CN102964435B - 截短型溶血链球菌溶菌素o及利用其的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种截短型溶血链球菌溶菌素O基因与ASO检测试剂盒。本发明人克隆部分SLO基因片段，将该部分的SLO基因克隆到大肠杆菌等表达载体中，使之产量表达并利于纯化。具体而言，本发明人提供一种DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。根据本发明，截短的SLO序列能使SLO蛋白的产量大大提高，每升细菌培养物能纯化得到150mg以上的SLO蛋白，纯度90％以上，经过免疫学实验证明，这一分段表达的SLO依然保持了特异的免疫原性。

Description

截短型溶血链球菌溶菌素O及利用其的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白基因以及试剂盒。更具体而言，涉及一种截短型溶血链球菌溶菌素O重组蛋白与ASO检测试剂盒。

背景技术

溶血链球菌溶血素O(Streptolysin O，SLO)是多种溶血性链球菌都会表达的一种分泌型蛋白，人在感染溶血性链球菌后会对SLO产生特异抗体。抗链球菌溶血素O(ASO)的检测，是临床诊断溶血性链球菌感染的重要指标之一。提纯的SLO主要来源于溶血链球菌中SLO的提纯，以及在大肠杆菌表达菌株中表达SLO蛋白并纯化。以上两种方法均存在一些局限性，从溶血链球菌中提纯SLO，得率低，难以大规模生产，同存在生物安全隐患；利用原核表达系统表达纯化SLO，由于SLO蛋白对细菌细胞具有毒性，一般难以大量表达。在现有技术中已有人报道了，每升细菌培养物(7-8g菌体湿重/升)能纯化出38.8mg左右蛋白，而其中目的蛋白的纯度只有40％(参见非专利文献1：Sandra Camprub′I，Marc Bruguera，Francesca Canalias.International Journalof Biological Macromolecules，38(2006)134-139)。175-574

全长SLO基因是含有571个氨基酸残基(aa)的蛋白，通过结构预测发现，这一蛋白大致可以分为前后三个区域。其中，第一段区域1-77个aa，是胞外分泌信号肽，具有细胞毒性；最后一段459-571aa具有细胞膜铆定功能，是SLO的毒性相关结构域(参见非专利文献2：Silvia Weis，Michael Palmer.Biochimicaet Biophysica Acta，1510(2001)292-299)。我们选择对101-400aa的片段进行克隆表达。

现有技术中报道的表达方案，一般只去除蛋白的信号肽部分，表达剩余大部分蛋白，但因为剩余部分的毒性影响细胞生长，产量也不高。由非专利文献1的记载可知，每升细菌培养物(7-8g湿菌体/升)能纯化出38.8mg左右蛋白，而其中目的蛋白的纯度只有40％。

发明内容

本发明要解决的问题

本发明的目的在于提供一种能在表达载体中大量表达SLO的基因以及基因工程菌，并利用该SLO制备ASO检测试剂盒。

解决问题的手段

本发明人将SLO的结构域(Domain)1和4截去，将剩余的截短的SLO基因克隆到大肠杆菌等表达载体中，使之大量表达并利于纯化。具体而言，本发明人提供如下的技术方案。

1.一种DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种DNA序列，其为编码如下蛋白质的序列：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列且具有溶血链球菌溶血素O免疫原性的蛋白质。

3.一种溶血链球菌溶血素O，其特征在于，

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列且具有溶血链球菌溶血素O免疫原性的蛋白质。

4.一种表达载体，其含有权利要求1或2所述的DNA序列。

5.一种制备溶血链球菌溶血素O的方法，包括用技术方案4所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的制备溶血链球菌溶血素O。

6.根据技术方案5所述的方法，其特征在于，宿主细胞是大肠杆菌。

7.一种抗溶血链球菌溶血素O检测试剂盒，其特征在于，包含缓冲液、叠氮钠以及包被技术方案3所述的溶血链球菌溶血素O的胶乳。

8.一种抗溶血链球菌溶血素O检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包含如下工序：a)将胶乳微球用缓冲液稀释，将缓冲液溶解的技术方案3所述的溶血链球菌溶血素O加入到所述胶乳微球的稀释液中，室温搅拌后，收集沉淀；b)用缓冲液重悬所述沉淀，调整所述胶乳浓度至规定浓度。

技术效果

根据本发明，截短的SLO序列能使SLO蛋白的产量大大提高，每升细菌培养物能纯化得到150mg以上的SLO蛋白，纯度90％以上。将SLO重组抗原用来研制ASO胶乳增强试剂盒，发现研制的ASO试剂盒检测临床标本结果和对照ASO试剂盒测试结果相关性很好，证明表达的SLO依然保持了特异的免疫原性。

附图说明

图1是ASO试剂定标曲线，曲线中的每一个点代表一个含量的校准品，X轴表示ASO含量，Y轴表示吸光度；

图2是自制试剂和对照试剂测定50人份血清相关性分析相关性图表；

图3是表示SLO基因的克隆的电泳图；

图4是经IPTG的诱导过的截短型SLO蛋白电泳图，(+)表示经IPTG的诱导，(-)表示未经IPTG的诱导；

图5是上清液和沉淀中的截短型SLO蛋白电泳图。

具体实施方式

本发明的截短型溶血链球菌溶菌素O基因

本发明提供一种碱基序列如SEQ ID NO：1所示的DNA序列，以及编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的DNA序列。根据简并密码子原理，简并密码子之间的突变并不改变氨基酸序列，这种突变不会影响蛋白质本身的性质，因此，这一类的变异也属于本申请的专利保护范围之内。此外，与本发明提供的DNA序列对应的RNA序列也可实现本发明的效果。

作为本发明的对象的基因序列，并不限于前述SEQ ID NO：1所示的DNA序列以及其中的简并密码子突变序列，还包括编码与该蛋白质具有同等功能的蛋白质的其他基因序列。作为具有同等功能的蛋白质，例如可以为在SEQ IDNO：2限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列且具有SLO免疫原性的蛋白质。

本发明的基因序列可以通过PCR方式从链球菌(Streptococcus pyogenes)的基因组DNA中扩增，或可通过基因合成获得，国内可以进行基因合成的公司有上海生工，上海旭冠，北京英骏等。

本发明的蛋白质

本发明还提供一种溶血链球菌溶血素O，其特征在于，(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列且具有SLO免疫原性的蛋白质。

此类蛋白质可以为由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加上述数量的氨基酸残基后的氨基酸序列组成，且具有SLO免疫原性的蛋白质。此外，此类蛋白质还可以为具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有约70％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上、最优选为95％以上的同一性的氨基酸序列且具有SLO免疫原性的蛋白质。

此类蛋白质可通过使用《Molecular Cloning3》、《Current Protocols inMolecular Biology》等记载的定点诱变法获得。

本发明中，在蛋白质的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列，是指在同一序列中的任意1个或多个氨基酸序列的位置上的1个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加，并且可同时发生取代、缺失或添加中的两种以上。

下面例举可互相取代的氨基酸残基，同一组中包含的氨基酸残基可互相取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

本发明的蛋白质也可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法合成。并且，也可以利用Advanced Chem Tech公司、铂金埃尔默(Perkin Elmer)、Pharmacia公司、Protein Technology Installment公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、岛津制作所等制造的肽合成仪进行化学合成。

本发明的载体及使用该载体转化的大肠杆菌

本发明提供含有上述基因序列的载体，所述载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。作为载体，可例举出质粒、噬菌体、病毒、粘粒等生物工程领域中常用的载体。本发明的载体通常包括表达盒，该表达盒含有的结构要素为：(1)在宿主细胞内可转录的启动子；(2)在该启动子的正义方向或反义方向上连接的上述基因序列；以及(3)涉及RNA分子的转录终止以及多聚腺苷化作用，在宿主内起作用的信号。本发明中，优选表达载体为pET28b载体，优选宿主为大肠杆菌DH5α、DE3，但本发明的载体和宿主并不限于此。

分子克隆技术通常特指基因克隆(gene cloning)或DNA重组技术(recombinant DNA technology)。基因克隆主要包括：①连接外源基因和克隆载体，构建重组DNA分子，②将重组DNA分子转入受体细胞，使外源基因随受体细胞分裂而得以复制、繁殖。

基因克隆的基本方法主要有以下操作和结果：

(1)包括有目的基因在内的DNA片断插入到空载体中，空载体包括可以包括多种常见的检测标记(例如荧光标记、抗生素标记等报告基因)和酶切位点。重组载体可以采用空载体本身多克隆位点的多种核酸内切酶(如NdeI、NcoI、EcoRI、HindIII，BamHI等)，可以先用酶线性化空载体，与采用相同核酸内切酶处理的目的基因片段相连接，构建本发明的重组表达载体。本发明选用NcoI和XhoI双酶切pET28b及其连接的PCR产物片段，经连接酶连接，构建本发明的重组pET28b-SLO。

(2)重组载体pET28b-SLO可以通过生物分子学领域常见的方法重组表达质粒转化、转导或者转染到宿主细胞中，如氯化钙法化学转化，高压电击转化，本发明优选化学法进行转化；所述的宿主细胞可以为原核细胞或者真核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母细胞或者动植物细胞，本发明优选大肠杆菌细胞BL21(DE3)。

(3)将重组表达质粒pET28b-SLO转化至BL21(DE3)细胞中后，即得到生产SLO抗原的基因工程菌株，基因工程菌株经过大量培养、诱导后，可以通过离心方法分析重组细胞和培养基，用高压匀浆或者超声的方法破碎细胞，用离心或者过滤方法去除细胞碎片，用亲和层析方法从上清液中纯化SLO抗原。对纯化的SLO抗原可以用如下方法进行纯度确定，如电泳分析法(SDS-PAGE)、抗原抗体法、蛋白质谱法、扩散分析、恒溶度法等。

本发明的ASO检测试剂盒以及使用方法

本发明所述SLO抗原基因工程菌的构建方法和一种可以定量检测溶血素“O”试剂盒。

优选的情况下，本发明的试剂盒包括SLO抗原、聚苯乙烯微球和牛血清白蛋白等，聚苯乙烯微球在试剂盒中的作用是起到胶乳增强作用，牛血清白蛋白是起稳定试剂作用，由于用本发明所述的方法可以制备大量表达的SLO抗原，并且重组抗原的特异性很好，所以用本发明所述的SLO抗原制备的抗链球菌素O测定试剂盒具有灵敏度高的优点，并且可以进行规模化制备。免疫胶乳增强试剂盒由两种试剂组成：试剂1为酸碱缓冲液+0.1％BSA溶液，试剂2为：将包被好的微球用试剂1充分悬浮的乳浊液。可以使用的缓冲液包括：pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液(50mM)，pH8.5-9.5的硼酸缓冲液，pH8.0-9.5的Tris-HCl缓冲液，pH8.0-9.6的碳酸缓冲液。优选pH7.0-8.0的缓冲液，但不仅限于上述缓冲液组分。为了保证乳浊液的分散性，有时也可以添加0.1％TritonX-100。

为了保证目的蛋白在试剂盒中的稳定性，可加入一定比例的叠氮钠(0.01％-0.1％)，DTT(1mM)等试剂。

抗链球菌素O测定试剂盒临床上用于测定人体血清或血浆中抗链球菌素O的含量。链球菌素O(SLO)是链球菌的一种胞外产物，它能溶解细胞膜从而导致溶血。抗链球菌素(ASO)是SLO的抗体。ASO测试能为早期的链球菌感染提供证据，主要应用于急性风湿热、链球菌感染后的血管球性肾炎、患有咽炎的个人以及其它急性感染的检验。

上述ASO检测试剂盒的制备方法，包含如下工序：a)用浓度为50mM的pH7.0的磷酸盐缓冲液，将胶乳微球进行稀释，在分光光度计上检测OD值为2.0-2.5(波长600nm，光径1cm)，将缓冲液溶解的抗原加入到所述胶乳微球的稀释液中，以50rpm/min的搅拌速度，在室温下搅拌3小时，25000g条件下离心1小时，收集沉淀，；b)用含有0.1％BSA的pH为7.0的磷酸盐缓冲液重悬沉淀，并将浓度调整至OD值为1.2-1.4(波长600nm，光径1cm)。

实施例

下面，通过实施例对本发明进行更进一步的说明，但是，本发明并不限于如下实施例。

实验材料

1菌种

本实验用到的大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)购自天根公司。

链球菌Streptococcus pyogenes由军事医学科学院提供。

2载体

本实验涉及到的表达载体pET28b由本实验室保存。

3引物

本实验用到的引物SLO-1/SLO-2均为生工合成。

SLO-1：ATCGCATATG AAACAAAACACTGCTAGTACAGAAAC，附加NdeI酶切位点；SLO-2：ATCGCTCGAG AGCTTCATTGCTGACACCTTTTC，附加XhoI酶切位点。

4培养基：

LB培养基：蛋白胨：10g/L

          酵母粉：5g/L

          NaCI：10g/L

          121℃20min灭菌。

5其他

本实施例中所用到的Taq酶与dNTP、限制性内切酶，修饰酶与连接酶等购自Takara公司，镍柱购自GE Company的HisTrap H.P。

实施例1

截短的SLO基因的克隆和表达载体的构建

将链球菌菌种接种于肉浸液肉汤培养基(Meat Infusion Broth)，37℃震荡培养18-24小时。离心收集菌体，沉淀重新悬浮于1ml TE(pH8.0)中。加入6μl50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h，再加入2mol/L NaCl50μl，10％SDS110μl，20mg/ml的蛋白酶K3μl，50℃作用15min。之后将菌液分到10ml离心管中，加等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，混匀后放置5min。12000rpm离心10min，吸取上清。重复抽提两次。在上清中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。12000rpm离心10min，沉淀用75％的乙醇洗涤、凉干后，溶于50μl ddH₂O中。

按照SLO基因序列设计引物SLO-1/SLO-2，以纯化的链球菌DNA为模板，扩增SLO的第100-400位aa的基因序列，约0.9kb，参见图3，预计表达得到的蛋白大小为30-35kD。将扩增正确的目的条带回收，用NcoI和XhoI消化后，连入同样酶切的pET28b载体。转化大肠杆菌DH5α，提取质粒并酶切鉴定，得到的阳性克隆命名为pET28b-SLO。将酶切鉴定为阳性的质粒转化表达菌种BL21(DE3)，然后涂布在含有卡那霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上，经抗性筛选可以得到SLO抗原基因工程菌。酶切阳性的质粒测序，测序结果表明表达载体构建正确。实施例2

截短型SLO蛋白的表达

从LB固体培养基上挑选SLO基因工程菌落，分别接种于含有100ug/ml的LB培养基中37℃过夜培养，第二天1：1000稀释于LB培养基中，37℃培养至OD2.0，加入终浓度1mM的IPTG进行诱导，4小时后收获菌液。将未加IPTG的菌液作为未诱导的对照。

分别取诱导前后的菌液各500μl，离心后去上清，菌体用200μl的蛋白上样缓冲液重悬，煮沸5min后离心，上清用于SDS-PAGE检测。考马斯亮蓝的染色结果显示，经过IPTG的诱导，在预测的分子量处有一条特异的浓集的蛋白条带，而未诱导的菌体则没有，具体结果请见图4。选择表达水平高的菌株为工程菌株。

诱导后的细菌超声破碎后离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，结果表明重组蛋白大部分以可溶形式存在于上清中，具体结果请见图5。

SDS电泳结果表明，在预期大小(30-35kD)很大一部分SLO蛋白都以可溶的形式在上清中存在，因此可用镍柱亲和层析的方法将目的蛋白纯化。纯化后电泳检测结果表明，目的蛋白的纯度可以达到95％以上。1L培养基大约可纯化150mg目的蛋白。

重组SLO蛋白的免疫原性测定

本试验用ELISA方法验证了重组蛋白的免疫原性。ElISA吸光值读数如表1所示。以BSA包被的小孔为阴性对照，对照与样品各做3个重复，ASO的稀释度为1：20000。ELISA数据表明，重组的SLO蛋白与ASO有很强的特异免疫反应。

表1SLO重组蛋白的ELISA检测

实施例3

工程菌的保存、扩大培养及目的蛋白的纯化

菌种保存方法：

挑取LB+Kan(100ug/ml)固体平板上pET28b-SLO基因工程菌落，接种于LB+kan(100ug/ml)的液体培养基中，待OD600生长至2.0左右后，将其保存至含有甘油的冻存管中，甘油的终浓度为15％。

细胞活化和摇瓶发酵操作方法：

取冻存管、待菌液溶解后，在LB+Kan(100ug/ml)固体平板上进行划线培养(37℃)，长出单菌落后，挑取单菌落接种于LB+Kan(100ug/ml)的液体培养基中，37℃150rpm/min过夜培养(约12h)，按0.1％的接种量接种于LB+Kan(100ug/ml)的液体培养基中37℃220rpm/min培养。待培养液生长到OD600＝1左右时，加诱导剂IPTG，终浓度为1mM，30度培养过夜，然后破胞提取SLO蛋白。

蛋白的纯化：

将发酵得到的菌体用上样缓冲液(20mM PBS，0.5MNaCl，30mM咪唑，pH7.4)重悬，按照1克菌体加入10ml上样缓冲液(Loading Buffer)的比例充分悬浮菌体后，超声波破碎。离心后取上清用0.45μM的滤膜过滤，既为镍柱纯化的样品。

将上述样品上柱，用Loading Buffer冲洗至OD280吸收值至直线，用Elusion Buffer(20mM PBS，0.5MNaCl，300mM咪唑，pH7.4)洗脱，收集洗脱峰。

实施例4

ELISA和Western Blot检测重组蛋白的抗原性

用抗SLO阴性和阳性血清1：10000倍稀释后，按照ELISA操作规程包被，分别与提纯的重组蛋白反应。结果显示重组的SLO能区分阳性和阴性的血清。Western Blot中，一抗为抗SLO阴性和阳性血清按照1：10000倍稀释，二抗为过氧化物酶标记的兔抗人IgG1：4000倍稀释液。结果与ELISA相同，表示重组SLO能够用于检测SLO的抗体。

实施例5

胶乳增强法试剂盒配置

SLO抗原与胶乳的交联：在洁净的容器中将微球用PBS稀释五倍，将PBS溶解的抗原(1mg/ml，每0.1ml胶乳加入5ml抗原)缓慢加入到不断搅拌的胶乳微球中。室温搅拌4小时；26000g4度离心一个小时，将离心管倒置，尽量将上清去除干净，留沉淀。用PBS+0.1％BSA缓冲液重悬：由于离心时间较长，沉淀贴壁较紧，重悬时需先用吸管尽量吹打均匀，但应尽量避免起泡沫。然后用超声破碎仪超声混匀(300w，0.6cm的探头，超声5秒，暂停5秒，每个离心管超声5分钟～10分钟)，至没有明显颗粒。用缓冲液调整胶乳浓度为试剂盒要求浓度。免疫胶乳增强试剂盒由两种试剂组成：试剂1为酸碱缓冲液+0.1％BSA溶液，试剂2为：将包被好的微球用试剂1充分悬浮的乳浊液。可以使用的缓冲液包括：pH7.0PB(50mM)，pH8.5硼酸缓冲液，pH8.0Tris-HCl缓冲液，pH9.6的碳酸缓冲液。优选pH7.0-8.0的缓冲液，但不仅限于上述缓冲液组分。

为了保证目的蛋白在试剂盒中的稳定性，可加入一定比例的叠氮钠(0.01％-0.1％)，DTT(1mM)等试剂。为了保证乳浊液的分散性，也可以添加0.1％TritonX-100。

实施例6

ASO胶乳试剂盒的应用

测定步骤：250ul试剂1加入3样本，于37度5分钟后加入50ul的试剂2，在主波长为600nm、付波长为700nm的条件下读取吸光度值，反应五分钟后读取另外一点的吸光度值，经计算得到吸光度差值。

制作本发明ASO校准品的标准曲线：采用本发明的校准品(制备5种不同含量的0，75IU/ml、150IU/ml、200IU/ml、300IU/ml的ASO校准品)，采用奥林帕斯AU400生化分析仪器，按照上述测定步骤测得本发明ASO校准品曲线。曲线中每个点代表一个含量的校准品。其中X轴表示ASO的含量；Y轴表示吸光度。见图1。

相关性实验：

使用上述实施例5制备的试剂盒(简称本发明试剂)和对照试剂(市售ASO试剂)，采用奥林帕斯公司制造的AU400全自动生化分析仪器对50例人血清进行测定，对测定值进行分析。发明试剂按照与上述参数进行测定，对照试剂按照原厂家说明书参数进行测定利德曼生产的抗链球菌素O测定试剂盒说明书所述参数进行测定，测值结果见表2、图2。

由图2结果所知，发明试剂与对照试剂的相关系数为R2＝0.9994，回归方程为Y＝1.0013X-0.206。该结果标明本试剂与对照试剂测定病人血清ASO含量的效果相关性良好，具有很好的特异性和准确性。本发明试剂不限于奥林帕斯AU400生化分析仪器，还适用于其它半自动和全自动生化分析仪器。

表2

工业实用性

根据本发明，截短的SLO序列能使SLO蛋白的产量大大提高，每升细菌培养物能纯化得到150mg以上的SLO蛋白，纯度90％以上，经过免疫学实验证明，这一分段表达的SLO依然保持了特异的免疫原性，因此，本发明极具工业实用价值。

Claims (8)

1.一种溶血链球菌溶血素O，其特征在于，

所述溶血链球菌溶血素O的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种DNA，其序列编码权利要求1所述的溶血链球菌溶血素O。

3.根据权利要求2所述的DNA，其序列为如SEQ ID NO：1所示的序列或其简并密码子突变序列。

4.一种表达载体，其含有权利要求2或3所述的DNA序列。

5.一种制备溶血链球菌溶血素O的方法，其包括用权利要求4所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的溶血链球菌溶血素O。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌。

7.一种抗溶血链球菌溶血素O检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含缓冲液、叠氮钠以及包被权利要求1所述的溶血链球菌溶血素O的胶乳；所述缓冲液为：pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液，或pH8.5－9.5的硼酸缓冲液，或pH8.0-9.5的Tris-HCl缓冲液，或pH8.0-9.6的碳酸缓冲液。

8.根据权利要求7所述的抗溶血链球菌溶血素O检测试剂盒，其中，包含如下工序：a）将胶乳微球用缓冲液稀释，将缓冲液溶解的权利要求1所述的溶血链球菌溶血素O加入到所述胶乳微球的稀释液中，室温搅拌后，收集沉淀；b）用缓冲液重悬所述沉淀，调整所述胶乳浓度至规定浓度。