KR20190096910A - 담즙산에 의해 발현이 유도되는 pedv 백신 제조용 표면발현 벡터, 그에 의해 형질전환된 형질전환유산균과 이들 pedv 백신용 표면발현벡터 및 형질전환된 재조합 유산균의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물의 세포표면에서 발현되는 것으로, PEDV의 막단백질 유전자 중 항원결정기로 선별된 되는 아미노산 서열열을 암호화하는 염기서열을 포함하는 PEDV 백신 제조용 표면발현 벡터, 신규한 담즙산에 의해 발현이 유도되는 PEDV 백신 제조용 표면발현 벡터에 의해 M1, M2, M3 단백질이 세포표면에 발현된 형질전환유산균, 이러한 유산균을 이용한 백신에 관한 것이다. 상기 PEDV 막단백질 유전자의 염기서열은 서열번호 4로도 기재되어 있으며, 상기 PEDV 막단백질 유전자 중에서 항원성이 높은 부위인 항원결정기 M1, M2, M3의 각 아미노산 서열을 서열번호 1, 2 또는 3을 가진다. 그리고 본 발명은 상기 PEDV의 막단백질 유전자 중에서 가장 변이가 적고 항원성이 높은 영역 중 유산균 발현벡터와 융합할 각 결정항원기를 준비하는 단계, Signal sequence(SP)및 cell wall-anchoring domain(CWA) 증폭에 사용한 프라이머로, SP forward primer에 PstI 제한효소 사이트를, CWA reverse primer에는 HindⅢ 제한효소 사이트를 부착하고, 각각의 M1, M2, M3 항원결정기를 각각 SP DNA와 혼합한 후에 각각 PCR을 실시함으로써, SP와 M1, M2, M3 항원결정기가 각각 연결된 fusion gene(SP-M1, SP-M2, SP-M3)를 구축하는 단계 및 상기 SP와 M1, M2, M3 항원결정기가 각각 연결된 fusion gene(SP-M1, SP-M2, SP-M3)를 구축하여 선택된 상기 항원결정기를 유산균벡터 pBCEG29의 PstI-HindIII 사이트에 도입하여(6.5Kbp 크기의 pULP3-SPM1CWA, pULP3-SPM2CWA, pULP3-SPM3CWA) 를 각각 구축하는 단계를 포함하는 담즙산에 의해 발현이 유도되는 PEDV 백신용 표면발현벡터 제조방법과 PEDV 백신용 표면발현벡터에 의하여 형질전환된 재조합 유산균의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명인 담즙산에 의해 발현이 유도되는 돼지 유행성 설사 바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) 백신용 벡터로 형질전환된 Lactobacillus plantarum 재조합 유산균을 이용함으로써 PEDV의 감염을 예방하고 치료함으로써 돼지의 PEDV 질병으로 인한 농가의 경제적 손실을 막을 수 있다.

Description

담즙산에 의해 발현이 유도되는 PEDV 백신 제조용 표면발현 벡터, 그에 의해 형질전환된 형질전환유산균과 이들 PEDV 백신용 표면발현벡터 및 형질전환된 재조합 유산균의 제조방법{VACCINE VECTOR FOR PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS(PEDV) INDUCIBLY EXPRESSED UNDER BILE ACID, TRANSFORMED RECOMBINANT LACTIC ACID BACTERIA AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 돼지 유행성 설사 바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 막단백질(membrane protein)을 암호화하는 유전자를 포함하며, 담즙산에 의해 발현이 유도되는 PEDV 백신 제조용 표면발현 벡터, 그에 의해 형질전환된 형질전환유산균과 이들 PEDV 백신용 표면발현벡터 및 형질전환된 재조합 유산균의 제조방법에 관한 것이다.

돼지 유행성 설사(porcine epidemic diarrhea, PED)는 PED 바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) 감염에 의해 발생되는 돼지의 핵심적인 전염병 중의 하나이다. 상기 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)의 전체 게놈 길이는 28 kilobase pair 정도이며, 상기 게놈의 구성에는 스파이크 단백질 (spike glycoprotein), 막 단백질 (membrane protein), 외피단백질 및 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질 등 4개의 구조단백질을 가지고 있다. 참고적으로 상기 PEDV 전염병에 감염되면 돼지 융모 상피세포를 변성 또는 괴사시켜 돼지 융모의 위축과 탈락을 동반하게 되며, 이로 인하여 돼지의 영양분을 흡수하는 데 장애가 초래되고, 돼지 또는 그 자돈의 경우 구토와 수양성 설사를 초래한다. 특히 자돈의 경우는 치사율이 70% 이상에 이른다.

돼지 질병에 관련된 대부분의 바이러스 전염병 등에서는 백신을 통한 전염병 질환의 예방에 주로 의존하고 있다. 그러나 상기 돼지 유행성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) 백신 등의 개발에 있어서 백신제제의 생산비가 높은 것이 일반적이다. 또한 PEDV 혈청배지 등을 포함된 다양한 이종단백질에 의하여 면역적인 다양한 부작용도 발생되고 있으며 이들의 문제점을 해결하기 위하여 돼지 유전자 및 단백질을 이용하여 PEDV 백신을 개발하고 있다. 또한 PEDV 병원체를 약화시킨 생독백신과 상기 병원체를 죽인 사독백신의 경우, 적절한 종류나 시기에 접종을 시행하지 못할 경우 오히려 다양한 부작용이 발생할 수 있다.

한편, 대장균에서 직접 생산된 재조합 백신의 경우, 병원체 오염 배제와 저렴한 대량 생산비용의 이점은 있으나 돼지에서의 경구투여 시에 위와 장을 통과하면서 재조합 백신이 파괴되거나 약화되어 백신으로서의 가치가 저하되는 문제가 있기 때문에 새로운 형태의 백신 개발이 시급한 실정이다. 또한, 항원성을 갖는 유전자를 분리하여 박테리아, 효모 또는 포유류의 세포에서 발현시킨 것을 백신으로 사용하는 사례도 있었으나 백신 효과면에서 적절한 효과를 내지 못하고 있는 실정이다.

이러한 PEDV 질병관련 연구 및 돼지 사양농가의 문제점을 고려하여 본 발명자들은 PEDV의 새로운 항원결정기를 개발하고, 이를 선행특허(특허 10-1613897)를 통해 확보된 담즙산 유도 발현벡터에 클로닝한 후에 유산균 세포표면에 발현시켰으며, 마우스에 급여하여 항원에 특이적인 IgG 및 IgA 항체의 증가 확인을 통해 백신의 효능을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

한국등록특허: 10-1613897

본 발명의 목적은 돼지 유행성 설사 바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 막단백질(membrane protein)의 특정부위를 암호화하는 유전자를 포함하는 담즙산에 의해 발현이 유도되는 PEDV 백신 제조용 표면발현 벡터, 그에 의해 형질전환된 형질전환유산균과 이들 PEDV 백신용 표면발현벡터 및 형질전환된 재조합 유산균의 제조방법에 관한 것을 제공하고, PEDV 막단백질의 특정부위를 세포표면에 발현시킨 유산균을 마우스에 경구 급여하여 PEDV에 대한 IgG 및 IgA 항체가 유도되는 면역반응을 확인하고자 하였다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 미생물의 세포표면에서 발현되는 것으로, PEDV의 막단백질 유전자 중 항원결정기로 선별된 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하는 PEDV 백신 제조용 표면발현 벡터를 제공하고자 하였다.

또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, PEDV의 막단백질 유전자 중 선택된 항원결정기는 epitope1 (이하 ‘M1’으로 함), epitope2 (이하 ‘M2’으로 함 ), epitope3 (이하 ‘M3’으로 함) 중 선택된 어느 하나 이상으로 이루어지며, 선행특허(특허 10-1613897)에 의해 확보된 담즙산 발현 유도 유산균벡터인 pBCEG29에 상기 M1, M2, M3 항원결정기를 각각 발현하는 PEDV 백신 제조용 표면발현 벡터로서, 구체적으로 pULP3-SPM1CWA, pULP3-SPM2CWA, 또는 pULP3-SPM3CWA 벡터를 제공한다. 상기 pULP3-SPM1CWA, pULP3-SPM2CWA, pULP3-SPM3CWA 각각의 DNA 서열은 서열번호 5와 도 7, 서열번호 6과 도 8, 및 서열번호 7과 도 9에서 보는 바와 같다.

또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 신규한 담즙산에 의해 발현이 유도되는 PEDV 백신 제조용 표면발현 벡터에 의해 상기 M1, M2, M3 단백질이 세포표면에 발현된 형질전환유산균을 제공하고, 상기 유산균은 형질전환된 Lactobacillus plantarum SK156(KACC 81063BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환유산균을 제공하고자 한다.

또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 PEDV의 막단백질 유전자 중에서 가장 변이가 적고 항원성이 높은 영역 중 유산균 발현벡터와 융합할 각 결정항원기를 준비하는 단계, Signal sequence(SP)및 cell wall-anchoring domain(CWA) 증폭에 사용한 프라이머로, SP forward primer에 PstI 제한효소 사이트를, CWA reverse primer에는 HindⅢ 제한효소 사이트를 부착하고, 각각의 M1, M2, M3 항원결정기를 각각 SP DNA와 혼합한 후에 각각 PCR을 실시함으로써, SP와 M1, M2, M3 항원결정기가 각각 연결된 fusion gene인 SP-M1, SP-M2 및 SP-M3를 각각 구축하는 단계 및 상기 SP와 M1, M2, M3 항원결정기가 각각 연결된 fusion gene인 SP-M1, SP-M2 및 SP-M3를 구축하여 선택된 상기 항원결정기를 유산균벡터 pBCEG29의 PstI-HindIII 사이트에 도입하여 각각의 유산균벡터(6.5Kbp 크기의 pULP3-SPM1CWA, pULP3-SPM2CWA, pULP3-SPM3CWA)를 구축하는 단계를 포함하는 담즙산에 의해 발현이 유도되는 PEDV 백신용 표면발현벡터 제조방법에 관한 것을 제공한다.

또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 PEDV의 막단백질 유전자 중 항원결정기는 M1, M2, M3 중 선택된 어느 하나 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 담즙산에 의해 발현이 유도되는 PEDV 백신용 표면발현벡터 제조방법을 제공하고, 상기 항원결정기를 함유하는 상기 유산균벡터는 6.5Kbp 크기의 pULP3-SPM1CWA, pULP3-SPM2CWA, pULP3-SPM3CWA를 각각 구축하는 것을 특징으로 하는 담즙산에 의해 발현이 유도되는 PEDV 백신용 표면발현벡터 제조방법을 제공한다.

또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 PEDV 백신용 표면발현벡터에 의하여 형질전환된 재조합 유산균의 제조방법과 상기 유산균은 Lactobacillus plantarum SK156(KACC 81063BP)인 것으로 특징으로 하는 형질전환된 재조합 유산균의 제조방법을 제공한다.

또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 형질전환된 재조합 유산균의 제조방법에 의해 제조된 형질전환된 재조합 유산균인 Lactobacillus plantarum SK156(KACC 81063BP)과 형질전환된 재조합 유산균인 Lactobacillus plantarum SK156(KACC 81063BP)을 유효성분으로 함유하는 PEDV 치료용 백신을 제공하며, 상기 백신은 경구용인 것을 특징으로 하는 PEDV 치료용 백신을 제공한다.

본 발명의 특이한 효과로는 PEDV 막단백질의 특정 도메인을 도입한 표면발현벡터를 장관에서 생존성이 높은 유산균인 Lactobacills plantarum 유산균에 도입하며, 상기 방법으로 형질전환된 Lactobacills plantarum SK156(KACC 81063BP) 재조합 유산균을 유효성분으로 함유하는 PEDV 백신으로 사용하여 PEDV 감염을 예방하고 치료함으로써 돼지의 PEDV 질병으로 인한 농가의 경제적 손실을 막을 수 있다. 특히 자돈의 경우는 체내 면역성이 극히 낮아 PEDV 질병으로 인한 사망률이 70% 이상 이르는 문제를 해결할 수 있어 축산 농가의 소득을 증대시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 PEDV 막단백질 유전자의 염기서열을 나타낸 것으로서, 상기 염기서열은 서열번호 4로 기재되어 있으며, 상기 PEDV 막단백질 유전자 중에서 항원성이 높은 부위인 항원결정기 (M1, M2, M3)함유한 염기서열과 아미노산 서열을 표시하고 하고 있으며, 항원결정기 (M1, M2, M3)의 각 아미노산 서열을 서열번호 1, 2 또는 3에 나타낸다.
도 2는 PEDV 막단백질의 3차구조 및 항원결정단백질의 위치를 나타낸 것이다 (Epitope 1: M1, Epitope 2: M2, Epitope 3: M3).
도 3은 PEDV 항원결정기를 유산균 세포표면에 발현하기 위한 construct를 나타낸 것으로서, PEDV epitope 부분에 M1, M2 또는 M3 항원이 삽입된 것이다.
도 4는 PEDV 항원결정기가 도입된 유산균 표면발현벡터를 나타낸 것이다.
도 5는 형질전환 유산균의 세포표면에 M1, M2, M3 항원이 각각 성공적으로 발현된 것을 형광현미경으로 관찰한 것이다.
도 6은 PEDV 항원인 M1, M2, M3이 세포표면에 발현된 유산균을 급여한 마우스의 혈청내 IgG 및 분내 IgA의 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 M1 항원을 클로닝한 유산균 발현벡터 pULP3-SPM1CWA의 DNA 서열을 나타낸 것이다. 밑줄친 부분은 signal sequence, M1 및 cell wall-anchoring domain 부분이 융합된 염기서열을 나타낸 것이다. 이탤릭체는 사용한 제한효소 사이트 PstI 및 HindIII를 각각 나타낸 것이다.
도 8은 M2 항원을 클로닝한 유산균 발현벡터 pULP3-SPM2CWA의 DNA 서열을 나타낸 것이다. 밑줄친 부분은 signal sequence, M2 및 cell wall-anchoring domain 부분이 융합된 염기서열을 나타낸 것이다. 이탤릭체는 사용한 제한효소 사이트 PstI 및 HindIII를 각각 나타낸 것이다
도 9는 M3 항원을 클로닝한 유산균 발현벡터 pULP3-SPM3CWA의 DNA 서열을 나타낸 것이다. 밑줄친 부분은 signal sequence, M3 및 cell wall-anchoring domain 부분이 융합된 염기서열을 나타낸 것이다. 이탤릭체는 사용한 제한효소 사이트 PstI 및 HindIII를 각각 나타낸 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"핵산"은 당분야에 공지된 용어이다. 여기에서 "핵산"은 핵염기로 구성된 DNA, RNA 또는 이의 유도체 또는 유사체 분자(가닥)을 말한다. 예를 들면 핵염기에는 DNA에서 볼 수 있는 자연 생성 또는 유도된 퓨린 또는 피리미딘 염기(가령, 아데닌 "A", 구아닌 "G", 티민 "T" 또는 시토신 "C") 또는 RNA (가령, A, G, 우라실 "U" 또는C)를 포함한다. "폴리펩티드"는 단일 폴리펩티드뿐 아니라 다수의 폴리펩티드들을 포함하는 것이며, 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 하나 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 포함한다. 상기 용어는 또한 해독후 변형을 가진 폴리펩티드를 포함한다.

"단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다. "∼에 의해 코딩되는" 또는 "∼를 코딩하는"이란 핵산 서열이 폴리펩티드 서열을 코딩하는 것을 말하며, 여기서 상기 폴리펩티드 서열은 상기 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드인 적어도 3∼5개 아미노산, 더 바람직하게 는 적어도 8∼10개 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 적어도 15∼20개 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 상기 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 사용하여 면역학적으로 확인할 수 있는 폴리펩티드 서열도 포함된다. 따라서, 항원 "폴리펩티드", "단백질" 또는 "아미노산" 서열은 항원의 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 대해 70% 이상의 유사성, 바람직하게는 약 80% 이상의 유사성, 더 바람직하게는 약 90∼95%의 유사성, 가장 바람직하게는 약 99%의 유사성을 가질 수 있다. 여기서 단백질 중 항원단백질과 관련하여, 항원결정기(epitope 또는 antigenic determinant)는 항체, B세포, T세포등의 면역계가 항원을 식별하게 해 주는 항원의 특정한 부분이다. 항원결정기를 식별하는 항체의 특정한 부분은 항원결합부위(paratope)또는 항원결정부위(antigenic determinant 라고 한다. 일반적으로 항원 또는 그 항원결정기는 자기 자신이 아닌 외부에서 온 물질이라고 생각하기 쉽지만, 암세포와 같이 자기 자신의 것임에도 항원으로 작동하는 경우도 있고, 이 경우에도 항원결합부위로 분류한다. 단백질 항원의 항원결정기는 크게 그 모양과 항원결합부위와의 작용 방식에 따라 입체구조 항원결정기와 선형 항원결정기로 나뉜다. 입체구조 항원결정기는 항원의 불연속적인 아미노산 배열으로 구성된다. 이 종류의 항원결정기는 항체 항원결합부위의 3차원적 구조와 반응한다. 대부분의 항원결정기는 입체구조 항원결정기이다. 이와 반대로, 선형 항원결정기는 항체 항원결합부위의 1차원적인 구조와 반응한다. 항원의 선형 항원결정기를 구성하는 아미노산은 연속적이다.

본 발명에서 사용되는 "유전자"는 유전적 기능이 관련되어 있는 핵산 분자(염색체, 플라스미드 등)의 뉴클레오티드 서열이다. 유전자는, 예를 들어, 유기체의 게놈 내의 특정 물리적 위치("유전자좌")를 차지하는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 포유동물의 DNA 서열)을 포함하는, 유기체의 유전 단위이다. 유전자는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 발현 생성물을 코딩할 수 있다. 일반적으로, 유전자는 폴리펩티드 코딩 서열과 같은 코딩 서열 및 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 조절 서열(예를 들어, 인핸서 서열)과 같은 비코딩서열을 포함한다. 다수의 진핵생물 유전자가 "인트론"(비코딩 서열)이 개재되어 있는 "엑손"(코딩 서열)을 갖는다."오픈 리딩 프레임" 또는 "ORF", 또는 "orf"는 정지 코돈이 개재하지 않은 상태로 특정 바이러스 단백질을 코딩하는 데 필요한 최소한의 뉴클레오티드 서열을 말한다. "프로모터"는 유전자의 발현을 조절하는 핵산 서열을 가리킨다. "프로모터 서열"은 세포 내에서 RNA 중합효소에 결합하여 코딩 서열의 하류로 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열 내에는 RNA 중합효소결합을 담당하는 단백질 결합 도메인(보존 서열)뿐만 아니라 전사 개시 부위가 발견된다. "서열의 연결 또는 융합 (fusion)"은 융합된 구성요소를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 말한다. 융합된 구성요소들은 직접적 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 다른 서열(즉, 링커 혹은 기능도메인)이 융합된 요소들 사이에 위치할 수 있다. 그리고 클로닝(cloning)은 유전자 클로닝에 관한 것으로 유전자 클로닝에서는 염색체 중 특정 유전자를 선발하여 이것을 유전자 조작기술로 벡터에 연결하여 숙주세포에 도입, 세포의 복제 메커니즘을 이용하여 대량으로 증식시킨다. 증식시키는 방법으로 여러 가지 플라스미드나 파지에 의한 벡터 DNA가 이용된다. 벡터 DNA에 목적하는 유전자를 삽입하여 숙주세포에 도입시킬 때 목적 유전자가 숙주세포의 염색체에 합쳐져 버리면 나중에 회수가 곤란하다. 이 때문에 벡터 DNA는 숙주 세포질에서 자기복제가 가능해야 하고 작은 것일수록 좋다.

"형질전환(트랜스펙션)"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다. "작동 가능하게 연결된"이란 언급된 구성요소들이 그 일반적 기능을 수행하도록 구성되어 있는 요소들의 배열을말한다. 따라서, 코딩 서열(예를 들어, 관심있는 항원을 코딩하는 서열)에 작동 가능하게 연결된 특정 프로모터는 조절 단백질 및 적절한 효소가 존재할 경우 코딩 서열의 발현을 가능하게 할 수 있다. 일부 경우, 특정 조절요소가 이들이 코딩 서열의 발현을 지시하는 기능을 할 수 있는 한 코딩 서열에 인접할 필요는 없다.

" 벡터" 라는 용어는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다. "숙주 세포"는 하나 이상의 DNA 또는 벡터가 도입되는 진핵 또는 원핵 세포를 가리키며, 특정 대상 세포만이 아니라 그 자손 혹은 잠재적 자손까지도 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 어떤 변형이 돌연변이 혹은 환경적 영향 때문에 후속 세대에 일어날 수 있기 때문에 사실 상기 자손은 부모 세포와 동일하지는 않지만, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 용어의 범주 내에서 여전히 포함된다.

"백신" 또는 "백신 조성물"은 본원에서 상호 교환하여 사용될 수 있으며, 동물에서 면역 반응을 유발하고/하거나, 질병 또는 감염에 의한 사망 가능성으로부터 동물을 보호하는 1종 이상의 면역학적 활성 성분을 포함하는약학적 조성물을 말하며, 이것은 활성 성분의 면역학적 활성을 증대시키는 1종 이상의 추가적인 성분들을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 백신은 약학적 조성물에 전형적인 그 밖의 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다.항원 또는 백신 조성물에 대한 "면역 반응"은, 피험체에서, 관심있는 항원 또는 백신 조성물 중에 존재하는 분자에 대해 체액성 및/또는 세포 매개성 면역 반응이 발생되는 것이다. "체액성 면역 반응"은 항체 매개성 면역반응으로서 본 발명의 항원/백신에 대한 친화성을 갖는 항체의 생성을 포함하는 한편, "세포 매개성 면역 반응"은 T 림프구 및/또는 다른 백혈구에 의해 매개되는 것이다. "세포 매개성 면역 반응"은 주요 조직 적합성 복합체(MHC)의 클래스 I 또는 클래스 II 분자와 회합된 항원성 에피토프의 제시에 의해 유발된다. "면역학적 유효량"이란, 당업자에게 공지되어 있는 표준 분석법에 의해 측정시, 세포성(T세포) 또는 체액성(B세포 또는 항체) 반응 중 어느 하나의 면역 반응을 유발하기에 충분한 항원 또는 백신의 양을 말한다. 면역원으로서의 항원의 유효성은 증식 분석법, 세포 용해 분석법, 예컨대 T 세포가 그 특정 표적 세포를 용해시키는 능력을 측정하는 크롬 방출 분석법에 의해, 또는 혈청 중의 항원에 특이적인 순환 항체 수준을 측정함으로써 B 세포 활성 수준을 측정하는 것의 의해 측정할 수 있다. 또한, 면역 반응의 보호 수준은, 주사된 항원으로 면역화된 숙주를 공격함으로써 측정할 수 있다.“투여” 및 유사 용어는 조성물, 예를 들면, 플라스미드와 운반체의 혼합물을 치료 개체에 전달하여, 상기 조성물이 신체 부위에 전달되고 상기 플라스미드가 표적 세포를 트랜스펙션시키도록 하는 것을 의미한다. 따라서, 조성물은 예로써 전신 투여, 전형적으로 피하, 근육내, 정맥내, 또는 복강내 투여에 의해 개체에 투여된다. 하지만, 당분야에 공지된 바와 같이, 심근 유전자 전달을 수행하기 위한 전달 옵션에는 심외막(epicardial), 심내막(endocardial), 관상동맥내(intracoronary), 역관류(retroperfusion), 심막내(intapericardial) 투여 경로가 등록특허 포함된다(J.M. Isner, supra). 모든 유형의 벡터는 심외막과 심내막 투여 경로를 통한 심근내 주입 및 심막내 주입에 의해 전달될 수 있다.

"예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. "치료"는 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (b) 질환 또는 질병의 경감; 및 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 “치료학적 유효량”은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 치료 목적을 위한 "포유류"는 인간, 가축 및 농장 가축 및 동물원, 스포츠 혹은 개, 말, 고양이, 소, 원숭이 등의 애완용 동물을 포함하여 포유류로 분류되는 어떠한 동물도 가리킨다. 바람직하게는 상기 포유류는 돼지이다."돼지(porcine, swine, pig)", "양돈", "육돈"은 상호 교환하여 사용될 수 있으며, 멧돼지과(Suidae)의 일원인 임의의 동물을 지칭한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.

실시예 1. PEDV 항원유전자의 클로닝

1-1 항원결정기(epitope)의 결정

돼지 유행성 설사 바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV))는 코로나바이러스과(coronaviridae) 바이러스에 속하며 단일가닥 RNA를 게놈(genome)으로 가지고 있다. PEDV 유전체 길이는 약 28Kb이며, spike단백질(180-220KDa)과 막단백질 또는 외피단백질 (27-32KDa) 그리고 뉴클레오캡시드 단백질(55-58KDa)을 암호화하고 있다.

그동안 PEDV의 spike단백질을 항원결정기로 사용한 연구가 대부분이었으나, 본 발명에서는 PEDV의 막단백질, 그 중에서도 특정 도메인을 항원결정기로 이용하였다. 그동안 보고된 한국형, 일본형, 중국형 PEDV 염기서열을 확보하고, IEDB Bepipred Linear Epitope Prediction software (http://tools.immuneepitope.org)를 사용하여 막단백질 유전자 중에서 가장 변이가 적고 항원성이 높은 영역을 선발한 것을 항원결정기라 하고, 이들 각각을 epitope1(M1), epitope2(M2), epitope3(M3)로 명명하고 유산균 발현벡터와 융합할 항원으로 사용하였다(도 1, 도 2).

1-2 막단백질 DNA 항원결정기의 합성

PEDV 막단백질 유전자 중에서 가장 변이가 적고 항원성이 높은 M1, M2, M3 영역의 염기서열을 함유하는 서열번호 4로 표시되는 염기서열(도 1)를 합성하였다. 도 1에는 항원결정기 M1, M2, M3 영역의 염기서열과 아미노산 서열을 나타내고 있으며, 항원결정기 M1, M2, M3 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 1, 2 또는 3에 나타낸다.

1-3 세포표면발현용 벡터 pULP3의 제작

유산균 세포표면 발현용 벡터를 제작하기 위해 먼저, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 염색체를 template로 하여 surface layer protein A (slpA) 로부터 signal sequence (SP)와 cell wall-anchoring domain (CWA)를 사용하였다. SP 및 CWA 증폭에 사용한 프라이머는 하기 표 1에서 보는 바와 같으며, SP forward primer에 PstI 제한효소 사이트를, CWA reverse primer에는 HindⅢ 제한효소 사이트를 부착하였다.

SlpA 유래의 signal sequence (SP)와 cell wall-anchoring domain (CWA) 증폭을 위해 사용된 프라이머

프라이머 이름	프라이머 시퀀스	제한효소
SP-PstI-F	GCT CGT CTG CAG ATG AAG AAA AAT TTA AGA AT	PstI
SP-R	TCC TTT ACT CAT TGA TGA ACT TGC GTT
CWA-F	ACC AAG CTT TTA TCT AAA GTT TGC AAC
CWA-HisHindⅢ-R	ACC AAG CTT TTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG TCT AAA GTT TGC AAC	HindⅢ

먼저, M1, M2, M3 항원결정기를 각각 SP DNA와 혼합한 후에 각각 PCR을 실시함으로써, SP와 M1, M2, M3 항원결정기가 각각 연결된 fusion gene, 즉 SP-M1, SP-M2, SP-M3를 확보하였다. 한편, CWA DNA 증폭시에 C-말단 부위에 Histidine을 코딩하는 DNA 서열을 추가한 후에 PCR를 실시하였다.

다음으로, SP-항원결정기(M1, M2, M3)와 CWA DNA를 각각 혼합한 후에 하기 표 2에서 보는 바와 같은 프라이머들을 사용하여 PCR를 실시하였으며, 최종적으로 도 3에서 보는 바와 같은 순서로 유산균 표면에 발현시킬 DNA를 완성하였다.

SP와 항원결정기 (M1, M2, M3)의 융합을 위해 사용된 프라이머

프라이머 이름	프라이머 시퀸스
SP-FM1-R	GTA CAT AAT CCA TGA TGA ACT TGC GTT	M1 증폭
CWA-FM1-F	CAT TCA TGG TGG AAG TCA GCT ACT TTG CCA
SP-FM2-R	GC ATC AGT TTC TGA TGA ACT TGC GTT	M2 증폭
CWA-FM2-F	ATT CCA GTT TTA AAG TCA GCT ACT TTG CCA
SP-FM3-R	AGC ATC AGT TTC TGA TGA ACT TGC GTT	M3 증폭
CWA-FM3-F	TCA AAC GGT CGT AAG TCA GCT ACT TTG CCA

실시예 2. 유산균 표면발현벡터와의 융합

도 3에서 보는 바와 같이 구축된 SP와 항원결정기 (M1, M2, M3)를 각각 융합한 세 종류의 construct를, 선행특허(등록번호 10-1613897)를 통해 확보한 담즙산에 의해 발현이 유도되는 유산균용 벡터인 pBCEG29의 PstI-HindIII 사이트에 도입함으로써, 약 6.5Kbp 크기의 pULP3-SPM1CWA, pULP3-SPM2CWA, pULP3-SPM3CWA 를 각각 구축하였다(도 4). pULP3-SPM1CWA, pULP3-SPM2CWA, pULP3-SPM3CWA 각각의 DNA 서열은 서열번호 5와 도 7, 서열번호 6과 도 8, 및 서열번호 7과 도 9에서 보는 바와 같다.

실시예 3. 형질전환된 유산균의 제조

최종적으로 구축된 발현벡터를 Lactobacillus plantarum KACC 81063BP 에 도입하였다. 좀 더 구체적으로 설명하면, Lactobacillus plantarum KACC 81063BP 균주를 1% 글리신이 함유된 MRS 액체배지에 접종하였으며, OD₆₆₀ = 0.3 내지 0.5에 도달할 때까지 배양한 후에 ice에 10-20분간 방치하였다. 이 후, 5,000xg 에서 10-20분간 원심분리하여 유산균을 회수하였으며, 인산완충용액(5mM sodium phosphate, 1mM MgCl₂, pH7.4)으로 2-3회 세척하였다. 세척된 유산균 세포를 1mM 수크로오스, 1mM MgCl₂(pH7.4) 용액 100~200㎕에 현탁한 후에 0.1~1㎍의 pULP3와 혼합하였다. Ice에 5~10분간 방치한 후에, 1~5KV, 10~50uF의 조건으로 전기천공(electroporation)을 실시하였다. 여기에 MRS 배지 500㎕를 첨가한 후 37℃에서 2~3시간동안 배양한 후, 원심분리하여 세포를 침전시켰으며 5~10㎍/㎖ 농도의 에리트로마이신이 함유된 MRS 고체배지에 도말하였다. 상기 유산균이 도말된 MRS 고체배지를 37℃에서 48~72시간 동안 배양하였으며, 생성된 콜로니를 취하여 형질전환주로 선발하였다.

참고로, 숙주유산균으로서 Lactobacillus plantarum KACC 81063BP 이외에도 다른 Lactobacillus 속 유산균들에도 다양하게 도입할 수 있다.

실시예 4. 형질전환된 유산균 표면에서의 항원 발현여부 조사

PEDV M1, M2, M3의 유산균 세포표면 발현유무는 항원-항체 반응을 이용한 immunofluorescence assay 방법을 이용하여 확인하였다. 각 항원결정기 유전자가 삽입된 pULP3-SPM1CWA, pULP3-SPM2CWA, pULP3-SPM3CWA 벡터를 각각 도입한 L. plantarum KACC 81063BP 형질전환주를 anti-His-tag antibody (R&D Systems, Inc., USA)와 배양하고 570nm UV 파장에서 붉은 형광색을 띄는 anti-mouse IgG NorthernLights^™ NL557-conjugated antibody (R&D Systems, Inc., USA)와 37℃에서 1~2시간 동안 배양한 후에 형광현미경으로 세포표면을 관찰하였다. 도 5에서 보는 바와 같이, 일반 광학현미경 및 570nm filter가 장착된 형광현미경으로 관찰한 결과, 항원결정기가 포함되어 있지 않은 벡터(pULP3)가 도입된 형질전환주는 570nm filter에서 어떠한 형광반응도 나타내지 않은 반면, 항원결정기가 도입된 형질전환주의 세포표면에 강한 형광을 관찰할 수 있었다. 즉, 항원결정기 M1, M2, M3 각각 유산균 표면에 성공적으로 발현되었음이 확인되었다.

실시예 5 형질전환된 유산균의 마우스 급여실험

5-1 PEDV 막단백질 항원을 표면발현하는 유산균의 체액성 면역반응 유도

PEDV 막단백질 M1, M2, M3 항원결정기가 각각 표면발현이 확인된 유산균을 암컷 SPF Balb/C 마우스(8주령)에 경구투여하여 체액성 면역반응이 유도되는지 확인하였다.

구체적으로, M1, M2 또는 M3가 발현된 유산균과, 발현되지 않은 유산균를 2.0~6.0×10⁹ CFU/ml 농도로 준비한 다음, 3일간 200㎕씩 경구투여하여 immunization하였으며 (0~2일차), 2주 후에 1차 부스팅 (14~16일, 다시 2주 후에 2차 부스팅 (28~30일차) 하였다. 혈청 내의 M1, M2, M3 항원 특이적인 IgG 항체와, 점막 내에서 분비되는 M1, M2, M3 항원 특이적인 IgA 항체를 측정하기 위하여, 0일차, 21일차, 35일차에 마우스의 꼬리정맥으로부터 혈액시료를 채취하였으며, 항문마사지를 통하여 분변을 채취하여 0.01M EDTA-Na₂가 포함된 PBS 버퍼 0.4ml에 현탁하였다. 현탁액을 12,000×g에서 30분간 원심분리한 상등액을 사용하여 ELISA 실험을 실시하였다.

5-2 효소면역측정법(ELISA)를 통한 체액 면역반응 조사

항원 특이적인 IgG 및 IgA 항체의 분석을 위해, E. coli에서 발현된 재조합 PEDV 에피토프 100㎕(3㎍/ml)를 96웰 플레이트에 코팅한 후에, 3% bovine serum albumin(BSA)를 함유한 인산완충용액(PBS)으로 37℃에서 1시간 동안 blocking 하였다. PBS/Tween-20 용액으로 3회 세척한 뒤, 200배 희석된 100㎕의 면역화마우스 혈청을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. HRP-conjugated goat anti-mouse IgG와 IgA 항체(dilution 1:10000; Invitrogen, USA)로 검출한 후에, 3, 3’, 5, 5’-tetramethylbenzidine (TMB)로 발색시켰다. 0.5N H₂SO₄를 첨가하여 발색반응을 중지시킨 후에, ELISA plate reader (OD₄₅₀)를 사용하여 IgG와 IgA 항체의 역가를 확인한 결과는 도 6에서 보는 바와 같다.

도 6에서 보는 바와 같이, IgA 항체의 경우, 1차 부스팅한 이후인 21일부터 대조구(wild type)에 비해 M1 항원에 대한 IgA 역가가 유의적으로 증가하기 시작하였으며, 35일부터는 M3 항원에 대한 IgA 역가도 유의적으로 증가하였다. 한편 IgG 항체의 경우, M1, M2, M3 항원결정기 모두 1차 부스팅한 이후인 21일부터 IgG의 역가가 대조구(wild type)에 비해 유의적으로 증가하였으며, 2차 부스팅한 이후인 35일차에서는 M1 항원에 대한 IgG 역가가 특히 높은 수준을 나타내었다. 즉, PED 바이러스의 막 단백질 중에서도 특히 M1 항원에 의해 IgG 및 IgA 항체가 더 높은 수준으로 유도됨을 보여주었다.

5-3 실험통계처리

실험당 3번의 독립적인 반복을 실시하였다. 통계적 유의성은 student's t-test를 사용하여 계산되었으며, 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 고려되었다.

한국농업미생물자원센터 KACC81063BP 20170920

<110> Industry Academic Cooperation of Dankook University(Cheonan) <120> VACCINE VECTOR FOR PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS(PEDV) INDUCIBLY EXPRESSED UNDER BILE ACID, TRANSFORMED RECOMBINANT LACTIC ACID BACTERIA AND MANUFACTURING METHOD THEREOF <130> P-M1,M2,M3 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope 1 (M1) of porcine epidemic diarrhea virus <400> 1 Trp Ile Met Tyr Phe Val Asn Ser Ile Arg Leu Trp Arg Arg Thr His 1 5 10 15 Ser Trp Trp <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope 2 (M2) of porcine epidemic diarrhea virus <400> 2 Glu Thr Asp Ala Leu Leu Thr Thr Ser Val Met Gly Arg Gln Val Arg 1 5 10 15 Ile Pro Val Leu 20 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope 3 (M3) of porcine epidemic diarrhea virus <400> 3 Arg Ser Val Asn Ala Ser Ser Gly Thr Gly Trp Ala Phe Tyr Val Arg 1 5 10 15 Ser Lys His Gly Asp Tyr Ser Ala 20 <210> 4 <211> 572 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Membrane protein of porcine epidemic diarrhea virus <400> 4 gccattacaa gtactctgtg ttcttgtatg gtgtcaagat ggctattcta tggatacttt 60 ggcctcttgt gttggcactg tcactttttg atgcatgggc tagcttccag gtcaactggg 120 tctttttcgc tttcagcatc cttatggctt gcatcactct tatgctgtgg ataatgtatt 180 ttgtcaatag cattcggttg tggcgcagga cacattcttg gtggtctttc aatcctgaaa 240 ctgacgcgct tctcactact tctgtgatgg gccgacaggt ccgcattcca gtgcttggag 300 caccaactgg tgtaacgcta acactcctta gtggtacatt gtttgtagag ggctataagg 360 ttgctactgg cgtacaggta agtcaattac ctaatttcgt cacagtcgcc aaggccacta 420 caacaattgt ctacggacgt gttggtcgtt cagtcaatgc ttcatctggc actggttggg 480 ctttctatgt ccggtcaaaa cacggcgact attcagctgt gagtaatccg agtgcggttc 540 tcacagatag tgagaaagtg cttcatttag tc 572 <210> 5 <211> 6482 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VACCINE VECTOR(pULP3-SPM1CWA) DNA <400> 5 ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 60 gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 120 cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 180 tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 240 cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 300 aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 360 cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 420 gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 480 ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 540 cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 600 aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 660 tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 720 ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 780 tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 840 ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 900 agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 960 atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 1020 cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 1080 ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 1140 ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 1200 agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 1260 agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 1320 gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 1380 cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 1440 gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 1500 tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 1560 tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 1620 aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 1680 cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 1740 cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 1800 aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 1860 ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 1920 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 1980 ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 2040 acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag 2100 ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag 2160 ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag 2220 attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 2280 taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg 2340 cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt 2400 tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattcgag 2460 ctcccgctca tttatgggat caagctgaca cagcttgcgg gtttgggcag cgcccatggt 2520 tttattcgtg tgggatagaa atttgaaaat cagggggggc gagggagcga attttgcgac 2580 cgtactacga cccccctttt aggtgccgag tgccaacatt gagttttagt ttagcttggt 2640 cttactctct caagggatac agtcccccca gaaaaatcaa caaatcgcca acaaaatgac 2700 aacatttttc aaaaaatgcg tgtttagttg cattgaatgc gcaattatgc tactttttgt 2760 gtaatgaata attgaagggg gctaggaatt ttggaaaata aaaagagatt gacgattacg 2820 ttatcgagtc aagttcttaa atacttatcg gagactgcga aaaataaagg tctatctaaa 2880 tctgcgttga ttacagttgc actagaaaaa tacaaggaag ggcaaaatta agcacaaaaa 2940 agagcgtacc cggctaaaag ttcgctcatt cggtgcttgt tttgataagg cgattttaac 3000 attatggcta aagacaaggc aaggtacttc acctttttgc tatatccaga aagcattcct 3060 gctgattggg aacagcgttt agagttaatt ggtgtcccaa ttgcgattag tccgcttcat 3120 gatagggata agagcaatgt tgaaggacaa acatacaaga aagctcatta tcacgttatt 3180 tacgtggcga ggaatccggt tacgccggag agtgtaagaa ttaaaattaa acgattgtta 3240 ggcgacaaaa gcattgctaa ggtgcaaatt gtcattcgta gcatggaaag catgtatcta 3300 tatcttactc acgagtctaa agacgctgtt gagaagaaaa agcataagta cagcaagcat 3360 gacatttctt tgctgaacaa ttttgatatt gatcgctata ttacgcttga tgttaaagac 3420 aaagacgaca tgctgaatga tgtttgtgat ttgattgatg accataattt ggcaaatatg 3480 cgtgaactga gacgcttttt aaaagctcat ggttcagaat atggcatgcc cagtattaaa 3540 gtcgtcaatt cggttttacg tgctcatact ggactgataa ggctgtattt cgatgctgtt 3600 tatcaggaac gcaagtacgg cagaggcgat ataaacaaag agaccggtga gatacaagat 3660 taattagcga atgaaaattg ggtgctcaat tgagcgcctt ttttgttgtc ggctagccga 3720 cttctgatac aggtttttgg gggttagcac aacatagaat tcattctatg tataagtgcg 3780 cattgcttta aaaatagcaa tgaaaaaatc cgaaaaaaat gtcaaaggcg cacttacacg 3840 tcatcaaaga tgacgttgtg ctaaacccat taaaacctgt atcagatttc gctttgctca 3900 aacaaaactg acttgcgtca gttggaatct ttaaagccaa taaagtccag tcaccaactc 3960 cttcggactt tattggcttt aaagattggc tttaaatgcc cctaatttgc tctctaagcc 4020 attttagctg ttaaccgtat aatttactgt ccgtcaacgg taaatcgacg tagaacggct 4080 tttagccgtt ctaggaggct ttaaggagtt gacagactca ctagaccaag acacttttgc 4140 gcatgcaaag aaaagcacac ctgctttttt tgcctgcctc acggcgagtg cggggtgagt 4200 ttgagcggga gctcggtacc ccccttaact tacttattaa ataatttata gctattgaaa 4260 agagataaga attgttcaaa gctaatattg tttaaatcgt caattcctgc atgttttaag 4320 gaattgttaa attgattttt tgtaaatatt ttcttgtatt ctttgttaac ccatttcata 4380 acgaaataat tatacttttg tttatctttg tgtgatattc ttgatttttt tctacttaat 4440 ctgataagtg agctattcac tttaggttta ggatgaaaat attctcttgg aaccatactt 4500 aatatagaaa tatcaacttc tgccattaaa agtaatgcca atgagcgttt tgtatttaat 4560 aatcttttag caaacccgta ttccacgatt aaataaatct cattagctat actatcaaaa 4620 acaattttgc gtattatatc cgtacttatg ttataaggta tattaccata tattttatag 4680 gattggtttt taggaaattt aaactgcaat atatccttgt ttaaaacttg gaaattatcg 4740 tgatcaacaa gtttattttc tgtagttttg cataatttat ggtctatttc aatggcagtt 4800 acgaaattac acctctttac taattcaagg gtaaaatggc cttttcctga gccgatttca 4860 aagatattat catgttcatt taatcttata tttgtcatta ttttatctat attatgtttt 4920 gaagtaataa agttttgact gtgttttata tttttctcgt tcattataac cctctttaat 4980 ttggttatat gaattttgct tattaacgat tcattataac cacttatttt ttgtttggtt 5040 gataatgaac tgtgctgatt acaaaaatac taaaaatgcc catatttttt cctccttata 5100 aaattagtat aattatagca cggtcgggta cccggggatc ctctagagtc gaccatttgc 5160 acgaattcta atctttccaa ttggcatgtc catatcatca tgaataacta aaatatcttc 5220 aggcttaatt ttaaagaaat tagctacttg cgcgattgat tttcccgaat cgttcataaa 5280 agtctgtggt tcaagaaaaa ttacatcttc accgttgatc ttttgttttg tccataagcc 5340 ttcaaacttc tccttatcta gggttaaacc atttttctct aagtaatgat ctaatgccat 5400 aaaacctgta ttatgcttag tctgatcata ttttctacct ggatttccta aacctgcaat 5460 taacttcatt ctttttcatc ctctttgata aatatttcat tctaaatctg cttattgctc 5520 ttgagattat agcacacgct tacttacaaa taattaatta gatctttaaa attatatttt 5580 taatttttaa attccaatat gatataatcg ttattgttaa ataaatcact aatatggaag 5640 gaagtatctg cagatgaaga aaaatttaag aatcgttagc gctgctgctg ctgctttact 5700 tgctgttgct ccagttgctg cttctgctgt atctactgtt agcgctgcta ctactattaa 5760 cgcaagttca tcatggatta tgtacttcgt taactcaatt cgtttatggc gtcgtactca 5820 ttcatggtgg aagtcagcta ctttgccagt agttgttact gttcctaatg ttgctgagcc 5880 aactgtagcc agcgtaagca agagaattat gcacaacgca tactactacg acaaggacgc 5940 taagcgtgtt ggtactgaca gcgttaagcg ttacaactca gtaagcgtat tgccaaacac 6000 tactactatc aacggtaaga cttactacca agtagttgaa aacggtaagg ctgttgacaa 6060 gtacatcaac gctgcaaaca tcgatggtac taagcgtact ttgaagcaca acgcttacgt 6120 ttacgcatca tcaaagaagc gtgctaacaa ggttgtattg aagaagggtg aagttgtaac 6180 tacttacggt gcttcataca cattcaagaa cggccaaaag tactacaaga tcggtgacaa 6240 cactgacaag acttacgtta aggttgcaaa ctttagacac caccaccacc accactaaaa 6300 gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc 6360 cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct 6420 aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 6480 ag 6482 <210> 6 <211> 6485 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VACCINE VECTOR(pULP3-SPM2CWA) DNA <400> 6 ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 60 gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 120 cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 180 tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 240 cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 300 aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 360 cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 420 gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 480 ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 540 cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 600 aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 660 tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 720 ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 780 tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 840 ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 900 agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 960 atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 1020 cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 1080 ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat 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ccgaaaagtg 1980 ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 2040 acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag 2100 ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag 2160 ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag 2220 attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 2280 taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg 2340 cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt 2400 tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattcgag 2460 ctcccgctca tttatgggat caagctgaca cagcttgcgg gtttgggcag cgcccatggt 2520 tttattcgtg tgggatagaa atttgaaaat cagggggggc gagggagcga attttgcgac 2580 cgtactacga cccccctttt aggtgccgag tgccaacatt gagttttagt ttagcttggt 2640 cttactctct caagggatac agtcccccca gaaaaatcaa caaatcgcca acaaaatgac 2700 aacatttttc aaaaaatgcg tgtttagttg cattgaatgc gcaattatgc tactttttgt 2760 gtaatgaata attgaagggg gctaggaatt ttggaaaata aaaagagatt gacgattacg 2820 ttatcgagtc aagttcttaa atacttatcg gagactgcga aaaataaagg tctatctaaa 2880 tctgcgttga ttacagttgc actagaaaaa tacaaggaag ggcaaaatta agcacaaaaa 2940 agagcgtacc cggctaaaag ttcgctcatt cggtgcttgt tttgataagg cgattttaac 3000 attatggcta aagacaaggc aaggtacttc acctttttgc tatatccaga aagcattcct 3060 gctgattggg aacagcgttt agagttaatt ggtgtcccaa ttgcgattag tccgcttcat 3120 gatagggata agagcaatgt tgaaggacaa acatacaaga aagctcatta tcacgttatt 3180 tacgtggcga ggaatccggt tacgccggag agtgtaagaa ttaaaattaa acgattgtta 3240 ggcgacaaaa gcattgctaa ggtgcaaatt gtcattcgta gcatggaaag catgtatcta 3300 tatcttactc acgagtctaa agacgctgtt gagaagaaaa agcataagta cagcaagcat 3360 gacatttctt tgctgaacaa ttttgatatt gatcgctata ttacgcttga tgttaaagac 3420 aaagacgaca tgctgaatga tgtttgtgat ttgattgatg accataattt ggcaaatatg 3480 cgtgaactga gacgcttttt aaaagctcat ggttcagaat atggcatgcc cagtattaaa 3540 gtcgtcaatt cggttttacg tgctcatact ggactgataa ggctgtattt cgatgctgtt 3600 tatcaggaac gcaagtacgg cagaggcgat ataaacaaag agaccggtga gatacaagat 3660 taattagcga atgaaaattg ggtgctcaat tgagcgcctt ttttgttgtc ggctagccga 3720 cttctgatac aggtttttgg gggttagcac aacatagaat tcattctatg tataagtgcg 3780 cattgcttta aaaatagcaa tgaaaaaatc cgaaaaaaat gtcaaaggcg cacttacacg 3840 tcatcaaaga tgacgttgtg ctaaacccat taaaacctgt atcagatttc gctttgctca 3900 aacaaaactg acttgcgtca gttggaatct ttaaagccaa taaagtccag tcaccaactc 3960 cttcggactt tattggcttt aaagattggc tttaaatgcc cctaatttgc tctctaagcc 4020 attttagctg ttaaccgtat aatttactgt ccgtcaacgg taaatcgacg tagaacggct 4080 tttagccgtt ctaggaggct ttaaggagtt gacagactca ctagaccaag acacttttgc 4140 gcatgcaaag aaaagcacac ctgctttttt tgcctgcctc acggcgagtg cggggtgagt 4200 ttgagcggga gctcggtacc ccccttaact tacttattaa ataatttata gctattgaaa 4260 agagataaga attgttcaaa gctaatattg tttaaatcgt caattcctgc atgttttaag 4320 gaattgttaa attgattttt tgtaaatatt ttcttgtatt ctttgttaac ccatttcata 4380 acgaaataat tatacttttg tttatctttg tgtgatattc ttgatttttt tctacttaat 4440 ctgataagtg agctattcac tttaggttta ggatgaaaat attctcttgg aaccatactt 4500 aatatagaaa tatcaacttc tgccattaaa agtaatgcca atgagcgttt tgtatttaat 4560 aatcttttag caaacccgta ttccacgatt aaataaatct cattagctat actatcaaaa 4620 acaattttgc gtattatatc cgtacttatg ttataaggta tattaccata tattttatag 4680 gattggtttt taggaaattt aaactgcaat atatccttgt ttaaaacttg gaaattatcg 4740 tgatcaacaa gtttattttc tgtagttttg cataatttat ggtctatttc aatggcagtt 4800 acgaaattac acctctttac taattcaagg gtaaaatggc cttttcctga gccgatttca 4860 aagatattat catgttcatt taatcttata tttgtcatta ttttatctat attatgtttt 4920 gaagtaataa agttttgact gtgttttata tttttctcgt tcattataac cctctttaat 4980 ttggttatat gaattttgct tattaacgat tcattataac cacttatttt ttgtttggtt 5040 gataatgaac tgtgctgatt acaaaaatac taaaaatgcc catatttttt cctccttata 5100 aaattagtat aattatagca cggtcgggta cccggggatc ctctagagtc gaccatttgc 5160 acgaattcta atctttccaa ttggcatgtc catatcatca tgaataacta aaatatcttc 5220 aggcttaatt ttaaagaaat tagctacttg cgcgattgat tttcccgaat cgttcataaa 5280 agtctgtggt tcaagaaaaa ttacatcttc accgttgatc ttttgttttg tccataagcc 5340 ttcaaacttc tccttatcta gggttaaacc atttttctct aagtaatgat ctaatgccat 5400 aaaacctgta ttatgcttag tctgatcata ttttctacct ggatttccta aacctgcaat 5460 taacttcatt ctttttcatc ctctttgata aatatttcat tctaaatctg cttattgctc 5520 ttgagattat agcacacgct tacttacaaa taattaatta gatctttaaa attatatttt 5580 taatttttaa attccaatat gatataatcg ttattgttaa ataaatcact aatatggaag 5640 gaagtatctg cagatgaaga aaaatttaag aatcgttagc gctgctgctg ctgctttact 5700 tgctgttgct ccagttgctg cttctgctgt atctactgtt agcgctgcta ctactattaa 5760 cgcaagttca tcagaaactg atgctttatt aactacttca gttatgggtc gtcaagttcg 5820 tattccagtt ttaaagtcag ctactttgcc agtagttgtt actgttccta atgttgctga 5880 gccaactgta gccagcgtaa gcaagagaat tatgcacaac gcatactact acgacaagga 5940 cgctaagcgt gttggtactg acagcgttaa gcgttacaac tcagtaagcg tattgccaaa 6000 cactactact atcaacggta agacttacta ccaagtagtt gaaaacggta aggctgttga 6060 caagtacatc aacgctgcaa acatcgatgg tactaagcgt actttgaagc acaacgctta 6120 cgtttacgca tcatcaaaga agcgtgctaa caaggttgta ttgaagaagg 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atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 480 ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 540 cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 600 aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 660 tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 720 ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 780 tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 840 ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 900 agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 960 atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 1020 cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 1080 ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 1140 ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 1200 agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 1260 agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 1320 gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 1380 cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 1440 gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 1500 tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 1560 tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 1620 aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 1680 cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 1740 cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 1800 aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 1860 ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 1920 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 1980 ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 2040 acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag 2100 ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag 2160 ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag 2220 attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 2280 taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg 2340 cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt 2400 tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattcgag 2460 ctcccgctca tttatgggat caagctgaca cagcttgcgg gtttgggcag cgcccatggt 2520 tttattcgtg tgggatagaa atttgaaaat cagggggggc gagggagcga attttgcgac 2580 cgtactacga cccccctttt aggtgccgag tgccaacatt gagttttagt ttagcttggt 2640 cttactctct caagggatac agtcccccca gaaaaatcaa caaatcgcca acaaaatgac 2700 aacatttttc aaaaaatgcg tgtttagttg cattgaatgc gcaattatgc tactttttgt 2760 gtaatgaata attgaagggg gctaggaatt ttggaaaata aaaagagatt gacgattacg 2820 ttatcgagtc aagttcttaa atacttatcg gagactgcga aaaataaagg tctatctaaa 2880 tctgcgttga ttacagttgc actagaaaaa tacaaggaag ggcaaaatta agcacaaaaa 2940 agagcgtacc cggctaaaag ttcgctcatt cggtgcttgt tttgataagg cgattttaac 3000 attatggcta aagacaaggc aaggtacttc acctttttgc tatatccaga aagcattcct 3060 gctgattggg aacagcgttt agagttaatt ggtgtcccaa ttgcgattag tccgcttcat 3120 gatagggata agagcaatgt tgaaggacaa acatacaaga aagctcatta tcacgttatt 3180 tacgtggcga ggaatccggt tacgccggag agtgtaagaa ttaaaattaa acgattgtta 3240 ggcgacaaaa gcattgctaa ggtgcaaatt gtcattcgta gcatggaaag catgtatcta 3300 tatcttactc acgagtctaa agacgctgtt gagaagaaaa agcataagta cagcaagcat 3360 gacatttctt tgctgaacaa ttttgatatt gatcgctata ttacgcttga tgttaaagac 3420 aaagacgaca tgctgaatga tgtttgtgat ttgattgatg accataattt ggcaaatatg 3480 cgtgaactga gacgcttttt aaaagctcat ggttcagaat atggcatgcc cagtattaaa 3540 gtcgtcaatt cggttttacg tgctcatact ggactgataa ggctgtattt cgatgctgtt 3600 tatcaggaac gcaagtacgg cagaggcgat ataaacaaag agaccggtga gatacaagat 3660 taattagcga atgaaaattg ggtgctcaat tgagcgcctt ttttgttgtc ggctagccga 3720 cttctgatac aggtttttgg gggttagcac aacatagaat tcattctatg tataagtgcg 3780 cattgcttta aaaatagcaa 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cgtacttatg ttataaggta tattaccata tattttatag 4680 gattggtttt taggaaattt aaactgcaat atatccttgt ttaaaacttg gaaattatcg 4740 tgatcaacaa gtttattttc tgtagttttg cataatttat ggtctatttc aatggcagtt 4800 acgaaattac acctctttac taattcaagg gtaaaatggc cttttcctga gccgatttca 4860 aagatattat catgttcatt taatcttata tttgtcatta ttttatctat attatgtttt 4920 gaagtaataa agttttgact gtgttttata tttttctcgt tcattataac cctctttaat 4980 ttggttatat gaattttgct tattaacgat tcattataac cacttatttt ttgtttggtt 5040 gataatgaac tgtgctgatt acaaaaatac taaaaatgcc catatttttt cctccttata 5100 aaattagtat aattatagca cggtcgggta cccggggatc ctctagagtc gaccatttgc 5160 acgaattcta atctttccaa ttggcatgtc catatcatca tgaataacta aaatatcttc 5220 aggcttaatt ttaaagaaat tagctacttg cgcgattgat tttcccgaat cgttcataaa 5280 agtctgtggt tcaagaaaaa ttacatcttc accgttgatc ttttgttttg tccataagcc 5340 ttcaaacttc tccttatcta gggttaaacc atttttctct aagtaatgat ctaatgccat 5400 aaaacctgta ttatgcttag tctgatcata ttttctacct ggatttccta aacctgcaat 5460 taacttcatt ctttttcatc ctctttgata aatatttcat tctaaatctg cttattgctc 5520 ttgagattat agcacacgct tacttacaaa taattaatta gatctttaaa attatatttt 5580 taatttttaa attccaatat gatataatcg ttattgttaa ataaatcact aatatggaag 5640 gaagtatctg cagatgaaga aaaatttaag aatcgttagc gctgctgctg ctgctttact 5700 tgctgttgct ccagttgctg cttctgctgt atctactgtt agcgctgcta ctactattaa 5760 cgcaagttca tcacgttcag ttaacgcttc atcaggtact ggttgggctt tctacgttcg 5820 ttcaaagcat ggtgattact cagctaagtc agctactttg ccagtagttg ttactgttcc 5880 taatgttgct gagccaactg tagccagcgt aagcaagaga attatgcaca acgcatacta 5940 ctacgacaag gacgctaagc gtgttggtac tgacagcgtt aagcgttaca actcagtaag 6000 cgtattgcca aacactacta ctatcaacgg taagacttac taccaagtag ttgaaaacgg 6060 taaggctgtt gacaagtaca tcaacgctgc aaacatcgat ggtactaagc gtactttgaa 6120 gcacaacgct tacgtttacg catcatcaaa gaagcgtgct aacaaggttg tattgaagaa 6180 gggtgaagtt gtaactactt acggtgcttc atacacattc aagaacggcc aaaagtacta 6240 caagatcggt gacaacactg acaagactta cgttaaggtt gcaaacttta gacaccacca 6300 ccaccaccac taaaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 6360 atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 6420 cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 6480 gaaacctgtc gtgccag 6497

Claims (11)

1. 돼지 유행성 설사 바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 막단백질 유전자 중에서 선별된 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 PEDV의 항원 결정기.
   
2. PEDV의 막단백질 유전자 중에서 선별된 서열번호 1로 이루어지는 아미노산 서열, 서열번호 2로 이루어지는 아미노산 서열 및 서열번호 3로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 돼지 유행성 설사 바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 항원 결정기를 발현하는, PEDV 백신 제조용 표면발현 벡터.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 PEDV 백신 제조용 표면발현 벡터는, 담즙산에 의해 발현이 유도되는 유산균용 벡터 pBCEG29를 이용하는 것을 특징으로 하는, PEDV 백신 제조용 표면발현 벡터.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 PEDV 백신 제조용 표면발현 벡터는 pULP3-SPM1CWA, pULP3-SPM2CWA, 또는 pULP3-SPM3CWA인 PEDV 백신 제조용 표면발현 벡터.
   
5. 돼지 유행성 설사 바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 막단백질 유전자 중에서 선별된 서열번호 1로 이루어지는 아미노산 서열, 서열번호 2로 이루어지는 아미노산 서열 및 서열번호 3로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 PEDV의 항원결정기(M1, M2, M3)를 준비하는 단계;
   Signal sequence(SP)및 cell wall-anchoring domain(CWA) 증폭에 사용한 프라이머로, SP forward primer에 PstI 제한효소 사이트를, CWA reverse primer에는 HindⅢ 제한효소 사이트를 부착하고, 각각의 M1, M2, M3 항원결정기를 각각 SP DNA와 혼합한 후에 각각 PCR을 실시함으로써, SP와 M1, M2, M3 항원결정기가 각각 연결된 fusion gene인 SP-M1, SP-M2 및 SP-M3를 구축하는 단계; 및
   상기 SP와 M1, M2, M3 항원결정기가 각각 연결된 fusion gene인 SP-M1, SP-M2 및 SP-M3를 구축하여 선택된 상기 항원결정기를 유산균벡터 pBCEG29의 PstI-HindIII 사이트에 도입하여 각 항원결정기를 암호화하는 염기서열을 포함하는 표면발현벡터를 구축하는 단계;
   를 포함하는 담즙산에 의해 발현이 유도되는 PEDV 백신용 표면발현벡터 제조방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 PEDV 백신용 표면발현벡터는 6.5Kbp 크기의 pULP3-SPM1CWA, pULP3-SPM2CWA, 또는 pULP3-SPM3CWA인, 담즙산에 의해 발현이 유도되는 PEDV 백신용 표면발현벡터 제조방법.
   
7. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 PEDV 백신 제조용 표면발현 벡터에 의해 형질전환되며, 서열번호 1로 이루어지는 아미노산 서열, 서열번호 2로 이루어지는 아미노산 서열 및 서열번호 3로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 돼지 유행성 설사 바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 항원 결정기를 세포 표면에서 발현하는, 형질전환 유산균.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 유산균은 Lactobacillus plantarum인 형질전환 유산균.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 유산균은 형질전환된 Lactobacillus plantarum SK156(KACC 81063BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환 유산균.
   
10. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 PEDV 백신 제조용 표면발현 벡터에 의해 형질전환되며, 서열번호 1로 이루어지는 아미노산 서열, 서열번호 2로 이루어지는 아미노산 서열 및 서열번호 3로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 돼지 유행성 설사 바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 항원 결정기를 세포 표면에서 발현하는 형질전환 유산균을 유효성분으로 함유하는 PEDV 치료용 백신.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 백신은 경구용인 것을 특징으로 하는 PEDV 치료용 백신.

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