CN102121938A - 一种免疫学检测试剂盒及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种免疫学检测试剂盒及其制备和使用方法，所述试剂盒中包括用可直接检测的标记物标记的待测蛋白抗体，所述待测蛋白为心脑血管疾病检查的相关蛋白。所述待测蛋白包括纤维蛋白原、C-反应蛋白、血栓前体蛋白、肌酸激酶和人体脂蛋白相关磷脂酶A2中的一种或多种。使用该试剂盒可一步法检测样品中的待测蛋白丰度或浓度，节省了步骤和时间，并且与ELISA等传统的需要级联放大信号的方法相比，提高了准确度。

Description

一种免疫学检测试剂盒及其制备和使用方法

技术领域

本发明涉及一种用于心脑血管疾病相关检查的免疫学检测试剂盒，及其制备和使用方法。特别涉及人体血浆中脂蛋白相关磷脂酶A2(Lipoprotein-associated Phospholipase A2，缩写为Lp-PLA2)蛋白检测试剂盒及其制备和使用方法。

背景技术

心脑血管疾病业已成为世界上危害人类健康的头号“杀手”，对心脑血管疾病的检测、预防和治疗，尤其是冠状动脉的硬化和栓塞的检测、预防和治疗一直是全世界医学研究中努力不懈的目标。目前，三维立体的心血管造影虽然能够精确了解冠状动脉的阻塞程度，对于血管搭桥手术或血管内的支架支撑扩张术提供关键的信息，但是却无法准确预测缺血性心脏病突发的时间，频率和严重性。血液检查中，除了早期使用的常规血脂胆固醇，低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)，以及相互比例等检测外，为了寻找更能在短期内预测或反映是否有心脏病发生的敏感指标，研究的重点逐步把目标转移到了一系列比较新的血液检测上，其中包括纤维蛋白原，C-反应蛋白(C-Reactive Protein，CRP)，血栓前体蛋白(Thrombus Precursor Protein，TpP)，肌酸激酶Creatine Kinase-MB(CK-MB)等。虽然这些检查都有一定的意义，临床上也都已经逐步演化成了心脑血管疾病人的一整套常规检查，但是每个检查还是存在一定的局限性。于是，临床研究又把目标放在寻找更新，更有效的指标上。目前，最新、最有效，也是世界上研究目标最集中的是用于预测冠心病和脑动脉粥样硬化病人是否在短期内发生血管内栓塞(心肌梗塞和脑血栓)可能性的前期发病因子“血浆中脂蛋白相关磷脂酶A2”(Lipoprotein-associated Phospho-lipase A2，缩写为Lp-PLA2)的体外血液检测。

Lp-PLA2又称为血小板活化因子乙酰水解酶，蛋白分子量为50kDa，由成熟的巨噬细胞和淋巴细胞合成和分泌，并受炎性介质的调节，主要与低密度脂蛋白LDL结合，能水解血小板活化因子使之失去活性，又能水解低密度脂蛋白上的氧化卵磷脂，生成促炎物质溶血卵磷脂和氧化游离脂肪酸，具有促炎症和促动脉粥样硬化的作用。因此Lp-PLA2从炎症细胞中产生和释放也可以被解读成为一个极佳的前炎症反应指标，通过检测循环系统中的Lp-PLA2酶水平，可以独立的预测心脑血管的病发。越来越多研究表明Lp-PLA2具有促动脉粥样硬化作用，与心脑血管栓塞风险直接有关，因此已经成为短期内预测冠心病和脑动脉血管栓塞新的诊断指标和将来的治疗目标。

尽管Lp-PLA2是一项崭新的血液检测，对于Lp-PLA2的研究也仅有不长的历史，但从美国多家医疗单位在最近的这几年间进行的参与人数达二万多病人的大规模临床研究中，目前已经显示了Lp-PLA2检测对于心脑血管疾病突发预测的有效性。同时，检测Lp-PLA2也可以同时预测脑动脉粥样硬化性病变造成的脑动脉血栓性中风。显然，检测Lp-PLA2将具有重大的临床意义和市场前景。

目前在免疫学检测中最常用的方法是酶联免疫法(ELISA)。ELISA法最大的缺点就是步骤多，费时，而且由于使用了级联放大作用，在增加检测灵敏度的同时，也带来了准确性降低的问题。尤其在疾病检测方面，高准确性是很重要的一个指标。所以，亟需寻找一种更准确的免疫学检测方法来替代ELISA用于疾病检测中。

发明内容

为了提高诊断的准确性，本发明提供一种免疫学检测试剂盒，其中包括用可直接检测的标记物标记的待测蛋白的抗体，其中所述待测蛋白包括纤维蛋白原、C-反应蛋白、血栓前体蛋白、肌酸激酶和人体脂蛋白相关磷脂酶A2中的一种或多种。该试剂盒可以通过检测多种指标来提高诊断的准确性，而且该试剂盒不需要通过底物的信号放大作用就能够得到检测结果，简化了步骤，同时提高了准确性。此外，使用该检测试剂盒，能够一步检测样品中待测蛋白的丰度或浓度，避免了多步操作的繁杂和因级联放大造成的准确性低的假阳性的问题。

优选上述可直接检测的标记物为量子点标记，C点标记或纳米金标记。这三种标记物具有信号强、易检测等优点，除却了在酶联免疫检测中通过作用于底物而将检测信号经级联放大等多步操作过程，使检测更加快捷，准确。优选待测蛋白为Lp-PLA2蛋白，可将检测Lp-PLA2蛋白的丰度或浓度用于预测冠心病和脑动脉粥样硬化病人是否有短期内发生冠状动脉栓塞和脑血栓等心脑血管疾病的风险预测和诊断中。上述试剂盒中可包括待测蛋白的标准品，例如重组的，在蛋白N-端或C-端带有His-标签的待测蛋白作为检测标准，用来绘制标准曲线，或者用以证实检验过程的正确性和准确性。

在一个实施方式中，本发明的试剂盒所检测的样本可以是人体的血浆或血清蛋白。

优选上述抗体是单抗，更优选上述试剂盒进一步包括识别待测蛋白的其他抗原决定簇的抗体。这种情况下，可以使用双抗原夹心法来检测待测蛋白，进一步提高其准确性。上述识别待测蛋白的其他抗原决定簇的抗体可以是单抗，也可以是多抗，这种多抗可以是经由带有抗原决定簇的多肽免疫的哺乳类动物(鼠，兔，羊，牛等)的血清中分离的IgG多抗。

在一个优选的实施方式中，上述试剂盒中的待测蛋白包括纤维蛋白原、C-反应蛋白、血栓前体蛋白、肌酸激酶和人体脂蛋白相关磷脂酶A2中的两种以上，不同的待测蛋白的抗体用不同的标记物进行标记。

本发明还提供上述免疫性检测试剂盒的制备方法，包括步骤：制备待测蛋白的抗体，并用可直接检测的标记物标记所述抗体。其中制备抗体的方法可以为使用杂交瘤技术制备单克隆抗体的方法。该方法还可以包括制备识别待测蛋白中的其他抗原决定簇的抗体的步骤。

在一个实施方式中，还包括用发酵法制备重组的待测蛋白作为标准物的步骤。这种重组蛋白可以是带His标签的蛋白，也可以是带有其他标签的重组蛋白，例如GST标签等生物工程中常用标签。

本发明进一步提供一种上述试剂盒的使用方法，其中包括步骤：(1)将待测样品与用可直接检测的标记物标记的待测蛋白抗体一起孵育，使待测样品中可能存在的待测蛋白与所述抗体结合；(2)通过检测标记物，检测样品中待测蛋白的含量水平。

在一个优选的实施方式中，在步骤1)之前还可以包括包被待测蛋白的另一抗体的步骤，和将待测样品与所述另一抗体一起孵育以使待测样品可能存在的待测蛋白与所述另一抗体结合的步骤，其中，所述另一抗体与所述用可直接检测的标记物标记的待测蛋白抗体分别识别不同的抗原决定簇。

更优选地，该方法还包括用作为检测标准的待测蛋白检测并生成标准曲线的步骤。

总而言之，本发明的试剂盒具有以下优点：

(1)检测快速省时，这是因为省却了使用二抗与酶联底物等物质放大信号的步骤，使整个检测所需时间几乎减少一半；

(2)检测的准确率提高，误差率降低，这是因为是一步到位检测的方法避免了间接放大信号过程中产生的各种可能误差，从而使检测的假阳性和假阴性都同时降低；

(3)当待测蛋白为两种以上时，可以通过同时检测两种以上的指标来提高检测的准确率；

(4)当待测蛋白为人体脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白时，可以预测冠心病和脑动脉粥样硬化病人是否有短期内发生冠状动脉栓塞和脑血栓等心脑血管疾病风险。

附图说明

图1是根据本发明的一个实施方式的试剂盒的生产流程图。

图2是根据本发明的一个实施方式的试剂盒的使用流程图。

图3是pcDNA3.1-his-hLp-PLA2质粒的示意图。pcDNA3.1-his-hLp-PLA2的哺乳动物表达质粒图谱：全长的人Lp-PLA2的N端带有6个组氨酸标签。该蛋白被克隆到pcDNA3.1载体的KpnI和XbaI限制性内切酶位点，受CMV启动子的控制。

图4A为His-Lp-PLA2的氨基酸序列。

图4B为His-Lp-PLA2的DNA序列。

图5A为ELISA检测结果分布图。

图5B为量子点565nm检测结果分布图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细描述。本领域普通技术人员通过这些具体实施方式可更清楚本发明的上述优点和其他优点。

本发明试剂盒的一个优选的实施方式包括标记的抗Lp-PLA2蛋白的抗体，其标记物可以是量子点或纳米金，也可以是C点。利用该标记的抗体与待测样品中的Lp-PLA2蛋白结合后，可以通过直接检测量子点或纳米金或C点来检测样品中的Lp-PLA2蛋白。从而获知关于心脏疾病情况的相关信息。

本发明试剂盒的一个优选的实施方式包括两种单克隆抗体，分别针对Lp-PLA2蛋白上有一定距离的两个不同的抗原决定簇。将其中一个单抗用量子点标记，另一个单抗首先用来包被，然后将待测样品与其共孵育，使样品中的Lp-PLA2蛋白与之结合。再加入上述标记的单抗与Lp-PLA2蛋白结合。检测标记物的量，就能直接得到样品中Lp-PLA2蛋白的丰度或浓度信息。

本发明的试剂盒不仅可以用于检测LP-PLA2蛋白，还可以用来检测例如纤维蛋白原，C-反应蛋白(C-Reactive Protein，CRP)，血栓前体蛋白(ThrombusPrecursor Protein，TpP)，肌酸激酶Creatine Kinase-MB(CK-MB)等人体血清蛋白以及一切其他用于心脑血管疾病相关检测中的蛋白。只是其中的抗体需要换成相应的抗体。

本发明试剂盒的制备方法中，优选可直接检测的标记物为量子点标记或纳米金标记。一个优选实施方式中，制备所述抗体的方法为使用杂交瘤技术制备单克隆抗体的方法。进一步优选的实施方式中，还包括制备识别的抗原决定簇与所述单抗识别的抗原决定簇不同的另一种单抗的步骤，这种单抗也可以用杂交瘤技术制备，例如用发酵罐培养法或鼠腹腔注射法生成杂交瘤。

本发明试剂盒还可以包括用发酵法制备重组的Lp-PLA2蛋白作为标准物的步骤。该标准物可以用来作为阳性对照或制作标准曲线。

根据试剂盒的成分，确定本发明的试剂盒的使用方法，例如还包括包被待测蛋白的另一单抗时，可以使用“双抗体夹心法”检测。例如，先包被试剂盒的抗体与所述标记了的抗体分别识别Lp-PLA2蛋白中的不同抗原决定簇。用未标记的单抗先包被试剂盒，然后将待测样品与之结合，再加入标记好的单抗，最后检测标记物的量，用以直接解读被检测蛋白的丰度或浓度信息。也可以将标记抗体与待测蛋白直接结合来检测。

在检测病人血样中的待测蛋白的同时，还包括用作为检测标准的已知浓度的重组待测蛋白加以检测并生成标准曲线。在本发明的Lp-PLA2检测中，其设定的标准曲线由已知浓度为50ng，100ng，200ng，400ng和800ng/ml的重组人体His-Lp-PLA2蛋白组成。

下面结合具体实施例说明本发明：

实施例1

1、单抗的制备

用以下合成的Lp-PLA2蛋白抗原决定簇多肽链1)PANWNSPLRPGEKYC；2)SFGQTKIPRGNGPYC；3)PSQDNDRLDTLWIPC；4)CDHGKPVKNALDLKF；5)QHIMLQNSSGIEKYN免疫小鼠，制备单抗杂交瘤，选择其中二个杂交瘤以发酵罐培养或老鼠腹腔注射法生产Lp-PLA2蛋白的单克隆抗体A和B，其具体操作可参见(Kohler et al.，Nature 256：495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling et al.，InMonoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)

纯化和浓缩单抗A和B，并分别进行配方、调节浓度和灭菌分装。单抗A灭菌分装后即为检测液A剂。

取单抗B，用量子点标记。以下为二种量子点-抗体标记中可以施行的方法。

1)使用Invitrogen公司或其他商业公司出售的，其最大荧光辐射在565nm光的波段或其他波段范围的，已经包被有链霉亲和素(streptavidin)的CdSe-ZnS量子点(其中由CdSe组成量子点的核，而由ZnS组成其壳)，然后与生物素结合的抗体相混合，通过生物素与链霉亲和素之间的强亲和力的结合就可以快速形成量子点标记的抗体。至于生物素与抗体的结合技术是生物科技业的一项已经广为掌握的标准技术，因此在此不再赘述。

2)也可以使用Invitrogen公司的

ITK^TM Amino(PEG)量子点或其他商业公司的类似量子点，将其直接标记在抗体或间接标记在链霉亲和素或其他蛋白上。因为这些量子点最外层包被有amine-derivatized PEG，可以直接与胺反应性基团，比如有异硫氰酸酯和succinimidyl esters或有羧基等基团的蛋白和其他水溶性的生物聚合物结合。操作上，以10μM/1mM的比例将

ITK^TMAmino(PEG)量子点加入于BS3溶液(Bis[sulfosuccinimidyl]suberate)中，经混合在室温中反应半小时。然后用NAP-5柱(一种由Amersham Biosciences生产的除盐柱)将过分连接的量子点除去。然后将量子点加入盛放于玻璃容器内的，有着40倍摩尔浓度的被标记抗体或其他蛋白溶液中，轻度混合后在室温中再反应2个小时。然后加入1M的甘氨酸至最后浓度达50mM，用于淬灭其发光。被标记的抗体或其他蛋白最后可以通过Superdex200或其他类似的分子筛分离柱进行提纯，并经0.2μm的针筒过滤装置而达无菌保存，得到检测液B剂。

上述检测液A和B的生产都需经过质量监控的过程。

2、标准物的制备

采用分子工程重组技术制备出人体His-Lp-PLA2重组蛋白，其蛋白的氨基酸与核酸序列参见图4(图4A为氨基酸序列，图4B为核酸序列)。含有重组蛋白基因的pcDNA3.1-his-hLp-PLA2质粒示意图请参见图3。经转染的HEK293或CHO细胞株用发酵罐表达重组的Lp-PLA2蛋白，其重组表达和发酵过程可参见《分子克隆》。细胞经收获后，用细胞裂解液裂解，离心后取上清液，再经含镍亲和分离柱(例如Qiagen公司的Ni-NTA树脂亲和分离柱)纯化该重组蛋白，再用100mM的Imidazole将该重组蛋白从分离柱洗脱，然后透析，浓缩，最后经过配方、浓度调配和灭菌分装成五个浓度作为检测标准物。

3、用该试剂盒检测样品

流程如图2所示。用检测液抗体A剂事先包被96孔板，并经1％的牛血清白蛋白封闭后，将病人的稀释血样(新鲜血清或抗凝血浆或在零度以下储藏不超过一周的血清或抗凝血浆)和已知浓度的检测标准物——重组的Lp-PLA2蛋白溶液置入包被板中。在含有饱和湿度的摄氏37度中孵育二个小时，然后洗涤。

放入已标记有量子点颗粒的检测液B剂。直接用荧光光谱仪读数，将待测样品检测得到的数字与检测标准物比较，得出分析结果。

实施例2

如实施例1一样的过程的检测，只是待测蛋白为纤维蛋白原，或C-反应蛋白(C-Reactive Protein，CRP)，或血栓前体蛋白(Thrombus Precursor Protein，TpP)，或肌酸激酶Creatine Kinase-MB(CK-MB)等人体血清蛋白或一切其他在心脑血管疾病相关检测中的蛋白。

结果

选用实施例1的检测盒试剂对28例经确诊患有冠状性心脏病的病人和21例相同年龄的正常对照组进行检测其Lp-PLA2蛋白浓度，并同时与使用ELISA法检测取得的结果进行对照。(参见图5A和图5B)

结果表明，采用ELISA法检测，在28例疾病组中有二例呈现假阴性，在21例正常对照组中有一例呈现假阳性。而本发明的试剂盒检测结果中仅出现一例病人组的结果处于边缘值之间，但二组结果都没有出现假阴性与假阳性。尽管此次检测的检测案例较少，无法在统计学处理上具有绝对的说服力，但是还是能够显示实施例1的检测试剂盒相对具有更高准确性。

上文中通过几个实施例具体说明了本发明的技术方案，应理解的是，本发明并不限于此处公开的实施方式，其保护范围由所附权利要求书所限定，对此处所公开的实施方式的各种适当修改均应落在本发明的保护范围内。

Claims (18)

1.一种免疫学检测试剂盒，其中包括用可直接检测的标记物标记的待测蛋白抗体，其中所述待测蛋白为心脑血管疾病检查的相关蛋白。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述待测蛋白包括纤维蛋白原、C-反应蛋白、血栓前体蛋白、肌酸激酶和人体脂蛋白相关磷脂酶A2中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述可直接检测的标记物为量子点、C点或纳米金。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述待测蛋白为人体脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白。

5.如权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，其中包括待测蛋白样本是重组的蛋白作为检测标准。

6.如权利要求1-5中任一项所述的试剂盒，其中用于试剂盒所检测的样本是人体的血浆或血清蛋白。

7.如权利要求1-6中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体为单抗。

8.如权利要求1-7中任一项所述的试剂盒，其中进一步包括识别待测蛋白的其他抗原决定簇的抗体。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述识别待测蛋白的其他抗原决定簇的抗体为多抗。

10.如权利要求1-9中任一项所述的试剂盒，其中所述待测蛋白包括纤维蛋白原、C-反应蛋白、血栓前体蛋白、肌酸激酶和人体脂蛋白相关磷脂酶A2中的两种以上，不同的待测蛋白的抗体用不同的标记物进行标记。

11.一种制备如权利要求1-10所述的免疫学检测试剂盒的方法，包括步骤：制备待测蛋白的抗体，并用可直接检测的标记物标记所述抗体。

12.如权利要求11所述的制备方法，其中制备所述抗体的方法为使用杂交瘤技术制备单克隆抗体的方法。

13.如权利要求11或12所述的制备方法，还包括步骤：制备识别所述待测蛋白中的其他抗原决定簇的抗体。

14.如权利要求11-13中任一项所述的制备方法，其中还包括步骤：用发酵法制备重组的所述待测蛋白作为标准物。

15.如权利要求14所述的制备方法，其中所述重组的待测蛋白带有His标签。

16.一种权利要求1-10中任一项所述的试剂盒的使用方法，其中包括步骤：

1)将待测样品与用可直接检测的标记物标记的待测蛋白抗体一起孵育，使待测样品中可能存在的待测蛋白与所述抗体结合；

2)通过检测标记物，检测样品中待测蛋白的含量水平。

17.根据权利要求16所述的方法，其中在步骤1)之前还包括包被待测蛋白的另一抗体的步骤，和将待测样品与所述另一抗体一起孵育以使待测样品可能存在的待测蛋白与所述另一抗体结合的步骤，其中，所述另一抗体与所述用可直接检测的标记物标记的待测蛋白抗体分别识别不同的抗原决定簇。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其中还包括用作为检测标准的待测蛋白检测并生成标准曲线的步骤。

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