CN112557667B - 一种基于双色量子点比率荧光探针的c反应蛋白高灵敏免疫检测方法 - Google Patents
一种基于双色量子点比率荧光探针的c反应蛋白高灵敏免疫检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于双色量子点比率荧光探针的C反应蛋白高灵敏免疫检测方法，它将银纳米颗粒AgNPs偶联CRP标记抗体，再与捕获抗体对C反应蛋白进行双抗体夹心，获得双抗体夹心模型；进一步利用氰离子CN‑溶解双抗体夹心模型捕获的AgNPs，使得AgNPs释放出Ag+进行信号放大，然后加入所述双色量子点比率荧光探针，进行测量荧光光谱，即可实现C反应蛋白的定量分析；双色量子点比率荧光探针是以红色量子点为核心，并包埋于巯基化树状二氧化硅球中，且外层组装有绿色量子点，形成的双色荧光微球。本发明的方法利用CN‑腐蚀AgNPs，使其变为Ag+，基于银离子与量子点比率荧光探针之间的离子交换作用，通过荧光信号和溶液颜色的变化，从而定性和定量的检测C反应蛋白的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于双色量子点比率荧光探针的C反应蛋白高灵敏免疫检测方法。
背景技术
比率荧光探针是近年来受到广泛关注的一种新型荧光传感器，比率荧光探针通常是指使用两种不同发射波长的荧光材料构建的具有双发射特性的荧光传感器，根据两个发射峰比例的变化，建立与目标物含量之间的关系，对目标物进行定量和定性的分析。对于使用单荧光通道对目标物的检测，仅对响应的发射波长处信号进行分析，由于一些不可避免的与目标物无关的因素会对结果造成影响，例如：样品基质的光散射，激发源的波动和探针局部浓度的变化等。而比率荧光探针可通过两个荧光峰值的比值消除误差，从而获得更可靠的数据，提高检测的灵敏度，并且由于荧光颜色的变化容易被肉眼识别，实现目标物的荧光直观检测，因而在化学、生物以及环境的监测与分析等方面有较多应用。
通常使用量子点和有机染料作为比率探针的荧光信号。相比于有机染料，由于量子点显示出狭窄的发射峰，在宽波长范围内的光吸收，耐光漂白性和高量子产率等特性，量子点已越来越多地应用于涉及荧光的生物技术研究。量子点比率荧光微球通常是将水相量子点通过包埋或者共价偶联的方式制备，但是水相量子点表面配体在修饰过程中容易被破坏，可能影响最终的荧光强度，无法准确调控荧光比率。并且，由于水溶性量子点荧光产率低，性质不稳定，在应用方面也受到一定的限制；一般具有高发光性能，单分散性好，色纯度高的量子点通常在油相合成。在油相中合成的量子点表面包裹有一层有机配体分子，性质稳定，但具有疏水性。因此，发展油相量子点的可控组装、色调调控，以及相转移修饰策略，对于比率荧光探针传感体系的开发及其可视化/定量免疫诊断应用具有重要意义。
二氧化硅微球具有较高的光学透明度，尺寸可以控制，合成方法相对较为简单，并且可以进行多种表面硅烷化修饰，是一种优良的纳米载体。目前有报道利用微球模板对水溶性量子点或荧光分子的负载来制备双色荧光微球。例如，Li等人利用硅酸四乙酯水解形成硅层，在水相中将水溶性量子点包裹在硅层内形成荧光微球，对硅球表面进行氨基修饰，用碳二亚胺活化水溶性量子点的羧基，然后通过酰胺键负载在荧光微球表面，得到比率荧光微球。此外，Lu等人通过向体系中加入乳化剂，将量子点和碳点以一定比例混合，利用硅酸四乙酯的水解将两种荧光物质包埋在硅球内，形成荧光微球。然而，上述方法需要对量子点进行一定的修饰，因此在组装过程中可能导致量子点表面配体脱落，导致荧光猝灭，同时负载效率低，且最终得到的微球的荧光强度比具有随机性。树状二氧化硅微球具有大的比表面积，孔道高度开放，本身具有易功能化的特点，使得其在人工载药、仿生传感、生物医学等方面具有广泛的应用。
本发明的方法将带有金属亲和性表面（巯基化改性）的树状二氧化硅球与油溶性量子点在有机相中直接组装，不仅组装效率高，而且避免了复杂繁琐的量子点相转移等前处理，有利于量子产率的保持。同时由于油溶性量子点的性质稳定，因此在制备比率探针的过程中可以通过次序分层次组装，精确控制两种颜色的量子点的组装量，获得指定荧光强度比例的双色荧光微球。
免疫分析是基于抗体-抗原高度特异性识别的蛋白检测方法。如今已广泛应用于生物医学诊断、生物和生化研究等领域。酶联免疫反应（ELISA）是免疫测定的一种非常重要的形式。将信号放大与荧光比色传感机制引入传统ELISA检测方法，能够将吸光度检测模式转化为可肉眼识别以及高灵敏定量的比率荧光模式，并通过信号放大机制提高检测灵敏度，为提升传统免疫检测平台的分析性能提供了新思路。基于此，本发明的方法利用银纳米颗粒（AgNPs）标记抗体与捕获抗体对C反应蛋白（CRP）进行双抗体夹心；进一步利用氰离子（CN-）溶解捕获的AgNPs，释放出大量银离子（Ag+），通过银离子与微球表面量子点发生离子交换作用，对外层量子点荧光进行猝灭，而内层量子点荧光完好保持，实现基于抗原浓度的微球颜色连续变化（由绿至红），即可同时进行肉眼可视化判读以及荧光光谱定量分析。
发明内容
针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于双色量子点比率荧光探针的C反应蛋白高灵敏免疫检测方法，本发明的目的是利用金属的配位作用，将性质比较稳定的油溶性量子点直接负载到巯基化树状二氧化硅球里，实现量子点的高效组装。然后对复合微球进行硅烷化以及巯基修饰后，负载另一波长的量子点，通过控制量子点的加入量，从而得到不同比率的荧光探针；同时，利用柠檬酸钠，抗坏血酸和硝酸银，制备尺寸均一的AgNPs，利用静电吸附偶联抗体的方式，将AgNPs偶联抗体，使得AgNPs的优良性质可以广泛的应用到免疫分析检测中。
本发明公开了一种利用树状二氧化硅微球作为亲和模板，负载两种粒径均一、波长不同的量子点，通过修饰得到性质稳定、荧光比率可调、生物相容性好的荧光比率信号探针的合成方法，尺寸均一的AgNPs的合成方法以及利用双抗体夹心ELISA（直接ELISA）检测抗原—C反应蛋白。利用CN-腐蚀AgNPs，使其变为Ag+，基于银离子与量子点比率荧光探针之间的离子交换作用，通过荧光信号和溶液颜色的变化，从而定性和定量的检测C反应蛋白的浓度。
本发明实现了以下技术效果：1、以巯基化树状二氧化硅球为金属亲和模板，直接在有机相中实现对油溶性量子点的高密度负载；2、发展了双色量子点的分层次序组装，实现不同波段荧光强度的精确独立调控；3、通过二氧化硅中间层与表面有机硅薄层的多层级结构，构建双波段荧光对外来金属离子（如Ag+）的选择性响应机制，实现检测波段猝灭-参比波段恒定的荧光色调变化。
所述的一种基于双色量子点比率荧光探针的C反应蛋白高灵敏免疫检测方法，其特征在于包括以下过程：
1）所述双色量子点比率荧光探针是以红色量子点为核心，并包埋于巯基化树状二氧化硅球中，且巯基化树状二氧化硅球的外层组装有绿色量子点，形成双色荧光微球；其中，所述红色量子点为发红色荧光的CdSe/CdS/ZnS量子点，所述绿色量子点为发绿色荧光的CdZnSe/CdS/ZnS量子点；
2）将银纳米颗粒AgNPs偶联CRP标记抗体，获得银纳米颗粒AgNPs标记抗体；然后利用银纳米颗粒AgNPs标记抗体与捕获抗体对C反应蛋白进行双抗体夹心，获得双抗体夹心模型；进一步利用氰离子CN-溶解双抗体夹心模型捕获的AgNPs，使得AgNPs释放出Ag+进行信号放大，然后加入步骤1）的双色荧光微球，通过AgNPs释放出的Ag+与双色荧光微球表面的绿色量子点发生离子交换作用，对双色荧光微球外层的绿色量子点荧光进行猝灭，而双色荧光微球内层的红色量子点荧光完整保持，实现基于C反应蛋白浓度与双色荧光微球颜色变化之间的关系，即可同时进行肉眼可视化判读以及荧光光谱定量分析。
所述的一种基于双色量子点比率荧光探针的C反应蛋白高灵敏免疫检测方法，其特征在于步骤1）中，所述双色量子点比率荧光探针的制备方法为：以红色量子点为核心，并包埋于巯基化树状二氧化硅球中，然后经硅烷化处理、巯基化处理，加入绿色量子点，超声组装、硅烷化处理后，即得到双色荧光微球。
所述的一种基于双色量子点比率荧光探针的C反应蛋白高灵敏免疫检测方法，其特征在于步骤2）中，银纳米颗粒AgNPs偶联CRP标记抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1：在柠檬酸钠和抗坏血酸的混合水溶液中，用碱将溶液pH至调至9.5~10.5，加入AgNO3搅拌均匀后，在90-110℃下反应1-3h，即制得银纳米颗粒AgNPs；
S2：取步骤S1制得的AgNPs加入碳酸钾溶液中，将溶液pH值调至8-8.5，然后加入CRP-C6抗体，CRP-C6抗体与AgNPs的质量比为1:30~50，室温搅拌0.5-2h后，加入BSA水溶液和PEG-20000水溶液搅拌20-60min，离心，所得固体保存于蛋白保存缓冲液中，即制得银纳米颗粒AgNPs偶联CRP标记抗体。
所述的一种基于双色量子点比率荧光探针的C反应蛋白高灵敏免疫检测方法，其特征在于步骤2）中，所述捕获抗体为CRP-C2抗体。
所述的一种基于双色量子点比率荧光探针的C反应蛋白高灵敏免疫检测方法，其特征在于步骤2）中，利用银纳米颗粒AgNPs标记抗体与捕获抗体对C反应蛋白进行双抗体夹心的过程为：
M1：将CRP-C2抗体用pH=9.5~10的碳酸盐缓冲液稀释后，以每孔100μL滴入板条中，于4℃下封闭16h，随后洗板；
M2：加入体积分数3% BSA水溶液，室温封闭2h，随后洗板；
M3：加入不同浓度的C反应蛋白，37℃反应1h，再进行洗板后，加入银纳米颗粒AgNPs偶联CRP-C6抗体，37℃反应1h，随后洗板，即操作完成。
所述的一种基于双色量子点比率荧光探针的C反应蛋白高灵敏免疫检测方法，其特征在于利用银纳米颗粒AgNPs标记抗体与捕获抗体对C反应蛋白进行双抗体夹心后，进一步检测C反应蛋白浓度的过程为：向步骤M3操作后的混合液中加入CN-，置于摇床37℃，转速50~150rpm，振荡反应0.5-1.5h，随后加入所述双色荧光微球，猝灭反应5-30min，观察溶液颜色，并测量荧光光谱。
相对于现有技术，本发明取得的有益效果是：
1）采用高发光及稳定性的油溶性量子点，并发展有机相中量子点的直接亲和组装方法，无需对量子点表面进行任何改性和修饰。
2）利用巯基和金属间的配位作用，实现量子点在树状二氧化硅球上的高密度负载。
3）发展模板化分层次序组装方法，可根据需要控制红绿两种颜色量子点的组装量，精确调节比率荧光微球的比率和颜色。
4）借助正辛基三甲氧基硅烷（OTMS）对量子点表面包覆（疏水相互作用），实现量子点微球的相转移，有效避免了常规配体替换方法造成的量子点发光效率下降。
5）通过二氧化硅中间层与表面有机硅薄层的多层级结构，构建双波段荧光对外来金属离子（如Ag+）的选择性响应机制，实现检测波段猝灭-参比波段恒定的荧光色调变化。
6）利用酶标板，制备的信号探针和双抗体夹心的方法，形成免疫三明治结构；利用CN-腐蚀AgNPs，释放大量Ag+，并进一步猝灭外层绿色荧光信号，实现溶液荧光随抗原浓度增大由绿至红的逐渐变化，同时适合可视化及光谱定量分析。
附图说明
图1为实施例4制得的巯基化二氧化硅球产物以及实施例5制得的SQ、SQS-SH以及SQSQ材料的TEM表征结果对比图；
图2为实施例4制得的巯基化二氧化硅球产物以及实施例5制得的SQ、SQS-SH以及SQSQ材料的SEM表征结果对比图；
图3为实施例5中使用的G-QDs、R-QDs以及实施例5最终制得的SQSQ材料的荧光发射光谱的测试结果对比图；
图4为实施例5最终制得的SQSQ材料作用于不同银离子浓度的测试体系下的荧光发射光谱的测试结果对比图；
图5为实施例5最终制得的SQSQ材料作用于不同CRP抗原浓度的测试体系下的荧光发射光谱的测试结果对比图；
图6为基于图5中的荧光发射光谱图，绘制得到的测试体系的I527/I623对CRP抗原浓度（0-1000ng/mL）的非线性拟合图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
以下实施例中，本发明所使用的盐酸浓度为36%-38%，氨水浓度为25%-28%，硅酸钠溶液浓度为12%-13%。本发明中说明的溶液，是指混合均匀的分散液。
实施例1：
将0.068 g三乙醇胺（TEA）加入到25 mL超纯水中，在80 ℃油浴中轻轻磁力搅拌反应30 min，将0.38 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和0.168g水杨酸钠（NaSal）加入到上述溶液中，继续搅拌反应1 h，之后将4 mL正硅酸四乙酯（TEOS）加入到上述水-CTAB-NaSal-TEA溶液中，继续搅拌反应3 h后将产物用无水乙醇洗三遍并分散于乙醇中。将上一步产物超声成均相后，离心过滤，所得产物加入到50 mL盐酸和50 mL甲醇的混合液中，在60℃水浴中磁力搅拌反应6 h两次，随后将产物用无水乙醇洗三遍，得到平均直径300nm、平均孔径25nm的树状二氧化硅微球（树状二氧化硅微球的平均直径是通过马尔文粒度仪和SEM检测共同测得的，孔径就是大致通过SEM检测观察得到的结果，下同）。将所得树状二氧化硅微球分散于100 mL乙醇中。
其中，产物加入到50 mL盐酸和50 mL甲醇的混合液中，在60℃水浴中磁力搅拌反应6 h两次的具体过程为：产物加入到50 mL盐酸和50 mL甲醇的混合液中，在60℃水浴中磁力搅拌反应6 h后，离心过滤，所得产物再按照同样的方式重复处理一次，最后再离心过滤，得到处理后的产物。
实施例2：
将0.068 g三乙醇胺（TEA）加入到25 mL超纯水中，在80 ℃油浴中轻轻磁力搅拌反应30 min，将0.38 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和0.252g水杨酸钠（NaSal）加入到上述溶液中，继续搅拌反应1 h，之后将4 mL正硅酸四乙酯（TEOS）加入到上述水-CTAB-NaSal-TEA溶液中，继续搅拌反应3 h后将产物用无水乙醇洗三遍并分散于乙醇中。将上一步产物超声成均相后，离心过滤，所得产物加入到50 mL盐酸和50 mL甲醇的混合液中，在60 ℃水浴中磁力搅拌反应6 h两次，随后将产物用无水乙醇洗三遍，得到平均直径300nm、平均孔径30 nm的树状二氧化硅微球。将所得树状二氧化硅微球分散于100 mL乙醇中。
实施例3：
将0.068 g三乙醇胺（TEA）加入到25 mL超纯水中，在80 ℃油浴中轻轻磁力搅拌反应30 min，将0.38 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和0.286g水杨酸钠（NaSal）加入到上述溶液中，继续搅拌反应1 h，之后将4 mL正硅酸四乙酯（TEOS）加入到上述水-CTAB-NaSal-TEA溶液中，继续搅拌反应3 h后将产物用无水乙醇洗三遍并分散于乙醇中。将上一步产物超声成均相后，离心过滤，所得产物加入到50 mL盐酸和50 mL甲醇的混合液中，在60℃水浴中磁力搅拌反应6 h两次，随后将产物用无水乙醇洗三遍，得到平均直径300nm、平均孔径32nm的树状二氧化硅微球。将所得树状二氧化硅微球分散于100 mL乙醇中。
实施例4：
取100 mL实施例1制备的树状二氧化硅的乙醇分散液，加入1.25 mL氨水，并加入0.5 mL（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷(MPTMS)，室温下搅拌12h，离心收集产物，乙醇洗三次，即制得巯基化二氧化硅球产物。实施例4制得的巯基化二氧化硅球产物最后保存在25mL乙醇溶液中，冰箱4℃储存。
实施例4制得的巯基化二氧化硅球产物从乙醇溶液中取出后，干燥，然后进行材料表征。实施例4的巯基化二氧化硅球的TEM图及SEM图分别如图1中的A1分图和图2中的A1分图所示。
参见图1-2，通过SEM图和TEM图中的A1能够看出，实施例4中合成了具有树状结构、孔径较为均一的二氧化硅微球结构。
实施例5：
硅烷化的二氧化硅/双色量子点荧光微球的制备方法，包括以下步骤：
1）取1 mL实施例4的巯基化二氧化硅球的乙醇溶液离心，沉淀中加入10 mg mL-1 CdSe/CdS/ZnS红色量子点的氯仿溶液0.1mL，超声得到红色均相溶液。离心，得到二氧化硅/红色量子点复合物沉淀。将二氧化硅/量子点微球沉淀物在空气中稍微干燥后，加入100 μL正辛基三甲氧基硅烷（OTMS），沉淀溶解后得到均相溶液。将该溶液转入7.5 mL甲醇及187.5μL氨水混合溶液中反应30 min。离心，用甲醇洗涤沉淀一次。将沉淀分散于16.5 mL水中并加入33 μL硅酸钠溶液，在室温下搅拌过夜，离心，所得沉淀即为硅烷化的二氧化硅/量子点荧光微球，将其标记为SQ材料。
2）将步骤1）所得SQ材料分散于30 mL水-乙醇混合液中（乙醇与水的体积比为4:1），加0.75 mL氨水和360 μL硅酸四乙酯，室温搅拌12 h。将溶液离心并用乙醇洗涤3次，沉淀分散于10 mL乙醇中。向上述10 mL乙醇溶液中加入30 mL乙醇及1 mL氨水，混合均匀后加入200 μL MPTMS，室温条件下搅拌过夜，离心用乙醇洗三次，所得洗涤后的沉淀即为巯基化的二氧化硅/量子点/二氧化硅微球，将其标记为SQS-SH材料。
3）向步骤2）所得SQS-SH沉淀中加入10mg mL-1 CdZnSe/CdS/ZnS绿色量子点的氯仿溶液0.3 mL，超声得到均相绿色透明溶液。离心得到二氧化硅/绿色量子点复合物沉淀。向二氧化硅/绿色量子点复合物沉淀中加入100 μL正辛基三甲氧基硅烷，沉淀溶解得到均相溶液。加入7.5 mL甲醇及187.5 μL氨水后反应30 min。离心，用甲醇洗涤沉淀一次。将上述沉淀分散于16.5 mL水中并加入33 μL硅酸钠溶液，在室温下搅拌过夜，离心，所得沉淀即为得到硅烷化的二氧化硅/双色量子点荧光微球，将其标记为SQSQ材料。实施例5制得的双色量子点比率荧光探针（即SQSQ材料）保存在20mL 乙醇中，得到双色量子点比率荧光探针的乙醇，以便将其应用于后面实施例7和实施例9的检测中。
实施例5所得SQ、SQS-SH及SQSQ分别进行干燥后进行表征，SQ、SQS-SH及SQSQ材料的TEM图分别如图1中的分图A2、分图A3和分图A4所示，SQ、SQS-SH及SQSQ材料的SEM图分别如图2中的分图A2、分图A3和分图A4所示。
参见图1-2，通过 SEM图和TEM图中的A2能够看出，红色量子点已经负载到了二氧化硅微球的孔道里，通过SEM图的A2能看出二氧化硅微球的孔道里有红色量子点的存在。
通过SEM图和TEM图中的A3可以看出，二氧化硅微球表面的孔道已经被二氧化硅完全包裹，成为了一个较为光滑的球体，能够比较好地保护内部的红色量子点不被银离子猝灭，通过TEM图的A3能看出包裹的二氧化硅层的厚度大约有10nm左右。
通过SEM图和TEM图中的A4可以看出，绿色量子点完全负载到了二氧化碳微球的外表面。
将实施例5中使用的CdSe/CdS/ZnS红色量子点标记为R-QDs，将实施例5中使用的CdZnSe/CdS/ZnS绿色量子点标记为G-QDs。将所述G-QDs、R-QDs以及实施例5最终制得的SQSQ材料分别进行荧光光谱检测，其三者的荧光发射光谱的测试结果汇总于图3中。其中进行荧光光谱检测的测试条件为：365nm激发光源下，激发狭缝5nm，发射狭缝5nm，扫描速度1500nm/min。
图3中是为了将G-QDs、R-QDs以及SQSQ进行荧光发射光谱的均归一化处理，归一化处理的目的是为了方便观察树状二氧化硅微球组装完量子点后，量子点的荧光峰值是否发生偏移，根据图3中发现几乎没有偏移。
实施例6：
硅烷化的二氧化硅/双色量子点荧光微球的制备方法，包括以下步骤：
1）取1 mL实施例4的巯基化二氧化硅球的乙醇溶液离心，沉淀中加入10 mg mL-1 CdSe/CdS/ZnS红色量子点的氯仿溶液0.1mL，超声得到红色均相溶液。离心，得到二氧化硅/红色量子点复合物沉淀。将二氧化硅/量子点微球沉淀物在空气中稍微干燥后，加入100 μL正辛基三甲氧基硅烷（OTMS），沉淀溶解后得到均相溶液。将该溶液转入7.5 mL甲醇及187.5μL氨水混合溶液中反应30 min。离心，用甲醇洗涤沉淀一次。将沉淀分散于16.5 mL水中并加入33 μL硅酸钠溶液，在室温下搅拌过夜得到硅烷化的二氧化硅/量子点荧光微球。离心，将沉淀分散于30 mL水-乙醇混合液中（乙醇与水的体积比为4:1），加0.75 mL氨水，360 μL硅酸四乙酯，室温搅拌12 h。将溶液离心并用乙醇洗涤3次，沉淀分散于10 mL乙醇中。
2）向上述10 mL乙醇溶液中加入30 mL乙醇及1 mL氨水，混合均匀后加入200 μLMPTMS，室温条件下搅拌过夜，离心用乙醇洗三次，向沉淀中加入10mg mL-1 CdZnSe/CdS/ZnS绿色量子点的氯仿溶液0.5 mL，超声得到均相绿色透明溶液。离心得到二氧化硅/绿色量子点复合物沉淀。向二氧化硅/量子点微球沉淀中加入100 μL正辛基三甲氧基硅烷，沉淀溶解得到均相溶液。加入7.5 mL甲醇及187.5 μL氨水后反应30 min。离心，用甲醇洗涤沉淀一次。将上述沉淀分散于16.5 mL水中并加入33 μL硅酸钠溶液，在室温下搅拌过夜得到硅烷化的二氧化硅/双色量子点荧光微球。
实施例7：
测试实施例5制备的SQSQ材料，对不同浓度的银离子溶液猝灭实验，实验过程如下：
测试体系：990微升不同浓度的硝酸银溶液中，加入10微升实施例5保存的双色量子点比率荧光探针的乙醇溶液，反应十分钟，测量荧光光谱，拍摄荧光照片。测试体系中银离子浓度分别为0μM、0.1μM、0.2μM、0.4μM、和0.8μM。
进行荧光光谱检测的测试条件为：365nm激发光源下，激发狭缝5nm，发射狭缝5nm，扫描速度1500nm/min。
对于上述0μM、0.1μM、0.2μM、0.4μM、和0.8μM银离子浓度的测试体系分别进行荧光光谱检测，将测试结果汇总于图4中。
从图4中可以看出，随着银离子浓度的增加，测试体系溶液颜色从绿色逐渐变到红色。随着银离子浓度的增加，测试的荧光光谱强度逐渐降低。
实施例8：
将80mL含有0.3mM柠檬酸钠和0.6mM抗坏血酸的水溶液，用0.1M氢氧化钠溶液将pH调至10，然后加入0.1M浓度的AgNO3水溶液0.8mL，然后在30℃水浴中以900rpm速度搅拌，保持15min，然后在100℃的油浴锅中反应2h，离心，得到合成的AgNPs产物。
取4mg合成的AgNPs，加入130微升的0.2mol/L碳酸钾溶液中，将溶液pH调制8-8.5，加入0.1mg CRP-C6抗体，室温搅拌1h，加入40μL 20%BSA水溶液和20μL 20% PEG-20000水溶液，室温搅拌30min，8000rpm下离心15min，得到合成的AgNPs偶联CRP标记抗体产物保存在2mL蛋白保存缓冲液（pH=7.4的20mM PB，2.5%BSA，1%蔗糖）中，获得AgNPs偶联CRP标记抗体的保存溶液。
实施例9：
用pH为9.5-10的10mM碳酸盐缓冲液将CRP-C2抗体稀释至6.0μg/mL，以每孔100μL滴入板条中，4℃避光封闭16h，用pH=7.4的10mM PBST洗两次，加入3%BSA水溶液，室温封闭2h，pH=7.4的10mM PBST洗两次，加入100μL 不同浓度的CRP抗原，37度反应1h，pH=7.4的10mM PBST洗四次，加入100μL 实施例8中保存的AgNPs偶联CRP标记抗体的保存溶液，37度反应1h，pH=7.4的10mM PBST洗四次，加入200μL 4mM CN-溶液，摇床37度，转速100ppm，反应1h，形成酶联免疫反应的最终溶液产物。
所述酶联免疫反应的最终溶液产物中，CRP抗原的浓度分别为0、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL以及1μg/mL的条件下，使用实施例5制备的SQSQ材料对其进行免疫检测，实验过程如下：向200μL酶联免疫反应的最终溶液产物中，加入10μL实施例5保存的双色量子点比率荧光探针的乙醇溶液，再用790μL的水，将总体积调至1毫升，方便测量荧光光谱，反应10min，观察溶液颜色，测量荧光光谱。
进行荧光光谱检测的测试条件为：365nm激发光源下，激发狭缝5nm，发射狭缝5nm，扫描速度1500nm/min。
对于在实施例5制备的二氧化硅/量子点荧光微球的作用下，对于上述0、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL以及1μg/mL CRP抗原浓度的测试体系分别进行荧光光谱检测，将测试结果汇总于图5中。
根据图5中可以看出，随着抗原浓度的不断升高，绿色量子点的荧光峰值不断减少，结论是随着抗原浓度的不断升高，酶联免疫反应捕获的银纳米颗粒也就不断增多，绿色量子点的猝灭效果也就不断增强，变色幅度也就越来越大。
根据图5中的结果，计算测试体系在527nm处的荧光强度与623处的荧光强度的比值，记为I527/I623。由此，绘制测试体系的I527/I623对CRP抗原浓度（0-1000ng/mL）的非线性拟合图，结果如图6所示。
从图6中能够更加直观地看出绿红荧光比的不断降低，从而直接证明了双色量子点比率荧光探针在C反应蛋白方面的检测应用是成功的。
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。
Claims (6)
1.一种基于双色量子点比率荧光探针的C反应蛋白高灵敏免疫检测方法，其特征在于包括以下过程：
1）所述双色量子点比率荧光探针是以红色量子点为核心，并包埋于巯基化树状二氧化硅球中，且巯基化树状二氧化硅球的外层组装有绿色量子点，形成双色荧光微球；其中，所述红色量子点为发红色荧光的CdSe/CdS/ZnS量子点，所述绿色量子点为发绿色荧光的CdZnSe/CdS/ZnS量子点；
2）将银纳米颗粒AgNPs偶联CRP标记抗体，获得银纳米颗粒AgNPs标记抗体；然后利用银纳米颗粒AgNPs标记抗体与捕获抗体对C反应蛋白进行双抗体夹心，获得双抗体夹心模型；进一步利用氰离子CN-溶解双抗体夹心模型捕获的AgNPs，使得AgNPs释放出Ag+进行信号放大，然后加入步骤1）的双色荧光微球，通过AgNPs释放出的Ag+与双色荧光微球表面的绿色量子点发生离子交换作用，对双色荧光微球外层的绿色量子点荧光进行猝灭，而双色荧光微球内层的红色量子点荧光完整保持，实现基于C反应蛋白浓度与双色荧光微球颜色变化之间的关系，即可同时进行肉眼可视化判读以及荧光光谱定量分析。
2.如权利要求1所述的一种基于双色量子点比率荧光探针的C反应蛋白高灵敏免疫检测方法，其特征在于步骤1）中，所述双色量子点比率荧光探针的制备方法为：以红色量子点为核心，并包埋于巯基化树状二氧化硅球中，然后经硅烷化处理、巯基化处理，加入绿色量子点，超声组装、硅烷化处理后，即得到双色荧光微球。
3.如权利要求1所述的一种基于双色量子点比率荧光探针的C反应蛋白高灵敏免疫检测方法，其特征在于步骤2）中，银纳米颗粒AgNPs偶联CRP标记抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1：在柠檬酸钠和抗坏血酸的混合水溶液中，用碱将溶液pH至调至9.5~10.5，加入AgNO3搅拌均匀后，在90-110℃下反应1-3h，即制得银纳米颗粒AgNPs；
S2：取步骤S1制得的AgNPs加入碳酸钾溶液中，将溶液pH值调至8-8.5，然后加入CRP-C6抗体，CRP-C6抗体与AgNPs的质量比为1:30~50，室温搅拌0.5-2h后，加入BSA水溶液和PEG-20000水溶液搅拌20-60min，离心，所得固体保存于蛋白保存缓冲液中，即制得银纳米颗粒AgNPs偶联CRP标记抗体。
4.如权利要求1所述的一种基于双色量子点比率荧光探针的C反应蛋白高灵敏免疫检测方法，其特征在于步骤2）中，所述捕获抗体为CRP-C2抗体。
5.如权利要求4所述的一种基于双色量子点比率荧光探针的C反应蛋白高灵敏免疫检测方法，其特征在于步骤2）中，利用银纳米颗粒AgNPs标记抗体与捕获抗体对C反应蛋白进行双抗体夹心的过程为：
M1：将CRP-C2抗体用pH=9.5~10的碳酸盐缓冲液稀释后，以每孔100μL滴入板条中，于4℃下封闭16h，随后洗板；
M2：加入体积分数3% BSA水溶液，室温封闭2h，随后洗板；
M3：加入不同浓度的C反应蛋白，37℃反应1h，再进行洗板后，加入银纳米颗粒AgNPs偶联CRP标记抗体，37℃反应1h，随后洗板，即操作完成。
6.如权利要求4所述的一种基于双色量子点比率荧光探针的C反应蛋白高灵敏免疫检测方法，其特征在于利用银纳米颗粒AgNPs标记抗体与捕获抗体对C反应蛋白进行双抗体夹心后，进一步检测C反应蛋白浓度的过程为：向步骤M3操作完成后的混合液中加入CN-，置于摇床37℃，转速50~150rpm，振荡反应0.5-1.5h，随后加入所述双色荧光微球，猝灭反应5-30min，观察溶液颜色，并测量荧光光谱。
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