CN106554411A - 可用作标准物质的胱抑素c产品、其制备方法及其用途 - Google Patents
可用作标准物质的胱抑素c产品、其制备方法及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106554411A CN106554411A CN201510631976.3A CN201510631976A CN106554411A CN 106554411 A CN106554411 A CN 106554411A CN 201510631976 A CN201510631976 A CN 201510631976A CN 106554411 A CN106554411 A CN 106554411A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cysc
- standard substance
- bladder chalone
- product
- human cystatin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/96—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood or serum control standard
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/81—Protease inhibitors
- G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- G01N2333/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本申请涉及可用作标准物质的胱抑素C产品、其制备方法及其用途。更具体地,本申请涉及一种可用作标准物质的胱抑素C产品,其含有按质量计≥95%的重组人胱抑素C。本申请应用基因工程和分子生物学技术,批量表达并纯化了重组人胱抑素C蛋白。该蛋白在氨基酸序列水平上与天然人胱抑素C相同,理化性质和天然人胱抑素C相当。通过本申请的方法制备的胱抑素C具有明确的溯源性,这为胱抑素C标准物质、胱抑素C诊断试剂、胱抑素C校准品或质控品的制备提供了原料。
Description
技术领域
本申请涉及计量学领域,尤其是标准物质领域,更具体地,本申请涉及一种可用作标准物质的胱抑素C产品、其制备方法及其用途。
背景技术
胱抑素C(Cystatin C,CysC)又称半胱氨酸蛋白酶抑制剂C,是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族一员。人CysC相对分子质量为13KD,是一个由120个氨基酸组成的分泌性低分子量蛋白质。它广泛存在于人体的血液、脑脊液、唾液及精液等体液之中,可被肾小球自由滤过,其血清浓度与肾小球滤过率(GFR)呈负相关,而不受性别、年龄、饮食、炎症、血脂、肝脏疾病等因素的干扰。CysC是一种理想的反映肾功能损害的标志物。
近几年来,有关人CysC的临床应用以及检测方法学的文献报道都已证实其重要价值所在。鉴于目前全球慢性肾脏病发病率不断上升,血清中的CysC作为临床检查的诊断价值日益引起人们的重视。
CysC检测通常采用PENIA、PETIA或ELISA方法。市面上可见多种不同制造商提供的检测试剂盒,可分别在不同检测平台上运行。然而,有文献报道,在不同实验室之间存在着较大的量值差异,这导致不同实验室甚至对相同样本的测量都是不具有可比较性的(ChristineA.White等人,2013)。这种室间差异,在很大程度上,来自于不同制造商所提供的校准品(或标准品)之间的差异。
因此,CysC标准物质和/或参考方法的开发将有助于协调制造商之间的差异。经过多年的努力,终于在2008年,国际临床化学联合会(IFCC)宣布了CysC有证标准物质的成功研制(证书编号:ERM-DA471/IFCC)。但是,它过于昂贵,大多数制造商和医疗机构,尤其是那些发展中国家和不发达国家的制造商和医疗机构,是负担不起的;并且订购周期极其长,难以满足临床需求。因此,迄今未得到临床界的广泛应用。
传统的人CysC是从患者血液、尿液等来源中提取的,该制备方法存在多种缺点。例如,样本的采集受伦理因素的影响,无法进行大规模的样本收集,也就难以大规模生产制备,这对于二级(即工作级)标准物质尤其不利,因为其直接用于现场分析测量,需求量很大;由于不同批次采集的样本来源的差异,容易导致成品的批间差很大;CysC在样本中浓度低,这导致成品杂质多,不易纯化,因而纯度差;生产成本也相对较高。以ERM-DA471/IFCC为例,就是从两家中心的志愿者血清中所制备的(参见ERM-DA471认证报告,EUR 24408EN–2010)。
近年来也有一些研究报道应用基因工程的方法进行重组人CysC的生产制备,但是它们的氨基酸序列大多无法完全忠实于天然CysC。
张骥等人,2007应用pET-28a(+)表达载体在大肠杆菌表达系统中实现了CysC的可溶表达。但是,经我们实验重复发现pET-28a(+)中所表达的CysC绝大部分以包涵体形式存在,可溶形式极少,无法进行CysC的大规模生产制备。
四川省迈克科技有限责任公司(中国专利申请号:200810147715.4)应用pET-32a(+)表达载体,在大肠杆菌中实现了CysC的可溶表达。但是其表达产物是带有Trx标签的融合蛋白。即使应用肠激酶进行标签蛋白的切除,仍然会有额外的氨基酸残余,并不能得到氨基酸序列完全忠实于天然CysC的蛋白。
陈特等人,2012构建了人CysC基因的原核表达质粒pColdTF-CysC,并获得了CysC的可溶表达,但是表达产物经3C蛋白酶切除后仍然会有额外的TF标签残余。
武汉友芝生物制药有限公司(一种在毕赤酵母中制备重组胱抑素C的方法,中国专利申请号:201210104241.1)应用pPIC9K表达载体在毕赤酵母中实现了CysC的可溶表达,但是在表达产物C-末端带有组氨酸标签,因此在氨基酸序列上也无法完全忠实于天然CysC。
根据对标准物质的要求,其至少应当具有与被测物质相近最好是相同的组成和特性。使用标准物质确定待测物质的量值时,为消除由于标准物质与待测物质两者在基体材质和测量范围上的不同而带来的系统影响,应选择与待测物质性质和组成相近似最好是相同的物质作为标准物质的候选,这是研制和使用标准物质应遵循的最基本原则。
鉴于此,在制备标准物质时,生产者往往有意识地选择某些材料或人工合成一些材料,例如:采集树叶来模拟生物化学和环境分析中植物的基体;人工合成含有痕量元素的玻璃作为矿物成分的基体;模拟海水、河水、酸雨作水质标准物质的基体等,这些作法都是为了消除在使用标准物质进行测量时由于基体差异而产生的影响。
从这一方面考虑,上述张骥等人、陈特等人、四川迈克等提供的CysC标准物质或制备方法均未能满足上述原则。可见,这样的标准物质在实际应用时,是不能理想地赋予待测物质以真实量值的。
发明内容
根据本申请的一方面,本申请提供了一种可用作标准物质的CysC产品,其含有按质量计≥95%的重组人CysC。换言之,CysC产品的纯度是≥95%。在一些实施方式中,纯度≥96%、≥97%、≥98%、≥99%、或者≥99.5%。
纯度表征了物质含杂质的程度,杂质越少,纯度越高。对于蛋白质纯度的测定允许采用本领域技术人员公知的任何方法(包括现在的以及未来的测定方法),包括但不限于电泳法、色谱法。在一些实施方式中,本申请的CysC产品的纯度是通过电泳法所确定的纯度。具体而言,在电泳法中,将本申请的CysC产品上样于凝胶中进行电泳,然后对凝胶进行染色,将代表着重组人CysC的条带的染色强度和全部条带的染色强度进行比较,通过所获得的比例确定重组人CysC蛋白质在CysC产品中的含量(即纯度)。
在另一些实施方式中,本申请的CysC产品的纯度是通过色谱法所确定的纯度。例如,将CysC产品上样于色谱柱上,当组分流出色谱柱时通过紫外检测信号,将代表着重组人CysC蛋白质的色谱峰面积和全部色谱峰面积进行比较,通过所获得的比例确定重组人CysC蛋白质在CysC产品中的含量。在一些实施方式中,重组人CysC的氨基酸序列是SEQ ID No.2。SEQ ID No.2是天然的人CysC的氨基酸序列,共120个氨基酸,CysC前体蛋白的序列可获自NCBI的公共数据库,登录号为NP_000090.1。
根据本申请的另一方面,本申请提供了一种可用作标准物质的CysC溶液,其由上述的CysC产品制得。这种CysC溶液其本身可以作为溶液标准物质来使用。考虑到不同分析方法和分析仪器中使用不同的试剂体系,所述CysC溶液可以根据实际需要制备在合适的试剂体系当中。
在一些实施方式中,所述CysC溶液中的试剂体系选自水、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液和乙酸-乙酸钠缓冲液中的一种或更多种。技术人员也允许将本申请的CysC产品配制在生物体液基质中;生物体液基质选自:血清基质、血浆基质和尿液基质。在一个优选实施方式中,所述CysC溶液是本申请的CysC产品溶于磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液体系中而得到的CysC溶液。
根据本申请的另一方面,本申请提供一种可用作标准物质的CysC产品的制备方法,包括:
提供包含SEQ ID NO:1所示核苷酸的构建体;
将所述构建体加载到表达载体中,获得重组表达载体;
将获得的重组表达载体转化至宿主细胞;
对转化有重组表达载体的宿主细胞进行培养,使所述宿主细胞表达带标签的重组人CysC;
从培养物中分离出带标签的重组人CysC;
去除重组人CysC的标签,优选通过肠激酶切割去除标签;
纯化重组人CysC;
对纯化的重组人CysC进行定值来获得可用作标准物质的CysC产品。
任选地,在对纯化的重组人CysC进行定值之后,还包括对定值后的重组人CysC进行包装的步骤。
SEQ ID No.1即天然的人CysC的核苷酸序列,共360个核苷酸,该序列可获自NCBI的公共数据库,登录号为NM_000099。
在一些实施方式中,为了方便操作,将SEQ ID NO:1所示的核苷酸以构建体的形式予以提供,因此构建体中允许引入酶切位点、终止密码子等元件便于重组表达的操作。在一些实施方式中,构建体包含完整的人CysC编码序列、酶切位点以及编码肠激酶识别位点的核苷酸。在一个具体的实施方式中,构建体的核苷酸序列是SEQ ID NO:3。在一个具体的实施方式中,肠激酶识别位点位于人CysC编码序列的5’或3’端;优选5’端。
在一些实施方式中,所述标签为组氨酸标签。本领域也称组氨酸标签为His-tag。在重组蛋白末端融合若干个组氨酸成串的肽段,凭借此组氨酸肽段与二价金属离子(镍、锌等)的螯合作用,便于用金属螯合亲和色谱纯化蛋白质。
在一些实施方式中,所述表达载体为原核表达载体。原核表达载体选自:pET-39b(+)、pET-41a(+)和pET-32a(+)。优选地,所述原核表达载体为pET-39b(+)。pET-39b(+)可商业途径获得。
在一些实施方式中,将所述构建体加载到表达载体中,获得重组表达载体,尤其是按照阅读框将所述构建体加载到表达载体中。构建重组表达载体的过程中,加载是通过这种方法获得:用限制性内切酶分别对表达载体与构建体进行切割,产生相合的末端(可以是黏端,也可以使平端),再采用DNA连接酶将切割过的构建体与切割过的表达载体连接,获得重组表达载体。
在一个具体的实施方式中,采用的是KpnI酶和XhoI酶进行酶切。表达载体上还提供有其它酶切位点。
在一些实施方式中,所述宿主细胞为大肠杆菌。所述大肠杆菌选自:大肠杆菌BL21(DE3)pLysS、C43(DE3)、BL21(DE3)和Rosetta(DE3)。优选地,所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。BL21(DE3)pLysS可商业途径获得。
在一些实施方式中,采用本领域已知方法将重组表达载体转化至大肠杆菌。这种方法包括,但不限于,电穿孔或制备感受态细胞。
在一些实施方式中,对转化有重组表达载体的宿主细胞进行培养,使宿主细胞表达带标签的重组人CysC。可以采用本领域公知的方法培养大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。例如:可以采用BL21(DE3)pLysS供应商推荐的培养方法,或者采用《分子克隆实验指南》中教导的方法。在一个具体的实施方式中,采用含抗生素的LB培养基培养大肠杆菌;培养温度为25-38℃。
在一个具体的实施方式中,通过诱导使宿主细胞表达带标签的重组人CysC。诱导表达的方法包括但不限于IPTG诱导法、乳糖诱导法。诱导的具体方式根据表达载体的不同可以有所改变。在一些实施方式中,诱导方法为IPTG诱导法。诱导温度为22-28℃;诱导时间为15-20h;IPTG终浓度为0.4-1.0mM。
在一些实施方式中,所述分离是通过亲和方式进行的。优选地,所述亲和方式为镍亲和色谱。
在一个具体的实施方式中,镍亲和色谱采用的是镍色谱柱。本领域技术人员可以根据生产规模、环境条件选择可用的市售镍色谱柱、或者根据已知方法自行填装镍色谱柱。
在一些实施方式中,本申请的重组人CysC与组氨酸标签融合表达。在一些实施方式中,采用肠激酶去除重组人CysC上的组氨酸标签。在一些实施方式中,肠激酶的浓度为10U肠激酶/mg的带标签的重组人CysC。酶切之后,从肠激酶消化获得的酶切产物中,采用亲和方式结合切下来的标签,而不结合亲和柱的重组人CysC从亲和柱流穿,从而获得纯化本申请的重组人CysC。在一些实施方式中,所述亲和方式为镍亲和色谱。
在一个具体的实施方式中,镍亲和色谱采用的是镍色谱柱。本领域技术人员可以根据生产规模、环境条件选择可用的市售镍色谱柱、或者根据已知方法自行填装镍色谱柱。
在一些实施方式中,对纯化的重组人CysC进行定值。所述定值是指,将重组人CysC溯源至国际标准物质或者溯源至国际标准方法。通过这种定值,使得重组人CysC被赋值,并且这种值具有明确不确定度。经过定值的CysC产品(或者溶液的形式),即可以作为标准物质。任选地,在定值之前,可以将纯化的重组人CysC进行稀释,以便于后续的定值和应用。
根据本申请的另一方面,本申请提供通过上述方法所制备的可用作标准物质的CysC产品。
根据本申请的另一方面,本申请提供上述可用作标准物质的CysC产品作为标准物质的用途。
在一些实施方式中,根据本申请的可用作标准物质的CysC产品,其作为标准物质,用于校准仪器。
在另一些实施方式中,根据本申请的可用作标准物质的CysC产品,其作为标准物质,用于待测样品中CysC含量的定量分析。
根据本申请的另一方面,本申请提供上述可用作标准物质的CysC溶液作为标准物质的用途。
在一些实施方式中,根据本申请的可用作标准物质的CysC溶液,其作为标准物质,用于校准仪器。
在另一些实施方式中,根据本申请的可用作标准物质的CysC溶液,其作为标准物质,用于待测样品中CysC含量的定量分析。
附图说明
图1是重组人CysC蛋白诱导的纯化电泳图。
其中,M:预染蛋白分子量标记(Marker);1:IPTG未诱导裂解上清液;2:IPTG诱导18h后的裂解上清液;3:Ni柱纯化后的融合蛋白;4:再次Ni柱纯化后的重组人CysC蛋白。
图2是重组人CysC蛋白Western杂交分析图。
其中,M:预染蛋白分子量标记;1:重组人CysC蛋白,一抗为兔抗人CysC多抗;2:重组人CysC蛋白,一抗为兔抗人血清白蛋白多抗。
图3是本申请的CysC产品与CysC国际标准物质DA471的电泳图。
其中,M:预染蛋白分子量标记;1:本申请的CysC产品,2:CysC国际标准物质DA471。
具体实施方式
术语:
标准物质(reference material)(也称作参考物质):根据ISO的定义,具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值,用以校准测量装置、评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质。标准物质可以是纯的或混合的气体、液体或固体。
有证标准物质(certified reference material):附有证书的标准物质,其一种或多种特性量值用建立了溯源性的程序确定,使之可溯源到准确复现的表示该特性值的测量单位,每一种认定的特性量值都附有给定置信水平的不确定度。
融合蛋白:通过重组技术得到的融合表达产物。在本申请的上下文中,融合蛋白用于指带标签的重组人CysC;具体而言,融合蛋白是指带有组氨酸标签的重组人CysC。
实施例
除非特别指出,以下实施例按照本领域技术人员已知的常规方法进行,所用试剂使用本领域在相应分析和制备中常用级别的试剂。除非特别指出,本文中所述%为质量/体积百分比。
本申请所用质粒载体均为本实验室保存,pET-39b(+)购于Novagen公司;大肠杆菌BL21(DE3)pLysS购于Novagen公司,限制性内切酶、T4DNA连接酶购于美国NEB公司。
实施例1:编码人CysC的多核苷酸的合成
按照NCBI公布的人CysC前体蛋白基因的序列NP_000090.1,获得人CysC的编码序列SEQ ID No.1。由北京三博远志生物技术有限责任公司人工合成序列为SEQ ID No.3的构建体,SEQ ID No.3中包含肠激酶识别位点、完整的SEQ ID No.1、终止密码子和双酶切位点。
实施例2:重组表达载体的构建
选用KpnI和XhoI限制性内切酶切割实施例1获得的构建体,再与经同样双酶切的pET-39b(+)连接,构建原核表达质粒。选用KpnI和XhoI限制性内切酶对质粒进行双酶切之后,进行DNA测序鉴定,选择测序结果显示包括SEQ ID No.3的质粒为阳性质粒。
实施例3:转化宿主细胞
将阳性质粒通过感受态细胞转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,获得阳性表达菌株。
实施例4:宿主细胞的培养
上述阳性菌株单克隆接种于10ml LB+Kan液体培养基中,37℃,220rpm培养16至20小时;之后按照1%接种量接种于新鲜的LB+Kan培养基中,37℃,220rpm培养3至4h;取1ml菌液作为未诱导条件下的对照,剩余菌液加入终浓度为1mM的IPTG,25℃,220rpm诱导培养16-20小时,取1ml菌液作为诱导后的样本。
诱导前后的细菌菌液离心去上清,菌体分别用100μl的PBS缓冲液重悬,煮沸5min后,SDS-PAGE电泳检测。经考马斯亮蓝染色,发现诱导后菌体裂解上清液中在预测分子量大小处有一条浓集的条带(见图1,道2),而诱导前的菌体在相同分子量处没有该蛋白条带(见图1,道1)。用BandScan软件分析发现目的蛋白占总蛋白量的按质量计15%左右。阳性的表达菌株均可以用于实施本申请,优选选取表达水平较高的菌株。
上述结果证明,有CysC融合蛋白以可溶形式存在于诱导后上清液中,而未诱导上清液中相应位置无特征蛋白条带。
实施例5:中试规模的宿主细胞培养
按照小量培养的条件放大培养量,1%的甘油保存的阳性的表达菌接种于50ml的LB+Kan培养基中,37℃,220rpm培养16-20小时培养。
之后按照2%接种量接种于1L LB+Kan培养基中37℃,220rpm培养4-5h至OD600达到0.6-1.0,加入IPTG至终浓度为1mM,25℃,220rpm诱导培养18h。
离心收集菌体按照1g菌体加入10ml的结合缓冲液(20mM PB,500mM NaCl,20mM咪唑,pH7.4)的比例加入结合缓冲液,超声破碎后再次离心取上清液,用0.22μm的滤膜过滤上清液后以备纯化。
实施例6:从培养物中分离带标签的重组人CysC
将HisTrap-FF(GE公司)柱用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。
实施例5中过滤后的上清液直接上样到柱上,上样后用结合缓冲液冲洗柱子到基线,再用洗脱缓冲液(20mM PB,500mM NaCl,200mM咪唑,pH7.4)洗脱并收集洗脱峰,即获得融合蛋白(带标签的重组人CysC)。
该融合蛋白进行SDS-PAGE电泳分析纯度,结果显示融合蛋白纯度在80%以上(见图1,道3)。BCA法测定融合蛋白浓度为4-5mg/ml。8L培养液可得到320-350mg的融合蛋白。
实施例7:去除融合蛋白的标签
将脱盐柱用3倍柱体积的肠激酶酶切缓冲液(25mM Tris-Cl,200mM NaCl,2mM CaCl2,pH7.4)平衡。
再将上述分离获得的融合蛋白直接上样到柱上,用肠激酶酶切缓冲液冲洗,收集蛋白洗脱峰。
然后向洗脱获得的溶液中加入肠激酶,终浓度为每mg融合蛋白10U肠激酶,置于23℃,120rpm摇床中酶切16-20小时去除His-tag。
实施例8:纯化重组人CysC
最后将酶切后的产物上样到5倍柱体积肠激酶酶切缓冲液平衡好的HisTrap-FF柱上,收集穿透峰,即根据本申请的重组人CysC(见图3,道1)。
实施例9:重组人CysC的性质分析
1.分子量鉴定:
将实施例8收获的重组人CysC以及天然人CysC分别经SDS-PAGE电泳分析CysC的分子量。
实验结果表明:重组人CysC(见图3,道1)和天然人CysC(见图3,道2)分子量均为13kDa左右。
2.等电点分析:
将实施例8收获的重组人CysC经等电聚焦电泳(IEF)技术测定重组人CysC的等电点。
实验结果表明:重组人CysC在pH9.0-9.5之间,并且具有其特征蛋白条带,其等电点为pI=9.3左右,与文献中报道天然人CysC的等电点基本相同。
3.氨基酸序列鉴定:
应用美国ABI公司Procise491蛋白序列测序系统(基于Edman降解法)测定本申请重组人CysC蛋白质的序列。
测定结果显示,本申请重组人CysC蛋白质的序列与天然人CysC相同。例如,质谱仪捕获到重组人CysC蛋白质的N端序列SSPGKPPRLVGGPMDASVEEEGV,与天然人CysC的N端序列完全相同。
表明:本申请重组人CysC的N端融合蛋白标签已经被完全去除,不含有任何残余His。
4.纯度检测:
将实施例8收获的重组人CysC经SDS-PAGE电泳分析。该方法蛋白纯度检测灵敏度为0.5%(相对质量浓度),在电泳图上重组人CysC(见图3,泳道1)和CysC国际标准物质DA471(见图3,泳道2)均未观察到其它的蛋白杂质。重复3次计算,重组人CysC蛋白的纯度平均值为按质量计97.5%。
5.中试产量:
将实施例8收获的重组人CysC进行BCA法测定,蛋白终浓度为2-3mg/ml,8L培养液最终可得到纯度在按质量计95%以上的70-80mg重组人CysC蛋白。
6.抗原性分析:
分别用Elisa及Western杂交鉴定重组CysC蛋白的抗原性。将实施例8收获的重组人CysC稀释至10μg/ml后,按照Elisa标准操作规程对酶标板进行包被,并分别使用抗人CysC的多克隆抗体及人血清白蛋白的多克隆抗体为一抗,应用HRP标记的的羊抗兔IgG为二抗,结果显示CysC多抗为一抗的板孔为阳性,而抗人血清白蛋白多抗为一抗的板孔为阴性。Western杂交结果表明在分子量为13KDa位置有明显的杂交条带(见图2)。
试验结果表明本申请的重组人CysC免疫原性特异性高。证明本申请的重组人CysC具有和天然CysC相同的免疫原性。
7.重组人CysC与天然人CysC在检测系统中的比较
应用不同厂家胱抑素C测定试剂盒在全自动生化分析仪上进行重组人CysC与天然人CysC蛋白(购自丹麦DAKO公司)质量浓度的对比测定;
将重组人CysC和天然CysC(DAKO)用PBS缓冲液分别稀释到浓度为5mg/L;再分别应用Gcell、Roche和DAKO公司的CysC测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)在日立7180全自动生化分析仪上测定CysC的质量浓度。
测定结果如表1所示,重组人CysC与天然人CysC具有极其相近的定量测值,标准误差远远小于5%,完全可以应用于高质量CysC试剂盒的研制。
表1:CysC质量浓度对比测定结果
小结:
实施例9的结果充分证明本申请的重组人CysC,在理化性质、生物学性质和计量学性质上,和天然CysC是高度一致的。
实施例10:标准物质的制备
首先应用包含终浓度为0.1%NaN3的生理盐水对本申请制备的CysC重组蛋白进行梯度稀释,将其稀释到终浓度为5-10mg/L的浓度范围;
随后应用CysC国际标准物质-DA471/IFCC(5.48mg/L)作为校准物质,测定稀释后重组CysC的浓度;
并继续稀释重组CysC到终浓度为4.9-5.1mg/L的范围内;
最后将其用移液器分装到棕色玻璃瓶中,每瓶1ml。
实施例11:重组人CysC的定值
1.均匀性检查:
从实施例10所制备的重组人CysC标准物质的不同瓶中抽取5份样品,每一份重复测量4次,其测量结果作为瓶间均匀性检验结果。再取5份样品中的任意一份,重复测量4次,其测量结果作为瓶内均匀性检验的结果。
将瓶内与瓶间的检验结果用统计方法(F检验)进行统计学计算,判断其均匀性,检验结果见表2。
检验结果可知,实施例10制备的重组人CysC标准物质均匀性好。
表2.重组人CysC的均匀性检验结果
2.稳定性检查:
任意取以上制备的重组人CysC溶液,放置于室温(25±2℃)下。在七天后进行测定,每一点重复测量3次,其测量结果作为室温放置的稳定性检验结果,检验结果见表3。
由结果可知,本申请的重组人CysC溶液室温放置一周内稳定。
表3.重组人CysC的室温放置稳定性检验结果
3.溯源性:
应用电喷雾-四级杆-飞行时间质谱法对本申请的标准物质(实施例10制备的重组人CysC溶液)进行定值。
在定值前,首先采用CysC国际标准物质-DA471/IFCC(5.48mg/L,其自身的不确定度是UCRM=0.15mg/L)对质谱质量轴进行校准或验证。然后,通过质谱法为本申请的标准物质赋值,使得其溯源至国际标准物质-DA471/IFCC,并本领域中公知的算法计算不确定度。
赋值以及不确定度的计算方法可以参考国际标准、国家标准或者行业标准,也允许按照教科书中的方法进行。例如,中国科学出版社的《实用测量不确定度评定》、科学出版社的《实验误差原理与数据处理》、上海市计量测试技术研究院出版社的《常用测量不确定度评定方法及应用实例》、中国计量出版社的《测量不确定度评定与表示指南》中都详细给出了算法。因此,在本申请中不再详细列出。当然,也可以按照ERM-DA471/IFCC中第7节的方法进行。在确定不确定度时需要考虑的因素会随着实验室的条件而改变,包括但不限于:DA471自身的不确定度、质谱仪自身的因素、人员操作带来的影响、溶液配制过程中所引入的不确定性。
实施例12:生化分析仪的校准
我们应用包含终浓度为0.1%NaN3的生理盐水对实施例11得到的经过赋值的重组人CysC依次进行倍比稀释,使得其终浓度依次分别为5.0mg/L、2.5mg/L、1.25mg/L、和0.625mg/L;再将上述生理盐水作为0mg/L。共5点作为量值测定的校准品。
然后用上述5点校准品对Gell的CysC胶乳增强免疫比浊试剂在全自动生化仪日立7180上进行定标后测定CysC国际标准物质-DA471/IFCC(5.48mg/L)的倍比稀释液2.74mg/L、1.37mg/L、和0.685mg/L、和0mg/L,测定结果见表4。
表4.本申请CysC标准物质对生化仪的校准
实施例13:本申请的重组人CysC用于待测物质的检测
使用实施例11中得到的经过赋值的重组人CysC倍比稀释液作为试剂盒校准品,对血清样本进行测定,同时CysC国际标准物质作为校准品对照。
应用本申请标准物质的各浓度稀释液5.0mg/L、2.5mg/L、1.25mg/L、和0.625mg/L、0mg/L,对Gcell的CysC测定试剂盒进行定标校准并测定20例血清样本;
同时以CysC国际标准物质-DA471/IFCC(5.48mg/L)的各浓度稀释液5.48mg/L、2.74mg/L、1.37mg/L、和0.685mg/L、和0mg/L,作为校准品对Gcell CysC试剂盒进行定标,作为对照测定上述20例的血清样本;
测定结果表明本申请的标准物质作为校准品测定血清样本与国际标准物质定标测定血清样本值几乎相同,无差异;测定结果见表5。
表5.本申请CysC标准物质作为校准品测定血清样本
样本编号 | 本申请标准物质 | DA471 |
1 | 1.01 | 0.99 |
2 | 1.46 | 1.45 |
3 | 1.03 | 1.00 |
4 | 0.81 | 0.80 |
5 | 0.64 | 0.64 |
6 | 0.85 | 0.84 |
7 | 0.90 | 0.88 |
8 | 1.10 | 1.09 |
9 | 1.04 | 1.03 |
10 | 0.72 | 0.71 |
11 | 1.18 | 1.17 |
12 | 0.84 | 0.82 |
13 | 4.45 | 4.65 |
14 | 5.24 | 5.28 |
15 | 3.21 | 3.25 |
16 | 6.44 | 6.38 |
17 | 0.70 | 0.70 |
18 | 0.68 | 0.69 |
19 | 2.36 | 2.41 |
20 | 3.59 | 3.58 |
参考文献
Christine A.White et al.The Impact of Interlaboratory Differences inCystatin C Assay Measurement on Glomerular Filtration Rate Estimation.CJASN.2013,vol 8(1);
ERM-DA471认证报告,EUR 24408EN–2010;
张骥等人,重组人胱抑素C在大肠杆菌中的表达与纯化,国际检验医学杂志,2007,28(5):39;
陈特等人,无融合标签人胱抑素C重组蛋白的制备,基础医学与临床,2012,32(6):697-701。
Claims (9)
1.一种可用作标准物质的胱抑素C产品,其含有按质量计≥95%的重组人胱抑素C。
2.根据权利要求1所述的可用作标准物质的胱抑素C产品,其中所述重组人胱抑素C的氨基酸序列是SEQ ID No.2。
3.一种可用作标准物质的胱抑素C溶液,其由权利要求1所述的胱抑素C产品配制于选自如下的试剂体系而制得的:水、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液和乙酸-乙酸钠缓冲液中的一种或更多种;优选磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。
4.一种可用作标准物质的胱抑素C产品的制备方法,包括:
提供包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸的构建体;
将所述构建体加载到表达载体中,获得重组表达载体;
将获得的重组表达载体转化至宿主细胞;
对转化有所述重组表达载体的宿主细胞进行培养,使所述宿主细胞表达带标签的重组人胱抑素C;
从培养物中分离出所述带标签的重组人胱抑素C;
去除重组人胱抑素C的标签;
纯化重组人胱抑素C;
对纯化的重组人胱抑素C进行定值,获得可用作标准物质的胱抑素C产品;以及
任选地,对定值后的重组人胱抑素C进行包装,
其中,所述标签优选为组氨酸标签,
优选,所述构建体包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸、酶切位点、肠激酶识别位点和终止密码子;更优选,所述构建体的核苷酸序列是SEQ ID NO:3。
5.根据权利要求4所述的可用作标准物质的胱抑素C产品的制备方法,其中:
表达载体为原核表达载体;
所述宿主细胞为大肠杆菌;
所述分离是通过亲和方式进行的;
所述纯化是通过亲和方式进行的。
6.根据权利要求5所述的可用作标准物质的胱抑素C产品的制备方法,其中:
所述原核表达载体选自:pET-39b(+)、pET-41a(+)和pET-32a(+);
所述大肠杆菌选自:大肠杆菌BL21(DE3)pLysS、C43(DE3)、BL21(DE3)和Rosetta(DE3);
所述亲和方式为镍亲和色谱。
7.一种可用作标准物质的胱抑素C产品,其是根据权利要求4-6中任一项所述方法制备的。
8.根据权利要求1-2和7中任一项所述的可用作标准物质的胱抑素C产品作为标准物质的用途。
9.根据权利要求3所述的可用作标准物质的胱抑素C溶液作为标准物质的用途。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510631976.3A CN106554411B (zh) | 2015-09-29 | 2015-09-29 | 可用作标准物质的胱抑素c产品、其制备方法及其用途 |
PCT/CN2016/070276 WO2017054371A1 (zh) | 2015-09-29 | 2016-01-06 | 可用作标准物质的胱抑素c产品、其制备方法及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510631976.3A CN106554411B (zh) | 2015-09-29 | 2015-09-29 | 可用作标准物质的胱抑素c产品、其制备方法及其用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106554411A true CN106554411A (zh) | 2017-04-05 |
CN106554411B CN106554411B (zh) | 2020-05-08 |
Family
ID=58416888
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510631976.3A Active CN106554411B (zh) | 2015-09-29 | 2015-09-29 | 可用作标准物质的胱抑素c产品、其制备方法及其用途 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106554411B (zh) |
WO (1) | WO2017054371A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109975552A (zh) * | 2017-12-28 | 2019-07-05 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 一种重组胱抑素c蛋白及其在检测试剂盒中的应用 |
CN110172434A (zh) * | 2019-05-23 | 2019-08-27 | 华东理工大学 | 一种生产人胱抑素c的基因工程菌及方法 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111198200B (zh) * | 2020-01-14 | 2023-04-07 | 广东省计量科学研究院(华南国家计量测试中心) | 镍居里点标准物质及其制备方法 |
CN115786426B (zh) * | 2022-10-31 | 2023-09-08 | 杭州先为达生物科技有限公司 | 高特异性肠激酶酶切方法及乙醇在提高肠激酶酶切特异性中的用途 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102643824A (zh) * | 2012-04-11 | 2012-08-22 | 武汉友芝友生物制药有限公司 | 一种在酵母中制备重组胱抑素c的方法 |
CN102676533A (zh) * | 2012-05-16 | 2012-09-19 | 广州军区广州总医院 | 一种重组人胱抑素c编码基因与表达方法 |
CN103014047A (zh) * | 2011-09-27 | 2013-04-03 | 深圳市菲鹏生物股份有限公司 | 一种具有天然活性的重组人胱抑素c蛋白及其制备方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101413001A (zh) * | 2008-11-28 | 2009-04-22 | 四川省迈克科技有限责任公司 | 重组人胱抑素c基因及其表达与应用 |
-
2015
- 2015-09-29 CN CN201510631976.3A patent/CN106554411B/zh active Active
-
2016
- 2016-01-06 WO PCT/CN2016/070276 patent/WO2017054371A1/zh active Application Filing
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103014047A (zh) * | 2011-09-27 | 2013-04-03 | 深圳市菲鹏生物股份有限公司 | 一种具有天然活性的重组人胱抑素c蛋白及其制备方法 |
CN102643824A (zh) * | 2012-04-11 | 2012-08-22 | 武汉友芝友生物制药有限公司 | 一种在酵母中制备重组胱抑素c的方法 |
CN102676533A (zh) * | 2012-05-16 | 2012-09-19 | 广州军区广州总医院 | 一种重组人胱抑素c编码基因与表达方法 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109975552A (zh) * | 2017-12-28 | 2019-07-05 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 一种重组胱抑素c蛋白及其在检测试剂盒中的应用 |
CN110172434A (zh) * | 2019-05-23 | 2019-08-27 | 华东理工大学 | 一种生产人胱抑素c的基因工程菌及方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106554411B (zh) | 2020-05-08 |
WO2017054371A1 (zh) | 2017-04-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104711279B (zh) | 一种血管内皮生长因子检测试剂盒及其原料制备 | |
CN106554411A (zh) | 可用作标准物质的胱抑素c产品、其制备方法及其用途 | |
Hashemitabar et al. | A proteomic analysis of human follicular fluid: comparison between younger and older women with normal FSH levels | |
Perutka et al. | Pseudotrypsin: A little-known trypsin proteoform | |
Cuozzo et al. | Lysine-based structure responsible for selective mannose phosphorylation of cathepsin D and cathepsin L defines a common structural motif for lysosomal enzyme targeting | |
CN110376384B (zh) | 检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的elisa检测试剂盒 | |
CN104215761B (zh) | 检测血清中抗gp73抗体的试剂盒 | |
Martínez-Aguilar et al. | Serum proteomic analysis reveals vitamin D-binding protein (VDBP) as a potential biomarker for low bone mineral density in Mexican postmenopausal women | |
CN105829348A (zh) | 蛋白质检测用融合蛋白及蛋白质检测方法 | |
Lima-Cabello et al. | Narrow-leafed lupin main allergen β-conglutin (Lup an 1) detection and quantification assessment in natural and processed foods | |
Krause et al. | CSF diagnostics: a potentially valuable tool in neurodegenerative and inflammatory disorders involving motor neurons: a review | |
CN106370855B (zh) | 基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒 | |
Bernfur et al. | Relative abundance of integral plasma membrane proteins in Arabidopsis leaf and root tissue determined by metabolic labeling and mass spectrometry | |
Scopes | Overview of protein purification and characterization | |
CN103063837B (zh) | 一种检测分枝杆菌感染的试剂、方法和试剂盒 | |
Waldera-Lupa et al. | Host cell protein detection gap risk mitigation: quantitative IAC-MS for ELISA antibody reagent coverage determination | |
Cao et al. | New insights into the structure-function relationship of the endosomal-type Na+, K+/H+ antiporter NHX6 from mulberry (Morus notabilis) | |
CN112094355A (zh) | 一种用于临床诊断的复合质控品及其制备方法 | |
CN104297494B (zh) | 一种抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒及其制备方法 | |
CN105037555B (zh) | 缀合物及其制备方法和应用 | |
Bullock et al. | Immunochemical assays of serum proteins: a European external quality assessment survey and the effects of calibration procedures on interlaboratory agreement | |
CN109957003A (zh) | 一种稳定的saa突变体及其在疾病检测中的应用 | |
CN114720691B (zh) | 一种检测生物标志物的试剂盒及其制备方法和应用 | |
CN104673818A (zh) | 猪rbp4蛋白体外表达及其抗体制备 | |
Sagu et al. | Targeted Bottom–Up Mass Spectrometry Approach for the Relative Quantification of Post-Translational Modification of Bovine κ-Casein during Milk Fermentation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |