CN113358866A - 基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法及应用 - Google Patents

基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法及应用，涉及生物医学诊断分析方法技术领域，其包括核酸适配体和破伤风抗原基于三重并联杂交链式反应获得长双链DNA，形成DNA模版CuNPs，并基于QDs选择性识别Cu2+和DNA模版CuNPs，监测QDs的荧光信号，并基于QDs的荧光信号定量单一目标物，同时将QDs喷墨打印在试纸上，构建基于距离变化读取的可视化分析，其与颜色读取整合后构建为颜色和距离二维可视化读取模式。本发明引入颜色和距离二维可视化分析，结合无酶核酸放大技术，在改善分析灵敏度的同时，为今后基层医院和偏远地区破伤风的POCT检测奠定基础。

Description

基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维 可视化和荧光分析方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医学诊断分析方法技术领域，尤其是涉及一种基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法及应用。
背景技术
破伤风是一种极为严重的疾病，每年约有100万人死于破伤风。平均病死率为20％-30％，新生儿及老年人的病死率尤其高。其潜伏期通常为7-8天，可短至24小时，平均治疗费用10万元以上。现已有破伤风类毒素抗体IgG的酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒，但其操作复杂、成本高、灵敏度低、难以家庭便携式诊断。最为重要的是抗体检测仅是一种间接方法，易受机体影响。其抗原(痉挛毒素) 的检测对破伤风诊断是直接且有效的。然而，现有医学诊断机构内对破伤风抗原的检测几乎处于空白。因此，发展高灵敏破伤风抗原的检测方法是具有重要意义的。
申请人已申请了名称为“一种破伤风抗原的检测方法及其应用”，申请号为“202011168842.X”的发明专利，详细介绍了破伤风抗原的均相可视化和荧光分析方法，该方法具有高的灵敏度和特异性，颜色可视化读取等优点。
但是其分析灵敏度仅仅能达到pg/mL级别，即分析灵敏度还是相对较低，并且只能实现颜色可视化读取，如何进一步改善分析灵敏度，为今后基层医院和偏远地区破伤风的POCT检测奠定基础成为了本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法，以解决现有技术中破伤风抗原的均相可视化和荧光分析方法的分析灵敏度较低，难以为今后基层医院和偏远地区破伤风的POCT检测奠定基础的技术问题。
本发明的目的之二在于提供一种基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法的应用。
为了实现上述目的之一，本发明提供了一种基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法，所述方法包括核酸适配体和破伤风抗原基于三重并联杂交链式反应获得长双链DNA，在抗坏血酸和 Cu2+存在下，形成DNA模版CuNPs，监测DNA模版CuNPs的荧光信号，并基于DNA模版CuNPs的荧光信号定量单一目标物，所述单一目标物为破伤风抗原。
根据一种优选实施方式，所述DNA模版Cu NPs的激发波长为340nm。
为了实现上述目的之一，本发明还提供了一种基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法，所述方法包括核酸适配体和破伤风抗原基于三重并联杂交链式反应获得长双链DNA，在抗坏血酸和 Cu2+存在下，形成DNA模版CuNPs，并基于QDs选择性识别Cu2+和DNA模版CuNPs，监测QDs的荧光信号，并基于QDs的荧光信号定量单一目标物，所述单一目标物为破伤风抗原。
为了实现上述目的之一，本发明又提供了一种基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法，所述方法包括核酸适配体和破伤风抗原基于三重并联杂交链式反应获得长双链DNA，在抗坏血酸和 Cu2+存在下，形成DNA模版CuNPs，并基于QDs选择性识别Cu2+和DNA模版CuNPs，监测QDs的荧光信号，并基于QDs的荧光信号定量单一目标物，同时将QDs喷墨打印在试纸上，构建基于距离变化读取的可视化分析定量单一目标物，其与颜色读取整合后构建为颜色和距离二维可视化读取模式，所述单一目标物为破伤风抗原。
根据一种优选实施方式，所述Cu2+可替换为Ag+。
根据一种优选实施方式，所述三重并联杂交链式反应可替换为无酶催化发卡组装、DNA酶或者核酸酶。
根据一种优选实施方式，所述核酸适配体可替换为抗体或者多肽。
根据一种优选实施方式，所述QDs包括CdTe QDs或者CdSe QDs。
根据一种优选实施方式，所述QDs的激发波长为365nm。
为了实现上述目的之二，本发明提供了一种基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法的应用，所述应用包括将上述任一所述的基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法应用于破伤风抗原的分析，以定量所述破伤风抗原。
本发明提供的基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法，具有以下技术效果：
该种均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法，具体包括核酸适配体和破伤风抗原基于三重并联杂交链式反应获得长双链DNA，在抗坏血酸和Cu2+存在下，形成DNA模版CuNPs，并基于QDs选择性识别Cu2+和DNA模版CuNPs，监测QDs的荧光信号，并基于QDs的荧光信号定量单一目标物，同时将QDs 喷墨打印在试纸上，构建基于距离变化读取的可视化分析定量单一目标物，其与颜色读取整合后构建为颜色和距离二维可视化读取模式，从而达到定量分析破伤风抗原的目的。本发明引入颜色和距离二维可视化分析，结合无酶核酸放大技术，在改善分析灵敏度的同时，为今后基层医院和偏远地区破伤风的POCT 检测奠定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是CdTe QDs选择性识别Cu2+和DNA模版CuNPs；
图2是三重无酶杂交链式反应辅助的破伤风抗原二维可视化和荧光分析；
图3是破伤风抗原分析材料表征及可行性验证；
图4是破伤风抗原分析条件优化；
图5是选择性阳离子交换反应辅助的破伤风抗原分析条件优化；
图6是破伤风抗原分析性能。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
所述POCT，为即时检验(point-of-care testing)，指在病人旁边进行的临床检测及床边检测(bedside testing)，通常不一定是临床检验师来进行。是在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果的一类新方法。
本发明包括三种基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法，具体如下：
(1)所述方法包括核酸适配体和破伤风抗原基于三重并联杂交链式反应获得长双链DNA，在抗坏血酸和Cu2+存在下，形成DNA模版CuNPs，监测DNA 模版Cu NPs的荧光信号，并基于DNA模版Cu NPs的荧光信号定量单一目标物，所述单一目标物为破伤风抗原。
(2)所述方法包括核酸适配体和破伤风抗原基于三重并联杂交链式反应获得长双链DNA，在抗坏血酸和Cu2+存在下，形成DNA模版CuNPs，并基于 QDs选择性识别Cu2+和DNA模版CuNPs，监测QDs的荧光信号，并基于QDs 的荧光信号定量单一目标物，所述单一目标物为破伤风抗原。
(3)所述方法包括核酸适配体和破伤风抗原基于三重并联杂交链式反应获得长双链DNA，在抗坏血酸和Cu2+存在下，形成DNA模版CuNPs，并基于 QDs选择性识别Cu2+和DNA模版CuNPs，监测QDs的荧光信号，并基于QDs 的荧光信号定量单一目标物，同时将QDs喷墨打印在试纸上，构建基于距离变化读取的可视化分析定量单一目标物，其与颜色读取整合后构建为颜色和距离二维可视化读取模式，所述单一目标物为破伤风抗原。
原理如下：
本发明是在名称为“一种破伤风抗原的检测方法及其应用”，申请号为“202011168842.X”的发明专利的基础上的进一步改进，与之前专利相比，本发明具有以下特点：
(1)颜色和距离二维可视化读取模式，如图1所示；
(2)保留选择性阳离子交换的现象，并将QDs喷墨打印在试纸上，构成基于试纸条距离读取的二维可视化；
(3)结合三重无酶杂交链式反应(HCR)核酸放大技术，在未显著增加分析成本和操作步骤时，进一步改善分析灵敏度，如图2所示。
该破伤风抗原分析原理如图2所示，体系有一个长双链DNA和6个发卡结构组成。在加入破伤风抗原时，其与核酸适配体(Aptamer 2)结合，释放出游离的P4，P5和P6单链DNA，释放出的单链DNA分别与H1-H6发卡结构结合，促发三个HCR反应同时发生，形成三条长双链DNA。
形成的长双链DNA作为Cu NPs的模版，在抗坏血酸(AA)和Cu2+存在时，在室温下形成Cu NPs。其后，可使用荧光仪监测CuNPs的荧光信号变化，进而实现破伤风抗原的定量分析(mode 1)。
此外，结合QDs可选择性识别Cu2+和DNA模版CuNPs的特性，在以上溶液中加入QDs后，可通过监测QDs溶液的荧光信号，实现破伤风抗原的高灵敏分析(mode 2)。
为了更好的实现POCT分析，将QDs喷墨打印在试纸上，构建基于距离变化读取的可视化分析，其与颜色读取整合后构建为颜色和距离二维可视化读取模式，可为临床POCT分析提供更好的可行性。
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。
实施例1：QDs的合成
CdTe QDs是根据一锅法合成的：
首先，将0.5mmol CdCl2和0.20g的柠檬酸三钠溶解在50毫升的水中，向以上溶液中加入的52μL巯基丙酸(MPA)。使用NaOH溶液，将以上混合物溶液pH调节至10.5。
然后，将0.1mmol Na2TeO3和50mg KBH4加入以上溶液中，回流1小时，至溶液呈红色，在紫外灯下呈现出强烈的红色荧光。
最后，通过沉淀(使用正丙醇)和离心(11000rpm,30分钟)纯化CdTe QDs 溶液。以上合成的MPA-CdTe QDs在使用前保存在4℃。
实施例2：破伤风抗原的分析步骤
2.1 DNA模版CuNPs为信号分子时
首先，向70μL 10mM pH 7.4MOPS缓冲液(100mM NaNO3,2.5mM Mg (NO3)2)中加入20μL不同浓度的破伤风痉挛毒素(破伤风抗原)，3μL 2μM A2-P4-P5-P6双链DNA，混合均匀后在37℃下孵育反应30min完成竞争反应，释放出游离的P4、P5和P6。
随后，向以上反应溶液中加入0.25μL 10μM的H1至H6链，并在37℃下孵育2h完成HCR反应生成尽可能多的双链DNA。
最后，向以上溶液中加入5μL 3mM Cu2+和5μL 40mM AA，振荡30s后室温下孵育4min。其后在340nm激发光下监测其溶液荧光信号强度。
2.2 QDs为信号分子时
向2.1所述的CuNPs溶液中加入2μL QDs原液，并在室温下孵育4min，完成阳离子交换反应。在365nm光激发下，使用荧光仪监测溶液荧光信号变化；以及在紫外灯下裸眼读取溶液颜色。
或者将喷墨打印的QDs试纸条插入以上Cu NPs溶液中，在室温下反应4 min并将其烘干，其后在紫外灯下读取试纸条距离。
实施例3：破伤风抗原分析可行性及材料表征
在对破伤风抗原分析可行性进行验证之前，首先对实验中涉及的材料进行了表征。如图3A和3B，其分别为双链模版Cu NPs的TEM图和紫外可见吸收峰形图。以上图表明合成的CuNPs分散均匀，其具有类球状，粒径约为4nm。 CuNPs的特征紫外吸收谱图在345nm处。
其后，对合成的QDs及其与Cu2+间阳离子交换反应进行的表征和验证。如图3C和D所示，QDs分散均匀，粒径约为4nm的类球状结构，且具有晶格结构。QDs在580nm处表现出特征紫外吸收峰形(图3E)。Cu2+的加入，使QDs 发生团聚生成了CuTe(图3F)。
随后，对图2所示的三重并联HCR反应进行了验证。如图3G所示， A2-P4-P5-P6双链DNA成功形成(对比条带1和条带2-5)。分别将P4、P5、 P6加入至H1，H2或者H3，H4或者H5，H6时，其分别通过成功出发HCR 反应，生成长双链DNA(对比条带6-11)。
当以CuNPs为信号分子时，荧光实验表明随着破伤风痉挛毒素浓度增加，溶液的荧光信号在逐渐增大，且实现0.1pg/mL浓度级别的检测(图3H)。在考察QDs为信号分子时分析可行性之前，首先验证了QDs选择性识别现象。如图3I内插图所示，Cu2+对QDs荧光信号的淬灭强于CuNPs，且Cu2+在试纸条上移动的距离源于Cu NPs引起的。对比不同浓度破伤风痉挛毒素引起的溶液荧光信号改变时，发现溶液荧光信号随着破伤风抗原浓度增加在逐渐增大，且可实现1fg/mL浓度级别的检测(图3I)。
实施例4：破伤风抗原分析条件优化
为了获得最优的分析性能，对实验条件进行了优化。如图4所示，破伤风抗原与核酸适配体结合反应可在1h内完成(图4A)；HCR反应可在2h内完成(图4B)；H1-H6发卡结构浓度在0.25μL(10μM)时获得最大荧光信号差值(图4C)；Cu2+和AA浓度分别在3mM和40mM时获得最大荧光信号差值 (图4D和4E)；4分钟足够CuNPs形成反应(图4F)。
随后，对以QDs为信号分子的选择性阳离子交换反应条件进行了考察。如图5A和B所示，2μL QDs原液时可获得最大荧光信号差值。QDs选择性识别 Cu2+和CuNPs的反应，可在4分钟内完成，并获得最大荧光差值(图5C和D)。
实施例5：破伤风抗原分析性能
在优化了实验条件后，对破伤风痉挛毒素的分析灵敏度进行了考察。
首先对以CuNPs为信号分子时分析灵敏度进行了考察，如图6A所示，随着抗原浓度增加，CuNPs的荧光信号在逐渐增大。对CuNPs荧光信号拟合后可发现在100fg/mL至10ng/mL浓度范围，浓度的对数与荧光信号呈现良好的线性关系(R2＝0.993，图6B)，其检出限为30fg/mL(基于三倍信噪比)。
QDs为信号分子时，其长时间稳定且强发光特性可为可视化读取提供可能性。在使用荧光仪监测信号之前，对紫外灯下可视化读取灵敏度进行了考察。
如图6C所示，试管内溶液颜色随着破伤风痉挛毒素浓度增加在逐渐加深，且可裸眼识别10fg/mL浓度破伤风抗原和空白溶液。
当使用试纸条读取其移动距离时，可发现其可轻松实现1fg/mL破伤风抗原的检测，其相比于颜色读取分析灵敏度提高了10倍，且距离读取不受色盲以及色弱等患者情况的影响(图6D)。
最后，使用荧光仪监测溶液信号随破伤风抗原浓度变化情况时，发现其与 Cu NPs作为信号分子时相似。对比可知QDs为信号分子时，该策略可实现1 fg/mL至1ng/mL浓度范围内破伤风抗原的检测，其线性良好，且检测限低至 0.25fg/mL(基于三倍信噪比，图6E和图6F)，该方法的检测限比CuNPs为信号分子时低了两个数量级。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法，其特征在于，所述方法包括核酸适配体和破伤风抗原基于三重并联杂交链式反应获得长双链DNA，在抗坏血酸和Cu2+存在下，形成DNA模版Cu NPs，监测DNA模版Cu NPs的荧光信号，并基于DNA模版Cu NPs的荧光信号定量单一目标物，所述单一目标物为破伤风抗原。
2.根据权利要求1所述的基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法，其特征在于，所述DNA模版CuNPs的激发波长为340nm。
3.一种基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法，其特征在于，所述方法包括核酸适配体和破伤风抗原基于三重并联杂交链式反应获得长双链DNA，在抗坏血酸和Cu2+存在下，形成DNA模版CuNPs，并基于QDs选择性识别Cu2+和DNA模版CuNPs，监测QDs的荧光信号，并基于QDs的荧光信号定量单一目标物，所述单一目标物为破伤风抗原。
4.一种基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法，其特征在于，所述方法包括核酸适配体和破伤风抗原基于三重并联杂交链式反应获得长双链DNA，在抗坏血酸和Cu2+存在下，形成DNA模版CuNPs，并基于QDs选择性识别Cu2+和DNA模版CuNPs，监测QDs的荧光信号，并基于QDs的荧光信号定量单一目标物，同时将QDs喷墨打印在试纸上，构建基于距离变化读取的可视化分析定量单一目标物，其与颜色读取整合后构建为颜色和距离二维可视化读取模式，所述单一目标物为破伤风抗原。
5.根据权利要求4所述的基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法，其特征在于，所述Cu2+可替换为Ag+。
6.根据权利要求4所述的基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法，其特征在于，所述三重并联杂交链式反应可替换为无酶催化发卡组装、DNA酶或者核酸酶。
7.根据权利要求4所述的基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法，其特征在于，所述核酸适配体可替换为抗体或者多肽。
8.根据权利要求4所述的基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法，其特征在于，所述QDs包括CdTe QDs或者CdSe QDs。
9.根据权利要求4所述的基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法，其特征在于，所述QDs的激发波长为365nm。
10.一种基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法的应用，其特征在于，所述应用包括将权利要求1-9任一所述的基于三重并联杂交链式反应的破伤风抗原的均相超灵敏二维可视化和荧光分析方法应用于破伤风抗原的分析，以定量所述破伤风抗原。
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