CN102010870B - 高表达量的溶血素基因及其分泌表达载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高表达量的溶血素基因及其分泌表达载体和应用，属于遗传工程领域。本发明是以来自Streptococcus pyogenes NZ131菌株slo基因序列为模板(Streptococcuspyogenes NZ131，complete genome：NCBI accession：NC_011375.1)，利用大肠杆菌优化密码子替换其56个大肠杆菌稀有密码子，设计并合成了编码化脓链球菌溶血素的新基因nslo，构建了含该nslo基因的分泌型表达载体和含该分泌型表达质粒的工程菌。表达结果表明，蛋白表达产量可以达到3mg/mL以上，酶活可达到2.4×10⁶HU/mL。本发明实现了nslo的高效表达，可广泛引用于与医学研究和疾病诊断，适合工业化生产。

Description

高表达量的溶血素基因及其分泌表达载体和应用

技术领域

本发明涉及一种人工改造合成的高表达量的化脓链球菌溶血素基因nslo，属于医学微生物基因工程领域。本发明还涉及一种依上述基因构建的分泌型表达载体及其应用，属于基因工程领域。 

技术背景

溶血素主要来自链球菌、金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌等。来自化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的溶血素(Streptolysin O，SLO)是胆固醇依赖性的，能够与人及其它动物的细胞膜上的胆固醇相结合，结合到细胞膜上的SLO蛋白分子会形成环状寡聚体，形成大的孔道，导致细胞膜溶解，而且介导一些大分子(如NADase)通过细胞膜，所以SLO是链球菌感染宿主过程中的重要毒素蛋白。 

SLO在医学研究和应用中具有广泛的应用价值，首先在医学与生物学研究中，SLO作为成孔蛋白，被用作打孔工具；其次，在诊断医学中，作为检测试剂，用来检测被Streptococcuspyogenes感染的患者体内的抗SLO的抗体(anti-SLO)；再其次，可以用做细胞自杀基因和自杀蛋白，研究其在控制肿瘤细胞繁殖中的应用。 

从天然链球菌中获得SLO的工艺成本高，得率低，具有不安全性。自1984年以来，前人一直研究SLO在大肠杆菌原核系统中的表达，至目前，国内外研究人员已经在原核系统中实现了SLO与maltose-binding protein、GST-tag和6His-tag等表达标签的融合表达。但是，在目前SLO的重组表达方法中，存在的显著缺点是表达产量始终比较低，在0.3mg/mL以下，导致后期纯化应用难度较大。 

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种人工改造合成的，可在大肠杆菌中高效表达的新的化脓链球菌溶血素基因nslo及其表达载体，该人工改造合成的nslo基因，具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列。 

所述核苷酸序列使用了使用了大肠杆菌偏爱性密码子。 

使用所述溶血素基因nslo构建的表达载体。 

所述表达载体为分泌型载体，优选为pET-20b(+)。 

使用所述溶血素基因nslo或表达载体构建的转基因细胞系或基因工程菌。 

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种所述溶血素基因nslo或含有溶血素基因nslo的表达载体在医学研究、疾病诊断和SLO抗体制品生产中的应用。 

本发明设计并合成了编码化脓链球菌溶血素的新基因nslo，构建了含该nslo基因的分泌型表达载体和含该分泌型表达质粒的工程菌。表达结果表明，溶血素蛋白产量可以达到3mg/ml，酶活达到2.4x10⁶HU/mL，Western和Elisa实验表明其抗原性显著，实现了SLO蛋白在原核生物大肠杆菌中高效率分泌性表达，适合工业化生产。 

附图说明

图1nslo/pET-20b(+)酶切鉴定图 

1.DNA Marker；2.nslo/pET-20b(+)；3.nslo/pET-20b(+)双酶切。 

图2nslo/pET-20b(+)物理图谱 

图3重组表达SLO摇瓶发酵的SDS-PAGE图谱 

1.蛋白Marker；2.pET-20b(+)/BL21(DE3)的胞内上清；3.nslo/pET-20b(+)/BL21(DE3)的胞内上清。 

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。 

实施例1nslo基因设计 

具体实施方式

以Streptococcuspyogenes NZ131菌株slo基因序列232-1673bp为起始序列(1-231序列编码的氨基酸序列与SLO的溶血活性与抗原性不相关)，在mRNA的二级结构分析的基础上，用65个大肠杆菌偏爱密码子替换slo基因内部的大肠杆菌稀有密码子，得到新的人工改造设计的化脓链球菌溶血素基因nslo，序列见SEQ ID NO.1，全长1485个核苷酸，编码495个氨基酸。 

实施例2nslo基因合成与克隆 

由于nslo基因与原slo基因相比，变动较大，不便于使用突变技术，因此使用化学合成法一步合成nslo基因，将合成的nslo基因与pMD18T(Takara)载体连接，转化JM109，转 化产物涂布含100g/mL氨苄青霉素的LB平板，经过37℃培养过夜，得到单克隆转化子nslo/pMD18T/JM109，经过菌落PCR鉴定，质粒酶切鉴定和测序鉴定，表明新合成的nslo基因全长为1485bp，编码495氨基酸，测定的序列和设计序列完全相同。 

实施例3分泌表达SLO蛋白的载体构建 

用于实现nslo基因在大肠杆菌中分泌性表达的载体是pET-20b(+)，该载体带有pelB信号肽和His-tag标签，将pET-20b(+)质粒和nslo/pMD18T用NocI和NotI切，酶切产物切胶回收，再用T4连接酶连接，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经过37℃培养过夜，挑选转化子，通过菌落PCR鉴定，质粒酶切鉴定(见图1)和测序鉴定，保存鉴定的nslo/pET-20b(+)/E.coli JM109菌，提取nslo/pET-20b(+)备用。 

实施例4分泌表达SLO蛋白的工程菌构建 

将质粒nslo/pET-20b(+)转化大肠杆菌宿主BL21(DE3)，再在100g/mL氨苄青霉素的LB平板，经过37℃培养过夜，经过菌落PCR鉴定，得到单克隆转化子nslo/pET-20b(+)/BL21(DE3)。 

实施例5发酵与SLO蛋白的分离纯化 

1、摇瓶发酵 

将nslo/pET-20b(+)/BL21(DE3)接种在LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入TB(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO4 12.54g/L，KH2PO4 2.31g/L)发酵液体培养基，37℃培养到细菌OD₆₀₀到0.8，用0.5mM IPTG(异丙基硫代β-D半乳糖苷)诱导，降温至15℃培养，48h时产酶达3mg/mL以上，SDS电泳图谱见图3。 

2、分离纯化 

将表达后的培养液离心，得到上清用0.45um膜过滤，过滤后的溶液按照1∶1的比例和2X Binging buffer(10mM咪唑，1M NaCl，40mM Tris-HCL)混匀备用；His-tag亲和层析柱用5倍柱体积的1X charging buffer(50mM NiSO4)处理后，再用倍柱体积1X Binding buffer(2.5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)平衡；上样品后用10倍柱体积1X Binging buffer洗柱，再用5倍柱体积1X Washing buffer(60mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)洗柱；用6倍柱体积1X Elution buffer(1M咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)洗脱。 

实施例6酶活测定、Western、Elisa鉴定重组表达的SLO蛋白抗原性 

SLO样品可用溶液A(溶液A：36mM H₃PO₄，126mM NaCl，1g/L BSA(bovine serumalbumin)，pH 7.0)进行系列梯度稀释。将0.5ml的150mM 2-mercaptoethanol与1ml稀释样品混匀，30℃孵育15min，然后每管加0.5ml含绵羊红细胞的A溶液(158×10⁸cell/ml)30℃下反应20min，离心后，用541nm检测上清中血红蛋白的浓度。1U定义为在该实验条件下，引起上述反应体系中50％红细胞溶解的酶量所需要的酶量。经测定，1mL菌液的酶活为2.4x10⁶HU以上。Western和Elisa实验结果为阳性，表明其具有抗原性。 

实施例7nslo基因在医学研究、疾病诊断中的应用 

用nslo基因构建SLO表达工程菌，通过发酵生产SLO蛋白。SLO蛋白是医学研究和临床使用的重要生物学试剂。利用SLO蛋白，作为抗原，可以检测患者体内ASO(抗SLO蛋白的抗体)，以此诊断链球菌感染引起的变态反应和最近是否存在链球菌感染。 

实施例8nslo基因SLO抗体制品生产中的应用 

将纯化得到的SLO蛋白，免疫动物，纯化免疫血清，得到SLO抗体。 

nslo基因SLO抗体制品生产中的应用可参考下列文献： 

1.Kimoto H，Fujii Y，Hirano S，Yokota Y，Taketo A.Expression of recombinant StreptolysinO and specific antibody production.J Mol Microbiol Biotechnol.2005；10(1)：64-8. 

2.Velázquez B，Massaldi H，Battistoni J，Chabalgoity JA.Construction and expression ofrecombinant streptolysin-o and preevaluation of its use in immunoassays.Clin Diagn Lab Immunol.2005 May；12(5)：683-4. 

序列表

核苷酸序列表

<110>盐城师范学院

<120>高表达量的溶血素基因及其分泌表达载体和应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1485

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于高效表达。

<400>1

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<210>2

<211>5154

<212>DNA

<213>nslo/pET-20b(+)

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Claims (6)

1.一种人工改造合成的化脓链球菌溶血素基因nslo，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

2.根据权利要求1所述的溶血素基因nslo，其特征在于所述核苷酸序列使用大肠杆菌的偏爱性密码子。 

3.含有权利要求1所述溶血素基因nslo的表达载体。 

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为分泌型载体。 

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于优选为pET-20b(+)。 

6.含有权利要求5所述表达载体的基因工程菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。 

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