CN101304760A - 诱导保护性应答的登革病毒衣壳蛋白以及药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及获得包含登革病毒血清型的衣壳蛋白的药物组合物，其能够在受者中诱导针对病毒攻击的保护性免疫应答，而不诱导抗体依赖性增强现象。

Description

诱导保护性应答的登革病毒衣壳蛋白以及药物组合物
本发明涉及生物技术和制药工业领域，特别是涉及获得能够诱导针对登革病毒(从现在开始称为DEN)感染的免疫应答的蛋白质，同时避免在重新感染这种病毒的个人中描述的抗体依赖性增强现象。
登革热(DF)和登革出血热(DHF)作为健康问题而获得越来越大的重要性，其影响几个热带和亚热带地区的国家。登革病毒已在超过100个国家中发现，并且估计有2500百万人生活在危险区域内。每年报道50-100百万例DF和250000-500000例DHF。(Guzmán M.G.和KouríG.2002.Dengue：an update.Lancet Infect.Dis.2：33-42)。
这种疾病的致病剂是黄病毒科黄病毒属的登革病毒，所其通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)传播(Leyssen P.，De Clerco E.，NeytsJ.2000.Perspectives for the treatment of infections withFlaviviridae.Clin.Microbiol.Rev.13：67-82)。
迄今为止已报道了可以在相同区域中传播的4种血清型。登革病毒是正RNA包被病毒，其基因组仅包含1个读码框。该RNA被翻译成多蛋白，所述多蛋白被加工成3个结构蛋白和7个非结构蛋白。(Russell P.K.，Brandt W.E.，Dalrymple J.M.1980.Chemical andantigenic structure of flaviviruses.The togaviruses：biology，structure，replication.Schelesinger R.W.(ed.).503-529)。
已进行多个流行病学调查以确定造成登革疾病的最严重形式的危险因素。它的特征在于高热、液体外渗、出血和最终地登革休克。(Gubler D.J.1998.Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever.Clin.Microbiol.Rev.11：480-496)。最重要的危险因素之一是经由异源血清型的继发感染。不存在不同血清型感染间的交叉保护。(KouríG.，Guzmán M.G.，Bravo J.，Trina C.1989.Dengue hemorrhagicfever/dengue shock syndrome：lessons from the Cuban epidemic.WHO Bulletin OMS.67：375-380)。
存在几种假设以解释这种现象。最重要的一种是抗体依赖性增强。(Halstead S.B.，Scanlon J.E.，Umpaivit P.，Udomsakdi S.1969.Dengue and Chikungunya virus infection in man in Thailand，1962-1964.IV.Epidemiologic studies in the Bangkokmetropolit anar ea.Am.J.Trop.Med.Hyg.18：997-1021)。
根据初步研究，提出DEN病毒在来自患者血液的外周单核细胞中更大量地复制，所述患者已经历该病毒的先前感染(Halstead S.B.，O’Rourke E.J.，Allison A.C.1977.Dengue viruses and mononuclearphagocytes.II.Identity of blood and tissue leukocytessupporting in vitro infection.J.Exp.Med.146：218-229)。后来，证实残留抗体负责这种效应(Morens DM，Halstead SB，Marchette NJ.1987.Profiles of antibody-dependent enhancementof dengue virus type 2 infection.Microb Pathog.Oc t；3(4)：231-7)。
在其中不存在中和的抗体特异性或浓度的条件下，抗体-病毒复合物可以被在膜中呈现Fcγ受体的细胞如单核细胞和巨噬细胞内在化。称为抗体依赖性增强(antibody depend enhancement，ADE)的这种机制在继发感染期间出现(Morens DM，Halstead SB，Marchette NJ.1987.Profiles of antibody-dependent enhancement of denguevirus type 2 infection.Microb Pathog.Oct；3(4)：231-7；Kliks S.C.，Nimmannitya S.，Nisalak A.，Burke D.S.1988.Evidencethat maternal dengue antibodies are important in thedevelopment of dengue hemorrhagic fever in infants.Am.J.Trop.Med.Hyg.38：411-419)。
Halstead等人(Halstead S.B.，Scanlon J.E.，Umpaivit P.，Udomsakdi S.1969.Dengue and Chikungunya virus infection inman in Thailand，1962-1964.IV.Epidemiologic studies in theBangkok metropolitan area.Am.J.Trop.Med.Hyg.18：997-1021)在泰国曼谷进行的3年研究中报道，在儿童中由于DEN感染的住院指数在7-8个月大的那些中达到最大。这些指数是在1-3个月的儿童中观察到的4-8倍，并且是在3岁儿童中的2倍。Kliks等人(KliksS.C.，Nimmannitya S.，Nisalak A.，Burke D.S.1988.Evidence thatmaternal dengue antibodies are important in the development ofdengue hemorrhagic fever in infants.Am.J.Trop.Med.Hyg.38：411-419)确定了针对DEN-2的母体中和抗体滴度与具有由同源病毒感染引起的DHF的13位儿童的年龄之间的关联。结果显示，当母体抗体水平减少至亚中和水平时，出现该病毒感染的严重病例。这些数据与这样的假设相一致，该假设为母体抗体具有双重作用，即首先防护和随后刺激DHF发展。
尽管具有这种免疫学现象，但现今全世界最先进的疫苗候选物基于包含包膜蛋白的4种不同血清型的减毒病毒。这些候选物在人志愿者中能够诱导针对暴露的蛋白质(PrM/M和包膜)的潜在扩大性抗体和针对4种病毒血清型的保护性中和抗体。(Kanesa-thasan N.，SunW.，Kim-Ahn G.，Van Albert S.，Putnak J.R.，King A.，Raengsakulsrach B.，Christ-Schmidt H.，Gilson K.，ZahradnikJ.M.，Vaughn D.W.，Innis B.L.，Saluzzo J.F.y Hoke C.H.2001.Safety and immunogenicity of attenuated dengue virus vaccines(Aventis Pasteur)in human volunteers.Vaccine.19：3179-3188)。
尽管诱导了增强抗体，但是免疫接种后高水平的中和抗体仍可以防止病毒复制。当就中和抗体而言对于疫苗中的4种血清型的总血清转化未获得或者在血液中减少至低水平时，该问题可以出现，并且随后个体将变得对于由其保护性抗体不存在的病毒血清型引起的严重继发感染易感。事实上，已在猴和人中进行了几种测试以确定疫苗制剂中的病毒量。(Guirakhoo F.，Arroyo J.，Pugachev K.V.，MillerC.，Zhang Z.-X.，Weltzin R.，Georgakopoulos K.，Catalan J.，Ocran S.，Soike K.，Raterree M.，Monath T.P.2001.Construction，safety，and immunogenicity in nonhuman primates of a chimericyellow fever-dengue viruste travalent vaccine.J.Virol.75：7290-7304)。
在某些情况下，未获得关于4种血清型的血清转化平衡(Sabchareon A，Lang J，Chanthavanich P，Yoksan S，Forrat R，Attanath P，Sirivichayakul C，Pengsaa K，Pojjaroen-Anant C，Chokejindachai W，Jagsudee A，Saluzzo JF，Bhamarapravati N.2002.Safety and immunogenicity of tetravalent live-attenuateddengue vaccines in Thai adult volunteers：role of serotypeconcentration，ratio，and multiple doses.Am J Trop Med Hyg.66(3)：264-72)。此外，在儿童中对于就中和抗体而言的总血清转化必需施用高达3次剂量的减毒疫苗，并且这些是否将长期持续仍是未知的。(Sabchareon A，Lang J，Chanthavanich P，Yoksan S，Forrat R，Attanath P，Sirivichayakul C，Pengsaa K，Pojjaroen-Anant C，Chambonneau L，Saluzzo JF，BhamarapravatiN..2004.Safety and immunogenicity of a three dose regimen oftwo tetravalent live-attenuated dengue vaccines in five-totwelve-year-old Thai children.Pediatr Infect Dis J.；23(2)：99-109)。在包含登革病毒的包膜蛋白的疫苗制剂中，从而在开发中的疫苗候选物中，这是最值得怀疑的关注之一。
目前在I/II期中的减毒疫苗的另一个缺点是安全性。已在几项研究中证实了，第一次剂量后，在成人和儿童中存在不良反应例如发热、肌痛、瘀斑和头痛(Sabchareon A，Lang J，Chanthavanich P，YoksanS，Forrat R，Attanath P，Sirivichayakul C，Pengsaa K，Po.jjaroen-Anant C，Chambonneau L，Saluzzo JF，BhamarapravatiN.2004.Safety and immunogenicity of a three dose regimen oftwo tetravalent live-attenuated dengue vaccines in five-totwelve-year-old Thai children.Pediatr Infect Dis J.；23(2)：99-109)。一般而言，可能出现与活疫苗潜在相关的毒力回复现象。
在新的备选方案的研究中，已开发了通过重组方法获得的基于包膜蛋白或其片段的疫苗候选物的不同变体。这些重组候选物避免了与活病毒接种相关的安全性问题，并且如果没有诱导针对4种血清型的平衡应答，那么能够使个体致敏(Velzing J，Groen J，Drouet MT，van Amerongen G，Copra C，Osterhaus AD，Deubel V.1999.Inductionof protective immunity against Dengue virus type 2：comparisonof candidate live attenuated and recombinant vaccines.Vaccine.Mar 17；17(11-12)：1312-20)。另一方面，这些候选物需要强效的佐剂--关于其在人中的使用仍未获得批准--以刺激血清型特异性的合适的保护性免疫应答(Hermida L，Rodriguez R，Lazo L，SilvaR，Zulueta A，Chinea G，Lopez C，Guzman MG，Guillen G.2004.A dengue-2 Envelope fragment inserted within the structure ofthe P64k meningococcal protein carrier enables a functionalimmune response against the virus in mice.J Virol Methods.2004Jan；115(1)：41-9)。
中和抗体的体液应答已在动物中得到广泛研究，并且其保护效应已得到证实。在登革热中作为保护机制的细胞毒性细胞免疫应答仍未深入探究。相反地，存在几个报道，其中证实了细胞应答的诱导与疾病的最严重形式之间的关联(Rothman A.L.y Ennis F.A.1999.Immunopathogenesis of Dengue Hemorragic Fever.Virology.257：1-6)。这些研究基于在显示出DHF的那些个体中存在高水平的激活的T-细胞(Green S，Pichyangkul S，Vaughn DW，Kalayanarooj S，Nimmannitya S，Nisalak A，Kurane I，Rothman AL，Ennis FA.1999.Early CD69 expression on peripheral blood lymphocytes fromchildren with dengue hemorrhagic fever.J Infect Dis.180(5)：1429-35)。
已报道T-细胞表位主要在非结构蛋白中(Kurane I，Zeng L，Brinton MA，Ennis FA.1998.Definition of an epitope on NS3recognized by human CD4+ cytotoxic T lymphocyte clonescross-reactive for dengue virus types 2，3，and 4.Virology.1998 Jan 20；240(2)：169-74)，但也存在于包膜和衣壳蛋白中(Bukowski，J.F.，I.Kurane，C.-J.Lai，M.Bray，B.Falgout和F.A.Ennis.1989.Dengue virus-specific cross-reactive CD8human cytotoxic T lymphocytes.J.Virol.63：5086 5091；Gagnon S.J.，Zeng W.，Kurane I.，Ennis F.A.1996.Identification of two epitopes on the dengue 4 virus capsidprotein recognized by a serotype-specific and a panel ofserotype-cross-reactive human CD4+ cytotoxic T-lymphocyteclones.J Virol.70：141-147)。然而，通过仅诱导细胞免疫应答的这些蛋白质中的一些蛋白质的保护特性仍未得到证实。
在避免免疫增强现象的疫苗候选物的研究中，已进行了使用非结构蛋白NS1和NS3的研究。在NS1的情况下，在用重组蛋白质免疫的小鼠中已达到了一定水平的保护。通过ADCC机制，使用包含NS1基因的裸露DNA已获得了类似结果(Wu SF，Liao CL，Lin YL，Yeh CT，Chen LK，Huang YF，Chou HY，Huang JL，Shaio MF，Sytwu HK.2003.Evaluation of protective efficacy and immune mechanisms ofusing a non-structural protein NS1 in DNA vaccine against dengue2 virus in mice.Vaccine.Sep 8；21(25-26)：3919-29)。然而，还存在这样的报道，即由于诱导识别人内皮细胞的抗体，它们可能涉及自身免疫现象(Chiou-Feng Lin，Huan-Yao Lei，Ai-Li Shiau，Hsiao-Sheng Liu，Trai-Ming Yeh，Shun-Hua Chen，Ching-Chuan Liu，Shu-Chen Chiu和Yee-Shin Lin.2002.Endothelial Cell ApoptosisInduced by Antibodies against Dengue Virus nonstructuralProtein l via Production of Nitric Oxide.J.Immunol.657-664)。此外，存在使用包含NS3基因的裸露DNA制剂获得了保护的报道；然而，证实了这种保护由产生的抗体介导，因为使用被动免疫接种获得了相同的保护(Tan CH，Yap EH，Singh M，Deubel V，Chan YC.1990.Passive protection studies in mice with monoclonal antibodiesdirected against the non-struetural protein NS3 of dengue 1virus.J Gen Virol.1990 Mar；71(Pt 3)：745-9)。此外，值得注意的是这样的假设，即基于NS3蛋白表位的研究，对于异源病毒感染来说细胞应答可以潜在地有害(Zivny J，DeFronzo M，Jarry W，Jameson J，Cruz J，Ennis FA，Rothman AL.1999.Partial agonisteffect influences the CTL response to a heterologous denguevirusserotype.J Immunol.Sep1；163(5)：2754-60)。
在登革病毒的衣壳蛋白的情况下，没有报道在使用致死登革病毒的攻击中具有保护的证据。关于相关的黄病毒，公开了其中作者用包含日本脑炎(JE)衣壳蛋白的基因的裸露DNA制剂接种小鼠的报道。这种制剂在小鼠中不诱导针对使用致死JE攻击的保护性应答，尽管证实了细胞毒性应答(Konishi E，Ajiro N，Nukuzuma C，Mason PW，Kurane I.2003.Comparison of protective efficacies of plasmidDNAs encoding Japanese encephalitis virus proteins that induceneutralizing antibody or cytotoxic T lymphocytes in mice.Vaccine.Sep 8；21(25-26)：3675-83)。
使用重组衣壳蛋白的保护仅在人乳头瘤病毒的情况下得到证实。然而，已提出它关于其他病毒如丙型肝炎病毒的保护作用。不过，在所有情况下，它们是慢性感染或肿瘤，其中细胞的细胞毒性应答是免疫系统清除病毒感染的唯一手段(Duenas-Carrera S，Alvarez-Lajonchere L，Alvarez-Obregon JC，Herrera A，LorenzoLJ，Pichardo D，Morales J.2000.A truncated variant of thehepatitis Cvirus core induces a slow but potent immune responsein mice following DNA immunization.Vaccine.Nov 22；19(7-8)：992-7；Suzich JA，Ghin SJ，Palmer-Hill FJ，等人，1995.Systemicimmunization with papillomavirus L1 protein completelyprevents the development of viral mucosal papillomas.Proc NatlAcad Sci USA；92：11553-57)。这些疾病与在人中的登革感染所显示的急性特征不一致(Vaughn D.W.，Green S.，Kalayanarooj S.，Innis B.L.，Nimmannitya S.，Suntayakorn S.，Endy T.P.，Raengsakulrach B.，Rothman A.L.，Ennis F.A.y Nisalak A.2000.Dengue viremia titer，antibody response pattern，and virusserotype correlate with disea seseverity.J Infect Dis.181：2-9)。
登革病毒的衣壳蛋白具有9-12kDa(112-127个氨基酸)的分子量，并且具有显著的碱性特征，因为它的25％氨基酸是精氨酸和赖氨酸。由于多阳离子肽做到这点的能力，这些氨基酸的存在可以有利于向免疫系统呈递抗原。(Lingnau K.，Egyed A.，Schellack C.，MattnerF，Buschle M.，Schmidt W.2002.Poly-1-arginine synergizeswith oligodeoxynucleotides containing CpG-motifs(CpG-ODN)for enhanced and prolonged immune responses and prevents theCpG-ODN-induced systemic release of pro-inflammatory cytokines.Vaccine.20：3498-3508)。该蛋白质完全位于病毒粒子结构内而无任何暴露区域(Kuhn RJ，Zhang W，Rossmann MG，Pletnev SV，CorverJ，Lenches E，Jones CT，Mukhopadhyay S，Chipman PR，Strauss EG，Baker TS，Strauss JH.2002.Structure of dengue virus：implications for flavivirus organization，maturation，andfusion.Cell.Mar 8；108(5)：717-25)。
Jones等人(Christopher T.Jones，Lixin Ma，John W.Burgner，Teresa D.Groesch，Carol B.Post和Richard J.Kuhn.2003.Flavivirus Capsid Is a Dimeric Alpha-Helical Protein.Journalof Virology，第7143-7149页，第77卷，No.12)纯化了在大肠杆菌(Escherichia coli)中通过重组方法获得的VD2的衣壳蛋白，并且证实这种蛋白质在不存在核酸的情况下在溶液中的表现如同二聚体。它的二级结构主要是α-螺旋的形式，并且由这些螺旋中的4个组成，在C-末端发现长度更长的螺旋。N-末端不呈现确定的结构，并且它的删除不影响该蛋白质的结构完整性。
本发明首次描述了，通过重组方法在大肠杆菌中获得且仅具有40％纯度的DEN-2病毒的衣壳能够在小鼠中诱导针对用致死DEN-2病毒的攻击的保护性免疫应答。证实了这种高度纯化的蛋白质保留了其保护能力，所述保护能力在用颗粒形式的分子免疫接种小鼠中被超过。此外，证实了所达到的保护由CD8+T-细胞介导，考虑到目前为止报道的关于衣壳的T-细胞表位由CD4+T细胞识别，这是新型元素(Gagnon SJ，Zeng W，Kurane I，Ennis FA.1996.Identificationof two epitopes on the dengue 4 virus capsid protein recognizedby a serotype-specific and a panel of serotype-cross-reactivehuman CD4+cytotoxic T-lymphocyte clones.J Virol.70(1)：141-7；Simmons CP，Dong T，Chau NV，Dung NT，Chau TN，Thao leTT，Dung NT，Hien TT，Rowland-Jones S，Farrar J.2005.EarlyT-cell responses to dengue virus epitopes in Vietnamese adultswith secondary dengue virus infections.J Virol.79(9)：5665-75)。此外，将这种重组分子与PD5蛋白相混合，所述PD5蛋白由脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的P64k蛋白和登革-2病毒的包膜蛋白的III结构域形成。这种融合蛋白能够产生高度血清型特异性的、保护性的和中和性的免疫应答，具有产生抗体依赖性增强现象的低可能性(Hermida L，Rodriguez R，Lazo L，Silva R，Zulueta A，Chinea G，Lopez C，Guzman MG，Guillen G.2004.Adengue-2 Envelope fragment inserted within the structure of theP64k meningococcal protein carrier enables a functional immuneresponse against the virus in mice.J Virol Methods.2004 Jan；115(1)：41-9)。
还描述了获得通过使衣壳蛋白与包膜蛋白的III结构域融合而形成的遗传构建体以达到相同目的。因此，其中衣壳与DEN-2的III结构域相组合的这2种制剂在小鼠中产生比单独的衣壳更高的淋巴组织增生性应答，并且另外，产生比单独的PD5更高的血清型特异性抗体应答。后面这个结果证实登革病毒的衣壳蛋白在通过异源抗原的抗体产生中的免疫增强能力，这是对于来自其他病毒如乙型肝炎病毒的其他重组衣壳所描述的现象(Alvarez JC，Guillén G.Formulationscontaining virus like particles as immunoenhancers by mucosalroute.Cuban office of the Industrial property.CU 1998/183)。
发明详述
本发明的目的是获得相应于登革病毒的衣壳蛋白的重组蛋白质，所述重组蛋白质当在小鼠中接种时产生针对用致死病毒感染的保护性应答。
将编码登革病毒的衣壳蛋白的基因插入包含噬菌体T5启动子的质粒中。用该重组质粒转化的细胞XL-1Blue表达高水平的所得到的蛋白质。
将这种蛋白质大约纯化至40％的纯度，并且在氢氧化铝中佐剂化(adjuvated)以在Balb/c小鼠中进行接种。最后1次剂量后1个月，测量抗病毒抗体应答。同时测定在体外用登革病毒刺激的脾中的淋巴组织增生性应答。结果，没有诱导抗病毒抗体，而是检测到显著的淋巴组织增生性应答。平行地，在未出血的小鼠中，进行保护测定法。接种相应于100LD50的登革病毒的致死剂量，并在21天期间观察疾病症状和死亡。结果，在经免疫的小鼠中获得44.4％的存活，而在阴性对照组中所有小鼠都死亡。这是通过仅用衣壳蛋白的免疫接种而产生针对登革病毒的保护性应答的第一个证据。
随后，进行高分辨率的纯化过程，获得纯度＞95％的重组蛋白质。
2种制剂即半纯化的和纯化的制剂通过HPLC进行分析，以了解每种样品中的蛋白质聚集状态。在半纯化的制剂中检测到具有更少保留时间的级分，而在纯化的样品中检测到相应于二聚体形式的分子的保留时间。
为了在纯化的变体中获得聚集状态，进行使用少量寡核苷酸的体外颗粒化过程。由于该过程，获得了直径21nm的颗粒。
均具有超过95％纯度的二聚化和颗粒化的制剂在小鼠中进行接种。二聚化制剂用弗氏佐剂和氢氧化铝进行佐剂化，而颗粒化的变体仅用氢氧化铝进行佐剂化。
类似于半纯化的制剂，检测到高水平的淋巴组织增生。在保护测定法中，用由弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂化的二聚化制剂分别获得40和20％的存活；然而，用氢氧化铝佐剂化的颗粒化蛋白质诱导更高的保护百分比。
这些结果连同用半纯化的蛋白质获得的那些结果一起显示了衣壳蛋白在Balb/c小鼠中诱导保护性应答的能力，并且证实了颗粒化形式的蛋白质的优越性，使得其可连同作为佐剂的氢氧化铝一起在未来用于人类。此外，未诱导抗病毒应答将消除抗体依赖性增强现象，其作为关于出现疾病的最严重形式(登革出血热)的危险因素。
为了确定保护的可能机制(由于其证实不存在，所以所述机制与抗体的诱导无关)，进行CD8+细胞耗竭的研究。结果，用每种变体的纯化蛋白质而达到的保护依赖于呈现这种标记物的细胞的存在，因为当消除它们时，诱导的保护效应消失。
类似地，进行研究以了解颗粒化的重组衣壳与诱导体液应答的抗原的组合是否不影响淋巴组织增生性应答的产生，并且计数能够促成免疫应答的这2种分支的免疫原混合物。为此，在小鼠中接种衣壳的纯化的颗粒化变体和包含登革-2病毒的包膜蛋白的III结构域的融合蛋白，所述小鼠能够产生减少ADE现象的血清型特异性的免疫应答(Hermida L，Rodriguez R，Lazo L，Silva R，Zulueta A，ChineaG，Lopez C，Guzman MG，Guillen G.2004.A dengue-2 Envelopefragment inserted within the structure of the P64kmeningococcal protein carrier enables a functional immuneresponse against the virus in mice.J Virol Methods.2004 Jan；115(1)：41-9)。当施用3次剂量并分析产生的抗体时，证实了抗病毒的血清型特异性抗体的更高诱导。同样地，检测到比仅由衣壳诱导的那种更高且比由该融合蛋白诱导的那种显著更高的淋巴组织增生性应答。
平行地，为了了解使用这2种抗原的基因融合物是否能够获得组合效应，构建了包含DEN-2病毒的包膜蛋白的III结构域(其与衣壳蛋白基因的N-末端融合)的质粒。所得到的具有40％纯度的蛋白质在Balb/c小鼠中产生比由单独的衣壳诱导的那种更高的淋巴组织增生性应答，和产生比由PD5诱导的那种更高的血清型特异性抗体应答。
附图描述
图1.DEN-2病毒的衣壳蛋白的克隆策略以产生PDC-2。
DEN2C：DEN-2的衣壳蛋白的片段。
图2.在15％的PDC-2半纯化过程时通过SDS-PAGE的分析。
1.破裂上清液。2和3.不吸附至Q Sepharose FF的级分。4.用NaCl 1M洗脱的级分。
图3.在15％的PDC-2半纯化过程时通过SDS-PAGE的分析。
1.破裂上清液。2.不吸附至凝胶的级分。3.洗涤的(350mMNaCl)。4.洗脱的级分(750mM NaCl)。5.在Tris 10mM，EDTA 1mM中的级分。
图4.半纯化的(A)和纯的(B)PDC-2制剂在Superdex 200中的色谱图。
图5.在用寡核苷酸处理前(A)和后(B)，纯的PDC-2制剂的电子显微镜照片。
图6.DEN-1病毒的衣壳蛋白的克隆策略以产生PDC-1。
DEN1 C：DEN-1的衣壳蛋白的片段。
图7.在15％的PDC-1半纯化过程时通过SDS-PAGE的分析。
1.分子量标准。2.破裂上清液。3.不吸附至Q Sepharose FF的级分。
实施例
实施例1.PDC-2的克隆和表达。
使用在序列表中被标识为序列号1和序列号2的寡核苷酸从DEN-2病毒株基因型Jamaica中扩增编码来自DEN-2病毒的衣壳蛋白的氨基酸1-99的核苷酸序列(序列号3)(Deubel V.，Kinney R.M.，Trent D.W.Nucleotide sequence and deduced amino acid sequenceof the nonstructural proteins of Dengue tpe 2 virus，Jamaicagenotype：Comparative analysis of the full-length genome.Virology 1988.165：234-244)。
通过用BamHI/HindIII消化质粒pQE-30(序列号6)来制备载体，所述质粒pQE-30包含噬菌体T5启动子和在N-末端区域中的6-组氨酸尾。连接后，通过限制酶消化来分析潜在的重组体，并且对阳性克隆进行测序以检查连接状况。
用称为pDC-2的所选克隆(图1和序列号4)转化感受态细胞XL-1Blue(Hanahan D.1983.Studies on transformation of Escherichiacoli with plasmids.J.Mol.Biol.166：557-580)。转化的大肠杆菌菌株在补充有50μg/mL氨苄青霉素的Luria Bertani培养基(LB)中于37℃培养10小时。终浓度为1mM的异丙基-B-D-吡喃硫代半乳糖苷(IPTG)用于诱导启动子。菌落生长后，进行细胞裂解物的SDS-PAGE。结果获得15-kDA条带。蛋白质通过抗DEN-2超免疫腹水(HMAF)进行识别。将这种蛋白质命名为PDC-2(序列号5)。
实施例2.PDC-2的半纯化和表征。
将从用pDC-2转化并于37℃生长的大肠杆菌菌株中获得的生物量通过弗氏压碎器进行破坏。获得重组蛋白质，在可溶性和不溶性级分之间相等地分布。使用Q Sepharose FF柱和缓冲液Tris 10mM pH 8，对可溶性级分实施阴离子交换色谱法。存在于非吸附级分中的蛋白质以40％的纯度被获得，并用于免疫学研究(图2)。
实施例3.半纯化的PDC-2的免疫学评估。
使用3组30只Balb/c小鼠。其中的2组用10ug重组蛋白质通过腹膜内途径进行免疫，在一个组中使用弗氏佐剂(FA)和在另一个组中使用氢氧化铝。将用FA佐剂化的由于经pQE-30转化的细胞破裂而获得的可溶性级分用作阴性对照；10只动物在第3次剂量后15天进行抽血，并且通过ELISA测定针对DEN-2的抗体滴度。在用任一种佐剂中配制的重组蛋白质进行免疫接种后，没有获得抗体滴度。
表1.在用半纯化的PDC-2免疫接种小鼠后获得的血清中针对DEN-2的抗体滴度。
Figure A20068004228000161
实施例4.保护测定法。
为了评估通过用所述变体免疫接种而赋予给小鼠的针对用致死的同源DEN病毒攻击的保护，使用来自用吸附在氢氧化铝中的重组蛋白质和用对照制剂免疫的每个组的10只小鼠。每只动物通过颅内接种接受100LD50的致死DEN-2病毒的剂量，并且观察21天以获得关于由于病毒性脑炎死亡的致死率百分比。作为阳性对照，使用由感染性DEN-2病毒(104pfu)免疫的一组10只小鼠。阳性对照组中的所有小鼠都存活，而阴性对照组中的所有小鼠都在攻击后第7-11天时生病，并且到第21天时获得100％的死亡率。最后，用重组蛋白质PDC-2免疫的组呈现出44.4％的保护(表2)。
表2.用同源的致死登革病毒攻击后在经PDC-2免疫的小鼠中的存活百分比。
  免疫原   存活百分比*
  XL-1blue   0
  DEN-2   100
  PDC-2氢氧化铝   44.4
*计算为：(存活者数目)/(小鼠总数目)。存活者的数据在攻击后21天获取。
实施例5.淋巴组织增生性应答。
在最后1次剂量后30天处死来自用由氢氧化铝佐剂化的衣壳蛋白进行免疫的组的其余动物。随后，取出它们的脾并且研究针对DEN-2的淋巴组织增生性应答。表3中的结果显示了获得的刺激指数。
表3.来自经免疫小鼠的淋巴细胞的针对同源血清型的刺激指数。
  PDC-2氢氧化铝
 DEN-2**   8*
 对照抗原***   1.5
 PHA****   7
*刺激指数：关于DNA自发合成，样品的每分钟计数与对照的每分钟计数的商平均值。
**从受DEN-2感染的小鼠脑中制备。
***从未受感染的小鼠脑中制备。
****促分裂原，植物凝集素(阳性对照)。
实施例6.PDC-2的纯化。
将从用pDC-2转化并于37℃生长的大肠杆菌菌株中获得的生物量通过弗氏压碎器进行破坏。获得重组蛋白质，在可溶性和不溶性级分之间相等地分布。使用SP-Sepharose FF柱和缓冲液Tris 10mM，Tween0.5％，尿素7M，pH 8，对可溶性级分实施阳离子交换色谱法。柱用缓冲液二乙醇胺30mM，NaCl 350mM，pH 10.3进行洗涤。用缓冲液二乙醇胺30mM，NaCl 750mM，pH 10.3来洗脱目的蛋白。洗脱了蛋白质后，使用G-25柱交换缓冲液。最后，在缓冲液Tris 10mM，EDTA 1mM中获得具有96％纯度的蛋白质(图3)。
实施例7.半纯化的和纯化的变体的表征。
为了表征半纯化的和纯化的制剂的聚集状态，使用TSK-5000柱(Tosoh bioscience，Japan)进行凝胶过滤色谱法。在施加半纯化的样品后，获得均匀和主要的峰，保留时间为15-20分钟，表明存在高分子量种类(图4A)。相反地，在来自衣壳蛋白的高度纯化级分的样品中，检测到30分钟的保留时间，相应于二聚体形式的分子(图4B)。
实施例8.“体外”再颗粒化的研究。
为了使二聚体形式的纯衣壳蛋白再颗粒化，将缓冲液交换成Hepes 25mM，KAc 100mM，MgAc2 1.7mM，pH 7.4。在使蛋白质以及寡核苷酸混合物一起于37℃加热1分钟后，使它们以等体积于30℃温育30分钟。作为实验的阴性对照，在没有寡核苷酸的情况下温育蛋白质。当用电子显微镜观察这2种制剂时，在先前与寡核苷酸混合物一起温育的蛋白质样品中观察到大量直径约21nm的颗粒，而在对照样品中没有观察到颗粒(图5)。
实施例9.纯化的衣壳在小鼠中的免疫学评估。
使用5组20只Balb/c小鼠。其中的2组用10ug二聚体的纯化的重组蛋白质通过腹膜内途径进行免疫，使用氢氧化铝和弗氏佐剂。另一组用由氢氧化铝佐剂化的10ug纯化且颗粒化的衣壳蛋白进行免疫。将来自用质粒pQE-30转化的XL-1blue细胞破裂的可溶性级分(经历与PDC-2相同的纯化步骤)用作阴性对照，其中用弗氏佐剂进行佐剂化。第5组用作为阳性对照的DEN-2病毒进行免疫。最后1次剂量后1个月，来自每个组的10只动物通过颅内接种接受100LD50的致死DEN-2的剂量，并且观察21天以获得存活百分比。阳性对照组中的所有小鼠都存活，而阴性对照组中的所有小鼠都在攻击后第7-11天时生病，并且获得0％的死亡率。最后，对于用重组蛋白质免疫的组，用纯的二聚体PDC-2免疫的组在与氢氧化铝一起免疫时呈现出20％的保护，和在使用弗氏佐剂时呈现出40％的保护。此外，在接受用氢氧化铝佐剂化的再颗粒化的纯蛋白质的组中，90％的小鼠得到保护(表4)。
表4.用同源的致死登革病毒攻击后测定的在用蛋白质变体免疫的小鼠中的存活百分比。
  免疫原(佐剂)   存活百分比*
  X1-1 Blue(弗氏)   0
  纯的且二聚的PDC-2(氢氧化铝)   20
  纯的且二聚的PDC-2(弗氏)   40
  纯的且再颗粒化的PDC-2(氢氧化铝)   90
  DEN-2   100
*计算为：(存活者数目)/(小鼠总数目)。存活者的数据在攻击后21天获取。
实施例10.淋巴组织增生性应答。
在最后1次剂量后15天处死来自用由氢氧化铝佐剂化的、二聚或再颗粒化的衣壳蛋白进行免疫的组的其余动物(10只动物)。随后，取出它们的脾并且研究针对DEN-2的淋巴组织增生性应答。表5中的结果显示了获得的刺激指数。
表5.来自经免疫小鼠的淋巴细胞的针对同源血清型的刺激指数。
  纯的且再颗粒化的PDC-2   纯的PDC-2
 DEN-2**   10*   4
 对照抗原***   1.5   1.2
 PHA****   7   8
*刺激指数：关于DNA自发合成，样品的每分钟计数与对照的每分钟计数的商平均值。
**从受DEN-2感染的小鼠脑中制备。
***从未受感染的小鼠脑中制备。
****促分裂原，植物凝集素(阳性对照)。
实施例11.由PD5和PDC-2形成的混合物的免疫学评估。
20只动物用10ug颗粒化的纯衣壳蛋白和20ug蛋白质PD5(序列号23)的混合物以间隔15天的3次剂量进行接种。用10ug纯的衣壳蛋白进行免疫的组，用与等体积的PDC-2混合的20ug蛋白质PD5进行免疫但从阴性对照运行获得的组，和用蛋白质P65k(在PD5构建中存在的载体蛋白)进行免疫的组用作对照。在所有情况下，氢氧化铝用作佐剂。
最后1次剂量后15天，动物进行抽血，并且通过ELISA就抗病毒抗体测试血清。如表6和7中所示，用混合物免疫的组发展出血清型特异性抗体，其滴度高于仅用蛋白质PD5免疫的组些，并且同时在这2个组中的滴度高于用蛋白质PDC-2免疫的组，在所述用蛋白质PDC-2免疫的组中没有检测到针对DEN-2病毒的抗体。另一方面，从每个组中取另外10只动物用于淋巴组织增生测定法。从这些动物的脾中提取细胞，并且用感染性DEN-2病毒进行刺激。如表8中所示，在用混合物免疫的组中，刺激指数高于仅用衣壳蛋白免疫的组。在用蛋白质PD5免疫的组中获得最低的刺激指数。
表6.在免疫接种后获得的血清中针对DEN-2病毒的抗体滴度。
Figure A20068004228000211
表7.在从每个组获得的血清混合物中所包含的抗体的血清型特异性的测定。
Figure A20068004228000212
表8.来自经免疫小鼠的淋巴细胞的针对同源血清型的刺激指数。
 PDC-2   PDC-2/PD5   PD5   P64k
  DEN-2**  9*   11   2.1   1.1
  对照(-)抗原***  1.3   1.6   1.5   1.2
  PHA****  7.5   7.3   7.9   8
*刺激指数：关于DNA自发合成，样品的每分钟计数与对照的每分钟计数的商平均值。
**从受DEN-2感染的小鼠脑中制备。
***从未受感染的小鼠脑中制备。
****促分裂原，植物凝集素(阳性对照)。
实施例12.CD8耗竭研究。
将再颗粒化的和二聚的衣壳蛋白接种入Balb/c小鼠中以获得诱导了细胞免疫应答的某些证据。将从由用于产生pDC-2的质粒转化的细胞获得的制剂用作阴性对照，通过类似于对于蛋白质PDC-2所使用的那种的纯化方法获得。
给20只动物的组施用3次剂量的蛋白质(20ug)，使用氢氧化铝作为佐剂。最后1次剂量后1个月，给每组的一半动物施用1mg大鼠抗小鼠CD8mAb，所述大鼠抗小鼠CD8mAb能够耗竭小鼠免疫系统的包含这种标记的细胞。在第二天时，所有动物用100LD50(半数致死剂量)的DEN-2病毒进行攻击。就疾病征兆的出现来观察它们，并且记录死亡。
在经免疫的未处理组的情况下，在用二聚的和再颗粒化的衣壳免疫的组中分别获得20％和80％的保护。平行地，在处理组中，保护百分比低于未处理组：对于二聚PDC-2为0％的保护，和对于再颗粒化的蛋白质为10％的保护。在阴性对照组的情况下，在处理和未处理的动物中都没有获得保护。
表9.用重组衣壳的变体进行免疫的动物中用致死DEN-2病毒的攻击测定法
  组   *在用抗CD8mAb处理的小鼠中的存活百分比   在未用抗CD8mAb处理的小鼠中的存活百分比
  PCD12再颗粒化的   10   80
  PCD12未颗粒化的   0   20
  对照(-)   0   0
*计算为：(存活者数目)/(小鼠总数目)。存活者的数据在攻击后21天获取。
实施例13：DEN-1蛋白质的获得和半纯化。
使用在序列表中被标识为序列号8和序列号10的寡核苷酸从DEN-1病毒株中扩增编码DEN-1病毒的衣壳蛋白的氨基酸1-100的核苷酸序列(序列号7)。通过质粒pQE-30(序列号6)的BamHI/HindIII消化来制备载体，所述质粒pQE-30包含噬菌体T5启动子和在N-末端区域中的6组氨酸尾。连接后，通过限制性消化来分析重组体，并且对阳性克隆进行测序以检查连接状况。用称为pDC-1的所选克隆(图6和序列号10)转化感受态细胞XL-1 Blue(Hanahan D.1983.Studieson transformation of Escherichia coli with plasmids.J.Mol.Biol.166：557-580)。转化的大肠杆菌菌株在补充有50μg/mL氨苄青霉素的LB中于37℃培养10小时。终浓度为1mM的异丙基-B-D-吡喃硫代半乳糖苷(IPTG)用于诱导启动子。菌落生长后，进行细胞裂解物的SDS-PAGE。结果获得15-kDA条带。蛋白质通过抗DEN-1HMAF进行识别。将这种蛋白质命名为PDC-1(序列号11)。
实施例14.PDC-1的半纯化和表征。
将从用pDC-1转化并于37℃生长的大肠杆菌菌株中获得的生物量通过弗氏压碎器进行破坏。获得重组蛋白质，在可溶性和不溶性级分之间相等地分布。使用Q Sepharose FF柱和缓冲液Tris 10mM pH 8，对可溶性级分实施阴离子交换色谱法。存在于非吸附级分中的蛋白质以45％的纯度被获得，并用于免疫学研究。
实施例15.半纯化的PDC-1的免疫学评估。
使用2组30只Balb/c小鼠。其中之一用10ug重组蛋白质通过腹膜内途径进行免疫，使用氢氧化铝作为佐剂。将用氢氧化铝佐剂化的由于经pQE-30转化的细胞破裂而获得的可溶性级分用作阴性对照。部分动物(10只小鼠)在第3次剂量后15天进行抽血，并且通过ELISA测定针对DEN-1的抗体滴度。在用重组蛋白质免疫接种后，没有获得抗病毒抗体滴度。
表10.在用半纯化的PDC-1免疫接种后获得的血清中针对DEN-1的抗体滴度。
Figure A20068004228000241
实施例16.保护测定法。
为了评估通过用所述变体免疫接种而赋予给小鼠的针对用致死的同源DEN病毒攻击的保护，使用来自用吸附在氢氧化铝中的重组蛋白质和用对照制剂免疫的每个组的10只小鼠。每只动物通过颅内接种接受100LD50的致死DEN-1的剂量，并且观察21天以获得关于由于病毒性脑炎死亡的致死率百分比。作为阳性对照，使用由感染性DEN-1病毒(104pfu)免疫的一组10只小鼠。阳性对照组中的所有小鼠都存活，而阴性对照组中的所有小鼠都在攻击后第7-11天时生病，并且到第21天时获得100％的死亡率。最后，用重组蛋白质PDC-1免疫的组呈现出50％的保护(表11)。
表11.用同源的致死DEN病毒攻击后测定的在用蛋白质变体免疫的小鼠中的存活百分比。
  免疫原   存活百分比*
  XL-1 blue(对照-)   0
  DEN-1(对照+)   100
  PDC-1   50
*计算为：(存活者数目)/(小鼠总数目)。存活者的数据在攻击后21天获取。
实施例17.淋巴组织增生性应答
在最后1次剂量后15天处死用蛋白质PDC-1进行免疫的组的其余动物。随后，取出它们的脾并且研究针对DEN-1的淋巴组织增生性应答。表12中的结果显示了获得的刺激指数。
表12.来自经免疫小鼠的淋巴细胞的针对同源血清型的刺激指数。
  PDC-1氢氧化铝
 DEN1**   8*
 对照抗原***   1.5
 PHA****   7
*刺激指数：关于DNA自发合成，样品的每分钟计数与对照的每分钟计数的商平均值。
**从受DEN-2感染的小鼠脑中制备。
***从未受感染的小鼠脑中制备。
****促分裂原，植物凝集素(阳性对照)。
实施例18.PDC-2DomIII的克隆和表达。
使用在序列表中被标识为序列号13和序列号14的寡核苷酸从DEN-2病毒株基因型Jamaica中扩增编码来自DEN-2的包膜蛋白的氨基酸286-426(相应于该蛋白质的结构域III的区域)的核苷酸序列(序列号12)(Deubel V.，Kinney R.M.，Trent D.W.Nucleotidesequence and deduced amino acid sequence of the nonstructuralproteins of Dengue type 2 virus，Jamaica genotype：Comparativeanalysis of the full-length genome.Virology 1988.165：234-244)。
通过用BamHI/BamHI消化质粒pDC-2来制备载体，所述质粒pDC-2包含噬菌体T5启动子、在N-末端区域中的6-组氨酸尾和相应于DEN-2病毒的衣壳蛋白的100个氨基酸的区域。连接后，通过限制酶消化来分析潜在的重组体，并且对阳性克隆进行测序以检查连接状况。最后将所选克隆命名为pDC-2 Dom III(序列号15)。
用称为pDC-2DomIII的所选克隆转化感受态细胞XL-1 Blue(Hanahan D.1983.Studies on transformation of Escherichiacoli with plasmids.J.Mol.Biol.166：557-580)。转化的大肠杆菌菌株在补充有50μg/mL氨苄青霉素的LB中于37℃培养10小时。终浓度为1mM的异丙基-B-D-吡喃硫代半乳糖苷(IPTG)用于诱导启动子。菌落生长后，进行细胞裂解物的SDS-PAGE。结果获得30-kDA条带。蛋白质通过抗DEN-2HMAF进行识别。将这种蛋白质命名为PDC-2Dom III(序列号16)。
实施例19.PDC-2DOM III的半纯化和表征。
将从用pDC-2DomIII转化并于37℃生长的大肠杆菌菌株中获得的生物量通过弗氏压碎器进行破坏。获得重组蛋白质，在可溶性和不溶性级分之间相等地分布。使用Q Sepharose FF柱和缓冲液Tris 10mMpH 8，对可溶性级分实施阴离子交换色谱法。存在于非吸附级分中的蛋白质以40％的纯度被获得，并用于免疫学研究(图2)。
实施例20.半纯化的PDC-2Dom III在小鼠中的免疫学评估。
使用5组30Balb/c小鼠。其中一个组用10ug重组蛋白质通过腹膜内途径进行免疫，使用氢氧化铝作为佐剂。将用氢氧化铝佐剂化的由于用质粒pQE-30转化的XL-1Blue细胞破裂而获得的可溶性级分用作阴性对照。包括另2组作为对照。其中之一用蛋白质PDC-2进行免疫，和另一组用蛋白质PD5(这种蛋白质包含DEN-2病毒的包膜蛋白的结构域III区域)进行免疫。第3次剂量后15天，对来自每个组的10只动物进行抽血，并且通过ELISA测定针对DEN-2的抗体滴度。如表13和14中所示，用PDC-2Dom III免疫的组发展出高滴度的针对DEN-2的血清型特异性抗体，高于由蛋白质PD5诱导的抗体滴度。这些结果证实，与衣壳蛋白的遗传组合增强了由包膜蛋白的结构域III引发的抗病毒免疫应答。
表13.在用Dom III-衣壳蛋白免疫接种后获得的血清中针对DEN-2病毒的抗体滴度。
Figure A20068004228000281
表14.在从每个组获得的血清混合物中所包含的抗体的血清型特异性的测定。
另一方面，从每个组中获取另外10只动物用于淋巴组织增生测定法。从这些动物的脾中提取细胞，并且用感染性DEN-2病毒进行刺激。表15显示了，在用组合进行免疫的组中，刺激指数高于仅用衣壳蛋白免疫的组。在用蛋白质PD5免疫的组中的刺激指数是最低的。
表15.来自经免疫小鼠的淋巴细胞的针对同源血清型的刺激指数。
  PDC-2   PDC-2Dom III   PD5   P64k
  DEN-2**   9.5*   11.6   2.2   1.2
  对照(-)抗原***   1.2   1.1   1.2   1.6
  PHA****   7.6   7.4   7.5   7.9
*刺激指数：关于DNA自发合成，样品的每分钟计数与对照的每分钟计数的商平均值。
**从受DEN-2感染的小鼠脑中制备。
***从未受感染的小鼠脑中制备。
****促分裂原，植物凝集素(阳性对照)。
序列表
<110>Center for Genetic Engineering and Biotecnology
<120>诱导保护性应答的登革病毒衣壳蛋白以及药物组合物
<130>Dengue
<160>24
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>登革病毒
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(24)
<223>用于扩增登革2病毒的衣壳蛋白的寡核苷酸BamH-I的序列
<400>1
cgggatccaa taaccaacga aaaa    24
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>登革病毒
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(23)
<223>用于扩增DEN-2病毒的衣壳蛋白的寡核苷酸Hind-III的序列
<400>2
acaagctttt acctgcgtct cct    23
<210>3
<211>339
<212>DNA
<213>登革病毒
<220>
<221>基因
<222>(1)..(339)
<223>编码登革2病毒的衣壳蛋白的氨基酸1-113的核苷酸序列
<400>3
aataaccaac gaaaaaaggc gagaagtacg cctttcaata tgctgaaacg cgagagaaac     60
cgcgtgtcaa ctgtgcaaca gctgacaaag agattctcac ttggaatgct gcaaggacga    120
ggaccattaa aactgttcat ggcccttgtg gcgttccttc gtttcctaac aatcccacca    180
acagcaggga tactgaaaag atggggaacg atcaaaaaat caaaagctat caatgttttg    240
agagggttca ggaaagagat tggaaggatg ctgaacatct tgaacaggag acgcaggaca    300
gcaggcgtga ttattatgtt gattccaaca gcgatggcg                           339
<210>4
<211>339
<212>DNA
<213>登革病毒
<220>
<221>基因
<222>(1)..(339)
<223>在质粒pQE-30中的编码嵌合蛋白质PDC-2的核苷酸序列
<400>4
atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatccaata accaacgaaa aaaggcgaga    60
agtacgcctt tcaatatgct gaaacgcgag agaaaccgcg tgtcaactgt gcaacagctg   120
acaaagagat tctcacttgg aatgctgcaa ggacgaggac cattaaaact gttcatggcc   180
cttgtggcgt tccttcgttt cctaacaatc ccaccaacag cagggatact gaaaagatgg   240
ggaacgatca aaaaatcaaa agctatcaat gttttgagag ggttcaggaa agagattgga   300
aggatgctga acatcttgaa caggagacgc taaaagctt                          339
<210>5
<211>111
<212>PRT
<213>登革病毒
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(111)
<223>相应于蛋白质PDC-2的氨基酸序列
<400>5
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asn Asn Gln Arg
1               5                   10                  15
Lys  Lys Ala Arg Ser Thr Pro Phe Asn Met Leu Lys Arg Glu Arg Asn
             20                  25                  30
Arg Val Ser Thr Val Gln Gln Leu Thr Lys Arg Phe Ser Leu Gly Met
        35                  40                  45
Leu Gln Gly Arg Gly Pro Leu Lys Leu Phe Met Ala Leu Val Ala Phe
    50                  55                  60
Leu Arg Phe Leu Thr Ile Pro Pro Thr Ala Gly Ile Leu Lys Arg Trp
65                  70                  75                  80
Gly Thr Ile Lys Lys Ser Lys Ala Ile Asn Val Leu Arg Gly Phe Arg
                85                  90                  95
Lys Glu Ile Gly Arg Met Leu Asn Ile Leu Asn Arg Arg Arg Arg
            100                 105                 110
<210>6
<211>3461
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒pQE-30
<220>
<221>misc_feature
<223>质粒pQE-30的核苷酸序列。以斜体形式，将限制位点BamHI/Hind III加下划线。
<400>6
ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca     60
attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aactatgaga    120
ggatcgcatc accatcacca tcacggatcc gcatgcgagc tcggtacccc gggtcgacct    180
gcagccaagc ttaattagct gagcttggac tcctgttgat agatccagta atgacctcag    240
aactccatct ggatttgttc agaacgctcg gttgccgccg ggcgtttttt attggtgaga    300
atccaagcta gcttggcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc    360
actggatata ccaccgttga tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt    420
cagtcagttg ctcaatgtac ctataaccag accgttcagc tggatattac ggccttttta    480
aagaccgtaa agaaaaataa gcacaagttt tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc    540
ctgatgaatg ctcatccgga atttcgtatg gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg    600
gatagtgttc acccttgtta caccgttttc catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc    660
tggagtgaat accacgacga tttccggcag tttctacaca tatattcgca agatgtggcg    720
tgttacggtg aaaacctggc ctatttccct aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc     780
tcagccaatc cctgggtgag tttcaccagt tttgatttaa acgtggccaa tatggacaac     840
ttcttcgccc cgttttcacc atgggcaaat attatacgca aggcgacaag gtgctgatgc     900
cgctggcgat tcaggttcat catgccgtct gtgatggctt ccatgtcggc agaatgctta     960
atgaattaca acagtactgc gatgagtggc agggcggggc gtaatttttt taaggcagtt    1020
attggtgccc ttaaacgcct ggggtaatga ctctctagct tgaggcatca aataaaacga    1080
aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc    1140
ctgagtagga caaatccgcc gctctagagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa    1200
aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg    1260
agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg    1320
acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga    1380
ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat    1440
accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtctgtcggc    1500
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg    1560
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg    1620
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac    1680
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg    1740
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct    1800
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg    1860
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct    1920
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac    1980
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt    2040
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc    2100
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca    2160
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat    2220
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac    2280
gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt    2340
aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc    2400
aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagctg    2460
cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg  2520
ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc  2580
cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta  2640
ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg  2700
ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct  2760
ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta  2820
gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg  2880
ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga  2940
ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt  3000
gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca  3060
ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt  3120
cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt  3180
ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga  3240
aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt  3300
gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc  3360
gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa  3420
cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca c                      3461
<210>7
<211>300
<212>DNA
<213>登革病毒
<220>
<221>基因
<222>(1)..(300)
<223>编码登革1病毒的衣壳蛋白的氨基酸1-100的核苷酸序列
<400>7
atgaacaacc aacggaaaaa gacggctcga ccgtctttca atatgctgaa acgcgcgaga     60
aaccgcgtgt caactgtttc acagttggcg aagagattct caaaaggatt gctctcaggc    120
caaggaccca tgaaattggt gatggccttc atagcattcc taagatttct agccataccc    180
ccaacagcag gaattttggc tagatggggc tcattcaaga agaatggagc gatcaaagtg    240
ctacggggtt tcaagaaaga aatctcaaac atgttgaata taatgaatag aaggaaaaga    300
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>登革病毒
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(26)
<223>用于扩增DEN-1病毒的衣壳蛋白的寡核苷酸BamH-I的序列
<400>8
ggatccatga acaaccaacg gaaaaa    26
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>登革病毒
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(24)
<223>用于扩增DEN-1病毒的衣壳蛋白的寡核苷酸Hind-III的序列
<400>9
aagctttctt ttccttctat tcat      24
<210>10
<211>345
<212>DNA
<213>登革病毒
<220>
<221>基因
<222>(1)..(345)
<223>在质粒pQE-30中的编码嵌合蛋白质PDC-1的核苷酸序列
<400>10
atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatccatga acaaccaacg gaaaaagacg    60
gctcgaccgt ctttcaatat gctgaaacgc gcgagaaacc gcgtgtcaac tgtttcacag   120
ttggcgaaga gattctcaaa aggattgctc tcaggccaag gacccatgaa attggtgatg   180
gccttcatag cattcctaag atttctagcc atacccccaa cagcaggaat tttggctaga   240
tggggctcat tcaagaagaa tggagcgatc aaagtgctac ggggtttcaa gaaagaaatc   300
tcaaacatgt tgaatataat gaatagaagg aaaagataaa agctt                   345
<210>11
<211>112
<212>PRT
<213>登革病毒
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(112)
<223>相应于蛋白质PDC-1的氨基酸序列
<400>11
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Met Asn Asn Gln
1               5                   10                  15
Arg Lys Lys Thr Ala Arg Pro Ser Phe Asn Met Leu Lys Arg Ala Arg
            20                  25                  30
Asn Arg Val Ser Thr Val Ser Gln Leu Ala Lys Arg Phe Ser Lys Gly
        35                  40                  45
Leu Leu Ser Gly Gln Gly Pro Met Lys Leu Val Met Ala Phe Ile Ala
    50                  55                  60
Phe Leu Arg Phe Leu Ala Ile Pro Pro Thr Ala Gly Ile Leu Ala Arg
65                  70                  75                  80
Trp Gly Ser Phe Lys Lys Asn Gly Ala Ile Lys Val Leu Arg Gly Phe
                85                  90                  95
Lys Lys Glu Ile Ser Asn Met Leu Asn Ile Met Asn Arg Arg Lys Arg
            100                 105                 110
<210>12
<211>426
<212>DNA
<213>登革病毒
<220>
<221>基因
<222>(1)..(426)
<223>编码DEN-2病毒的包膜蛋白的DomB的核苷酸序列
<400>12
aggctgagaa tggacaaact acagctcaaa ggaatgtcat actctatgtg tacaggaaag     60
tttaaaattg tgaaggaaat agcagaaaca caacatggaa caatagttat cagagtacaa    120
tatgaagggg acggctctcc atgtaagatc ccttttgaga taatggattt ggaaaaaaga    180
cacgtcttag gtcgcctgat tacagttaac ccgatcgtaa cagaaaaaga tagcccagtc    240
aacatagaag cagaacctcc attcggagac agctacatca tcataggagt agagccggga    300
caattgaaac tcaactggtt taagaaagga agttccatcg gccaaatgtt tgagacaaca    360
atgagaggag cgaagagaat ggccatttta ggtgacacag cctgggattt tggaagcctg    420
ggaggg                                                               426
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>登革病毒
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(21)
<223>寡核苷酸5′的序列，其用于扩增编码DEN-2病毒的包膜蛋白的氨基酸286-426的区域
<400>13
cttggatcca ttctgagaat g                 21
<210>14
<211>33
<212>DNA
<213>登革病毒
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(33)
<223>寡核苷酸3′的序列，其用于扩增编码DEN-2病毒的包膜蛋白的氨基酸286-426的区域
<400>14
tgtggatcct cctcctaggc ttccaaaatc cca    33
<210>15
<211>753
<212>DNA
<213>登革病毒
<220>
<221>基因
<222>(1)..(753)
<223>编码嵌合蛋白质pDC-2DomIII的核苷酸序列
<400>15
catcaccatc accatcacgg atccaggctg agaatggaca aactacagct caaaggaatg     60
tcatactcta tgtgtacagg aaagtttaaa attgtgaagg aaatagcaga aacacaacat    120
ggaacaatag ttatcagagt acaatatgaa ggggacggct ctccatgtaa gatccctttt    180
gagataatgg atttggaaaa aagacacgtc ttaggtcgcc tgattacagt taacccgatc    240
gtaacagaaa aagatagccc agtcaacata gaagcagaac ctccattcgg agacagctac    300
atcatcatag gagtagagcc gggacaattg aaactcaact ggtttaagaa aggaagttcc    360
atcggccaaa tgtttgagac aacaatgaga ggagcgaaga gaatggccat tttaggtgac    420
acagcctggg attttggatc cctgggagga ggatccaata accaacgaaa aaaggcgaga    480
agtacgcctt tcaatatgct gaaacgcgag agaaaccgcg tgtcaactgt gcaacagctg    540
acaaagagat tctcacttgg aatgctgcaa ggacgaggac cattaaaact gttcatggcc    600
cttgtggcgt tccttcgttt cctaacaatc ccaccaacag cagggatact gaaaagatgg    660
ggaacgatca aaaaatcaaa agctatcaat gttttgagag ggttcaggaa agagattgga    720
aggatgctga acatcttgaa caggagacgc  taa                                753
<210>16
<211>250
<212>PRT
<213>登革病毒
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(250)
<223>PDC-2DomIII的氨基酸序列
<400>16
His His His His His His Gly Ser Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln
1               5                   10                  15
Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile Val
            20                  25                  30
Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln
        35                  40                  45
Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp
    50                  55                  60
Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile
65                  70                  75                  80
Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe
                85                  90                  95
Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu
            100                 105                 110
Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr
        115                  120                  125
Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp
    130                  135                  140
Phe Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ser Asn Asn Gln Arg Lys Lys Ala Arg
145                 150                 155                 160
Ser Thr Pro Phe Asn Met Leu Lys Arg Glu Arg Asn Arg Val Ser Thr
                165                 170                 175
Val Gln Gln Leu Thr Lys Arg Phe Ser Leu Gly Met Leu Gln Gly Arg
            180                 185                 190
Gly Pro Leu Lys Leu Phe Met Ala Leu Val Ala Phe Leu Arg Phe Leu
        195                 200                 205
Thr Ile Pro Pro Thr Ala Gly Ile Leu Lys Arg Trp Gly Thr Ile Lys
    210                 215                 220
Lys Ser Lys Ala Ile Asn Val Leu Arg Gly Phe Arg Lys Glu Ile Gly
225                 230                 235                 240
Arg Met Leu Asn Ile Leu Asn Arg Arg Arg
                245                 250
<210>17
<211>142
<212>PRT
<213>登革病毒1型
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(142)
<223>相应于DEN-1病毒的包膜蛋白的DomB的氨基酸序列
<400>17
Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Val Ser Tyr Val Met
1               5                   10                  15
Cys Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His
            20                  25                  30
Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys
        35                  40                  45
Lys Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly
    50                  55                  60
Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Ile Asp Lys Glu Lys Pro Val
65                  70                  75                  80
Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly
                85                  90                  95
Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser
            100                 105                 110
Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala
        115                 120                 125
Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly
    130                 135                 140
<210>18
<211>142
<212>PRT
<213>登革病毒3型
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(142)
<223>相应于DEN-3病毒的包膜蛋白的DomB的氨基酸序列
<400>18
Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met
1               5                   10                  15
Cys Thr Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His
            20                  25                  30
Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Val Pro Cys
        35                  40                  45
Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn Gly
    50                  55                  60
Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val
65                  70                  75                  80
Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn Ile Val Ile Gly
                85                  90                  95
Ile Gly Asp Asn Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Lys Lys Gly Ser Ser
            100                 105                 110
Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala
        115                 120                 125
Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly
    130                 135                 140
<210>19
<211>142
<212>PRT
<213>登革病毒4型
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(142)
<223>相应于DEN-4病毒的包膜蛋白的DomB的氨基酸序列
<400>19
Lys Val Arg Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met
1               5                   10                  15
Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His
            20                  25                  30
Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys
        35                  40                  45
Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly
    50                  55                  60
Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn Ser Val Thr
65                  70                  75                  80
Asn Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly
                85                  90                  95
Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Ser Ser
            100                 105                 110
Ile Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala
        115                 120                 125
Ile Leu Gly Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly
    130                 135                 140
<210>20
<211>749
<212>PRT
<213>登革病毒1型
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(749)
<223>相应于蛋白质PLH3的氨基酸序列
<400>20
Met Gly His His His His His His Ala Met Val Asp Lys Arg Met Ala
1               5                   10                  15
Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp
            20                  25                  30
Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp
        35                  40                  45
Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Glu Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala
    50                  55                  60
Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu
65                  70                  75                  80
Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro
                85                  90                  95
Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala
            100                 105                 110
Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu
        115                  120                  125
Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala
    130                 135                 140
Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys
                165                 170                 175
Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala
            180                 185                 190
Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu
        195                 200                 205
Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala
    210                 215                 220
Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln
225                 230                 235                 240
Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala
                245                 250                 255
Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys
            260                 265                 270
Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile
        275                 280                 285
Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys
    290                 295                 300
Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu
305                 310                 315                 320
Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val
                325                 330                 335
Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys
            340                 345                 350
Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn
        355                 360                 365
Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr
    370                 375                 380
Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val
385                 390                 395                 400
Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu
                405                 410                 415
Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys
            420                 425                 430
Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val
        435                 440                 445
Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala
    450                 455                 460
Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile
465                 470                 475                 480
Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr
                485                 490                 495
Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe
            500                 505                 510
Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro
        515                 520                 525
Phe Thr Lys LeuIle Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly
    530                 535                 540
Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu
545                 550                 555                 560
Ala Ile Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His
                565                 570                 575
Pro His Pro Thr Leu Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala
            580                 585                 590
Leu Gly Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Arg
        595                 600                 605
Leu Lys Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Val Ser Tyr Val Met Cys
    610                 615                 620
Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly
625                 630                 635                 640
Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys
                645                 650                 655
Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg
            660                 665                 670
Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Ile Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn
        675                 680                 685
Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly Ala
    690                 695                 700
Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile
705                 710                 715                 720
Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile
                725                 730                 735
Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly
            740                 745
<210>21
<211>749
<212>PRT
<213>登革病毒3型
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(749)
<223>相应于蛋白质PAZ3的氨基酸序列
<400>21
Met Gly His His His His His His Ala Met Val Asp Lys Arg Met Ala
1               5                   10                  15
Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp
            20                  25                  30
Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp
        35                  40                  45
Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Glu Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala
    50                  55                  60
Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu
65                  70                  75                  80
Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro
                85                  90                  95
Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala
            100                 105                 110
Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu
        115                 120                 125
Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala
    130                 135                 140
Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys
                165                 170                 175
Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala
            180                 185                 190
Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu
        195                 200                 205
Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala
    210                 215                 220
Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln
225                 230                 235                 240
Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala
                245                 250                 255
Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys
            260                 265                 270
Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile
        275                 280                 285
Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys
    290                 295                 300
Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu
305                 310                 315                 320
Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val
                325                 330                 335
Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys
            340                 345                 350
Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn
        355                 360                 365
Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr
    370                 375                 380
Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val
385                 390                 395                 400
Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu
                405                 410                 415
Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys
            420                 425                 430
Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val
        435                 440                 445
Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala
    450                 455                 460
Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile
465                 470                 475                 480
Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr
                485                 490                 495
Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe
            500                 505                 510
Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro
        515                 520                 525
Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly
    530                 535                 540
Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu
545                 550                 555                 560
Ala Ile Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His
                565                 570                 575
Pro His Pro Thr Leu Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala
            580                 585                 590
Leu Gly Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Arg
        595                 600                 605
Leu Lys Met Asp Lys Leu Lys Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys
    610                 615                 620
Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly
625                 630                 635                 640
Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys
                645                 650                 655
Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg
            660                 665                 670
Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn
        675                 680                 685
Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn Ile Val Ile GlyIle
    690                 695                 700
Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Gly Ser Ser Ile
705                 710                 715                 720
Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile
                725                 730                 735
Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly
            740                 745
<210>22
<211>749
<212>PRT
<213>登革病毒4型
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(749)
<223>相应于PID3的氨基酸序列
<400>22
Met Gly His His His His His His Ala Met Val Asp Lys Arg Met Ala
1               5                   10                  15
Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp
            20                  25                  30
Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp
        35                  40                  45
Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Glu Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala
    50                  55                  60
Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu
65                  70                  75                  80
Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro
                85                  90                  95
Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala
            100                 105                 110
Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu
        115                 120                 125
Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala
    130                 135                 140
Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys
                165                 170                 175
Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala
            180                 185                 190
Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu
        195                 200                 205
Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala
    210                 215                 220
Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln
225                 230                 235                 240
Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala
                245                 250                 255
Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys
            260                 265                 270
Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile
        275                 280                 285
Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys
    290                 295                 300
Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu
305                 310                 315                 320
Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val
                325                 330                 335
Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys
            340                 345                 350
Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn
        355                 360                 365
Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr
    370                 375                 380
Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val
385                 390                 395                 400
Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu
                405                 410                 415
Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys
            420                 425                 430
Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val
        435                 440                 445
Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala
    450                 455                 460
Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile
465                 470                 475                 480
Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr
                485                 490                 495
Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe
            500                 505                 510
Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro
        515                 520                 525
Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly
    530                 535                 540
Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu
545                 550                 555                 560
Ala Ile Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His
                565                 570                 575
Pro His Pro Thr Leu Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala
            580                 585                 590
Leu Gly Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Lys
        595                 600                 605
Val Arg Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys
    610                 615                 620
Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly
625                 630                 635                 640
Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys
                645                 650                 655
Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg
            660                 665                 670
Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn
        675                 680                 685
Ile Glu Leu Glu ProPro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val
    690                 695                 700
Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Ser Ser Ile
705                 710                 715                 720
Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile
                725                 730                 735
Leu Gly Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly
            740                 745
<210>23
<211>750
<212>PRT
<213>登革病毒2型
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(750)
<223>相应于PLL3的氨基酸序列
<400>23
Met Gly His His His His His His Ala Met Val Asp Lys Arg Met Ala
1               5                   10                  15
Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp
            20                  25                  30
Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp
        35                  40                  45
Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Glu Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala
    50                  55                  60
Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu
5                  70                  75                  80
Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro
                85                  90                  95
Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala
            100                 105                 110
Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu
        115                 120                 125
Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala
    130                 135                 140
Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys
                165                 170                 175
Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala
            180                 185                 190
Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu
        195                 200                 205
Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala
    210                 215                 220
Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln
225                 230                 235                 240
Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala
                245                 250                 255
Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys
            260                 265                 270
Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile
        275                 280                 285
Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys
    290                 295                 300
Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu
305                 310                 315                 320
Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val
                325                 330                 335
Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys
            340                 345                 350
Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn
        355                 360                 365
Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr
    370                 375                 380
Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val
385                 390                 395                 400
Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu
                405                 410                 415
Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys
            420                 425                 430
Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val
        435                 440                 445
Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala
    450                 455                 460
Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile
465                 470                 475                 480
Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr
                485                 490                 495
Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe
            500                 505                 510
Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro
        515                 520                 525
Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly
    530                 535                 540
Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu
545                 550                 555                 560
Ala Ile Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His
                565                 570                 575
Pro His Pro Thr Leu Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala
            580                 585                 590
Leu Gly Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Asp
        595                 600                 605
Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met
    610                 615                 620
Cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His
625                 630                 635                 640
Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys
                645                 650                 655
Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly
            660                 665                 670
Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val
        675                 680                 685
Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly
    690                 695                 700
Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser
705                 710                 715                 720
Ile Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala
                725                 730                 735
Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly
            740                 745                 750
<210>24
<211>142
<212>PRT
<213>登革病毒2型
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(142)
<223>相应于DEN-2病毒的包膜蛋白的DomB的氨基酸序列
<400>24
Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met
1               5                   10                  15
Cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His
            20                  25                  30
Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys
        35                  40                  45
Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly
    50                  55                  60
Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val
65                  70                  75                  80
Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly
                85                  90                  95
Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser
            100                 105                 110
Ile Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala
        115                 120                 125
Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly
    130                 135                 140

Claims (8)

1.药物制剂，其特征在于，所述药物制剂是能够在受者生物中诱导针对登革病毒的免疫应答的疫苗，并且包含单独或与其他抗原相组合的一种或几种登革病毒血清型的衣壳蛋白。
2.根据权利要求1的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含单独、相互混合或组合的登革病毒1、2、3或4的衣壳蛋白。
3.根据权利要求1的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含与能够诱导体液和/或细胞应答的抗原相混合或相组合的衣壳蛋白。
4.根据权利要求1和3的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含与在序列表中被标识为序列20、序列21、序列22和序列23的一种或几种蛋白质相混合的衣壳蛋白。
5.根据权利要求1和3的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含与在序列表中被标识为序列17、序列18、序列19和序列24的一种或几种序列通过化学或遗传方法相融合的衣壳蛋白。
6.根据权利要求1、2、3、4和5的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含以聚集或颗粒形式的衣壳蛋白。
7.根据权利要求1、2、3、4、5和6的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含药理学上可接受的媒介物和油性或非油性佐剂。
8.根据权利要求1、2、3、4、5、6和7的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂是针对登革病毒的预防或治疗剂，用于口服、肌内、皮下、粘膜或静脉内使用。
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