CN113238037A - 一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系及其检测方法，本发明的检测体系将油相金纳米颗粒与巯基化介孔二氧化硅球组装合成富金构建体，再进行羧基化修饰，偶联链霉亲和素和生物素化抗体制得免疫微球，生物素化抗体即为生物素标记的恩诺沙星单克隆抗体，通过链霉亲和素与生物素的作用力结合恩诺沙星单克隆抗体。待检测的恩诺沙星与试纸条T线上的包被抗原共同竞争免疫微球的单克隆抗体，T线上的测量信号强度与检测的恩诺沙星的浓度呈反比，由此可对恩诺沙星定量检测。本发明对恩诺沙星可实现超灵敏检测，可视化检测限可达到0.0625ng/mL，定量检测限可达0.0013ng/mL。

Description

一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系及其检测方法。
背景技术
恩诺沙星作为喹诺酮类广谱抗生素，其氟化物衍生物也作为抗菌药物在兽医中推广和使用。由于食用动物源性产品（例如肉，牛奶，鸡蛋以及可能含有抗生素残留物的水产品），喹诺酮类抗生素就在人体类残留蓄积，对人体将会有严重的影响，如慢性或急性中毒、呼吸道感染、基因突变、致癌等危害。因此，各国对恩诺沙星及其代谢物环丙沙星的最大残留量均有严格规定，世界卫生组织限定动物源性食品残留量为0.4 ug/kg，欧盟规定为0.3ug/kg，我国规定为0.1 ug/kg。因此，恩诺沙星的定量及定性是分析研究领域面临的挑战。
目前，薄层色谱、高效液谱、液相色谱-串联质谱、毛细管电泳等等技术可实现对恩诺沙星的跟踪定量检测，但是这些技术不仅需要专业人员操作，设备昂贵，而且由于检测样本基质的复杂性，需要进行复杂繁琐的前处理，如wu等人通过合成磺酸盐官能化的磁性共价有机骨架复合物，然后通过Au-S键将金纳米颗粒负载于磁性共价有机骨架复合物上，该复合物对氟喹诺酮类药物具有较强的亲和力，则可作为良好的吸附剂用于磁性固相萃取，再结合HPLC-MS/MS技术则可表现出良好的线性关系（R2≥0.9989）和检测限（0.1-1.0ng/mL），对抗生素进行富集前处理并需借助繁重的仪器才可完成检测导致该技术无法进行现场快速检测。
为了提高检测的便捷性，Jeon等人开发了一种使用个人血糖仪进行恩诺沙星检测，通过将测试样品与大肠杆菌和葡萄糖混合后，使用个人血糖仪测量细菌代谢消耗的葡萄糖浓度，由于恩诺沙星的抗菌活性阻碍细菌代谢，则葡萄糖的消耗量与恩诺沙星浓度成比例。但是该方法对恩诺沙星的检出限仅为5ng/mL，且测定时间需要2h。
Wang等人利用染色体聚合物微球和量子点作为探针，检测了动物组织和牛奶中恩诺沙星的含量，可视化检出限在动物组织中仅能达到5ng/mL，在牛奶中为10ng/mL；Yan等人利用末端脱氧核苷酸酶催化恩诺沙星适体与脱氧胸苷三磷酸形成海胆体结构，再通过碱基互补配对富集碱基修饰AuNPs，通过提高AuNPs的负载率增强检测灵敏度，虽定量结果可至0.1ng/mL，但是肉眼需在浓度为10ng/mL才能看到较为明显的颜色变化；wang等人利用AuNPs猝灭量子点的荧光，AgNPs猝灭碳点荧光，构建了荧光共振能量转移体系，实现了对恩诺沙星1ng/mL的可视化检测。所以恩诺沙星的检测急需一种高灵敏、简单便捷、快速准确的技术。
侧流免疫层析是当前应用最为广泛的即时诊断平台，主要借助蛋白标志物及标记抗体在毛细层析作用下，与固定抗体（抗原）的免疫反应来实现定性定量分析，其标记分子主要为荧光染料、量子点、胶体金。荧光染料虽具有优异的敏感度，但信号强度受限于染料分子本身的亮度、光漂白、载体填充效率等因素；量子点作为新兴的荧光材料，虽能解决荧光染料光漂白、激发光谱窄、发射光谱宽等问题，但是在食物样品中由于基质的复杂性不易稳定存在，所以在食品检测中具有较大的局限性，并且量子点和荧光染料都需要在外激发光下获取信号，无法进行定性检测，使得二者在食品检验中的应用极大受限。AuNPs因其优越的光学性能、特殊的等离子共振效应、简单的生物标记、易合成、低成本、形貌尺寸可调节等优点作为经典的纳米光学标签占据免疫层析标签市场，由于检测结果肉眼可见，更让其在食品检验中备受欢迎。但是，传统的胶体金的粒径约为20-30nm，探针亮度低，信号弱，灵敏度低，无法满足市场的需求。目前，大量针对增强AuNPs的灵敏度与信号的研究，如 Xiong等人通过调节AuNPs的粒径与形貌，通过提高AuNPs的摩尔消光系数及对目标抗原的亲和力，以提高检测灵敏度，降低检测限。可是，单一的AuNPs的灵敏度与检测限仍具有很大的局限性，所以AuNPs的富集是研究的一大热点。纳米聚集体、纳米团簇、纳米囊泡，等材料逐渐成为AuNPs构建体的选择，所获得的金结构体展示出密集堆积的纳米构型，达到单个金纳米颗粒意想不到的物理化学和光学性质，从而促进了它们在生物传感、生物成像，药物递送和食品检验中的广泛运用。如Khalil等人通过金与巯基之间的配位作用，将AuNPs负载至实心硅的表面以增加金纳米颗粒的负载率。但是现有金富集免疫材料存在几大缺点：一是使用的水相金粒径不均一性能不稳定，在环境中不能长时间稳定保存，暴露空气中颜色易从酒红色变为紫色，严重影响定量检测结果；二是AuNPs与抗体之间采用静电吸附的方式联接，此方法形成的免疫探针易受环境干扰，极不稳定；三是形成的复合物不具备可修饰性，AuNPs裸露可能导致脱落现象，等等缺点依旧限制了复合材料的应用前景，所以AuNPs的富集研究还有待突破。
发明内容
针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系及其检测方法。在本发明中公开了一种基于高度均一粒径和高稳定性的油相金纳米颗粒与可调谐的树状介孔二氧化硅的高效组装，合成了稳定的、可修饰的、金纳米颗粒高密度富集的纳米级光学标签。利用免疫层析技术，通过竞争法实现对小分子物质恩诺沙星皮克级别超灵敏度检测。该技术解决了目前恩诺沙星检测面临的两大问题：一是在定性方面，可视化检测限为0.0625ng/mL，通过肉眼判断样品残留量是否满足国标需求，二是在定量方面，实现对恩诺沙星简单快速精准定量，达到对恩诺沙星的超灵敏度检测，定量检测限为0.0013ng/mL，线性范围为0.0019-0.25ng/mL。
所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于所述检测体系包括用于检测恩诺沙星的免疫微球，该免疫微球的制备方法为：将油相金纳米颗粒与巯基化介孔二氧化硅球组装合成富金构建体，再进行羧基化修饰，然后偶联链霉亲和素和生物素化抗体，即制得免疫微球；其中，所述生物素化抗体即为生物素标记的恩诺沙星单克隆抗体。
所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于所述免疫微球的具体制备步骤如下：
1）油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs的合成：
在氩气下将HAuCl4·4H2O加入甲苯中，并加入油胺，于90~105℃下回流搅拌反应5~7h；反应结束后，加入乙醇，摇晃至有沉淀产生，离心弃去上清，所得沉淀均匀分散于氯仿中，即得到油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs分散液；
2）富金构建体的制备：
富金构建体的制备方法包括以下两步：
步骤A：向步骤1）所得油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs分散液中加入巯基化介孔二氧化硅球，超声均匀后，离心、风干，所得固体中加入辛基三甲氧基硅烷OTMS，超声均匀后转移至甲醇/氨水混合液中，继续超声反应20-40分钟后离心得到复合物沉淀，复合物沉淀用甲醇洗涤除去多余的辛基三甲氧基硅烷OTMS后，加入至水中搅拌15~20h后，离心、分散于乙醇中，形成中间产物分散液；
步骤B：向步骤A所得中间产物分散液中加入水、氨水、TEOS，室温搅拌反应，随后离心收集产物，洗涤，分散于乙醇中，即得到富金构建体分散液；
3）羧基化富金构建体的制备：
取步骤2）所得富金构建体分散液，搅拌下加入氨水，然后加入APTMS搅拌反应10-15h，反应结束后将产物离心，用乙醇洗涤后，得到氨基修饰的富金构建体材料；然后将所述氨基修饰的富金构建体材料分散至N,N二甲基甲酰胺中，加入琥珀酸酐反应3~5h，反应结束后将产物离心，依次用乙醇、水洗涤后，分散于水中，即得到羧基化富金构建体分散液；
4）免疫微球的制备
取步骤3）所得羧基化富金构建体分散液离心，水洗，然后加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐和pH=6.0磷酸缓冲液，37℃活化20~40 min；随后离心收集产物，加入pH=7.4磷酸缓冲液和链霉亲和素，37℃摇床反应2~4h；反应结束后，离心、洗涤，然后加入pH=7.4磷酸盐缓冲液和生物素化抗体，37℃摇床反应0.5~1.5h；反应结束后，离心，用pH=7.4磷酸缓冲液洗涤数次，即得所述免疫微球，将其分散于保存液中冷藏保存。
所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于步骤1）中，HAuCl4·4H2O的质量与油胺的体积之比是1:10~15，质量的单位是g，体积的单位是mL。
所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于步骤2）的步骤A中，油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs与巯基化介孔二氧化硅球的质量比是1~5:1，优选为3:1。
所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于步骤2）的步骤A中，甲醇/氨水混合液中氨水与甲醇的体积比为0.02~0.03:1；步骤2）、步骤3）中使用的氨水浓度均是25~30%。
所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于步骤2）的步骤B中，水、氨水、TEOS三者的体积比是1:0.10~0.15:0.03~0.05；步骤2）的步骤A中油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs的质量与步骤B中TEOS的体积之比是0.05~0.25:1，优选为0.15:1，质量的单位是mg，体积的单位是uL。
所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于步骤4）中，羧基化富金构建体、链霉亲和素、生物素化抗体三者的质量之比是1：0.003~0.03：0.003~0.03，优选为1：0.006~0.0065：0.006~0.0065；步骤4）中，所述生物素化抗体即为生物素标记的恩诺沙星单克隆抗体。
所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于所述检测体系还包括用于检测恩诺沙星的试纸条，该试纸条包括NC膜、样品垫和吸水纸；所述样品垫、NC膜和吸水纸搭接组装，样品垫和吸水纸分别叠压在NC膜的两端，并在NC膜的表面形成检测区；所述检测区的NC膜上设置靠近样品垫的检测线区T线、靠近吸水纸的一条控制线区C线；其中，在试纸条的T线上为包被抗原，在试纸条的C线上为羊抗鼠二抗。
一种皮克级恩诺沙星的检测方法，采用根据所述的用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于该方法的具体步骤为：
M1：首先制备试纸条，试纸条包括NC膜、样品垫和吸水纸；所述样品垫、NC膜和吸水纸搭接组装，样品垫和吸水纸分别叠压在NC膜的两端，并在NC膜的表面形成检测区；所述检测区的NC膜上设置靠近样品垫的检测线区T线、靠近吸水纸的一条控制线区C线；其中，在试纸条的T线上为包被抗原，在试纸条的C线上为羊抗鼠二抗；
M2：配制一系列不同浓度的恩诺沙星溶液，将含免疫微球的分散液加入96孔板中，然后加入不同浓度的恩诺沙星溶液孵育3~10min，将步骤M1制备好的试纸条插入孵育液中层析3~10min，对试纸条的NC膜用金标读数仪进行检测分析，获得NC膜的T线及C线区域的金标读数仪测量的吸收峰信号谱图，当恩诺沙星浓度大于0ng/mL时信号谱图中T线区的峰面积与C线区的峰面积的比值为B，当恩诺沙星浓度等于0ng/mL时信号谱图中T线区峰面积与C线区峰面积为B0，B0为常数，以B/B0为纵坐标，并以恩诺沙星溶液浓度的Lg值为横坐标，进行绘制标准曲线，获得相应的线性回归方程；
M3：将含免疫微球的分散液加入96孔板中，然后加入待测样本孵育3~10min，将步骤M1制备好的试纸条插入孵育液中层析3~10min，对试纸条的NC膜用金标读数仪进行检测分析，获得NC膜的T线及C线区域的金标读数仪测量的吸收峰信号谱图，计算信号谱图中T线区的峰面积与C线区的峰面积的比值B1，并代入步骤M2的线性回归方程，即可计算得到待测样本中的恩诺沙星含量。
相对于现有技术，本发明取得的有益效果是：
第一、本发明公开了一种基于巯基化树状二氧化硅模板、油相金纳米颗粒、及二氧化硅壳层的金高负载量的纳米级光学标签，通过链霉亲和素与生物素间强有力的亲和力合成免疫微球，其优点在于：（1）通过对富金构建体金负载率的优化，合成具有高负载率的富金构建体；（2）探索富金构建体、链霉亲和素、生物素化抗体的最优质量比，使用链霉亲和素与生物素之间的作用力结合抗体，稳定性与抗干扰能力强于金与抗体之间的静电吸附；（3）对试纸条进行优化，构建免疫竞争体系，对恩诺沙星可实现超灵敏检测，可视化检测线可低至0.0625ng/mL，定量检测限可至0.0013ng/mL，远低于各国需求规定，是目前研究很少能达到的检测限。
第二、目前市场上使用的金纳米颗粒大多是水相，均一性差，不稳定等缺点限制了水相金的使用，本发明采用了有机相高温热分解法合成油相金纳米颗粒解决了此缺点。本发明采用油相金纳米颗粒，相比于现有常规水相金纳米颗粒，具有更好的稳定性和均一性。
第三、相对于传统的实心硅模板，本发明采用树状介孔二氧化硅具有更大的孔道和比表面积，通过巯基和Au的配位作用，可实现金纳米颗粒在树状二氧化硅球上的高密度负载，达到不改变金纳米颗粒原有的等离子共振特性的同时，提高检测灵敏度，降低检测限，以突破目前恩诺沙星检测遇到的问题，满足国标需求。另外，传统胶体金的粒径大多在20-30nm，以至于探针亮度低，信号弱，灵敏度低，所构成的富集金纳米颗粒的复合物大多均不稳定，且不具可修饰性，限制了该复合物的使用，本发明通过巯基与金纳米颗粒的金属配位作用，合成稳定，可修饰，且金高负载率的复合物，实现对恩诺沙星高灵敏度，低检测限检测，在可视化范围内可满足国标需求，这是目前研究还未能达到的水平。
第四、现有技术中，抗体标记胶体金大多采用静电吸附作用。而本发明中，通过对金纳米颗粒高负载量的可修饰的微球进行羧基化修饰，偶联链霉亲和素，通过链霉亲和素与生物素间超强亲和力而结合抗体，相比于现有常规的靠静电吸附偶联的胶体金-抗体复合物，本发明采用链霉亲和素与生物素之间的强亲和力具有更好的稳定性和抗干扰能力。
第五、本发明制备并优化免疫层析试纸，在进行对含恩诺沙星的样本溶液进行检测时，将本发明的免疫微球加入样本溶液中孵育一段时间，然后插入免疫层析试纸层析一段时间，待检测的恩诺沙星与试纸条T线上的包被抗原共同竞争免疫微球的富金构建体上标记的单克隆抗体，T线上的信号强度与检测的恩诺沙星的浓度呈反比，恩诺沙星的检测浓度越高，T线颜色越浅，检测时间为10分钟时，即恩诺沙星的检测浓度为0.0625ng/mL的时候T线颜色完全消失，即可视化检测限可低至0.0625ng/mL。本发明中，恩诺沙星的检测浓度在1.9×10-3-0.25ng/mL范围内时检测结果呈良好的线性关系，R2=0.9878，IC50=0.016ng/mL。
附图说明
图1为实施例1步骤1）制得的巯基化树状介孔二氧化硅，实施例3步骤3）中的步骤S1中所得dSiO2-Au复合物以及步骤S2所得富金构建体，三者的扫描电镜对比图；
图2为实施例1步骤1）制得的巯基化树状介孔二氧化硅、实施例1步骤2）制得的油胺修饰的金纳米颗粒（AuNPs），实施例3步骤3）中的步骤S1中所得dSiO2-Au复合物以及步骤S2所得富金构建体，四者的透射电镜对比图；
图3A为实施例1-5在步骤3）富金构建体的制备过程步骤S1中，制备的dSiO2/Au复合物分别采用紫外光谱仪进行表征的紫外光谱结果对比图；
图3B为实施例1-5在步骤3）富金构建体的制备过程步骤S2中，最终制备的富金构建体产物分别采用紫外光谱仪进行表征的紫外光谱结果对比图；
图4A为不同浓度的恩诺沙星溶液与免疫微球孵育后在试纸条中层析，层析后的试纸条经裸眼定性识别颜色变化的结果对比图；
图4B为浓度分别为0、2.25×10-4 、1.9×10-3、0.0156、0.0625 ng/mL的恩诺沙星溶液与免疫微球孵育后在试纸条中层析，层析后的试纸条经金标读数仪检测的扫面曲线结果对比图；
图4C为不同浓度的恩诺沙星溶液与免疫微球孵育后在试纸条中层析，层析后的试纸条经金标读数仪读取后，B/B0与恩诺沙星浓度的关系图，其中，B为恩诺沙星浓度大于0ng/mL时T线区的峰面积与C线区的峰面积两者的比值，B0为恩诺沙星浓度为0ng/mLT线区的峰面积与C线区的峰面积两者的比值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1：
1）巯基化树状介孔二氧化硅的合成：
将0.136g 三乙醇胺（TEA）加入到50 ml水中，并在80 ℃油浴中磁力搅拌0.5小时；然后，取0.608g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），0.35g水杨酸钠（NaSal）加入上述溶液中，继续搅拌1小时；然后在搅拌下，加入8 ml 硅酸四乙酯（TEOS）反应3小时；反应结束后，离心收集产物并用乙醇洗涤三次后分散于100mL盐酸和100mL甲醇的混合液中，60 ℃下萃取6小时，共两次；最后用乙醇洗涤3次，并将产物分散在400mL乙醇中，加入5 mL氨水、2mL（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷(MPTMS)，室温下搅拌12h；离心并用乙醇洗涤三遍后分散至乙醇中，得到巯基化树状二氧化硅的分散液（分散液中，巯基化树状二氧化硅的浓度为5mg/mL），即可得到巯基化树状二氧化硅，于冰箱4 ℃储存。
实施例1步骤1）制得的巯基化树状介孔二氧化硅进行表征，其扫描电镜图（SEM）如图1中的分图A所示，透射电镜图（TEM）如图2中的分图A所示，可以看出：巯基化树状介孔二氧化硅的粒径大约在260-280nm，具有较大的比表面积和孔道，这有利于AuNPs的高效组装。
2）油胺修饰的金纳米颗粒（AuNPs）的合成：
取0.824 mL HAuCl4·4H2O的乙醇溶液（1 g氯金酸溶于4 mL乙醇形成的溶液）于50mL三口Schlenk反应瓶中，利用Schlenk技术反复抽气-充气，将乙醇抽干，然后在氩气环境下加入25 mL甲苯、2.5 mL油胺，于100℃下回流搅拌反应6 h。反应结束后，加入等体积的乙醇，摇晃至有沉淀产生，离心弃去上清，最后将得到的沉淀分散至氯仿中，得到油胺修饰的金纳米颗粒（AuNPs）的分散液（分散液中，油胺修饰的金纳米颗粒（AuNPs）的浓度为5mg/mL），即可得到油胺修饰的金纳米颗粒（AuNPs），于冰箱4 ℃储存。
实施例1步骤2）制得的油胺修饰的金纳米颗粒（AuNPs）进行表征，其透射电镜图（TEM）如图2中的分图B所示，可以看出：成功合成粒径约为12nm的AuNPs，且具有良好的均一性。
3）富金构建体的制备，包括以下两步：
步骤S1：取1mL步骤1）所得巯基化树状二氧化硅的分散液，离心、风干后，加入1mL步骤2）所得油胺修饰的金纳米颗粒（AuNPs）的分散液，超声10min，得到含dSiO2/Au复合物的分散液；
步骤S2：将步骤S1所得含dSiO2/Au复合物的分散液离心、风干后，加入200uL 辛基三甲氧基硅烷（OTMS），然后超声至均相后转移至7.5mL甲醇与187.5uL氨水混合液中并继续超声30分钟，超声结束后离心，并用甲醇洗涤除去多余的辛基三甲氧基硅烷（OTMS），之后分散至16.5mL水中搅拌18h，在此过程，OTMS的硅氧烷水解生成两亲性的硅烷三醇，并通过疏水作用包覆dSiO2/Au复合物；随后离心，将产物分散至10mL乙醇中，加入2.5mL水和312.5uL氨水，然后分批次加入TEOS进行搅拌反应，每次在1h内加入12.5µL TEOS，加8次（共计8h），由此通过Stöber法生长二氧化硅层。反应结束后，产物用乙醇洗涤三遍后分散于20mL乙醇中，即得富金构建体的乙醇溶液（溶液中富金构建体的浓度为8mg/mL）。
实施例2-5：
实施例2-5的实验步骤重复实施例1，不同之处在于“在步骤3）富金构建体的制备过程步骤S1中，改变油胺修饰的金纳米颗粒（AuNPs）的分散液的添加体积”，其余步骤均与实施例1中相同。其中，实施例2-5在步骤3）富金构建体的制备过程步骤S1中，将油胺修饰的金纳米颗粒（AuNPs）的分散液的添加体积分别替换为2mL、3mL、4mL、5mL，以合成不同金负载率的富金构建体。
实施例1-5在步骤3）富金构建体的制备过程步骤S1中，制备的dSiO2/Au复合物分别采用紫外光谱仪进行表征，其紫外光谱图分别如图3A中的曲线a、b、c、d、e所示。实施例1-5在步骤3）富金构建体的制备过程步骤S2中，最终制备的富金构建体产物分别采用紫外光谱仪进行表征，其紫外光谱图分别如图3B中的曲线a、b、c、d、e所示。
对照图3A可以看出，对于dSiO2-Au复合物而言，随着金纳米颗粒的增加，吸光度越大。但是对照图3B可以看出，将dSiO2-Au复合物作为原料进一步反应时，加入OTMS转相、TEOS包硅后，油胺修饰的金纳米颗粒（AuNPs）的分散液的添加体积是4mL、5mL的情况下，最终制得的富金构建体的紫外吸光度下降，其原因是组装率过高时，在转相和包硅过程会导致金团聚。所以选择1mL巯基化树状二氧化硅的分散液中，加入3mL的油胺修饰的金纳米颗粒（AuNPs）的分散液，进行组装制备的金构建体为后期实验材料，即是按照实施例3的方法制备富金构建体。
实施例3的实验方法步骤3）中，步骤S1中所得dSiO2-Au复合物以及步骤S2所得富金构建体的扫描电镜图（SEM），分别如图1中的分图B和C所示。实施例3的实验方法步骤3）中，步骤S1中所得dSiO2-Au复合物以及步骤S2所得富金构建体的透射电镜图（TEM）分别如图2中的分图C和D所示。可以看出：实施例3成功合成了具有良好均一性和分散性、金纳米颗粒高负载率的富金构建体。
实施例6：
1）羧基化富金构建体的制备：
取20mL实施例3所得富金构建体的乙醇溶液（溶液中富金构建体的浓度为8mg/mL），加入0.5mL氨水，20µL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），反应12h，反应结束后将产物离心，用乙醇洗涤三遍，得到氨基修饰的富金构建体材料，将氨基修饰的富金构建体材料分散至10mL N,N二甲基甲酰胺中，加入10 mg琥珀酸酐反应4h ，用乙醇洗涤三遍，水洗涤三遍，最后分散至水中，得到羧基化富金构建体的分散液（分散液中，羧基化富金构建体的浓度为2mg/mL)。
2）免疫微球的制备：
取1mL步骤1）所得羧基化富金构建体的分散液，离心，水洗一遍；加入200uL 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐溶液（EDC，浓度为10 mg/mL），200uL N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐溶液（Sulfo-NHS，浓度为10 mg/mL），100uL PB缓冲液（0.01 M，pH=6.0），37℃活化 30 min；离心，加入500uL PB缓冲液（0.01M，pH=7.4），加入12.5uL链霉亲和素溶液（浓度为1mg/mL），37℃摇床3h；反应结束后，用PB缓冲液（0.01M，pH=7.4）洗涤三遍，加入500uL PBS缓冲液（0.01M，pH=7.4），12.5uL生物素化抗体溶液（浓度为1mg/mL，购自于北京维德维康生物技术有限公司），37℃摇床1h；PB缓冲液（0.01M，pH=7.4）洗涤三遍后，分散于PBS 缓冲液（0.02 M，pH=8.0，含 2.5% BSA，1%蔗糖，2% PEG-2000 和 0.02%叠氮化钠）中，得到免疫微球的分散液（分散液中，免疫微球的浓度是8mg/mL），置于4℃下冷藏保存。
3）试纸条的制备：
首先用0.02 M PBS 溶液（pH=7.4，含1% BSA，2.5%蔗糖，0.05% Tween-20，0.3%PVP K30和0.02%叠氮化钠）处理样品垫，并在37℃下干燥。用划膜喷金仪以0.7µL/cm的用量和4 cm/s的速度将包被抗原ENR-BSA喷涂在NC 膜的检测线区T线上（ NC膜上T线喷涂包被抗原ENR-BSA，浓度为0.8mg/mL），用划膜喷金仪以0.7µL/cm的用量和4 cm/s的速度将羊抗鼠二抗（GAM）喷涂在NC 膜的质控线区C线上（NC膜上C线喷涂GAM的浓度为1mg/mL），并在37℃下干燥。最后将吸水纸、NC 膜、样品垫依次组装，并用切条机切成 3.8 mm 宽的纸条，于干燥条件下密封保存。
上述组装的试纸条结构是：试纸条包括NC膜、样品垫和吸水纸；所述样品垫、NC膜和吸水纸搭接组装，样品垫和吸水纸分别叠压在NC膜的两端，并在NC膜的表面形成检测区；所述检测区的NC膜上设置靠近样品垫的检测线区T线、靠近吸水纸的一条控制线区C线。
4）恩诺沙星的检测：
用PBST（20mM ，pH=7.4，1.8% NaCl，0.5%Tween-20）作为恩诺沙星的稀释剂，以等浓度梯度稀释法配置不同浓度的恩诺沙星溶液，浓度依次分别为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.0156、7.8×10-3、3.9×10-3、1.9×10-3、9.7×10-4、4.8×10-4ng/mL，备用。
然后取5 uL步骤2）所得免疫微球的分散液（浓度8mg/mL）于96孔板中，分别加入150uL不同浓度的恩诺沙星溶液孵育5min，将步骤3）制备好的试纸条插入孵育液中层析5min，结束后去除样品垫，装壳，对试纸条的NC膜用金标读数仪进行检测分析，分析结果如图4A和图4B所示。
对照图4A为不同浓度的恩诺沙星溶液与免疫微球孵育后在试纸条中层析，层析后的试纸条经金标读数仪定性地识别颜色变化的结果对比图。其中图4A中有上、下两列横线，NC膜的T线颜色变化对照图4A中的下方横线，NC膜的C线颜色变化对照图4A中的上方横线。图4A中照片结果从右至左依次对应2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.0156、7.8×10-3、3.9×10-3、1.9×10-3、9.7×10-4、4.8×10-4、0ng/mL恩诺沙星溶液的测试结果，当恩诺沙星浓度为0.0625ng/mL时，T线颜色近似消失，则可视化检测限为0.0625ng/mL。
对照图4B为浓度分别为0、2.25×10-4 、1.9×10-3、0.0156、0.0625 ng/mL的恩诺沙星溶液与免疫微球孵育后在试纸条中层析，层析后的试纸条经金标读数仪检测的扫面曲线结果对比图，图4B的纵坐标为金标读数仪检测的吸收峰信号强度。从图4B可以看出：随着恩诺沙星浓度越高，T线区的检测信号强度越小，而C线区的检测信号强度变化较小。
浓度依次分别为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.0156、7.8×10-3、3.9×10-3、1.9×10-3、9.7×10-4、4.8×10-4ng/mL的恩诺沙星溶液与免疫微球孵育后在试纸条中层析，层析后的试纸条经金标读数仪检测扫面曲线。以恩诺沙星溶液浓度的Lg值为横坐标（即图4C中的Lg C，单位是ng/mL），B/B0为纵坐标，结果如图4C所示。从图4C中可以看出：恩诺沙星浓度与扫描信号存在一定的线性关系，可知浓度在1.9×10-3-0.25ng/mL范围内呈良好的线性关系，R2=0.9878，IC50=0.016ng/mL。
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。

Claims (9)

1.一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于所述检测体系包括用于检测恩诺沙星的免疫微球，该免疫微球的制备方法为：将油相金纳米颗粒与巯基化介孔二氧化硅球组装合成富金构建体，再进行羧基化修饰，然后偶联链霉亲和素和生物素化抗体，即制得免疫微球；其中，所述生物素化抗体即为生物素标记的恩诺沙星单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于所述免疫微球的具体制备步骤如下：
1）油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs的合成：
在氩气下将HAuCl4·4H2O加入甲苯中，并加入油胺，于90~105℃下回流搅拌反应5~7h；反应结束后，加入乙醇，摇晃至有沉淀产生，离心弃去上清，所得沉淀均匀分散于氯仿中，即得到油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs分散液；
2）富金构建体的制备：
富金构建体的制备方法包括以下两步：
步骤A：向步骤1）所得油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs分散液中加入巯基化介孔二氧化硅球，超声均匀后，离心、风干，所得固体中加入辛基三甲氧基硅烷OTMS，超声均匀后转移至甲醇/氨水混合液中，继续超声反应20-40分钟后离心得到复合物沉淀，复合物沉淀用甲醇洗涤除去多余的辛基三甲氧基硅烷OTMS后，加入至水中搅拌15~20h后，离心、分散于乙醇中，形成中间产物分散液；
步骤B：向步骤A所得中间产物分散液中加入水、氨水、TEOS，室温搅拌反应，随后离心收集产物，洗涤，分散于乙醇中，即得到富金构建体分散液；
3）羧基化富金构建体的制备：
取步骤2）所得富金构建体分散液，搅拌下加入氨水，然后加入APTMS搅拌反应10-15h，反应结束后将产物离心，用乙醇洗涤后，得到氨基修饰的富金构建体材料；然后将所述氨基修饰的富金构建体材料分散至N,N二甲基甲酰胺中，加入琥珀酸酐反应3~5h，反应结束后将产物离心，依次用乙醇、水洗涤后，分散于水中，即得到羧基化富金构建体分散液；
4）免疫微球的制备
取步骤3）所得羧基化富金构建体分散液离心，水洗，然后加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐和pH=6.0磷酸缓冲液，37℃活化20~40min；随后离心收集产物，加入pH=7.4磷酸缓冲液和链霉亲和素，37℃摇床反应2~4h；反应结束后，离心、洗涤，然后加入pH=7.4磷酸盐缓冲液和生物素化抗体，37℃摇床反应0.5~1.5h；反应结束后，离心，用pH=7.4磷酸缓冲液洗涤数次，即得所述免疫微球，将其分散于保存液中冷藏保存。
3.如权利要求2所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于步骤1）中，HAuCl4·4H2O的质量与油胺的体积之比是1:10~15，质量的单位是g，体积的单位是mL。
4.如权利要求2所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于步骤2）的步骤A中，油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs与巯基化介孔二氧化硅球的质量比是1~5:1，优选为3:1。
5.如权利要求2所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于步骤2）的步骤A中，甲醇/氨水混合液中氨水与甲醇的体积比为0.02~0.03:1；步骤2）、步骤3）中使用的氨水浓度均是25~30%。
6.如权利要求2所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于步骤2）的步骤B中，水、氨水、TEOS三者的体积比是1:0.10~0.15:0.03~0.05；步骤2）的步骤A中油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs的质量与步骤B中TEOS的体积之比是0.05~0.25:1，优选为0.15:1，质量的单位是mg，体积的单位是uL。
7.如权利要求2所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于步骤4）中，羧基化富金构建体、链霉亲和素、生物素化抗体三者的质量之比是1：0.003~0.03：0.003~0.03，优选为1：0.006~0.0065：0.006~0.0065；步骤4）中，所述生物素化抗体即为生物素标记的恩诺沙星单克隆抗体。
8.如权利要求1所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系，其特征在于所述检测体系还包括用于检测恩诺沙星的试纸条，该试纸条包括NC膜、样品垫和吸水纸；所述样品垫、NC膜和吸水纸搭接组装，样品垫和吸水纸分别叠压在NC膜的两端，并在NC膜的表面形成检测区；所述检测区的NC膜上设置靠近样品垫的检测线区T线、靠近吸水纸的一条控制线区C线；其中，在试纸条的T线上为包被抗原，在试纸条的C线上为羊抗鼠二抗。
9.一种皮克级恩诺沙星的检测方法，采用根据权利要求1～7中任一项所述的检测体系，其特征在于该方法的具体步骤为：
M1：首先制备试纸条，试纸条包括NC膜、样品垫和吸水纸；所述样品垫、NC膜和吸水纸搭接组装，样品垫和吸水纸分别叠压在NC膜的两端，并在NC膜的表面形成检测区；所述检测区的NC膜上设置靠近样品垫的检测线区T线、靠近吸水纸的一条控制线区C线；其中，在试纸条的T线上为包被抗原，在试纸条的C线上为羊抗鼠二抗；
M2：配制一系列不同浓度的恩诺沙星溶液，将含免疫微球的分散液加入96孔板中，然后加入不同浓度的恩诺沙星溶液孵育3~10min，将步骤M1制备好的试纸条插入孵育液中层析3~10min，对试纸条的NC膜用金标读数仪进行检测分析，获得NC膜的T线及C线区域的金标读数仪测量的吸收峰信号谱图，当恩诺沙星浓度大于0ng/mL时信号谱图中T线区的峰面积与C线区的峰面积的比值为B，当恩诺沙星浓度等于0ng/mL时信号谱图中T线区峰面积与C线区峰面积为B0，B0为常数，以B/B0为纵坐标，并以恩诺沙星溶液浓度的Lg值为横坐标，进行绘制标准曲线，获得相应的线性回归方程；
M3：将含免疫微球的分散液加入96孔板中，然后加入待测样本孵育3~10min，将步骤M1制备好的试纸条插入孵育液中层析3~10min，对试纸条的NC膜用金标读数仪进行检测分析，获得NC膜的T线及C线区域的金标读数仪测量的吸收峰信号谱图，计算信号谱图中T线区的峰面积与C线区的峰面积的比值B1，并代入步骤M2的线性回归方程，即可计算得到待测样本中的恩诺沙星含量。
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