CN104711279B - 一种血管内皮生长因子检测试剂盒及其原料制备 - Google Patents
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Abstract
本发明一种血管内皮生长因子检测试剂盒及其原料制备，涉及一种蛋白免疫检测方法，和一种单克隆抗体制备技术，以及应用所述溶液的血管内皮生长因子(VEGF)检测试剂盒及其使用方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白免疫检测方法，关于一种基于化学发光原理用于血管内皮生长因子(VEGF)检测的试剂盒及其包被所用单克隆抗体制备技术。
背景技术
肿瘤细胞的生长、转移依赖新生血管的形成,血管内皮生长因子(VascpglarEndothelial Growth Factor，VEGF)是最有效的促血管生长因子(Ferraraetal.Endocr.Rev.1997，18：4-25)。血管内皮生长因子是近些年研究较为广泛的一种全新广谱肿瘤标记物(Cancer biomarker)，被认为是最有意义的血液肿瘤筛查的标记物。根据本公司的研究成果和国外的文献报道血管内皮生长因子检测试剂盒有四大功能：VEGF血液学检测可作为(1)肿瘤的筛查、(2)肿瘤的辅助诊断(Kondo S,Biochim BiophysActa.1994Mar 31；1221(2):211-4)、(3)肿瘤治疗疗效的评估和监测、(4)肿瘤预后、以及复发的监测(Marpg D Clin Cancer Res April2,2013；DOI:10.1158/1078-0432.CCR-12-3409)。
VEGF相对分子量为45kDa，是由二硫键连接的糖蛋白二聚体，由同一N端而其他区域有某些差异的两条多肽链组成。VEGF基因位于染色体6p21.3，该基因经过转录水平的剪切，可产生5种不同的转录子，分别编码23，121，165，186和206个氨基酸多肽，VEGF是一种典型的外分泌蛋白。VEGF分解的单体无活性,去除N 2糖基对生物效应无影响,但可能在细胞分泌中起作用。血管内皮细胞生长因子基因由8个外显子和7个内含子组成，定位于染色体6p21.3，由于外显子剪切的不同而形成不同的亚型，产生出分别VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF185、VEGF206等至少5种蛋白形式，其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，在人类中表达，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。
近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。用于检测血清学指标的方法主要包括放射性同位素免疫分析、酶联免疫吸附法、和化学发光免疫分析。这些方法既可以作为初筛试验也可以作为确认试验，其中化学发光法具有检测线性范围宽、检测仪器简单、操作方便等优点。
发明内容
1.1VEGF基因克隆和原核表达质粒的构建:从人胎盘cDNA文库中选取人VEGF165全长序列pGEX-4T-1作为载体，该载体含有谷胱苷肽S转移酶标签，蛋白的表达由tac启动子控制。tac启动子由IPTG诱导。克隆位点选取EcoRI和NotI。
1.2VEGF融合蛋白表达：将pGEX-4T-1/VEGF165转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞(大肠杆菌),得到稳定和高效表达菌株。LB培养基培养，37℃表达GST-VEGF165融合蛋白包涵体。
1.2VEGF165融合蛋白纯化：工程菌培养于LB液体培养基，经IPTG诱导，表达2小时后，收集菌体，超声破碎后，加入Sarkosyl，混匀。将含融合蛋白上清加入GlpgtathioneSepharose 4B凝胶，漂洗后，加入还原型谷胱甘肽洗脱液洗脱。收集蛋白。50％甘油储存于－20℃。
2.小鼠免疫和单克隆抗体制备
2.1小鼠免疫方案：选用6-8周龄雌性BALA/c小鼠分三次进行免疫，抗原：使用大肠杆菌来源VEGF；免疫佐剂使用弗氏佐剂；免疫方式：皮下多点注射及腹腔注射，一次免疫；VEGF抗原20ug与佐剂充分乳化后皮下多点注射；二次免疫：与一次免疫间隔3周后，VEGF抗原20ug与佐剂充分乳化后皮下多点注射(避开一次免疫注射点)，三次免疫：与二次免疫间隔两周后，VEGF抗原20ug与佐剂充分乳化后腹腔注射。
2.2效价检测：三次免疫后10-14天静脉取血，检测抗体效价，达到106以上进行细胞融合。
2.3细胞融合
2.3.1骨髓瘤细胞制备：在做细胞融合前30天左右复苏骨髓瘤细胞株，用RPMI-1640培养基培养至状态较好后，再用8-杂氮鸟嘌呤(8-AG)培养基中培养培养1周，后再改用RPMI-1640培养基培养3-4天后给小鼠打实体瘤。打瘤细胞后12-18天将小鼠拉颈处死取出瘤细胞，瘤细胞取出后研磨，在用淋巴细胞分离液分离纯化并对细胞计数；
2.3.2脾细胞的制备
免疫后小鼠摘眼球处死，取脾，研磨，并对脾细胞计数。
2.3.3瘤细胞与脾细胞融合
脾细胞与瘤细胞按细胞计数5:1的比例融合，使用PEG1200诱导，融合后加到铺好的饲养层的96孔板培养5-7天，后用HAT培养基半量换液，CLIA方法筛选阳性细胞株。
2.4克隆化与细胞定珠
克隆化方法：有限稀释法，挑选的阳性细胞株进行有限稀释，反复2-3次有限稀释，选择阳性率95％以上的细胞定珠，并培养扩增冻存细胞株
2.5单克隆抗体培植
选用6-8周龄雌性BALA/c小鼠腹腔注射107个已定珠的细胞，5-10天取小鼠腹水，腹水离心后取上清，
2.6单克隆抗体纯化
选用GE公司proteinG纯化柱；用20mM PB缓冲液平衡纯化柱，加入腹水上样，用PH2.70.1mol甘氨酸盐酸缓冲液进行洗脱，用含有PH8.71mol tris缓冲液的EP管收集,0.05mM PB透析，浓缩冻存。
2.7单克隆抗体性质鉴定：性质鉴定包括利用Sigma CLIA抗体分型试剂检测。单抗细胞株上清，应用免疫印记试验和竞争实验检测抗体特异性。利用竞争CLIA检测抗体亲和力。
3.VEGF-CLIA试剂制备
试剂采用一种新型夹心法作为本课题的主要研究方法，基本原理是以链霉亲和素包被，加入生物素化的VEGF单抗，与标本中抗原反应后形成亲和素-抗体-抗原复合物，再加入另一株HRP酶标记的VEGF单抗，最终形成亲和素-生物素化抗体-抗原-HRP标记抗体复合物。具体试验过程包括以下几个步骤。
3.1生物素化抗体及酶标抗体浓度确定：通过棋盘试验，对比不同配对组合下校准品的RLpg值作统计学分析，以VEGF浓度为横坐标X值，RLpg值为纵坐标Y值，求线性相关系数R值。最终挑选具有良好线性，较高R值的生物素化抗体、辣根过氧化物酶标记抗体，酶标抗体应用浓度和生物素化抗体浓度作为夹心法CLIA检测方法的关键条件在选择时应同时满足S0RLpg值＜100，S5/S0(P/N)最大等条件。
3.2链霉亲和素包被液浓度的选择：以CB、作为包被液，分别包被1-5ug/ml链霉亲和素，最终选择3.5ug/ml用于包被。
3.3VEGF校准品制备与标定:按校准品原料VEGF对照国际约定参考品浓度，用PBS倍比稀释出系列校准品5个浓度点，并配制S0点。以工作校准品为准，将此系列产品校准品用化学发光法测定各浓度点实际浓度值，并将各浓度点微调至目标浓度值(0、50、100、200、400、800pg/mL)，准确度90％～110％以内。用2ml规格的管制玻璃瓶分装校准品溶液，分装量为0.5ml/瓶。置于2—8℃保存。
3.4检测流程：包被连霉亲和素100μl/孔4℃过夜，洗涤5次，加生物素化抗体50μl/孔，再加入待检样品50μl/孔,37℃孵育30min,洗涤5次，加HRP标记抗体100μl/孔，37℃孵育30min,洗涤5次，加入底物发光液50μl/孔，避光5min，检测RLpg值。具体步骤需要参考最终确定的检测条件。
4化学发光液
使用KPL公司的发光液，用8.0ml规格塑料瓶按3.0ml/瓶分装，置于2—8℃保存。
5分析性能分析和稳定性试验
采用建立的生物素亲和素CLIA方法检测VEGF标准品，计算不同浓度范围标准曲线的线性相关系数，R值最大的一组浓度范围即此方法最佳浓度范围。对线性关系重复性、特异性、准确性等需要反复验证。
5.1外观
微孔板应清洁，无异物污染和加工缺陷；液体部分应清亮、无沉淀或絮状物。
5.2最低检出量
VEGF标准品的最低检出量不大于10pg/ml。
5.3精密度
批内精密性CV(％)应不高于10％(n≥20)；批间精密性CV(％)应不高于15％(n≥5)
5.4准确性
回收率应介于90％-110％之间。
5.5线性范围
在(0～800)pg/ml的线性范围内，试剂盒的相关系数r应≥0.99。
5.6稳定性
2-8℃储存，有效期为12个月。
6检测设备：自动化学发光仪
化学发光仪使用北京滨松光子股份有限公司的BHP9504产品，市场上众多板式化学发光仪均可检测本试剂盒。
7校准品溯源
根据中华人民共和国国家标准GB/T 21415-2008/ISO 17511:2003《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》规定，为了使检验医学“量”的测量得到正确的医学应用、不论在何时何地都具有可比性，“量”必须有明确的定义。据此，作为体外诊断医疗器械生产商，我们进行了计量的溯源性研究。
GB/T 21415-2008/ISO 17511:2003中规定“具有国际约定校准品，但无国际约定参考测量程序，不能在计量上溯源至SI的情况”，制造商应自确定溯源测量程序。本公司选定系统和随机误差小的化学发光法作为VEGF工作校准品的赋值测量方法。企业以此测量程序开始建立了完整的VEGF校准品溯源链，国际约定校准品选用世界卫生组织英国国家生物制品检定所的重组人血管内皮生长因子(VEGF)WHO/NIBSC-UK-EN63QG作为溯源依据。
本发明第三方面提供了本发明第二方面所述试剂盒的使用制备方法，其包括如下步骤：1)用链霉亲和素包被固相载体；2)使生物素化抗体和固相链霉亲和素结合；3)待测样品和VEGF校准品分别与生物素化抗体接触,使其发生抗原抗体结合反应；4)使酶标记抗体与结合在生物素化抗体的抗原发生抗原抗体结合反应；5)加入化学发光底物溶液，并使其与所述的酶发生反应；6)检测固相载体上待测样品和校准品对应的发光值，并通过与校准品比较确定待测样品中的VEGF含量。
在一些实施方案中，所述载体是固相载体包括但不限于微孔板、塑料珠、塑料管、或磁性颗粒。
在一个优选的实施方案中，所述的固相载体为48或96孔的微孔板。
在一些实施方案中，所述VEGF校准品是以牛血清白蛋白缓冲液为溶剂，加入VEGF抗原纯品(纯度不低于90％)配制而成。
在一个优选的实施方案中，所述的VEGF校准品是配成的具有多个浓度梯度的VEGF校准品。
附图说明
图1为pGEX-4T-1载体；
图2为新型夹心法受体包被VEGF化学发光试剂反应原理；
图3为援引自GB/T 21415-2008-T中5.5规定具有国际约定校准品(非一级)，但无国际约定参考测量程序，不能在计量上溯源至SI的情况；
图4试剂盒校准曲线，以校准品浓度为横坐标，RLpg值为纵坐标会出的标准曲线。
图5正态分布图，600份健康人血清测定结果偏度系数＝0.001<1，经K-S检验，P＝0.871>0.05。证明VEGF检测结果符合正态分布。
图6国际约定校准品与工作校准品检测人血清样本对比结果
具体实施方式
提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本发明，所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本公开的范围。
试验步骤
自2～8℃环境取出试剂，室温平衡不少于15分钟，液体组分混匀；按下表进行加样(单位μl)和操作。
*:加底物前应保证吸干微孔中的残留物。底物A和B用前等体积混匀后每孔加50μl，于室温(18℃～25℃)环境，设定每孔测定1秒钟。
以上实施例的先后顺序仅为便于描述，不代表实施例的优劣。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (1)
1.一种血管内皮生长因子(VEGF)化学发光检测试剂盒的制备方法，其包括如下步骤：
1)VEGF165的蛋白表达和纯化：
从人胎盘cDNA文库中选取人VEGF165全长序列以pGEX-4T-1作为载体，构建表达载体pGEX-4T-1/VEGF165；将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞， 得到稳定和高效表达菌株；
高效表达菌株经IPTG诱导，表达2小时后，收集菌体，超声破碎后，加入Sarkosyl，混匀；将含融合蛋白上清加入Glpgtathione Sepharose 4B凝胶，漂洗后，加入还原型谷胱甘肽洗脱液洗脱，收集蛋白；
2)小鼠免疫和单克隆抗体制备：
小鼠免疫：选用6-8周龄雌性BALA/c小鼠分三次进行免疫，抗原：使用大肠杆菌来源VEGF；免疫佐剂使用弗氏佐剂；免疫方式：皮下多点注射及腹腔注射，一次免疫；VEGF抗原20ug与佐剂充分乳化后皮下多点注射；二次免疫：与一次免疫间隔3周后，VEGF抗原20ug与佐剂充分乳化后皮下多点注射，避开一次免疫注射点，三次免疫：与二次免疫间隔两周后，VEGF抗原20ug与佐剂充分乳化后腹腔注射；
进行细胞融合，并用CLIA方法筛选阳性细胞株，进行克隆化与细胞定珠，选用6-8周龄雌性BALA/c小鼠腹腔注射107个已定珠的细胞，5-10天取小鼠腹水，腹水离心后取上清；
3)将腹水上清采用proteinG纯化柱进行纯化：
用20mM PB缓冲液平衡纯化柱，加入腹水上样，用PH2.7 0.1mol甘氨酸盐酸缓冲液进行洗脱，用含有PH8.7 1mol tris缓冲液的EP管收集,0.05mM PB透析，浓缩冻存；
4)VEGF-CLIA试剂制备：
包被3.5ug/ml的链霉亲和素100μl/孔4℃过夜，洗涤5次，加生物素化抗体50μl/孔，再加入待检样品50μl/孔,37℃孵育30min,洗涤5次，加HRP标记抗体100μl/孔，37℃孵育30min， 洗涤5次，加入底物发光液50μl/孔，避光5min，检测RLpg值，并通过与校准品比较确定待测样品中的VEGF含量，VEGF标准品的最低检出量不大于10pg/ml。
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