CN102010870A - 高表达量的溶血素基因及其分泌表达载体和应用 - Google Patents
高表达量的溶血素基因及其分泌表达载体和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高表达量的溶血素基因及其分泌表达载体和应用,属于遗传工程领域。本发明是以来自Streptococcus pyogenes NZ131菌株slo基因序列为模板(Streptococcuspyogenes NZ131,complete genome:NCBI accession:NC_011375.1),利用大肠杆菌优化密码子替换其56个大肠杆菌稀有密码子,设计并合成了编码化脓链球菌溶血素的新基因nslo,构建了含该nslo基因的分泌型表达载体和含该分泌型表达质粒的工程菌。表达结果表明,蛋白表达产量可以达到3mg/mL以上,酶活可达到2.4×106HU/mL。本发明实现了nslo的高效表达,可广泛引用于与医学研究和疾病诊断,适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种人工改造合成的高表达量的化脓链球菌溶血素基因nslo,属于医学微生物基因工程领域。本发明还涉及一种依上述基因构建的分泌型表达载体及其应用,属于基因工程领域。
技术背景
溶血素主要来自链球菌、金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌等。来自化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的溶血素(Streptolysin O,SLO)是胆固醇依赖性的,能够与人及其它动物的细胞膜上的胆固醇相结合,结合到细胞膜上的SLO蛋白分子会形成环状寡聚体,形成大的孔道,导致细胞膜溶解,而且介导一些大分子(如NADase)通过细胞膜,所以SLO是链球菌感染宿主过程中的重要毒素蛋白。
SLO在医学研究和应用中具有广泛的应用价值,首先在医学与生物学研究中,SLO作为成孔蛋白,被用作打孔工具;其次,在诊断医学中,作为检测试剂,用来检测被Streptococcuspyogenes感染的患者体内的抗SLO的抗体(anti-SLO);再其次,可以用做细胞自杀基因和自杀蛋白,研究其在控制肿瘤细胞繁殖中的应用。
从天然链球菌中获得SLO的工艺成本高,得率低,具有不安全性。自1984年以来,前人一直研究SLO在大肠杆菌原核系统中的表达,至目前,国内外研究人员已经在原核系统中实现了SLO与maltose-binding protein、GST-tag和6His-tag等表达标签的融合表达。但是,在目前SLO的重组表达方法中,存在的显著缺点是表达产量始终比较低,在0.3mg/mL以下,导致后期纯化应用难度较大。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供一种人工改造合成的,可在大肠杆菌中高效表达的新的化脓链球菌溶血素基因nslo及其表达载体,该人工改造合成的nslo基因,具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列。
所述核苷酸序列使用了使用了大肠杆菌偏爱性密码子。
使用所述溶血素基因nslo构建的表达载体。
所述表达载体为分泌型载体,优选为pET-20b(+)。
使用所述溶血素基因nslo或表达载体构建的转基因细胞系或基因工程菌。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种所述溶血素基因nslo或含有溶血素基因nslo的表达载体在医学研究、疾病诊断和SLO抗体制品生产中的应用。
本发明设计并合成了编码化脓链球菌溶血素的新基因nslo,构建了含该nslo基因的分泌型表达载体和含该分泌型表达质粒的工程菌。表达结果表明,溶血素蛋白产量可以达到3mg/ml,酶活达到2.4x106HU/mL,Western和Elisa实验表明其抗原性显著,实现了SLO蛋白在原核生物大肠杆菌中高效率分泌性表达,适合工业化生产。
附图说明
图1nslo/pET-20b(+)酶切鉴定图
1.DNA Marker;2.nslo/pET-20b(+);3.nslo/pET-20b(+)双酶切。
图2nslo/pET-20b(+)物理图谱
图3重组表达SLO摇瓶发酵的SDS-PAGE图谱
1.蛋白Marker;2.pET-20b(+)/BL21(DE3)的胞内上清;3.nslo/pET-20b(+)/BL21(DE3)的胞内上清。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明,下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。
实施例1nslo基因设计
以Streptococcus pyogenes NZ131菌株slo基因序列232-1673bp为起始序列(1-231序列编码的氨基酸序列与SLO的溶血活性与抗原性不相关),在mRNA的二级结构分析的基础上,用65个大肠杆菌偏爱密码子替换slo基因内部的大肠杆菌稀有密码子,得到新的人工改造设计的化脓链球菌溶血素基因nslo,序列见SEQ ID NO.1,全长1485个核苷酸,编码495个氨基酸,替换的碱基和相关的密码子在nslo和NZ131菌株slo基因的比对图(图1)中进行了标记。
实施例2nslo基因合成与克隆
由于nslo基因与原slo基因相比,变动较大,不便于使用突变技术,因此使用化学合成法一步合成nslo基因,将合成的nslo基因与pMD18T(Takara)载体连接,转化JM109,转化产物涂布含100g/mL氨苄青霉素的LB平板,经过37℃培养过夜,得到单克隆转化子nslo/pMD18T/JM109,经过菌落PCR鉴定,质粒酶切鉴定和测序鉴定,表明新合成的nslo基因全长为1485bp,编码495氨基酸,测定的序列和设计序列完全相同。
实施例3分泌表达SLO蛋白的载体构建
用于实现nslo基因在大肠杆菌中分泌性表达的载体是pET-20b(+),该载体带有pelB信号肽和His-tag标签,将pET-20b(+)质粒和nslo/pMD18T用NocI和NotI切,酶切产物切胶回收,再用T4连接酶连接,连接产物转化E.coli JM109感受态细胞,经过37℃培养过夜,挑选转化子,通过菌落PCR鉴定,质粒酶切鉴定(见图2)和测序鉴定,保存鉴定的nslo/pET-20b(+)/E.coli JM109菌,提取nslo/pET-20b(+)备用。
实施例4分泌表达SLO蛋白的工程菌构建
将质粒nslo/pET-20b(+)转化大肠杆菌宿主BL21(DE3),再在100g/mL氨苄青霉素的LB平板,经过37℃培养过夜,经过菌落PCR鉴定,得到单克隆转化子nslo/pET-20b(+)/BL21(DE3)。
实施例5发酵与SLO蛋白的分离纯化
1、摇瓶发酵
将nslo/pET-20b(+)/BL21(DE3)接种在LB培养基中37℃液体培养过夜,后接入TB(甘油5g/L,蛋白胨12g/L,酵母膏24g/L,K2HPO4 12.54g/L,KH2PO4 2.31g/L)发酵液体培养基,37℃培养到细菌OD600到0.8,用0.5mM IPTG(异丙基硫代β-D半乳糖苷)诱导,降温至15℃培养,48h时产酶达3mg/mL以上,SDS电泳图谱见图4。
2、分离纯化
将表达后的培养液离心,得到上清用0.45um膜过滤,过滤后的溶液按照1∶1的比例和2X Binging buffer(10mM咪唑,1M NaCl,40mM Tris-HCL)混匀备用;His-tag亲和层析柱用5倍柱体积的1X charging buffer(50mM NiSO4)处理后,再用倍柱体积1X Binding buffer(2.5mM咪唑,0.5M NaCl,20mM Tris-HCL)平衡;上样品后用10倍柱体积1X Binging buffer洗柱,再用5倍柱体积1X Washing buffer(60mM咪唑,0.5M NaCl,20mM Tris-HCL)洗柱;用6倍柱体积1X Elution buffer(1M咪唑,0.5M NaCl,20mM Tris-HCL)洗脱。
实施例6酶活测定、Western、Elisa鉴定重组表达的SLO蛋白抗原性
SLO样品可用溶液A(溶液A:36mM H3PO4,126mM NaCl,1g/L BSA(bovine serumalbumin),pH 7.0)进行系列梯度稀释。将0.5ml的150mM 2-mercaptoethanol与1ml稀释样品混匀,30℃孵育15min,然后每管加0.5ml含绵羊红细胞的A溶液(158×108cell/ml)30℃下反应20min,离心后,用541nm检测上清中血红蛋白的浓度。1U定义为在该实验条件下,引起上述反应体系中50%红细胞溶解的酶量所需要的酶量。经测定,1mL菌液的酶活为2.4x106HU以上。Western和Elisa实验结果为阳性,表明其具有抗原性。
实施例7nslo基因在医学研究、疾病诊断中的应用
用nslo基因构建SLO表达工程菌,通过发酵生产SLO蛋白。SLO蛋白是医学研究和临床使用的重要生物学试剂。利用SLO蛋白,作为抗原,可以检测患者体内ASO(抗SLO蛋白的抗体),以此诊断链球菌感染引起的变态反应和最近是否存在链球菌感染。
实施例8nslo基因SLO抗体制品生产中的应用
将纯化得到的SLO蛋白,免疫动物,纯化免疫血清,得到SLO抗体。
nslo基因SLO抗体制品生产中的应用可参考下列文献:
1.Kimoto H,Fujii Y,Hirano S,Yokota Y,Taketo A.Expression of recombinant StreptolysinO and specific antibody production.J Mol Microbiol Biotechnol.2005;10(1):64-8.
2.Velázquez B,Massaldi H,Battistoni J,Chabalgoity JA.Construction and expression ofrecombinant streptolysin-o and preevaluation of its use in immunoassays.Clin Diagn Lab Immunol.2005 May;12(5):683-4.
序列表
核苷酸序列表
<110>盐城师范学院
<120>高表达量的溶血素基因及其分泌表达载体和应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1485
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据基因序列设计,用于高效表达。
<400>1
ctggctccga aagaaatgcc actggaatct gcagagaagg aagagaagaa gtcagaagac 60
aagaaaaaga gcgaagaaga tcacactgaa gaaatcaatg acaagattta ttcactgaat 120
tataatgagc tggaagtact ggctaagaat ggtgaaacca ttgaaaattt tgttcctaaa 180
gaaggcgtta agaaagctga taaatttatt gtcattgaac gcaagaagaa gaatatcaac 240
actactccag tcgatatttc catcattgac tctgtcactg atatgaccta tccagcagcc 300
ctgcagctgg ctgataaagg ttttaccgaa aacaaaccag acgcggtagt caccaagcgc 360
aacccacaaa agatccatat tgatttacca ggtatgggag acaaagcaac ggttgaggtc 420
aatgacccta cctatgccaa tgtttcaaca gctattgata atctggttaa ccaatggcat 480
gataattatt ctggtggtaa tacgctgcct gcccgcaccc aatatactga atcaatggta 540
tattctaaat cacagattga agcagctctg aatgttaata gcaaaatctt agatggtact 600
ttaggcattg atttcaagtc gatttcgaaa ggtgagaaga aggtgatgat tgcagcatac 660
aagcaaatct tctacaccgt atcagcaaac ctgcctaata atcctgcgga tgtgtttgat 720
aaatcagtga cctttaaaga tttacaacgc aaaggtgtca gcaatgaagc tccgccactc 780
tttgtgagta acgtagccta tggtcgcact gtgttcgtca aactggaaac cagttctaag 840
agtaatgatg ttgaagcggc ctttagtgca gctctgaaag gaaccgatgt taagacgaat 900
ggcaaatact ctgatatctt agagaatagt tcatttacag ctgtcgtctt aggaggagat 960
gctgcagagc acaataaggt agtcaccaaa gacttcgatg ttattcgcaa cgttatcaaa 1020
gacaatgcta ccttcagtcg caagaaccca gcttatccta tttcatacac cagtgttttc 1080
cttaagaata ataagattgc gggtgtcaat aaccgcactg aatatgttga aaccacctct 1140
accgagtaca ctagtggcaa gattaacctg tctcatcgcg gcgcgtatgt tgctcaatat 1200
gaaatccttt gggatgaaat caattatgat gacaaaggaa aagaagtgat tacaaaacgc 1260
cgctgggaca acaactggta tagtaagacc tcaccattta gcacagttat cccactagga 1320
gctaattcac gcaatatccg catcatggct cgcgagtgca ccggcttagc ttgggaatgg 1380
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<210>2
<211>5154
<212>DNA
<213>nslo/pET-20b(+)
<400>1
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Claims (8)
1.一种人工改造合成的化脓链球菌溶血素基因nslo,具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的溶血素基因nslo,其特征在于所述核苷酸序列使用大肠杆菌的偏爱性密码子。
3.含有权利要求1所述溶血素基因nslo的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体,其特征在于所述表达载体为分泌型载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体,其特征在于优选为pET-20b(+)。
6.含有权利要求1所述溶血素基因nslo或权利要求5所述表达载体的转基因细胞系。
7.含有权利要求1所述溶血素基因nslo或权利要求5所述表达载体的基因工程菌,优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
8.权利要求1所述溶血素基因nslo或权利要求5所述表达载体在医学研究、疾病诊断和溶血素抗体制品生产中的应用。
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