CN113406330A - 一种用于检测诺氟沙星的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品安全检测免疫分析技术领域，更具体地，涉及一种用于检测诺氟沙星的试剂盒及检测方法。试剂盒包括：诺氟沙星‑生物素标记物、诺氟沙星多克隆抗体、修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶、金纳米粒子、抗坏血酸磷酸、硫酸铜溶液和铜离子探针，金纳米粒子包括连接有叠氮基的金纳米粒子和连接有炔基的金纳米粒子。本发明技术具有灵敏度高、检测范围宽、操作简单、特异性好等优点，对诺氟沙星的超灵敏检测具有重要的实际意义，对于实现现场快速、超灵敏侦检技术具有很好的指导意义。

Description

一种用于检测诺氟沙星的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及食品安全检测免疫分析技术领域，更具体地，涉及一种用于检测诺氟沙星的试剂盒及检测方法。

背景技术

诺氟沙星(Norfloxacin，NOR)抗菌类药是喹诺酮类的第三代产品，其通过阻断细菌产生DNA转录酶，抑制细菌DNA复制从而起到抑菌作用。随着诺氟沙星使用量的增加，滥用现象频发导致在食品中残留严重。NOR常在饮料、肉制品、牛奶及大多数乳制品中出现，是一种广谱类抗生素，其在动物体内很难完全降解，大部分会在动物体内聚集、残留，食用含NOR含量超标的食物会引起变态反应、过敏反应、免疫抑制、致癌、致畸、致突变等，我国已禁止在畜牧养殖饲料中添加NOR作为抗菌药。

目前已建立起的NOR的检测技术主要包括高效相液色谱法检测技术、微生物测定法技术、免疫学检测技术等，其中以免疫学检测技术为主，包括免疫扩散法、凝集试验、放射性免疫测定、酶联免疫吸附、免疫荧光、化学发光酶联免疫检测等。ELISA作为传统的检测技术已经在部分地区广泛使用，但在实际样品(如乳制品、肉制品)的检测过程中，容易受到食品或人体血液中复杂成分的影响，从而使得该技术在灵敏度的检测上仍存在一定的缺陷。

因此，建立食品中NOR的高灵敏度检测技术对于消费者健康及该菌引起食物中毒的临床诊断具有十分重要的意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提供一种用于检测诺氟沙星的试剂盒及检测方法。

本发明的第二发明目的在于提供一种诺氟沙星的检测方法。

为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种用于检测诺氟沙星的试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)诺氟沙星-生物素标记物；

(2)诺氟沙星多克隆抗体；所述诺氟沙星多克隆抗体包被于多孔板上；

(3)修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶；

(4)金纳米粒子；所述金纳米粒子包括连接有叠氮基的金纳米粒子和连接有炔基的金纳米粒子，所述金纳米粒子用于检测一价铜离子；

(5)抗坏血酸磷酸；

(6)硫酸铜溶液；

(7)铜离子探针；所述铜离子探针用于检测二价铜离子；

所述诺氟沙星-生物素标记物用于与所述诺氟沙星多克隆抗体结合，且用于与所述修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶结合；

所述修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶用于还原所述抗坏血酸磷酸为抗坏血酸，所述抗坏血酸用于将所述硫酸铜溶液中的二价铜离子还原为一价铜离子。

可选的，所述金纳米粒子的直径为13～17nm；

优选的，所述连接有叠氮基的金纳米粒子和所述连接有炔基的金纳米粒子的摩尔比为1：1；

更优选的，所述金纳米粒子的浓度为0.5～2OD。

可选的，所述诺氟沙星-生物素标记物中，每1mg诺氟沙星上标记有生物素0.02～0.06mg；优选为0.04mg；

优选的，所述诺氟沙星-生物素标记物的浓度为0.6～1mg/mL，优选为0.8mg/mL；

更优选的，所述诺氟沙星-生物素标记物保存于甲醇中。

可选的，所述多孔板上诺氟沙星多克隆抗体包被量为50～200μg/孔，优选为100μg/孔。

可选的，抗坏血酸磷酸的浓度为1～3mM，优选2mM。

可选的，硫酸铜溶液的浓度为1～3mM，优选为2mM；

优选的，铜离子探针的浓度为10～30μM，优选为20μM，保存于pH＝7.2的Tris-HCl：CH₃CN体积比为1:1的混合溶剂中。

可选的，所述试剂盒中还含有诺氟沙星标准品；

优选的，所述诺氟沙星标准品的浓度为10^-6pg/mL～10⁷pg/mL；

更优选的，所述诺氟沙星标准品采用稀释液配制得到，所述稀释液为含有体积百分比为10％甲醇的1X PBS缓冲液。

可选的，所述铜离子探针用于输出荧光信号；所述金纳米粒子用于输出可视化信号。

本发明涉及一种诺氟沙星的检测方法，采用上述试剂盒进行检测，至少包括以下步骤：

S1、将诺氟沙星多克隆抗体包被于多孔板上；所述多孔板上诺氟沙星多克隆抗体包被量为50～200μg/孔，优选为100μg/孔；

S2、将检测诺氟沙星标准品每个梯度浓度各50μL和诺氟沙星-生物素标记物50μL混合，加入到多孔板上，36～38℃条件反应45～75分钟，优选60分钟；

S3、加入修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶100μL体积，36～38℃条件反应20～40分钟，优选分钟；

S4、加入抗坏血酸磷酸100μL，36～38℃条件反应45～75分钟，优选60分钟；

S5、加入硫酸铜溶液100μL，室温条件反应7～15分钟，优选10分钟；

S6、取100μL加入铜离子探针100μL，检测荧光信号，并绘制标准曲线，取50μL加入金纳米粒子混合液160μL体积，检测可视化信号，并制备颜色变化图；

S7、将检测得到的各梯度浓度荧光信号绘制标准曲线，将检测得到的各梯度浓度可视化信号制备颜色变化图；

S8、将待测样品分别稀释10³、稀释10⁶、稀释10⁹倍，将待测样品原液、待测样品原液10³倍稀释液、待测样品原液10⁶倍稀释液、待测样品原液10⁹倍倍稀释液，用S2～S7的方法进行检测，当其中一个稀释倍数的荧光值出现在标准曲线上时，带入标准曲线计算待测物浓度，并将颜色变化与颜色变化图进行比较。

可选的，诺氟沙星-生物素标记物检测前采用稀释液稀释4×10⁴倍；

修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶检测前采用PBS稀释2000倍；

抗坏血酸磷酸检测前采用pH为7.4的Tri-Hcl缓冲液稀释10倍。

本发明至少具有以下有益的效果：

本发明技术具有灵敏度高、检测范围宽、操作简单、特异性好等优点，对诺氟沙星的超灵敏检测具有重要的实际意义，对于实现现场快速、超灵敏侦检技术具有很好的指导意义。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1为双通道检测诺氟沙星原理图；

图2为胶体金紫外表征图；

图3为胶体金透射电镜图；

图4为胶体金粒径表征图；

图5为胶体金与修饰上叠氮基/炔基的胶体金的紫外对比图；

图6为胶体金@叠氮基的透射电镜图；

图7为胶体金@叠氮基的粒径表征图；

图8为胶体金与修饰上叠氮基/炔基的胶体金的zeta电位图；

图9为胶体金@炔基的透射电镜图；

图10为胶体金@炔基的粒径表征图；

图11为不同浓度的硫酸铜在不同波长下的荧光强度图；

图12为不同浓度的硫酸铜在560nm处的荧光强度折线图；

图13为不同浓度的AA在不同波长下的荧光强度图；

图14为不同浓度的AA在480nm激发光下，560nm处的荧光强度折线图；

图15为不同稀释倍数在不同波长下的荧光强度图；

图16为不同稀释倍数在480nm激发光下、560nm处的荧光强度折线图；

图17为不同浓度AA(10μM-1000μM)引起的胶体金颜色变化及紫外变化图；

图18为不同稀释倍数的SA-ALP(1:500-1:32000)引起的胶体金颜色变化及紫外变化图；

图19为荧光检测标准曲线图；

图20为荧光检测折线图；

图21为AuNPs的颜色变化标准图；

图22为特异性检测直方图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例涉及一种用于检测诺氟沙星的试剂盒，试剂盒包括：

(1)诺氟沙星-生物素标记物；

(2)诺氟沙星多克隆抗体；诺氟沙星多克隆抗体包被于多孔板上；

(3)修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶；

(4)金纳米粒子；金纳米粒子包括连接有叠氮基的金纳米粒子和连接有炔基的金纳米粒子，金纳米粒子用于检测一价铜离子；

(5)抗坏血酸磷酸；

(6)硫酸铜溶液；

(7)铜离子探针；铜离子探针用于检测二价铜离子；

诺氟沙星-生物素标记物用于与诺氟沙星多克隆抗体结合，且用于与修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶结合；修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶用于还原所述抗坏血酸磷酸为抗坏血酸，抗坏血酸用于将所述硫酸铜溶液中的二价铜离子还原为一价铜离子。本发明的检测原理如图1所示，具体为：NOR(诺氟沙星)与NOR-Bio(诺氟沙星-生物素)同时添加于包被有Anti-Nor Ab(诺氟沙星多克隆抗体)的96孔板中，孵育。然后添加SA-ALP(碱性磷酸酶-链霉亲和素)孵育。加入AAP(抗坏血酸磷酸)孵育，得到反应物。取出反应物与CuSO₄室温反应，在棕色离心管中加入铜离子探针(Cu²⁺probe)，用F97Pro荧光分光光度计记录荧光光谱，荧光强度出现在650nm处，将反应物加入含有CuSO₄和160μL AuNPs@Alkynyl(胶体金/炔基)/AuNPs@Azide(胶体金/叠氮基)的孔中进行CuAAC反应，观察AuNPs的颜色变化。铜离子探针用于输出荧光信号；金纳米粒子用于输出可视化信号。本发明通过两种方法同时检测诺氟沙星小分子，既可以在痕量下检测也可以在特殊环境下呈现肉眼可见的检测。采用两种方式检测信号的好处为可以在不同情况下检测诺氟沙星抗生素残留。可先采用可视化信号先进行定性检测是否有，然后通过荧光信号继续定量检测。本申请试剂盒的荧光信号能够满足实验室低浓度检测的需要，视化信号可实现现场检测，在没有仪器的情况下，根据颜色的变化能直接读数。

作为本发明实施例的一种具体实施方式，金纳米粒子的直径为13～17nm；该直径能够更好的修饰炔基和叠氮，而且自身不容易产生聚集。连接有叠氮基的金纳米粒子和连接有炔基的金纳米粒子的摩尔比为1：1。

更优选的，金纳米粒子的浓度为0.5～2OD，优选为1OD。如果金纳米粒子的浓度过高，则容易自身产生聚集，如果浓度过低，则颜色较浅，不容易看出变化。

作为本发明实施例的一种具体实施方式，诺氟沙星-生物素标记物中，每1mg诺氟沙星上标记有生物素0.02～0.06mg；优选为0.04mg；选用该标记量的技术优势为能够是足够的生物素标记到诺氟沙星小分子上。

进一步的，诺氟沙星-生物素标记物的使用浓度为0.02～0.06μg/mL，优选为0.04μg/mL；选用该浓度可减低检测限，诺氟沙星-生物素标记物保存于甲醇中。

作为本发明实施例的一种具体实施方式，多孔板上诺氟沙星多克隆抗体包被量为50～200μg/孔，优选为100μg/孔。选用该包被量能够减低检测限，又能节省完全抗原。

作为本发明实施例的一种具体实施方式，抗坏血酸磷酸的浓度为1～3mM，优选2mM；选用该浓度可降低检测限。

作为本发明实施例的一种具体实施方式，硫酸铜溶液的浓度为1～3mM，优选为2mM；选用该浓度可减低检测限。

作为本发明实施例的一种具体实施方式，铜离子探针的浓度为10～30μM，优选为20μM，选用该浓度可降低检测限。铜离子探针保存于pH＝7.2的Tris-HCl：CH₃CN体积比为1:1的混合溶剂中。

作为本发明实施例的一种具体实施方式，试剂盒中还含有诺氟沙星标准品；诺氟沙星标准品的浓度为10^-6pg/mL～10⁷pg/mL；依次为10^-6pg/mL、10^-5pg/mL、10^-4pg/mL、10^-3pg/mL、10^-2pg/mL、10pg/mL、10²pg/mL、10³pg/mL、10⁴pg/mL、10⁵pg/mL、10⁶pg/mL、10⁷pg/mL。其中，诺氟沙星标准品采用稀释液配制得到，稀释液为含有体积百分比为10％甲醇的1×PBS缓冲液。

作为本发明实施例的一种具体实施方式，NOR多克隆抗体的制备方法为：首先，通过EDC(碳二亚胺)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)法制备诺氟沙星完全抗原，对大白兔进行免疫，通过乳化仪将佐剂、完全抗原和生理盐水进行乳化，乳化完成后(乳化完成鉴定：吸取少量乳化好的溶液滴入清水中，不分散且适度凝固即说明乳化完成)可进行皮下注射，效价达到要求后，取血离心选取上清，对血清进行纯化获得诺氟沙星多克隆抗体。

本发明实施例还涉及该诺氟沙星的检测方法，采用上述试剂盒进行检测，至少包括以下步骤：

S1、将诺氟沙星多克隆抗体包被于多孔板上；多孔板上诺氟沙星多克隆抗体包被量为50～200μg/孔，优选为100μg/孔；

S2、将检测诺氟沙星标准品每个梯度浓度各50μL和诺氟沙星-生物素标记物50μL混合，加入到多孔板上，36～38℃反应45～75分钟，优选37℃反应60分钟；

S3、加入修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶100μL体积，36～38℃反应20～40分钟，优选37℃反应30分钟；

S4、加入抗坏血酸磷酸100μL，36～38℃反应45～75分钟，优选37℃反应60分钟；

S5、加入硫酸铜溶液100μL，室温条件反应7～15分钟，优选10分钟；

S6、取100μL加入铜离子探针100μL，检测荧光信号，并绘制标准曲线，取50μL加入金纳米粒子混合液160μL体积，检测可视化信号，并制备颜色变化图；

S7、将检测得到的各梯度浓度荧光信号绘制标准曲线，将检测得到的各梯度浓度可视化信号制备颜色变化图；

S8、将待测样品分别稀释10³、稀释10⁶、稀释10⁹倍，将待测样品原液、待测样品原液10³倍稀释液、待测样品原液10⁶倍稀释液、待测样品原液10⁹倍稀释液，用S2～S7的方法进行检测，当其中一个稀释倍数的荧光值出现在标准曲线上时，带入标准曲线计算待测物浓度，并将颜色变化与颜色变化图进行比较。

具体的，诺氟沙星-生物素标记物检测前采用稀释液稀释4×10⁴倍；修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶检测前采用PBS稀释2000倍；抗坏血酸磷酸检测前采用pH为7.4的Tri-Hcl缓冲液稀释10倍。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明的具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行，使用中氯金酸购自克百威公司；实验中所用到的诺氟沙星标准品购自Sigma公司，铜离子探针购自赫利森(厦门)生物科技有限公司，链霉亲和素-碱性磷酸酶购自北京贝奥斯生物合成生物技术公司，NOR多克隆抗体由自制并纯化(制备方法参考：武二斌，魏东；诺氟沙星多克隆抗体的制备[J].北京农业，2015(12):6.)巯基叠氮/巯基炔基/巯基聚乙二醇购自西安瑞西生物科技有限公司。生物素以及纳米粒子的合成以及修饰在公开文献的知道下制备获得，铜离子探针通过购买获得。

实施例1诺氟沙星-生物素标记物(NOR-Bio)的制备

1)诺氟沙星半抗原的叠氮化

①称取5mg诺氟沙星半抗原(购自上海源叶生物科技有限公司)(1eq)溶于1mL DMF中，加入0.7mg的HATU(1.5eq)，室温下300r/min振荡反应30min，

②加入0.4mg的DIPEA(2eq)，室温下300r/min振荡反应1h，

③之后加入1mg的2-叠氮基乙胺(5eq)，室温下300r/min振荡反应12h，

④用薄层色谱法(TLC)萃取分离纯化，展开剂为：三氯甲烷/甲醇/氨水为15/10/3，

⑤将分离硅胶板在紫外分析仪下观察，刮下目标产物(NOR-N₃)的特征条带，用900μL甲醇萃取产物。

2)诺氟沙星-生物素标记物合成

①称取0.2mg生物素炔(2eq)溶于DMF，

②在室温300r/min振荡条件下将生物素炔逐滴加到上述萃取产物中；

③将0.1mol/L的CuSO₄溶于和0.2mol/L新鲜配置的抗坏血酸溶液预混合，取100μL加到反应体系中，在室温下300r/min振荡反应8h。

实施例2金纳米粒子的合成及修饰

1)金纳米粒子合成

①制备前将三颈烧瓶、转子、棕色磨口玻璃用王水浸泡过夜除去杂质，双蒸水清洗吹干备用，

②称取30mg柠檬酸钠溶于3mL水中，制备1％的柠檬酸钠溶液，

③将反应的三颈烧瓶放置在磁力搅拌器中固定好，与冷凝管连接，加入1mL 1％的氯金酸溶液和99mL水，加入转子，将三颈烧瓶的瓶口用塞子盖好。将磁力搅拌器温度调至200℃，转速调制999r/min，加热搅拌至沸腾，

④迅速加入2mL预热好的柠檬酸钠溶液，

⑤溶液由黄变澄清接着变黑变紫，最后变为酒红色，继续加热15min后，撤掉热源，自然冷却至室温，

⑥使用0.45μm醋酸纤维素滤膜过滤，

⑦4℃保存于棕色磨口玻璃瓶中备用，

结果如图2～图10所示。

其中：图2为胶体金紫外表征图，图3为胶体金透射电镜图，图4为胶体金粒径表征图，图5为胶体金与修饰上叠氮/炔基的胶体金紫外对比图(在515到535nm之间，由上到下依次为AuNPs、AuNPs@Azide、AuNPs@Alkynyl)，图6为胶体金@叠氮透射电镜图，图7为胶体金@叠氮粒径表征图，图8为胶体金与修饰上叠氮/炔基的胶体金zeta电位图，图9为胶体金@炔基透射电镜图，图10为胶体金@炔基粒径表征图。

上述实验结果表明：胶体金上修饰叠氮/炔基修饰成功。

2)金纳米粒子修饰技术

采用柠檬酸钠还原法制备13nm左右粒径金纳米粒子，共轭反应在室温下搅拌24h，将一定体积的金胶体与甲醇/水溶液混合，其中甲醇/水溶液中含有过量的巯基聚乙二醇或巯基叠氮。通常，500μL金纳米溶胶(1mM)用去离子水稀释至5mL。然后用氢氧化钠将溶液的调整到pH为9。剧烈搅拌下，将巯基聚乙二醇(100μL，甲醇0.01M)和巯基叠氮(200μL，甲醇0.01M)同时加入纳米金溶液中，搅拌24h，离心20min，得到叠氮功能化金纳米粒子。得到的叠氮功能化金纳米粒子用H₂O/tBuOH(3×5mL)洗涤，离心，最终再分散在H₂O/tBuOH(1.5mL)中。

制备炔基功能化的金纳米粒子，采用相同的方法，用巯基炔基(200μL，0.01M)代替巯基叠氮。

实施例3条件优化

1、验证铜离子的作用及探索最佳浓度：

取不同浓度(0.1mM～500mM)的Cu²⁺100μL与铜离子探针(工作浓度20μM)(购自赫利森(厦门)生物科技有限公司)100μL反应。

实验结果如图11和12所示；其中图11为不同浓度的硫酸铜在不同波长下的荧光强度图(其中，在波峰位置由上到下依次为2mM、1mM、0.5mM、0.2mM、0.1mM、10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、500mM)，图12为不同浓度的硫酸铜在560nm处的荧光强度折线图。

根据图11和图12的实验结果确定铜离子的最佳反应浓度为2mM。

2、验证AA的最佳工作浓度：

将Cu²⁺与不同浓度的AA(0～2000μM)混合，反应10min，取100μL混合物加入铜离子探针(100μL)并测量荧光信号，

实验结果如图13和14所示；其中图13为不同浓度的AA在不同波长下的荧光强度图(其中，在波峰位置由上到下依次为0、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM、200μM、500μM、1000μM、2000μM)；图14为不同浓度的AA在560nm处的荧光强度折线图。

根据图13和图14的实验结果发现荧光信号随着AA浓度的增加而降低，最终发现大于100μM时荧光强度改变程度减小。

3、验证SA-ALP的最佳工作浓度：

AAP(200μM，为了获得大于100μM的浓度因此AAP选择两倍量)与SA-ALP混合时，将不同稀释倍数的SA-ALP(1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000)与AAP反应10min，取混合物50μL与铜离子(50μL)反应10min，最后加入铜离子探针(100μL)反应10min并测量其荧光强度。实验结果如图15和图16所示；其中，图15为不同稀释倍数在不同波长下的荧光强度图(在波峰位置由上到下依次为1：16000、1：8000、1：4000、1：2000、1：1000、1：500)；图16为不同稀释倍数560nm处的荧光强度折线图。

同样，使用AuNPs@Azide/AuNPs@Alkynyl代替铜离子探针来验证Cu+的存在，实验结果如图17和图18所示，其中图17为不同浓度AA(10Μm～1000μM)引起的胶体金颜色变化及紫外变化图(在560nm处由上到下依次为1000μM到10μM)，其中图18为不同稀释倍数的SA-ALP(1:500～1:32000)引起的胶体金颜色变化及紫外变化图(在560nm处由上到下依次为1:500到1:32000)。

图17和图18说明胶体金的聚集导致颜色发生变化，紫外峰发生红移。

实施例4试剂盒组成

试剂盒的组成如表1所示：

表1

实施例5检测方法的建立

所有的反应在96孔板上进行。

诺氟沙星标准品用甲醇：PBS(v:v，1:9)缓冲液稀释至10^-6pg/mL-10⁷pg/mL。

(1)1：4000倍(3.5μg/mL)稀释抗体于96孔板上包被，100μL/孔，4℃，过夜。

(2)PBST清洗掉多余的抗体220μL/孔×5次。

(3)1％BSA将多余的孔位封闭，150μL/孔，37℃，1h。

(4)50μL诺氟沙星标准品和0.04μg/mL的诺氟沙星-生物素标记物(NOR-Bio)(50μL)预先混合，同时加入到96孔板上，100μL/孔，37℃，1h。

(5)PBST清洗掉多余的混合物220μL/孔×5次。

(6)1：2000倍稀释生物素-链霉亲和素，100μL/孔，37℃，1h。

(7)PBST清洗掉多余的生物素-链霉亲和素220μL/孔×5次。

(8)每孔加入100μL的AAP(溶解于pH＝7.4的Tri-Hcl缓冲液中)。

(9)取出50μL反应完的混合物转移到棕色离心管中，每孔加入50μL的CuSO₄(2mM)溶液，反应十分钟，10分钟后，在棕色离心管中加入100μL的铜离子探针，用F97Pro荧光分光光度计记录荧光光谱，荧光强度出现在560nm处。荧光检测标曲如图19所示、荧光检测折线图如图20所示，检测范围为3.18×10^-2～6.88×10³pg mL^-1。

将50μL的混合物加入含有20μL CuSO₄(2mM)和160μL炔/叠氮-AuNPs(1:1，v:v)的孔中进行CuAAC反应，观察AuNPs的颜色变化如图21所示。

实施例6

基于双通道检测法特异性实验：为了验证传感器的特异性，对其他干扰蛋白进行了检测。我们选择了几种干扰物质，包括其他几种氟喹诺酮类药物、OVA、E2和SAL。选取3种浓度(0.1pg/mL、10pg/mL、1000pg/mL)，用实施例3方法进行标准品检测。荧光法检测特异性实验结果如图22所示。

如图22所示，在1000pg/mL浓度下OVA、E2和SAL无交叉反应，诺氟沙星结构类似物有交叉反应，随着浓度的降低其交叉反应率减低，在低浓度条件下特异性较高。

本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。

Claims (10)

1.一种用于检测诺氟沙星的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)诺氟沙星-生物素标记物；

(2)诺氟沙星多克隆抗体；所述诺氟沙星多克隆抗体包被于多孔板上；

(3)修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶；

(4)金纳米粒子；所述金纳米粒子包括连接有叠氮基的金纳米粒子和连接有炔基的金纳米粒子，所述金纳米粒子用于检测一价铜离子；

(5)抗坏血酸磷酸；

(6)硫酸铜溶液；

(7)铜离子探针；所述铜离子探针用于检测二价铜离子；

所述诺氟沙星-生物素标记物用于与所述诺氟沙星多克隆抗体结合，且用于与所述修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶结合；

所述修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶用于还原所述抗坏血酸磷酸为抗坏血酸，所述抗坏血酸用于将所述硫酸铜溶液中的二价铜离子还原为一价铜离子。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述金纳米粒子的直径为13～17nm；

优选的，所述连接有叠氮基的金纳米粒子和所述连接有炔基的金纳米粒子的摩尔比为1：1；

更优选的，所述金纳米粒子的浓度为0.5～2OD。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述诺氟沙星-生物素标记物中，每1mg诺氟沙星上标记有生物素0.02～0.06mg；优选为0.04mg；

优选的，所述诺氟沙星-生物素标记物的浓度为0.6～1mg/mL，优选为0.8mg/mL；

更优选的，所述诺氟沙星-生物素标记物保存于甲醇中。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述多孔板上诺氟沙星多克隆抗体包被量为50～200μg/孔，优选为100μg/孔。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，抗坏血酸磷酸的浓度为1～3mM，优选2mM。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，硫酸铜溶液的浓度为1～3mM，优选为2mM；

优选的，铜离子探针的浓度为10～30μM，优选为20μM，保存于pH＝7.2的Tris-HCl：CH₃CN体积比为1:1的混合溶剂中。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有诺氟沙星标准品；

优选的，所述诺氟沙星标准品的浓度为10^-6pg/mL～10⁷pg/mL；

更优选的，所述诺氟沙星标准品采用稀释液配制得到，所述稀释液为含有体积百分比为10％甲醇的1X PBS缓冲液。

8.根据权利要求1～7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述铜离子探针用于输出荧光信号；所述金纳米粒子用于输出可视化信号。

9.一种诺氟沙星的检测方法，其特征在于，采用权利要求1～8任一项所述的试剂盒进行检测，至少包括以下步骤：

S1、将诺氟沙星多克隆抗体包被于多孔板上；所述多孔板上诺氟沙星多克隆抗体包被量为50～200μg/孔，优选为100μg/孔；

S2、将检测诺氟沙星标准品每个梯度浓度各50μL和诺氟沙星-生物素标记物50μL混合，加入到多孔板上，36～38℃条件反应45～75分钟，优选60分钟；

S3、加入修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶100μL体积，36～38℃条件反应20～40分钟，优选分钟；

S4、加入抗坏血酸磷酸100μL，36～38℃条件反应45～75分钟，优选60分钟；

S5、加入硫酸铜溶液100μL，室温条件反应7～15分钟，优选10分钟；

S6、取100μL加入铜离子探针100μL，检测荧光信号，并绘制标准曲线，取50μL加入金纳米粒子混合液160μL体积，检测可视化信号，并制备颜色变化图；

S7、将检测得到的各梯度浓度荧光信号绘制标准曲线，将检测得到的各梯度浓度可视化信号制备颜色变化图；

S8、将待测样品分别稀释10³、稀释10⁶、稀释10⁹倍，将待测样品原液、待测样品原液10³倍稀释液、待测样品原液10⁶倍稀释液、待测样品原液10⁹倍倍稀释液，用S2～S7的方法进行检测，当其中一个稀释倍数的荧光值出现在标准曲线上时，带入标准曲线计算待测物浓度，并将颜色变化与颜色变化图进行比较。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，诺氟沙星-生物素标记物检测前采用稀释液稀释4×10⁴倍；

优选的，修饰有链霉亲和素的碱性磷酸酶检测前采用PBS稀释2000倍；

更优选的，抗坏血酸磷酸检测前采用pH为7.4的Tri-Hcl缓冲液稀释10倍。

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