CN101413001A - 重组人胱抑素c基因及其表达与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人胱抑素C基因及其表达与应用。该截短人胱抑素C基因具有SEQ ID NO：1所示核酸序列；截短人胱抑素C蛋白具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。本发明运用基因工程技术表达纯化大量稳定的重组可溶胱抑素C蛋白并利用该蛋白获得了一对单抗，进而制备了稳定的胱抑素C诊断试剂及其质控品。解决了我国人胱抑素测定试剂盒自主研发的瓶颈问题。

Description

重组人胱抑素C基因及其表达与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种重组人胱抑素C基因及其表达与应用。

背景技术

胱抑素C(Cystatin C)是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族2中的成员之一。它的分子量为13kD，是由122个氨基酸组成的低分子量非糖基化蛋白质(M Abrahamson，et al.Biochemical Journal，1990.)，含两对二硫键，且能在所有有核细胞中恒定、持续地转录及表达，可被看做House keeping基因(黄君富等，医学临床生物化学与检验学分册)。近来的研究已经发现胱抑素C参与机体许多生理与病理过程，包括肿瘤的侵润性生长及转移、炎症的发生与发展以及组织纤维化(张耀全，袁发焕等，2003，23(6))等疾病。作为外分泌型蛋白，它广泛的存在于脑脊液、血液、唾液及精液等体液中且浓度较高。因胱抑素C是一种低分子量蛋白质，可经肾小球自由滤过，在近曲小管被重吸收并降解，肾脏是清除循环中胱抑素C的唯一器官，所以血清胱抑素C浓度主要由GFR决定，由此可见胱抑素C是一种理想的反映GFR变化的内源性标志物(Grubb A，et al，Acta Med Scand，1985)。同时有研究报道应用兔抗胱抑素C抗体建立的ELISA技术检测了急性心肌梗塞病人急性期、恢复期及正常对照组的血清胱抑素C水平，发现急性期与恢复期的自身对照并无显著性差异，但有意义的是这两者的胱抑素C水平均显著低于正常对照组(冯建芳等，基础医学与临床，1995)。提示胱抑素C的血清浓度改变，在一定程度上可以作为急性心肌梗塞诊断的参考指标。

血清胱抑素C浓度的测定具有重要的诊断意义，但目前我国还没有自主研发的胱抑素C诊断试剂。究其原因制备胱抑素C诊断试剂盒需要特异性强和灵敏性高的抗胱抑素C单克隆抗体，而要得到该单克隆抗体就必须得到高纯度的胱抑素C蛋白，传统的从胎盘、尿液等组织中提取的胱抑素C蛋白浓度低，纯度差，批间差大无法用做免疫原制备单抗或制备诊断质控品。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组人胱抑素C基因、该基因表达的重组蛋白及其制备方法，以及该蛋白的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种具有SEQ IDNO：1所示核酸序列的截短人胱抑素C基因。

一种具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的截短人胱抑素C蛋白。

一种根据SEQ ID NO：1所示核酸序列制备重组可溶人胱抑素C蛋白的方法，包括下述步骤：(1)从新鲜人胎盘中获得总RNA，用RT-PCR方法得到截短人胱抑素C的DNA序列；(2)用步骤(1)获得的DNA序列与表达质粒重组，重组子经过DNA测序验证，确定重组表达质粒的序列和阅读框均正确；(3)用步骤(2)所获得的重组表达质粒转化表达宿主细胞；(4)培养宿主细胞并从细胞胞质中回收和纯化重组可溶性人胱抑素C蛋白。

所述表达载体为能与人胱抑素蛋白的基因序列重组并形成表达质粒的表达载体，具体地，表达载体为原核表达载体，且该原核表达载体的融合蛋白标签可对人胱抑素C蛋白的两对二硫键正确配对起到促进作用，该原核表达载体可选PET32a(+)。所述的表达宿主细胞为能够表达所述重组表达质粒的宿主细胞，且具有校正大肠杆菌密码子偏好性的特征，可选大肠杆菌Rosseta gami II(DE3)。

本发明不限于特定的表达载体，在一优选实施方案中，本发明使用原核表达载体，例如：PET32a(+)。本发明不限于特定的宿主细胞，在一优选实施方案中，本发明使用大肠杆菌Rosseta gami II(DE3)，Rosseta gami II(DE3)购于Merck公司，是MerK公司自己对有特殊功能的大肠杆菌产品的命名。

所述培养宿主细胞所用的培养基采用含抗生素基础培养基扩增培养宿主细胞，参数为：培养温度35℃～37℃，培养时间4～5h；诱导温度35-37℃，诱导时间3～5h；诱导物IPTG终浓度为0.2～0.5mM。

筛选宿主细胞中高效表达的阳性表达菌株作为工程菌，重组可溶性人胱抑素C蛋白通过工程菌诱导培养后离心收集菌体，超声破碎后离心取上清经过镍柱一步纯化得到。

一种制备抗人胱抑素C不同表位的系列单克隆抗体或多克隆抗体的方法，运用按照上述方法制备的重组可溶性人胱抑素C蛋白免疫实验动物获得单克隆抗体或多克隆抗体。通过位点叠加实验确定抗不同抗原表位的系列单克隆抗体；所述系列是指大于等于两株。

一种制备测定人体内人胱抑素C蛋白浓度诊断试剂的方法，运用上述方法制备的两株单克隆抗体通过化学交联剂分别与胶乳交联后混合于缓冲液中制备成诊断试剂，其中两株单克隆抗体摩尔比为1：1。

所述化学交联剂为Sulfo-NHS，EDC.HCL。

一种制备人胱抑素C诊断试剂质控品的方法，按照上述方法制备的重组可溶性人胱抑素C蛋白用保护性缓冲液分别调制到从低到高5个固定浓度后冻干制备。

所述从低到高5个固定浓度是指按照上述制备的诊断试剂的检测线性范围而定的浓度。

所述的5个固定浓度分别为0.5ug/ml；1ug/ml；2ug/ml；4ug/ml；8ug/ml。

综上，本发明的有益效果是：本发明运用基因工程技术表达纯化大量稳定的重组可溶胱抑素C蛋白并利用该蛋白获得了一对单抗，进而制备了稳定的胱抑素C诊断试剂及其质控品。解决了我国人胱抑素测定试剂盒自主研发的瓶颈问题。

附图说明

图1是本发明制备的人胱抑素C诊断试剂的测定结果示意图，其中横轴表示进口试剂1测定进口试剂2校准品的校准值(ug/ml)，纵轴表示自制试剂测定进口试剂2校准品的校准值(ug/ml)；

图2是重组人胱抑素C蛋白诱导纯化电泳图，其中，M：中分子量蛋白Marker；1：IPTG诱导前全菌裂解液；2：IPTG诱导3h后全菌裂解液；3：Ni柱纯化后重组蛋白；

图3是cystatin C重组蛋白Weastern Blot分析的示意图，其中，M：预染蛋白Marker；1：cystatin C重组蛋白，一抗为抗人胱抑素多抗；2：cystatin C重组蛋白，一抗为抗人血红蛋白多抗。

具体实施方式

实施例1：

制备重组可溶人胱抑素C蛋白

(1)克隆截短胱抑素C基因、构建表达质粒

按照胱抑素C基因DNA序列设计引物，RT-PCR扩增该基因并与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5a，PCR鉴定单克隆确定可能的阳性质粒，再提取质粒双酶切鉴定。经过DNA测序证明碱基及开放阅读框正确的阳性质粒用适宜的酶切出与同样双酶切的PET32a(+)连接，构建原核表达质粒，转化表达宿主菌Rosseta gami II。PCR鉴定阳性宿主菌。上述实验用质粒载体均为本实验室保存，表达菌Rosseta gami II购于Merck公司，总RNA提取试剂盒购于Fermentas公司，反转录试剂盒、限制性内切酶、连接试剂盒购于大连Takara公司。

(2)筛选高效表达的阳性表达菌株

接种10株上述阳性菌株与5mlLB+amp中，37℃，220rpm培养过夜，第二日按1％接种量接种于新鲜的LB+amp培养基中，37℃，220rpm培养4—5小时，取1ml菌液做未诱导条件下的菌体蛋白对照，余下菌液加入终浓度0.5mM的IPTG，25℃，170rpm诱导培养过夜，取1ml菌液做为诱导后的菌体蛋白对照。

诱导前后的细菌菌液离心去上清，菌体分别用100ul的TE缓冲液重悬，煮沸5min后，SDS—PAGE电泳。考马斯亮兰染色，BandScan分析电泳条带。诱导后的菌在预测的分子量处有一条浓集的蛋白条带，诱导前的菌在相同的分子量处没有蛋白条带。经BandScan软件分析该目的蛋白占总蛋白量的20％以上。选表达水平高的菌株为工程菌株。

诱导后的细菌超声破碎后离心取上清和沉淀分别进行SDS—PAGE电泳分析，结果表明重组蛋白是以可溶形式存在于上清中。

(3)工程菌的扩大培养及目的蛋白的纯化

按照小量培养的条件扩大培养量，1％的甘油菌接种于20mlLB+amp培养基中37℃，220rpm过夜培养，第二日2％接种量接种于1LLB+amp培养基中37℃，220rpm培养4-5h至OD₆₀₀至0.5-1.0，加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃，220rpm诱导培养3-5h，离心收集菌体按1G菌体加入10ml Loading Buffer(20Mm PBS，0.5M NaCl，30mM咪唑，PH7.4)的比例加入Loading Buffer，超声破碎再次离心取上清，用0.45uM的滤膜过滤以备纯化。

HisTRAP H.P(GE company)柱，用10倍柱体积Loading Buffer平衡柱子，上述过滤上清直接上柱，上样后用Loading Buffer洗柱至OD₂₈₀吸收值至基线，用Elusion Buffer(20Mm PBS，0.5M NaCl，300mM咪唑，PH7.4)洗脱，收集洗脱峰，进行SDS-PAGE分析纯度，结果显示纯度达到90％以上，蛋白浓度2—3mg/ml。6L培养液可得到140—200mg蛋白。

(4)Elisa及Western鉴定重组蛋白抗原性

纯化的重组胱抑素C稀释至10ug/ml后按照Elisa标准操作规程包板，分别使用抗胱抑素C多克隆抗体及抗人血红蛋白多克隆抗体为一抗，使用辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG为二抗，结果显示抗胱抑素C多抗为一抗的孔板为阳性而抗人血红蛋白多体为一抗的孔板为阴性。证明重组胱抑素C免疫特异性高。Western实验结果与Elisa结果相同。

实施例2：

制备人胱抑素C诊断试剂

(1)一对抗不同表位单克隆抗体的制备

纯化重组胱抑素C蛋白按照单克隆抗体制备标准操作规程制备多株抗克隆抗体。通过位点叠加实验筛选一对抗不同位点的单抗。具体步骤如下：取纯化的重组人胱抑素C蛋白稀释至10ug/ml按照Elisa标准操作规程包数个板(1-N，N为待测单克隆株数)，封闭洗板后加入第一株单抗至此单抗所对应的抗原位点饱和的浓度(至位点饱和所需单抗浓度是通过预实验完成的)，37℃孵育。第1板按普通程序加入二抗并显色，记录下板孔OD值OD₁.同时第2板洗涤后加入第二株单抗，第3板洗涤后加入第三株单抗…第N板洗涤后加入第N株单抗，再次37℃孵育，按程序加入二抗后显色，板孔OD_n值与OD₁进行比较，OD值差别超过临界点的单抗确定为与第一株单抗抗不同抗原位点者。按照上述方法筛选获得了两株抗不同位点的单抗，分别命名为C₁，C₂。

(2)单克隆抗体致敏胶乳

胶乳与EDC.HCL、Sulfo-NHS按照一定比例混合于活化缓冲液(0.1M MES，0.15M NaCl，PH5.0)中，15min后加入淬灭剂离心收集胶乳，重悬于致敏缓冲液(0.1M pBS，0.5M NaCl，PH7.2)中加入适量混合单抗(单抗一与单抗二按摩尔比1：1混合)反应1h.反应液加入终浓度1％BSA封闭过夜。离心收集致敏好的胶乳重悬于反应缓冲液(0.2M NH₄Cl，0.1M NaCl，0.2‰PEG20000，PH8.4)中即为人胱抑素C诊断试剂R2。

(3)试剂测定结果

通过自制试剂，进口试剂1分别测定进口试剂2配套校准品得到校准值。结果显示：自制试剂与进口试剂1校准值相关系数达到0.9997，参见图1所示。

实施例3：

制备人胱抑素C诊断质控品

取浓缩重组人胱抑素蛋白用保护缓冲液(0.02M碳酸盐缓冲液，20％丙三醇，0.8％蔗糖，0.5％BSA，0.2‰NaN₃)稀释成8ug/ml，4ug/ml，2ug/ml，1ug/ml，0.5ug/ml等五个浓度，冻干后即制成人胱抑素C诊断质控品。

序列表

<110>四川省迈克科技有限责任公司

<120>重组人胱抑素C基因及其表达与应用

<130>重组人胱抑素C基因及其表达与应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>394

<212>DNA

<213>人

<400>1

<210>2

<211>122

<212>PRT

<213>人

<400>2

Claims (14)

1、一种具有SEQ ID NO：1所示核酸序列的截短人胱抑素C基因。

2、一种具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的截短人胱抑素C蛋白。

3、一种根据权利要求1所述核酸序列制备重组可溶人胱抑素C蛋白的方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)从新鲜人胎盘中获得总RNA，用RT-PCR方法得到SEQ IDNO：1所示的截短人胱抑素C基因序列；

(2)用步骤(1)获得的截短人胱抑素C基因序列与表达质粒重组，重组子经过DNA测序验证，确定重组表达质粒的序列和阅读框均正确；

(3)用步骤(2)所获得的重组表达质粒转化表达宿主细胞；

(4)培养宿主细胞并从细胞胞质中回收和纯化重组可溶性人胱抑素C蛋白。

4、根据权利要求3所述的制备重组可溶人胱抑素C蛋白的方法，其特征在于：所述表达载体为原核表达载体，且该原核表达载体的融合蛋白标签可对人胱抑素C蛋白的两对二硫键正确配对起到促进作用。

5、根据权利要求4所述的制备重组可溶人胱抑素C蛋白的方法，其特征在于：所述原核表达载体为PET32a(+)。

6、根据权利要求3所述的制备重组可溶人胱抑素C蛋白的方法，其特征在于：所述的表达宿主细胞为能够表达所述重组表达质粒的宿主细胞，且具有校正大肠杆菌密码子偏好性的特征。

7、根据权利要求6所述的制备重组可溶人胱抑素C蛋白的方法，其特征在于：所述的表达宿主细胞为大肠杆菌Rosseta gami II(DE3)。

8、根据权利要求3所述的制备重组可溶人胱抑素C蛋白的方法，其特征在于：所述培养宿主细胞所用的培养基采用含抗生素基础培养基扩增培养宿主细胞，参数为：培养温度35℃～37℃，培养时间4～5h；诱导温度35-37℃，诱导时间3～5h；诱导物IPTG终浓度为0.2～0.5mM。

9、根据权利要求3所述的制备重组可溶人胱抑素C蛋白的方法，其特征在于：筛选宿主细胞中高效表达的阳性表达菌株作为工程菌，重组可溶性人胱抑素C蛋白通过工程菌诱导培养后离心收集菌体，超声破碎后离心取上清经过镍柱一步纯化得到。

10、一种制备抗人胱抑素C不同表位的系列单克隆抗体或多克隆抗体的方法，其特征在于：运用按照权利要求3所述制备的重组可溶性人胱抑素C蛋白免疫实验动物获得单克隆抗体或多克隆抗体，通过位点叠加实验确定抗不同抗原表位的系列单克隆抗体；所述系列是指大于等于两株。

11、一种制备测定人体内人胱抑素C蛋白浓度诊断试剂的方法，其特征在于：运用权利要求10所制备的两株单克隆抗体通过化学交联剂分别与胶乳交联后混合于缓冲液中制备成诊断试剂，其中两株单克隆抗体摩尔比为1：1。

12、根据权利要求11所述制备测定人体内人胱抑素C蛋白浓度诊断试剂的方法，其特征在于：所述化学交联剂为Sulfo-NHS，EDC.HCL。

13、一种制备人胱抑素C诊断试剂质控品的方法，其特征在于：按照权利要求3所述制备的重组可溶性人胱抑素C蛋白用保护性缓冲液分别调制到从低到高5个固定浓度后冻干制备。

14、根据权利要求13所述制备人胱抑素C诊断试剂质控品的方法，其特征在于：所述从低到高5个固定浓度是指按照权利要求11制备的诊断试剂的检测线性范围而定的浓度，所述5个固定浓度分别为0.5ug/ml；1ug/ml；2ug/ml；4ug/ml；8ug/ml。

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