶段：急性HIV感染(AHI)，无症状感染和AIDS。其中，AHI是最危险的感染阶段，感染风险为无症状感染期的26倍。联合国艾滋病规划署/世界卫生组织提出的90-90-90目标和世界艾滋病日的“Knowyour status”主题均强调，筛查HIV感染对于艾滋病的预防和控制具有深远的意义，尤其是筛查AHI。早期筛查可以及早诊断和有效治疗，从而可以提高总生存率并减少传播。
现在，第四代抗原抗体试剂已有商品化试剂盒，并且广泛用于临床检测中，可以同时鉴定HIV-1p24抗原和抗HIV IgM和IgG抗体，从而将“窗口期”缩短到大约2周。然而，该试剂不能区分抗原和抗体，导致不清楚疾病阶段。HIV-1p24抗原比抗体早出现约7天，是检测中最早出现的蛋白质生物标记之一。因此，HIV-1p24抗原检测在疾病的早期检测中具有重要的价值。
现有HIV p24检测方法主要是利用ELISA原理，通过在检测抗体上标记电化学活性物质三吡啶钌，或者辣根过氧化物酶(HRP，催化底物TMB显色)，其分别通过监测电化学发光信号和紫外吸收信号实现对p24的检测。然而，以上电化学发光策略仪器成本高，紫外吸收光谱仪分析灵敏度低，且易受检测介质的干扰；最为重要的是其均需要依靠现有检测仪器，难以实现便携式可视化快速分析。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于量子点选择性阳离子交换反应的HIV p24高灵敏检测方法、试剂盒及其应用。本发明引入发光量子点选择性阳离子交换反应信号放大技术，提高分析灵敏度；发光量子点颜色在可见光范围内，易于实现人眼可视化分析；荧光分析策略灵敏度高、样品需求量少、抗干扰能力强、分析速度快，且小型化荧光光度计便于携带。
本发明采用的技术方案如下：
一种基于量子点选择性阳离子交换反应的HIV p24高灵敏、可视化、低成本的检测方法，包括以下步骤：
(1)采用识别抗体(Ab1)、待测样品和检测抗体(Ab2)制备得到一抗-p24-检测抗体-生物素三明治夹心复合物；
(2)将步骤(1)所得一抗-p24-检测抗体-生物素三明治夹心复合物与链霉亲和素-碱性磷酸酶进行连接，得到一抗-p24-检测抗体-ALP复合物；
(3)向所述一抗-p24-检测抗体-ALP复合物中加入维生素C-2-磷酸盐进行孵育，再加入硝酸银溶液进行反应，之后加入量子点原液进行反应，对荧光信号进行分析得到检测结果。
上述检测方法主要是联合抗原-抗体间的酶联免疫吸附分析识别原理，链霉亲和素-碱性磷酸酶(SA-ALP)催化底物维生素C-2-磷酸盐(AAP)生成抗坏血酸(AA)，随后抗坏血酸还原银离子(Ag+)生成银纳米粒子(Ag NPs)，QDs可选择性识别Ag+和Ag NPs的现象进行本发明所述检测过程，具体是利用ELISA策略形成识别抗体-p24-检测抗体-ALP复合物，利用ALP催化底物AAP生成AA，AA还原Ag+生成Ag NPs，随后加入QDs触发阳离子交换反应，最后通过荧光仪监测溶液信号变化，实现HIV p24的准确定量，或者在紫外灯照射下通过裸眼读取实现HIV p24的半定量分析。
本发明所述检测方法引入量子点与银离子间在室温、中性条件下，快速反应的阳离子交换反应信号放大技术，同时利用选择性识别反应有效提高分析灵敏度；利用发光量子点的高发光效率和长期稳定性，在小型紫外灯照射下，可肉眼读取的优势，可实现可视化读取；使用到的现有荧光分光光度计仪器成熟，检测需要试剂少，且已有小型化便携式低成本仪器供使用。整个检测过程无需高温高压，以及强酸强碱性溶液；阳离子交换反应在室温，中性条件下可快速反应。
进一步地，步骤(1)中制备一抗-p24-检测抗体-生物素三明治夹心复合物的具体操作为：
(S1)将识别抗体与分析缓冲液混合后孵育过夜，使用清洗缓冲液进行洗涤，得到反应体系I；
(S2)向所述混合体系I中加入封闭缓冲液进行孵育，使用清洗缓冲液进行洗涤，之后加入待测样品和分析缓冲液进行孵育，使用清洗缓冲液进行洗涤，得到反应体系II；
(S3)向所述反应体系II中加入检测抗体和分析缓冲液并进行孵育，使用清洗缓冲液进行洗涤，得到所述一抗-p24-检测抗体-生物素三明治夹心复合物。
进一步地，步骤(S1)-(S3)中，所述分析缓冲液的组份包括100mmol/L NaNO3、2.5mmol/L Mg(NO3)2、pH为7.4的10mmol/L MOPS缓冲液；所述清洗缓冲液的组份为包含0.05％v/v吐温20的分析缓冲液，使用所述清洗缓冲液的洗涤次数为2-4次。
进一步地，步骤(S1)中，所述识别抗体和分析缓冲液的体积比为1:(1-5)，所述识别抗体的浓度为10-30μg/mL，所述孵育的温度为2-6℃。
进一步地，步骤(S2)中，所述封闭缓冲液的组份包含1％w/v,g mL-1BSA、pH 7.4为10mmol/L MOPS缓冲液；所述加入待测样品和分析缓冲液的体积比为2:(2-4)。
进一步地，步骤(S2)-(S3)中，所述孵育的温度均为35-39℃，所述孵育的时间均为40-80min。
进一步地，步骤(S3)中，所述加入检测抗体和分析缓冲液的体积比为2:(2-4)，所述检测抗体的浓度为5-15μg/mL。
进一步地，20μg/mLAb1和10μg/mLAb2为最优浓度；Ab1与p24、Ab1-p24与Ab2孵育反应均可在60分钟完成。
进一步地，步骤(1)中，所述待测样品为人血清样品，所述检测抗体为生物素标记的检测抗体。
进一步地，步骤(2)中的具体操作为：将链霉亲和素-碱性磷酸酶和分析缓冲液加入至所得一抗-p24-检测抗体-生物素三明治夹心复合物中进行孵育，使用清洗缓冲液进行洗涤，得到所述一抗-p24-检测抗体-ALP复合物。
进一步地，所述链霉亲和素-碱性磷酸酶的浓度为2-8μg/mL，优选5μg/mL；所述链霉亲和素-碱性磷酸酶和分析缓冲液的体积比为2:(2-4)；所述分析缓冲液的组份包括100mmol/L NaNO3、2.5mmol/L Mg(NO3)2、pH为7.4的10mmol/L MOPS缓冲液；所述清洗缓冲液的组份为包含0.05％v/v吐温20的分析缓冲液，使用所述清洗缓冲液的洗涤次数为2-4次；所述孵育的温度为20-30℃，所述孵育的时间为10-20min。
进一步地，步骤(3)中，所述一抗-p24-检测抗体-ALP复合物加入维生素C-2-磷酸盐的同时还加入了分析缓冲液，所述分析缓冲液的组份包括100mmol/LNaNO3、2.5mmol/LMg(NO3)2、pH为7.4的10mmol/LMOPS缓冲液；所述维生素C-2-磷酸酯盐与分析缓冲液的体积比为1:(1-3)，所述维生素C-2-磷酸盐的浓度为0.5-1.5mmol/L，优选1mmol/L，所述孵育温度为35-39℃，所述孵育时间为10-30min。
进一步地，步骤(3)中，所述硝酸银的加入量与所述维生素C-2-磷酸盐的加入体积相同，所述硝酸银的浓度为2-8μmol/L，优选5μmol/L，所述加入硝酸银后在20-30℃避光条件性进行反应；所述量子点原液的加入体积是所述硝酸银溶液加入体积的0.5％-1.5％，所述加入量子点原液后在20-30℃避光条件性进行反应
进一步地，步骤(3)中，所述量子点原液为碲化镉量子点原液或硒化镉量子点原液。
进一步地，步骤(3)中，所述对荧光信号进行分析得到检测结果包括两种方式：一种方式是通过荧光仪监测溶液信号变化，实现HIV p24的准确定量；另一种方式是在紫外灯照射下，通过裸眼读取实现HIV p24的半定量分析。
本发明所述检测方法中发光量子点颜色在可见光范围内，易于实现人眼读取信号变化，实现人眼可视化检测HIV p24。在小型紫外灯照射下，随着HIV p24含量增加，反应溶液的红色在逐渐增强，HIV p24在1pg/mL-1ng/mL浓度范围内，颜色变化明显，且可裸眼识别，即裸眼可区分10pg/mL浓度HIV p24和空白溶液；随后，使用荧光仪对上述溶液荧光信号进行检测，并建立校准曲线，随着HIV p24浓度增加，溶液的荧光信号在逐渐增加，且在1-100pg/mL浓度范围内荧光信号和浓度对数呈现良好线性，其线性方程为Y＝166LogC+134，线性相关系数为0.996，该体系的检测下限为0.25pg/mL(基于三倍信噪比)。
进一步研究发现，在同样的反应体系下，10pg/mL和100pg/mL HIV p24产生显著的荧光信号增加，而高浓度(1ng/mL)的牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、凝血酶(thrombin)、转铁蛋白(transferrin)和木瓜蛋白酶(papain)引起的荧光信号变化几乎可以忽略，因此证明本发明所述检测体系具有良好的选择性，能够为今后在临床样品中p24检测奠定了良好基础。
本发明还提供一种用于检测HIV p24的试剂盒，包含识别抗体、检测抗体、链霉亲和素-碱性磷酸酶、维生素C-2-磷酸盐、硝酸银溶液、量子点原液和缓冲液；所述试剂盒利用所述基于量子点选择性阳离子交换反应的HIV p24高灵敏检测方法进行检测。
本发明所述试剂盒灵敏度高，不易受外界检测介质的干扰，检测结果依靠荧光分光光度计进行准确定量分析或直接依靠人眼可视化半定量分析，整个检测过程简单、快速、成本低，且样本需求量低。
所述用于检测HIV p24的试剂盒在检测HIV p24抗原中的应用。
所述基于量子点选择性阳离子交换反应的HIV p24高灵敏检测方法在检测HIVp24抗原中的应用。
本发明所述技术方案的有益效果说明：
本发明提供一种基于量子点选择性阳离子交换反应的HIV p24高灵敏检测方法，具体包括采用识别抗体、待测样品和生物素标记的检测抗体制备得到一抗-p24-检测抗体-生物素三明治夹心复合物；将所得一抗-p24-检测抗体-生物素三明治夹心复合物与链霉亲和素-碱性磷酸酶进行连接，得到一抗-p24-检测抗体-ALP复合物；向所述一抗-p24-检测抗体-ALP复合物中加入维生素C-2-磷酸盐进行孵育，再加入硝酸银溶液进行反应，之后加入量子点原液进行反应，对荧光信号进行分析得到检测结果。上述检测方法主要是联合抗原-抗体间的酶联免疫吸附分析识别原理，链霉亲和素-碱性磷酸酶(SA-ALP)催化底物维生素C-2-磷酸盐(AAP)生成抗坏血酸(AA)，随后抗坏血酸还原银离子(Ag+)生成银纳米粒子(AgNPs)，QDs可选择性识别Ag+和Ag NPs的现象进行本发明所述检测过程，具体是利用ELISA策略形成识别抗体-p24-检测抗体-ALP复合物，利用ALP催化底物AAP生成AA，AA还原Ag+生成Ag NPs，随后加入QDs触发阳离子交换反应，最后通过荧光仪监测溶液信号变化，实现HIVp24的准确定量，或者在紫外灯照射下通过裸眼读取实现HIV p24的半定量分析。
本发明所述检测方法引入量子点与银离子间在室温、中性条件下，快速反应的阳离子交换反应信号放大技术，同时利用选择性识别反应有效提高分析灵敏度；利用发光量子点的高发光效率和长期稳定性，在小型紫外灯照射下，可肉眼读取的优势，可实现可视化读取；使用到的现有荧光分光光度计仪器成熟，检测需要试剂少，且已有小型化便携式低成本仪器供使用。整个检测过程无需高温高压，以及强酸强碱性溶液；阳离子交换反应在室温，中性条件下可快速反应；荧光分析策略灵敏度高、样品需求量少、抗干扰能力强、分析速度快，且小型化荧光光度计便于携带；所述检测方法对HIV p24蛋白具有较好的选择性和较高的分析性能，为临床样品中HIV p24检测奠定了良好基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1所述检测方法HIV p24可视化和荧光分析检测策略原理图；
图2是QDs和QDs+Ag+的透射电子显微镜(TEM)图像；
图3是QDs的紫外可见吸收峰形和傅里叶变换红外光谱(FTIR)；
图4是荧光实验验证用于HIV p24蛋白检测可行性分析图；
图5是识别抗体和检测抗体浓度优化图；
图6是ALP催化底物AAP生成AA的条件优化图；
图7是AA还原Ag+为Ag NPs的条件优化图；
图8是选择性阳离子交换反应条件优化图；
图9是本发明所述HIV p24蛋白检测体系的分析性能和选择性分析图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下述实施例中使用到的分析缓冲液的组分包含100mmol/L NaNO3、2.5mmol/L Mg(NO3)2、pH为7.4的10mmol/L MOPS缓冲液；所述清洗缓冲液的组份为包含0.05％v/v吐温20的分析缓冲液；所述封闭缓冲液的组份包含1％w/v,g mL-1BSA、pH 7.4为10mmol/LMOPS缓冲液。
实施例1
(1)将10μL 20μg/mL识别抗体(Ab1)和30μL分析缓冲液混合后加入96孔板中，在4℃下孵育过夜。使用200μL清洗缓冲液洗涤上述96孔板3次，用于除掉未结合的识别抗体。随后，加入100μL封闭缓冲液在37℃下孵育1小时，用于封闭96孔板内余下空位，清洗3次。随后，向96孔板中加入40μL待测血清样品，以及60μL分析缓冲液，在37℃下孵育1小时，并洗涤三次。将40μL10μg/mL生物素标记的检测抗体(Ab2)和60μL分析缓冲液一起加入96孔板，并在37℃下孵育1小时，用于形成一抗-p24-检测抗体-生物素三明治夹心复合物，并洗涤三次。
(2)将40μL 5μg/mL链霉亲和素-碱性磷酸酶(SA-ALP)和60μL分析缓冲液加入至步骤(1)中所得96孔板中，在25℃下孵育15分钟并洗涤三次，用于形成一抗-p24-检测抗体-ALP复合物。
(3)将50μL 1mmol/L AAP和100μL分析缓冲液加入步骤(2)所得96孔板中，并在37℃下孵育20分钟，用于生成AA，并将溶液转移至1.5mL离心管中，加入50μL 5μmol/L AgNO3，并在25℃下避光反应15分钟，加入0.5μL碲化镉量子点原液，在25℃下避光反应10分钟，在荧光分光光度计上检测反应混合物溶液的荧光信号并进行定量分析。
本实施例中的检测原理如图1所示，联合抗原-抗体间的酶联免疫吸附分析识别原理，链霉亲和素-碱性磷酸酶(SA-ALP)催化底物维生素C-2-磷酸盐(AAP)生成抗坏血酸(AA)，随后抗坏血酸还原银离子(Ag+)生成银纳米粒子(Ag NPs)，QDs可选择性识别Ag+和AgNPs的现象进行本发明所述检测过程，具体是利用ELISA策略形成识别抗体-p24-检测抗体-ALP复合物，利用ALP催化底物AAP生成AA，AA还原Ag+生成Ag NPs，随后加入QDs触发阳离子交换反应，最后通过荧光仪监测溶液信号变化，实现HIV p24的准确定量。
实施例2
(1)将10μL 30μg/mL识别抗体(Ab1)和10μL分析缓冲液混合后加入96孔板中，在2℃下孵育过夜。使用200μL清洗缓冲液洗涤上述96孔板2次，用于除掉未结合的识别抗体。随后，加入100μL封闭缓冲液在37℃下孵育1小时，用于封闭96孔板内余下空位，清洗2次。随后，向96孔板中加入40μL待测血清样品，以及40μL分析缓冲液，在35℃下孵育80min，并洗涤三次。将40μL5μg/mL生物素标记的检测抗体(Ab2)和40μL分析缓冲液一起加入96孔板，并在35℃下孵育80min，用于形成一抗-p24-检测抗体-生物素三明治夹心复合物，并洗涤2次。
(2)将40μL 2μg/mL链霉亲和素-碱性磷酸酶(SA-ALP)和40μL分析缓冲液加入至步骤(1)中所得96孔板中，在20℃下孵育20分钟并洗涤2次，用于形成一抗-p24-检测抗体-ALP复合物。
(3)将50μL 0.5mmol/L AAP和50μL分析缓冲液加入步骤(2)所得96孔板中，并在37℃下孵育20分钟，用于生成AA，并将溶液转移至1.5mL离心管中，加入50μL 2μmol/L AgNO3，并在20℃下避光反应15分钟，加入0.25μL硒化镉量子点原液，在20℃下避光反应10分钟，在荧光分光光度计上检测反应混合物溶液的荧光信号并进行定量分析。
实施例3
(1)将10μL 10μg/mL识别抗体(Ab1)和50μL分析缓冲液混合后加入96孔板中，在6℃下孵育过夜。使用200μL清洗缓冲液洗涤上述96孔板4次，用于除掉未结合的识别抗体。随后，加入100μL封闭缓冲液在37℃下孵育1小时，用于封闭96孔板内余下空位，清洗4次。随后，向96孔板中加入40μL待测血清样品，以及80μL分析缓冲液，在39℃下孵育40min，并洗涤三次。将40μL15μg/mL生物素标记的检测抗体(Ab2)和80μL分析缓冲液一起加入96孔板，并在39℃下孵育40min，用于形成一抗-p24-检测抗体-生物素三明治夹心复合物，并洗涤4次。
(2)将40μL 8μg/mL链霉亲和素-碱性磷酸酶(SA-ALP)和80μL分析缓冲液加入至步骤(1)中所得96孔板中，在30℃下孵育10分钟并洗涤4次，用于形成一抗-p24-检测抗体-ALP复合物。
(3)将50μL 1.5mmol/L AAP和150μL分析缓冲液加入步骤(2)所得96孔板中，并在39℃下孵育30分钟，用于生成AA，并将溶液转移至1.5mL离心管中，加入50μL 8μmol/LAgNO3，并在30℃下避光反应15分钟，加入0.75μL碲化镉量子点原液，在30℃下避光反应10分钟，在荧光分光光度计上检测反应混合物溶液的荧光信号并进行定量分析。
实验例
1、p24检测原则和可行性
首先对合成的QDs进行了表征，如图2A所示，合成的QDs具有类球状，其平均粒径为4nm，580nm处为其紫外可见吸收特征峰(图3A)，该QDs具有-CH2，COO-，CO，和CS官能团(图3B)。随后，我们验证了QDs与Ag+间阳离子交换反应的可行性，如图2B所示，在与Ag+反应后，QDs发生聚集，形成Ag2Te。最后，我们通过荧光实验验证了p24蛋白检测的可行性。如图4A和4B所示，Ag+可有效淬灭QDs的荧光信号(对比图4B-a和4B-b)；AA还原Ag+，以及ALP催化底物生成AA后还原Ag+，其对QDs荧光信号的淬灭作用明显弱于Ag+(图4B-c和4B-d)。当改变p24含量时，随着p24含量从0-1ng/mL浓度范围内增加时，溶液的荧光信号在显著增加(图4B-e至4B-h)。以上结果表明该体系可用于HIV p24的检测，且其灵敏度可低至pg/mL浓度级别。
2、p24检测条件优化
在分析p24之前，我们对该体系内的实验条件进行了优化，整个反应体系在96孔板和1.5mL离心管中进行。如图5所示，ELISA部分结果显示，20μg/mL和10μg/mL分别为Ab1和Ab2的最优浓度；Ab1与p24，Ab1-p24与Ab2孵育反应均可在60分钟完成。
随后，我们对ALP催化底物生成AA条件进行了优化。如图6所示，5μg/mL链霉亲和素标记的ALP(SA-ALP)，1mM AAP底物，以及20分钟的ALP催化底物AAP生成AA等条件在后期p24分析实验中被采用。
如图7所示，在控制Ag+浓度为5微摩尔每升时，改变Ag+体积时，在50μL时获得荧光信号最大差值。此外，在15分钟内，AA可将Ag+完全还原为Ag NPs。因此，50μL5微摩尔每升浓度Ag+，以及15分钟还原时间被采纳用于p24检测。
选择性阳离子交换反应对于该p24分析体系至关重要，我们对其中QDs的量和反应时间进行了考察。如图8所示，0.5μL QDs原液作为反应信号分子时获得最大荧光信号差值。阳离子交换反应迅速，在30秒内荧光信号急剧下降，且可在2分钟内完成反应。因此，我们选择0.5μL QDs原液作为信号分子，10分钟作为阳离子交换反应时间(确保其完全反应)。
3、p24分析性能和选择性：
在对实验条件优化后，我们对该p24分析体系的性能和选择性进行了考察。鉴于QDs具有强的发光特性，且可裸眼识别的现象，首先调查了可视化分析的性能。如图9A所示，在小型紫外灯照射下，随着p24含量增加，溶液的红色在逐渐增强；对比后可发现在1pg/mL-1ng/mL浓度范围内，颜色变化明显，且可裸眼识别，即裸眼可区分10pg/mL浓度p24和空白溶液。随后，使用荧光仪以上溶液荧光信号进行检测，并建立校准曲线。如图9B和9C所示，随着p24浓度增加，溶液的荧光信号在逐渐增加，且在1-100pg/mL浓度范围内荧光信号和浓度对数呈现良好线性，其线性方程为Y＝166LogC+134，线性相关系数为0.996，该体系的检测下限为0.25pg/mL(基于三倍信噪比)。随后，通过采用高浓度的共存蛋白作为潜在干扰物，对该p24分析实验的选择性进行了考察。如图9D和9E所示，10pg/mL和100pg/mL p24产生显著的荧光信号增加，而高浓度(1ng/mL)的牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、凝血酶(thrombin)、转铁蛋白(transferrin)和木瓜蛋白酶(papain)引起的荧光信号变化几乎可以忽略。因此，该体系具有良好的选择性，为今后在临床样品中p24检测奠定了良好基础。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种基于量子点选择性阳离子交换反应的HIV p24高灵敏检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用识别抗体、待测样品和检测抗体制备得到一抗-p24-检测抗体-生物素三明治夹心复合物；
(2)将步骤(1)所得一抗-p24-检测抗体-生物素三明治夹心复合物与链霉亲和素-碱性磷酸酶进行连接，得到一抗-p24-检测抗体-ALP复合物；
(3)向所述一抗-p24-检测抗体-ALP复合物中加入维生素C-2-磷酸盐进行孵育，再加入硝酸银溶液进行反应，之后加入量子点原液进行反应，对荧光信号进行分析得到检测结果。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中制备一抗-p24-检测抗体-生物素三明治夹心复合物的具体操作为：
(S1)将识别抗体与分析缓冲液混合后孵育过夜，使用清洗缓冲液进行洗涤，得到反应体系I；
(S2)向所述混合体系I中加入封闭缓冲液进行孵育，使用清洗缓冲液进行洗涤，之后加入待测样品和分析缓冲液进行孵育，使用清洗缓冲液进行洗涤，得到反应体系II；
(S3)向所述反应体系II中加入检测抗体和分析缓冲液并进行孵育，使用清洗缓冲液进行洗涤，得到所述一抗-p24-检测抗体三明治夹心复合物。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(S1)-(S3)中，所述分析缓冲液的组份包括100mmol/L NaNO3、2.5mmol/L Mg(NO3)2、pH为7.4的10mmol/L MOPS缓冲液；所述清洗缓冲液的组份为包含0.05％v/v吐温20的分析缓冲液，使用所述清洗缓冲液的洗涤次数为2-4次。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(S1)中，所述识别抗体和分析缓冲液的体积比为1:(1-5)，所述识别抗体的浓度为10-30μg/mL，所述孵育的温度为2-6℃；
步骤(S2)中，所述封闭缓冲液的组份包含1％w/v,g mL-1BSA、pH 7.4为10mmol/L MOPS缓冲液；所述加入待测样品和分析缓冲液的体积比为2:(2-4)；
步骤(S3)中，所述加入检测抗体和分析缓冲液的体积比为2:(2-4)，所述检测抗体的浓度为5-15μg/mL；
步骤(S2)-(S3)中，所述孵育的温度均为35-39℃，所述孵育的时间均为40-80min。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待测样品为人血清样品，所述检测抗体为生物素标记的检测抗体。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中的具体操作为：将链霉亲和素-碱性磷酸酶和分析缓冲液加入至所得一抗-p24-检测抗体-生物素三明治夹心复合物中进行孵育，使用清洗缓冲液进行洗涤，得到所述一抗-p24-检测抗体-ALP复合物。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述链霉亲和素-碱性磷酸酶的浓度为2-8μg/mL；所述链霉亲和素-碱性磷酸酶和分析缓冲液的体积比为2:(2-4)；所述分析缓冲液的组份包括100mmol/L NaNO3、2.5mmol/L Mg(NO3)2、pH为7.4的10mmol/L MOPS缓冲液；所述清洗缓冲液的组份为包含0.05％v/v吐温20的分析缓冲液，使用所述清洗缓冲液的洗涤次数为2-4次；所述孵育的温度为20-30℃，所述孵育的时间为10-20min。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述一抗-p24-检测抗体-ALP复合物加入维生素C-2-磷酸盐的同时还加入了分析缓冲液，所述分析缓冲液的组份包括100mmol/L NaNO3、2.5mmol/L Mg(NO3)2、pH为7.4的10mmol/L MOPS缓冲液；所述维生素C-2-磷酸盐与分析缓冲液的体积比为1:(1-3)，所述维生素C-2-磷酸盐的浓度为0.5-1.5mmol/L，所述孵育温度为35-39℃，所述孵育时间为10-30min；
所述硝酸银的加入量与所述维生素C-2-磷酸盐的加入体积相同，所述硝酸银的浓度为2-8μmol/L，所述加入硝酸银后在20-30℃避光条件性进行反应；所述量子点原液的加入体积是所述硝酸银溶液加入体积的0.5％-1.5％，所述加入量子点原液后在20-30℃避光条件性进行反应；
所述量子点原液为碲化镉量子点原液或硒化镉量子点原液。
所述对荧光信号进行分析得到检测结果包括两种方式：一种方式是通过荧光仪监测溶液信号的变化实现HIV p24的准确定量；另一种是在紫外灯照射下通过裸眼读取实现HIVp24的半定量分析。
9.一种用于检测HIV p24的试剂盒，其特征在于，包含识别抗体、检测抗体、链霉亲和素-碱性磷酸酶、维生素C-2-磷酸盐、硝酸银溶液、量子点原液和缓冲液；所述试剂盒利用所述基于量子点选择性阳离子交换反应的HIV p24高灵敏检测方法进行检测。
10.权利要求1-8任一项所述检测方法在检测HIV p24抗原中的应用。
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