CN109669044A - 基于双色量子点联合检测saa和crp的荧光免疫吸附检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

基于双色量子点联合检测saa和crp的荧光免疫吸附检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了基于双色量子点联合检测SAA和CRP的荧光免疫吸附检测试剂盒及其制备方法，属于体外诊断检测技术领域。荧光免疫吸附检测试剂盒，充分利用量子点多色标记优势和抗体抗原特异性反应的特点，在同一个酶标板孔中包被两种抗体，形成两种“包被抗体‑待测抗原‑量子点标记抗体”的双抗体夹心法，建立了简便、灵敏、稳定的新型多种标志物的检测方法。相比传统的ELISA法，本方法不仅节省检测样本用量，缩短检测时间，而且可提高检测效率，有利于节约检测成本，降低医疗费用。

Description

基于双色量子点联合检测SAA和CRP的荧光免疫吸附检测试剂 盒及其制备方法
技术领域
本发明属于体外诊断检测技术领域，具体基于双色量子点联合检测SAA 和CRP的荧光免疫吸附检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
C-反应蛋白(CRP)是由肝细胞合成的一种急性相蛋白。通常情况下， CRP在血清中低水平存在，但在炎症、感染、组织损伤时，CRP在细胞因子等的刺激下数小时就开始升高，48小时即可达峰值，其浓度有的可显著升高1000倍。CRP水平还与恶性肿瘤、自身免疫性疾病的活动期(风湿热、系统性红斑狼疮、类风湿等)、糖尿病、新生儿脓毒症等有密切关系。因此， CRP作为炎症重要标志物的检测在临床应用相当广泛。同时研究发现低水平的CRP与心血管疾病的发生有着密切的关系，是心血管炎症病变的生物标志物。
同CRP类似，血清淀粉样蛋白A(SAA)也是一种高度异质性的急性相反应蛋白，在正常人血液中低水平存在。当机体受到感染、外伤等刺激时 SAA浓度上升极快在48h之内可增加数百倍至一千倍，升幅高于CRP。其半衰期仅为50分钟左右，在炎症或感染急性期迅速升高，并在疾病的恢复期迅速下降，因此监测感染急性期反应，SAA是比CRP即更敏感的指标。同时研究显示，SAA在细菌、病毒感染、心血管疾病等疾病中均可检测到其水平的升高。
中国医药教育协会感染疾病专业委员会在《感染相关生物标志物临床意义解读专家共识》中指出，没有任何一个生物标志物是绝对敏感又绝对特异的，不能单凭某个生物标志物的改变来诊断疾病，只有结合、参照患者的临床表现与其它实验室检查结果，才能做出正确的判断。因此在诊断感染性相关疾病时，单独使用某一种指标不能有效的进行临床准确诊断，而将有关炎症标志物如SAA和CRP等联合检测，并与临床资料相结合，将有利于临床上对疾病做出更准确的诊断(如图1)。
虽然已报道有基于胶体金和稀土荧光免疫层析试纸条同时检测CRP和SAA的有关检测方法，但检测结果仅能做到半定量或定量，具有较低的灵敏度和稳定性。之前，酶联免疫吸附法是测定患者血清中超敏CRP的常用方法之一。近些年来，化学发光免疫分析是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，具有较高的灵敏度。在大多数三级医院，化学发光已基本取代酶联免疫成为主流，但是化学发光检测试剂盒检测费用高、且稳定性和灵敏度有待进一步提高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高稳定、高灵敏的基于双色量子点联合检测SAA和CRP的荧光免疫吸附检测试剂盒及其制备方法。
本发明提供的基于双色量子点联合检测SAA和CRP的荧光免疫吸附检测试剂盒，包括：量子点A标记的C-反应蛋白抗体2、量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2、包被C-反应蛋白抗体1和血清淀粉样蛋白A抗体1 的检测板、C-反应蛋白标准品溶液、血清淀粉样蛋白A标准品溶液、样品稀释液、标记抗体稀释液和洗涤液；
所述量子点A和量子点B的发射波长范围为450～800nm，所述量子点 A和量子点B的发射波长相差50～300nm；
所述量子点A为表面羧基化的水相量子点A；所述量子点B为表面羧基化的水相量子点B。
优选的，所述量子点A和量子点B包括CdSe/ZnS、ZnCdSeS/ZnS、 ZnxCd1-xSe、ZnSe、Cu掺杂的ZnSe、Mn掺杂的ZnSe和InP量子点中的两个。
优选的，所述量子点A标记的C-反应蛋白抗体2或量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2的浓度为1μg/μL～2μg/μL。
优选的，所述C-反应蛋白抗体1的包被浓度为1～10μg/mL。
优选的，所述血清淀粉样蛋白A抗体1的包被浓度为1～10μg/mL。
优选的，所述样品稀释液为含有体积浓度10％新生牛血清的0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液，所述样品稀释液的pH值为7.4。
优选的，所述标记抗体稀释液为含有质量浓度0.5％牛血清白蛋白的0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液，所述标记抗体稀释液的pH值为7.4。
优选的，所述洗涤液为含有体积浓度0.05％吐温20的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述洗涤液的pH值为7.4。
本发明提供的所述荧光免疫吸附检测试剂盒的制备方法，包括量子点A 标记的C-反应蛋白抗体2或量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2的制备方法和包被C-反应蛋白抗体1的检测板或包被血清淀粉样蛋白A抗体1 的检测板的制备方法；
所述量子点A标记的C-反应蛋白抗体2或量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2的制备方法包括以下步骤：
1)将表面包覆羧基的水相量子点活化，得到活化后的量子点A或量子点B；
2)将活化后的量子点A与C-反应蛋白抗体2偶联或将活化后的量子点 B与血清淀粉样蛋白A抗体2偶联，得到量子点A标记的C-反应蛋白抗体 2或量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2；
所述包被C-反应蛋白抗体1的检测板或包被血清淀粉样蛋白A抗体1 的检测板的制备方法，包括以下步骤：
A.用包被液溶解C-反应蛋白抗体1或血清淀粉样蛋白A抗体1，得到标记抗体溶液；
B.将所述标记抗体溶液注入检测板的每个孔中，静置过夜，弃去包被液，洗涤，得到包被标记抗体的检测板；
C.用封闭液封闭所述包被标记抗体的检测板，孵育，弃去封闭液，干燥。
优选的，步骤1)所述活化的方法是将含有表面包覆羧基的水相量子点 A或表面包覆羧基的水相量子点B的BS溶液、含S-NHS的BS溶液和含有 EDC的MES溶液按照体积比为18:1:1混合，超声处理，固液分离，得到的沉淀为活化后的量子点A或量子点B；
所述表面包覆羧基的水相量子点A或表面包覆羧基的水相量子点B的 BS溶液为包含0.83mg/mL表面包覆羧基的水相量子点A或表面包覆羧基的水相量子点B的0.005mol/L的BS溶液；
所述含S-NHS的BS溶液为含有0.049mg/μL S-NHS的0.005mol/L BS 溶液；所述含有EDC的MES溶液为含有0.017mg/μL EDC的0.005mol/L MES溶液。
本发明提供的基于双色量子点联合检测SAA和CRP的荧光免疫吸附检测试剂盒，采用双色量子点作为荧光标记物，根据发射波长的差异，用发光峰位不同的量子点分别标记不同物质的抗体，将两种标记的抗体同时用于免疫吸附检测，根据免疫复合物中荧光强度的变化得到待测物质中炎症因子 CRP和SAA物质的浓度，即可同时准确检测出同一样本中SAA和CRP的含量，从而实现SAA和CRP的联合检测。同时量子点具有荧光强度强且稳定、量子产率高、半峰宽窄、生物相容性好的特点，且具有宽激发窄发射等优势，与酶联免疫吸附法(ELISA)相比，本发明提供的检测试剂盒检测灵敏度高，同时减少了加入底物显色的步骤，降低了技术难度和操作误差。实验证明：所述试剂盒对C-反应蛋白(CRP)最低检测限(LOD＝3SD/K)为 6.37ng/mL，对血清淀粉样蛋白A(SAA)最低检测限(LOD＝3SD/K)为2.39 ng/mL。通过绘制CRP标准品的标准曲线，结果表明检测范围是5～1000 ng/mL，R2＝0.998；绘制SAA标准品的标准曲线，检测范围是5～1000ng/mL， R2＝0.992。由此可见，本发明提供的检测试剂盒具有检测范围广且检测结果稳定准确的特点。
同时，本发明提供的试剂盒，通过添加回收率实验，计算每种添加物质的回收率，结果表明：阴性血清样本中CRP和SAA两种物质的添加回收率在92.13％～101.85％之间，相对标准偏差小于15％，符合准确度的测定标准。经特异性实验表明CRP(或SAA)物质与相应的抗体之间特异性较好好，不受SAA(或CRP)、降钙素原、L-半胱酰胺、DL-异性半胱酰胺、谷胱甘肽和碱性磷酸酶等物质的干扰，检测结果准确可靠。
附图说明
图1临床常见检测CRP和SAA的组合方式图；
图2为本发明中双色量子点联合定量检测生物标志物CRP和SAA的荧光免疫吸附法(QD-FLISA)示意图；
图3为激发波长365nm条件下红绿双色量子点的发射图谱；
图4为CRP标准品的标准曲线；
图5为SAA标准品的标准曲线；
图6为检测C反应蛋白(CRP)的特异性柱形图；
图7为检测血清淀粉样蛋白A(SAA)的特异性柱形图。
具体实施方式
本发明提供的基于双色量子点联合检测SAA和CRP的荧光免疫吸附检测试剂盒，包括：量子点A标记的C-反应蛋白抗体2、量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2、包被C-反应蛋白抗体1和血清淀粉样蛋白A抗体1 的检测板、C-反应蛋白标准品溶液、血清淀粉样蛋白A标准品溶液、样品稀释液、标记抗体稀释液和洗涤液；
所述量子点A和量子点B的发射波长范围为450～800nm，所述量子点 A和量子点B的发射波长相差50～300nm；所述量子点A为表面羧基化的水相量子点A；所述量子点B为表面羧基化的水相量子点B。
在本发明中，所述荧光免疫吸附检测试剂盒的检测示意图见图2。水相量子点A或水相量子点B的表面均带有大量羧基(COO-)，在EDC和S-NHS 的作用下，与抗体蛋白质所带的氨基残基反应形成酰胺键，从而形成稳定的量子点标记抗体。通过抗原与抗体之间的特异性反应，设计“包被抗体-待测抗原-标记抗体”的三明治夹心法实验，在形同激发波长的光源下，产生了不同波峰的荧光强度，根据荧光强度与待测样品中存在的CRP和SAA标准品的浓度成正比，建立检测CRP和SAA物质的标准曲线，从而对未知待测的物质进行检测。
本发明提供的荧光免疫吸附检测试剂盒包括量子点A标记的C-反应蛋白抗体2和量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2。所述量子点A和量子点B的发光层覆盖的荧光范围优选为500～650nm，绿色量子点的发射波长500～560nm，红色量子点的发射波长600～650nm。
在本发明中，所述量子点A和量子点B优选为核壳型，优选包括 CdSe/ZnS、ZnCdSeS/ZnS、ZnxCd1-xSe、ZnSe、Cu掺杂的ZnSe、Mn掺杂的 ZnSe和InP量子点中的两个，更优选为CdSe/ZnS和ZnCdSeS/ZnS。对 CdSe/ZnS量子点而言，壳层的材料为ZnS，核层的材料为CdSe；对 ZnCdSeS/ZnS量子点而言，壳层的材料为ZnS，核层的材料为ZnCdSeS。本发明对所述CdSe/ZnS和ZnCdSeS/ZnS标记C-反应蛋白抗体2和血清淀粉样蛋白A抗体2的对应关系不做特殊限制，任意组合即可。本发明对所述量子点的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的量子点来源均可。例如图3为激发波长为365nm两种不同颜色量子点发射图谱。
在本发明中，所述量子点A和量子点B优选为表面羧基化的水相量子点A或表面羧基化的水相量子点B。所述表面羧基化的水相量子点A或表面羧基化的水相量子点B的制备方法优选包括两种，分别为聚合物包覆法和基于二氧化硅的包覆法(硅烷偶联剂)。
在本发明中，所述聚合物包覆法优选以聚马来酸酐十六醇酯修饰 CdSe/ZnS量子点为例加以具体说明。所述聚马来酸酐十六醇酯修饰 CdSe/ZnS量子点的制备方法，优选包括以下步骤：
①CdSe/ZnS量子点和氯仿混合，超声，得到分散液；
②聚马来酸酐十六醇酯和氯仿混合，超声，得到聚马来酸酐十六醇酯氯仿溶液；
③将所述分散液和聚马来酸酐十六醇酯氯仿溶液混合，超声，去除氯仿，得到聚马来酸酐十六醇酯-CdSe/ZnS偶联物；
④将聚马来酸酐十六醇酯-CdSe/ZnS偶联物、水和氨水混合，搅拌，固液分离，得到聚马来酸酐十六醇酯修饰CdSe/ZnS量子点。
在本发明中，所述CdSe/ZnS量子点的质量和氯仿的体积比为20mg：4 mL。所述聚马来酸酐十六醇酯的质量和氯仿的体积比为20mg：2mL。所述步骤①、②和③中超声参数优选相同。超声的功率优选为240W，所述超声的时间优选为4～5min，所述超声的温度优选为25℃。
所述去除氯仿的方法优选旋转蒸发。所述旋转蒸发的时间为15min。所述氨水的添加体积为40μL。所述水的添加体积为3.96mL。所述搅拌的时间优选为24h。固液分离的方法优选为离心。所述离心的转速优选为20000 rpm。所述离心的时间优选为30min。
在本发明中，所述基于二氧化硅的包覆法(硅烷偶联剂)以反相微乳液法制备表面羧基化的CdSe/ZnS量子点为例，加以说明。基于二氧化硅的包覆法(硅烷偶联剂)制备表面羧基化的水相量子点的制备方法优选包括以下步骤：
Ⅰ.向CdSe/ZnS量子点环己烷溶液依次加入正硅酸乙酯、氨水进行反应，搅拌，用乙醇溶液清洗，固液分离收集沉淀；
Ⅱ.将所述沉淀溶解后，依次加入正硅酸乙酯(TEOS)和氨水溶液，搅拌，用乙醇溶液清洗后，固液分离收集沉淀；
Ⅲ.将所述沉淀溶解后，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷和氨水溶液，搅拌，加入正己烷，固液分离，得到沉淀；
Ⅳ.将所述沉淀溶解，加入含丁二酸酐的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，搅拌固液分离，得到沉淀，重复该步骤一次；
Ⅴ.将所述沉淀与氨水溶液混合，超声，固液分离，沉淀为表面羧基化的CdSe/ZnS水相量子点。
在本发明中，所述环己烷为每8mL溶解有1.32g表面活性剂CO-520 的环己烷。所述CdSe/ZnS量子点环己烷溶液的浓度为10mg/mL。所述搅拌的时间优选为30min～24h。所述正硅酸乙酯的加入体积为160μL。所述氨水溶液的加入体积为450μL，所述氨水溶液中氨水和水的体积比为1:1。所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷(ATPES)添加体积优选为100μL。所述含丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺溶液的配制方法优选为将15mg的丁二酸酐溶解到150μLN，N-二甲基甲酰胺。所述固液分离优选为离心。所述离心的转速优选为10000～20000rpm，所述离心的时间优选为3～15min。所述清洗用溶液优选为乙醇溶液。所述乙醇溶液为分析纯乙醇(乙醇含量大于99.7％)，体积优选为10～20mL。
在本发明中，所述量子点A标记的C-反应蛋白抗体2或量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2的浓度独立优选1μg/μL～2μg/μL，更优选为1.38 μg/μL。CRP抗体2和SAA抗体2均为单克隆抗体。本发明对所述C-反应蛋白抗体2和血清淀粉样蛋白A抗体2的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的C-反应蛋白抗体2和血清淀粉样蛋白A抗体2的来源即可。其中所述C-反应蛋白抗体2中的2表示区别于C-反应蛋白抗体1的抗体，即所述 C-反应蛋白抗体2和C-反应蛋白抗体1结合在C-反应蛋白不同抗原决定簇上。
本发明提供的荧光免疫吸附检测试剂盒包括包被C-反应蛋白抗体1和血清淀粉样蛋白A抗体1的检测板。所述C-反应蛋白抗体1的包被浓度优选为5μg/mL。所述血清淀粉样蛋白A抗体1的包被浓度优选为5μg/mL。 CRP抗体1和SAA抗体1均为单克隆抗体。本发明对所述C-反应蛋白抗体 1和血清淀粉样蛋白A抗体1的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的C-反应蛋白抗体1和血清淀粉样蛋白A抗体1的来源即可。
本发明提供的荧光免疫吸附检测试剂盒包括样品稀释液。所述样品稀释液优选为含有体积浓度10％新生牛血清的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述样品稀释液的pH值为7.4。所述样品稀释液的作用是作为样品稀释时溶液使用。
本发明提供的荧光免疫吸附检测试剂盒包括标记抗体稀释液。所述标记抗体稀释液优选为含有质量浓度0.5％牛血清白蛋白的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述标记抗体稀释液的pH值为7.4。所述标记抗体稀释液的作用是用于稀释量子点A标记的C-反应蛋白抗体2或量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2。
本发明提供的荧光免疫吸附检测试剂盒包括洗涤液。所述洗涤液优选为含有体积浓度0.05％吐温20的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述洗涤液的 pH值为7.4。所述洗涤液的作用是在反应过程中洗涤检测板。
本发明提供的荧光免疫吸附检测试剂盒包括C-反应蛋白标准品溶液和血清淀粉样蛋白A标准品溶液。所述C-反应蛋白标准品溶液的溶质为CRP 抗原。所述血清淀粉样蛋白A标准品溶液的溶质为SAA抗原。所述C-反应蛋白标准品溶液的浓度优选为10μg/mL，使用时按照需要梯度稀释即可。所述血清淀粉样蛋白A标准品溶液的浓度优选为10μg/mL，使用时按照需要梯度稀释即可。
本发明提供的所述荧光免疫吸附检测试剂盒的制备方法，包括量子点A 标记的C-反应蛋白抗体2或量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2的制备方法和包被C-反应蛋白抗体1的检测板或包被血清淀粉样蛋白A抗体1 的检测板的制备方法。
所述量子点A标记的C-反应蛋白抗体2或量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2的制备方法包括以下步骤：
1)将表面包覆羧基的水相量子点活化，得到活化后的量子点A或量子点B；
2)将活化后的量子点A与C-反应蛋白抗体2偶联或将活化后的量子点 B与血清淀粉样蛋白A抗体2偶联，得到量子点A标记的C-反应蛋白抗体 2或量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2。
在本发明中，所述活化的方法优选是将含有表面包覆羧基的水相量子点 A或表面包覆羧基的水相量子点B的BS溶液、含S-NHS的BS溶液和含有 EDC的MES溶液按照体积比为18:1:1混合，超声处理，固液分离，得到的沉淀为活化后的量子点A或量子点B。所述表面包覆羧基的水相量子点A 或表面包覆羧基的水相量子点B的BS溶液优选为包含0.83mg/mL表面包覆羧基的水相量子点A或表面包覆羧基的水相量子点B的0.005mol/L的BS 溶液。所述含S-NHS的BS溶液优选为含有0.049mg/μL S-NHS的0.005mol/L BS溶液；所述含有EDC的MES溶液优选为含有0.017mg/μL EDC的0.005 mol/LMES溶液。
在本发明中，所述偶联的方法优选优选为将200μL的0.005mol/L BS (pH 8.0)加入到活化后的量子点中，在涡旋、超声条件下，复溶，加入68.8g CRP抗体(或SAA抗体)；涡旋混匀后，置于旋转培养器4℃过夜反应。分别加入终止剂(12μL，乙醇胺)和封闭剂(50μL，10％BSA)混匀，室温下，置于旋转培养器上反应30min，扩容至1.4mL，4℃低温20000rpm离心分离30min，弃上清；加入0.005mol/L BS(pH 9.0)复溶，离心弃上清。加入抗体2保存液，重悬至50μL。
在本发明中，所述包被C-反应蛋白抗体1的检测板或包被血清淀粉样蛋白A抗体1的检测板的制备方法，包括以下步骤：
A.用包被液溶解C-反应蛋白抗体1或血清淀粉样蛋白A抗体1，得到的标记抗体溶液；
B.将所述标记抗体溶液注入检测板的每个孔中，静置过夜，弃去包被液，洗涤，得到包被标记抗体的检测板；
C.用封闭液封闭所述包被标记抗体的检测板，孵育，弃去封闭液，干燥。
在本发明中，标记抗体溶液每孔加入量优选为100μL。所述包被的温度优选为4℃。所述洗涤的次数优选为2～4次，更优选为3次。
在本发明中，所述荧光免疫层析吸附检测试剂盒的使用方法，优选包括以下步骤：
将所述检测板中添加稀释后的样品溶液，添加标记抗体并孵育，数据检测，根据标准曲线计算样品中两种蛋白的含量。孵育完成后得到“包被抗体-抗原-偶联抗体”复合物，使用荧光酶标仪在激发波长同为405nm下，检测复合物分别在500～560nm和600～650nm发射波长的荧光强度。通过标准曲线求出待测样品中CRP和SAA物质的浓度。通常样品中某种待测物质浓度越大，得到三明治夹心结构复合物越多，所测得的相对荧光强度越高。
根据绘制CRP标准曲线可知，CRP蛋白的检测范围是5～1000ng/mL，标准曲线是Y＝6709+1.51X，R2＝0.998。
根据绘制CRP标准曲线可知，SAA蛋白的检测范围是5～1000ng/mL，标准曲线是Y＝4.38+0.5X，R2＝0.992。
本发明方法样品前处理采用样品稀释液进行稀释，过程简单，实现了炎症因子的同步检测，解决了分项检测所带来的操作繁琐、检测成本较高的问题，适用于细菌与病毒感染的快速鉴别诊断。
下面结合实施例对本发明提供的基于双色量子点联合检测SAA和CRP 的荧光免疫吸附检测试剂盒及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
试剂盒的组成及制备
(一)试剂盒的组成
包被抗体1：CRP单克隆抗体，购自北京百川飞虹生物科技有限公司，产品目录号为7D9，浓度为2.2mg/mL。SAA单克隆孔抗体，购自上海优宁维生物科技股份有限公司，产品目录号为2201，浓度为5.0mg/mL。
偶联抗体2：CRP单克隆抗体，购自杭州启泰有限公司，产品目录号为MC02，浓度为5mg/mL。SAA单克隆孔抗体，购自上海优宁维生物科技股份有限公司，产品目录号为2203，浓度为5.1mg/mL。
荧光标记的抗体2：绿色量子点结合CRP单克隆孔抗体，红色量子点结合SAA单克隆孔抗体。
标准品：CRP标准品购自杭州启泰有限公司，SAA标准品购自上海优宁维生物科技股份有限公司，分别用样品稀释液稀释至相关浓度。
洗涤液：含有体积比0.05％吐温20的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液， pH＝7.4。
样品稀释液：含有体积比10％人阴性血清的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液， pH＝7.4。
荧光标记抗体稀释液：含有质量比0.5％牛血清白蛋白的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4。
抗体2保存液：含有质量比0.5％牛血清白蛋白的0.005mol/L硼砂缓冲液，pH＝8.0。
包被液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值＝9.6。
封闭液：含有质量比0.5％牛血清白蛋白和5％蔗糖的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4。
(二)荧光标记的抗体2的制备方法
(1)活化：取150μL表面包覆羧基的水溶性量子点(5mg/mL)加入到750μLBS(5mMpH7.2)溶液中，加入50μL浓度为0.049mg/μL S-NHS 的0.005mol/LBS(pH 7.2)溶液与50μL浓度为0.017mg/μL EDC的0.005 mol/LMES(pH 5.5)溶液，涡旋混匀，4℃下超声活化10min。将体积增容至1.4mL，4℃下，使用低温超速离心机20000rpm离心分离30min，弃上清液。
(2)偶联：将200μL的0.005mol/LBS(pH 8.0)加入到活化后的量子点中，在涡旋、超声条件下，复溶，加入68.8μg CRP抗体(或SAA抗体)。涡旋混匀后，置于旋转培养器4℃过夜反应。分别加入终止剂(12μL，乙醇胺)和封闭剂(50μL，10wt％BSA)混匀，室温下，置于旋转培养器上反应30min，扩容至1.4mL，4℃低温20000rpm离心分离30min，弃上清。加入0.005mol/L BS(pH 9.0)复溶，离心弃上清。加入抗体2保存液，重悬至50μL。样品放入4℃冰箱保存备用。
(三)试剂盒的制备
(1)包被抗体1的制备方法：用包被液稀释包被抗体，确定抗体1包被浓度为5μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被过夜。甩去包被液后用洗涤液洗三遍，在吸水纸上拍干。每孔加入110μL封闭液后进行封闭，4℃孵育 24h。甩去封闭液，在吸水纸上拍干。放入恒温恒湿干燥箱中干燥24h。之后置于密封袋中，放入4℃冰箱中保存。
实施例2
检测方法
(一)标准曲线的制作
(1)标准品的孵育：取出酶标板，恢复至室温。用样品稀释液分别稀释CRP和SAA标准品至目标浓度，例如浓度的CRP标准品溶液：0、5、10、 25、50、100、200、400、800、1000ng/mL；浓度的SAA标准品溶液：0、 5、10、25、50、100、200、400、800、1000ng/mL。混合后，每孔加入100 μL，放入恒温恒湿培养箱中，37℃孵育30min；甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(2)标记抗体的孵育：用抗体2稀释液稀释SAA抗体2，按1:100倍稀释，每孔100μL，放入恒温恒湿培养箱中，37℃孵育30min。甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。之后用抗体2稀释液稀释CRP抗体2，按1:10倍稀释，每孔100μL，放入恒温恒湿培养箱中，37℃孵育30min。甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(3)数据检测：用荧光酶标仪检测数据，选择顶读、反射模式，激发光为405nm，测荧光谱，取荧光峰处的最大值。
(4)绘制标准曲线：以CRP或者SAA标准品的浓度为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。
结果如图4和图5所示。根据绘制CRP标准曲线可知，CRP蛋白的检测范围是5～1000ng/mL，标准曲线是Y＝6709+1.51X，R2＝0.998。
根据绘制CRP标准曲线可知，SAA蛋白的检测范围是5～1000ng/mL，标准曲线是Y＝4.38+0.5X，R2＝0.992。
实施例3
试剂盒的检测灵敏度实验
评价双抗体夹心酶联免疫吸附试验反应灵敏度的方法，常用的是最低检测限(LOD)。本实验中最低检测限的定义为：计算20份空白样本或者零标准品测定的平均值和3倍标准偏差，其平均值与检测到的最低浓度值所得到直线的斜率K，LOD＝3SD/K。
表1.C-反应蛋白(CRP)空白样本测定结果统计表ng/mL
平均值为82663，标准差为1868，斜率为880，最低检测限(LOD＝3SD/K) 为6.37ng/mL。
表2.血清淀粉样蛋白A(SAA)空白样本测定结果统计表ng/mL。
平均值为46097，标准差为2387，斜率为2996，最低检测限(LOD＝3SD/K) 为2.39ng/mL。
实施例4
添加回收率实验
向同一份不含CRP和SAA的阴性血清样本中添加CRP和SAA两种标准品，使得阴性血清中CRP和SAA的浓度分别为25ng/mL、100ng/mL、 250ng/mL、500ng/mL和750ng/mL；完成免疫吸附反应过程。每个浓度做 5个平行，计算每种添加物质的回收率(回收率＝实测值/添加值*100)。
表3.C-反应蛋白(CRP)样本回收率测定。
表4.血清淀粉样蛋白A(SAA)样本回收率测定
结果表明，阴性血清样本中CRP和SAA两种物质的添加回收率在 92.13％～101.85％之间，相对标准偏差小于15％，符合准确度的测定标准。
实施例5
特异性实验
配置浓度为100ng/mL的CRP(或SAA)，和高于其100倍的SAA(或 CRP)，降钙素原，L-半胱酰胺，DL-异性半胱酰胺，谷胱甘肽和碱性磷酸酶 (10μg/mL)等物质，进行荧光免疫吸附试验，从而对比其特异性。由图6 和图7得到，CRP(或SAA)物质特异性好，不受SAA(或CRP)，降钙素原，L-半胱酰胺，DL-异性半胱酰胺，谷胱甘肽和碱性磷酸酶等物质的干扰。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.基于双色量子点联合检测SAA和CRP的荧光免疫吸附检测试剂盒，其特征在于，包括：量子点A标记的C-反应蛋白抗体2、量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2、包被C-反应蛋白抗体1和血清淀粉样蛋白A抗体1的检测板、C-反应蛋白标准品溶液、血清淀粉样蛋白A标准品溶液、样品稀释液、标记抗体稀释液和洗涤液；
所述量子点A和量子点B的发射波长范围为450～800nm，所述量子点A和量子点B的发射波长相差50～300nm；
所述量子点A为表面羧基化的水相量子点A；所述量子点B为表面羧基化的水相量子点B。
2.根据权利要求1所述的荧光免疫吸附检测试剂盒，其特征在于，所述量子点A和量子点B包括CdSe/ZnS、ZnCdSeS/ZnS、ZnxCd1-xSe、ZnSe、Cu掺杂的ZnSe、Mn掺杂的ZnSe和InP量子点中的两个。
3.根据权利要求1所述的荧光免疫吸附检测试剂盒，其特征在于，所述量子点A标记的C-反应蛋白抗体2或量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2的浓度为1μg/μL～2μg/μL。
4.根据权利要求1所述的荧光免疫吸附检测试剂盒，其特征在于，所述C-反应蛋白抗体1的包被浓度为1～10μg/mL。
5.根据权利要求1所述的荧光免疫吸附检测试剂盒，其特征在于，所述血清淀粉样蛋白A抗体1的包被浓度为1～10μg/mL。
6.根据权利要求1所述的荧光免疫吸附检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含有体积浓度10％新生牛血清的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述样品稀释液的pH值为7.4。
7.根据权利要求1所述的荧光免疫吸附检测试剂盒，其特征在于，所述标记抗体稀释液为含有质量浓度0.5％牛血清白蛋白的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述标记抗体稀释液的pH值为7.4。
8.根据权利要求1～7任意一项所述的荧光免疫吸附检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为含有体积浓度0.05％吐温20的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述洗涤液的pH值为7.4。
9.权利要求1～8任意一项所述的荧光免疫吸附检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括量子点A标记的C-反应蛋白抗体2或量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2的制备方法和包被C-反应蛋白抗体1的检测板或包被血清淀粉样蛋白A抗体1的检测板的制备方法；
所述量子点A标记的C-反应蛋白抗体2或量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2的制备方法包括以下步骤：
1)将表面包覆羧基的水相量子点活化，得到活化后的量子点A或量子点B；
2)将活化后的量子点A与C-反应蛋白抗体2偶联或将活化后的量子点B与血清淀粉样蛋白A抗体2偶联，得到量子点A标记的C-反应蛋白抗体2或量子点B标记的血清淀粉样蛋白A抗体2；
所述包被C-反应蛋白抗体1的检测板或包被血清淀粉样蛋白A抗体1的检测板的制备方法，包括以下步骤：
A.用包被液溶解C-反应蛋白抗体1或血清淀粉样蛋白A抗体1，得到标记抗体溶液；
B.将所述标记抗体溶液注入检测板的每个孔中，静置过夜，弃去包被液，洗涤，得到包被标记抗体的检测板；
C.用封闭液封闭所述包被标记抗体的检测板，孵育，弃去封闭液，干燥。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述活化的方法是将含有表面包覆羧基的水相量子点A或表面包覆羧基的水相量子点B的BS溶液、含S-NHS的BS溶液和含有EDC的MES溶液按照体积比为18:1:1混合，超声处理，固液分离，得到的沉淀为活化后的量子点A或量子点B；
所述表面包覆羧基的水相量子点A或表面包覆羧基的水相量子点B的BS溶液为包含0.83mg/mL表面包覆羧基的水相量子点A或表面包覆羧基的水相量子点B的0.005mol/L的BS溶液；
所述含S-NHS的BS溶液为含有0.049mg/μL S-NHS的0.005mol/L BS溶液；所述含有EDC的MES溶液为含有0.017mg/μL EDC的0.005mol/LMES溶液。
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