WO2022211482A1 - 바이러스 표면 엔지니어링 기반의 면역 증강된 바이러스 백신 - Google Patents

바이러스 표면 엔지니어링 기반의 면역 증강된 바이러스 백신 Download PDF

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신현진
유지훈
박정은
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Definitions

  • vaccines such as attenuated vaccines, inactivated vaccines, second-generation vaccines, subunit vaccines, toxoid vaccines, DNA, RNA, recombinant virus vaccines, etc., which are third-generation vaccines, depending on the manufacturing method.
  • Efficacy of these vaccines is very diverse, and the immunological efficacy of each type is very different.
  • subunit vaccines and virus vaccines have excellent safety, but require an immune enhancing substance or adjuvant to improve immunogenicity.
  • Adjuvants are substances that increase the immune response to antigens by inducing temporary activation of the immune system. Many vaccine companies add adjuvants to vaccines to increase vaccine efficacy.
  • the epitope of a virus is usually composed of a spike protein on the surface of the virus or a protruding protrusion, and binding of an antibody to the virus surface protein can prevent the virus from binding to the receptor of the host cell.
  • the viral surface protein has the highest immunogenicity and neutralizing ability, and is therefore the most important in viral infection.
  • a spike protein (S), a membrane protein (M), and an envelope protein (E) which are viral structural proteins, protrude from the surface of the virus.
  • the present inventors have prepared a novel linker peptide that has high affinity with other proteins and can be attached to the surface of the virus, and uses the virus surface engineering technology together with the linker peptide to introduce a novel immune enhancing material to the surface of the virus.
  • a vaccine production platform was established, and the present invention was completed by verifying the excellent antigenicity of the vaccine composition prepared using the vaccine platform.
  • One aspect provides a linker peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • linker peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; And it provides a fusion protein comprising an immune enhancing substance linked to the C-terminus of the linker peptide.
  • Another aspect is an antigen derived from an infectious virus; And it provides a vaccine composition comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • Another aspect provides a method for preventing or treating an infectious disease comprising administering the vaccine composition to a subject other than humans.
  • One aspect is to provide a linker peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the term "peptide” may refer to a linear molecule formed by bonding amino acid residues to each other by peptide bonds.
  • the peptide can be prepared according to a chemical synthesis method known in the art, in particular a solid-phase synthesis technique or a liquid-phase synthesis technique (US Patent No. 5,516,891).
  • the present inventors identified a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the biologically effective activity may indicate that the virus is connected to or bound to the surface or at least one region while maintaining the antigenicity inherent in the virus.
  • linker refers to a peptide that connects separate polypeptide regions, preferably a peptide capable of directly or indirectly linking a viral surface protein and an immune enhancing substance.
  • the linker peptide may consist of a sequence of 20 to 30 amino acids, may include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and preferably consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In addition, not only the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1, but also 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 98% or more, most specifically 99% or more of the sequence.
  • amino acid sequence showing homology any amino acid sequence that exhibits substantially the same or corresponding efficacy as the protein is included without limitation.
  • it is an amino acid sequence having such homology it will be apparent to those skilled in the art that amino acid sequences in which some sequences are deleted, modified, substituted or added are also included within the scope of the present invention.
  • the term "homology" refers to the degree of similarity between the nucleotide sequence encoding the protein or the amino acid sequence constituting the protein.
  • the homology may be expressed as a percentage according to the degree of matching with a given amino acid sequence or base sequence, for example, calculating parameters such as score, identity and similarity. It can be confirmed by comparing the sequences using standard software, specifically BLAST 2.0, or by comparing the sequences by hybridization experiments written under defined stringent conditions. (e.g., J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).
  • the linker peptide has high affinity with other proteins, and in particular, can be attached to the surface of the virus, so that it can be used for the development of a vaccine composition with improved immunogenicity compared to conventional virus vaccines by linking an immune enhancing material to the virus surface protein.
  • the linker peptide may be used, for example, to connect or bind an immune enhancing substance to a virus, a virus-derived subunit or antigen, or a virus-like particle. More specifically, the linker peptide has the ability to bind to the antigen derived from the virus and at the same time can effectively maintain the antigenicity derived from the antigen itself, thereby contributing to improving the effectiveness as a vaccine composition.
  • linker peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; And to provide a fusion protein comprising an immune enhancing substance linked to the C-terminus of the linker peptide.
  • immune enhancing substance refers to a substance capable of assisting an immunogen in the formation of an immune response, which increases the biological or immunological half-life of an antigen; improved antigen delivery to antigen presenting sequences; improvement of antigen processing and presentation by antigen presenting cells; and one or more mechanisms including induction of production of immunomodulatory cytokines.
  • the immune enhancing substance is not particularly limited, but aluminum hydroxide, aluminum phosphate or other aluminum salts, calcium phosphate, DNA CpG motif, monophosphoryl lipid A, cholera toxin, E. coli heat inactivated toxin, pertussis toxin, muramyl dipeptide , Freund's incomplete adjuvant, MF59, SAF, immunostimulatory complexes, liposomes, biodegradable microspheres, saponins, nonionic block copolymers, muramyl peptide analogues, polyphosphazenes, synthetic polynucleotides, Fc region of antibodies, flagellin (flagellin), IFN- ⁇ , IL-2 (interleukin-2) or IL-12 (interleukin-12), etc. may be used alone or two or more types, preferably the Fc region of the antibody, flagellin and At least one selected from the group consisting of IL-2 (interleukin-2) may be used.
  • the N-terminus of the linker peptide in the fusion protein may bind to a viral surface protein, and the C-terminus of the linker peptide may bind to an immune enhancing substance.
  • the linker peptide may be arranged in the order of (viral surface protein)-(linker peptide)-(immune enhancing substance), thereby improving the immunogenicity of the virus.
  • an antigen peptide capable of inducing a vaccine response against various viruses such as PEDV, PRRSV and SARS-CoV-2 and an immune enhancing material for effectively inducing the formation of an antibody of the antigen peptide, Fc-derived from IgG
  • the linker peptide may be used in compositions and methods for preventing or treating infectious diseases caused by virus infection.
  • Another aspect is to provide a polynucleotide encoding the fusion protein, or a recombinant vector comprising the polynucleotide.
  • polynucleotide is a polymer material to which nucleotides are bound, and refers to DNA encoding genetic information.
  • the nucleotide sequence constituting the polynucleotide encoding the linker peptide includes not only the nucleotide sequence encoding the amino acid set forth in SEQ ID NO: 1, but also 80% or more, specifically 90% or more, and more specifically, the sequence A nucleotide sequence that exhibits 95% or more, more specifically 98% or more, and most specifically 99% or more homology, and a nucleotide sequence constituting a polynucleotide encoding a protein that exhibits substantially the same or corresponding efficacy as each protein. includes without limitation.
  • the polynucleotide encoding the linker peptide does not change the amino acid sequence of the protein expressed from the coding region in consideration of the codon preferred in the organism to which the protein is to be expressed due to codon degeneracy.
  • the polynucleotide may be included without limitation as long as it is a nucleotide sequence encoding each protein.
  • a probe that can be prepared from a known sequence for example, a sequence encoding a protein having the same activity as the protein by hybridization under stringent conditions with a sequence complementary to all or part of the polynucleotide sequence, is limited may be included without
  • stringent conditions means conditions that allow specific hybridization between polynucleotides. These conditions are specifically described in the literature (eg, J. Sambrook et al., supra). For example, genes having high homology between genes having homology of 40% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, still more specifically 97% or more, and particularly specifically 99% or more homology. Conditions that hybridize with each other and do not hybridize with genes with lower homology, or wash conditions of normal Southern hybridization at 60° C. 1XSSC, 0.1% SDS, specifically 60° C. 0.1XSSC, 0.1% SDS, more specifically As examples, the conditions of washing once, specifically 2 to 3 times, at a salt concentration and temperature equivalent to 68° C. 0.1XSSC, 0.1% SDS can be exemplified.
  • Hybridization requires that two polynucleotides have complementary sequences, although mismatch between bases is possible depending on the stringency of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine. Accordingly, the present disclosure may also encompass substantially similar polynucleotide sequences as well as isolated polynucleotide fragments complementary to the overall sequence.
  • polynucleotides having homology can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55° C. and using the conditions described above.
  • the Tm value may be 60° C., 63° C. or 65° C., but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
  • the appropriate stringency for hybridizing polynucleotides depends on the length and degree of complementarity of the polynucleotides, and the parameters are well known in the art.
  • the term "vector” refers to a vector capable of expressing a target protein in a suitable host cell, and refers to a genetic construct comprising regulatory elements operably linked to express a gene insert.
  • a vector may include expression control elements such as a promoter, an operator, a start codon, a stop codon, a polyadenylation signal, and/or an enhancer, and the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the vector may be an expression vector capable of stably expressing the fusion protein in a host cell.
  • the expression vector may be a conventional vector used to express a foreign protein in plants, animals, or microorganisms in the art.
  • the recombinant vector can be constructed through various methods known in the art.
  • the vector may include a selectable marker for selecting host cells containing the vector, and in the case of a replicable vector, it may include an origin of replication.
  • the vector comprises a promoter operable in an animal cell, for example a mammalian cell.
  • suitable promoters include a promoter derived from a mammalian virus and a promoter derived from a genome of a mammalian cell, for example, a Cytomegalovirus (CMV) promoter, a U6 promoter and an H1 promoter, and a Murine Leukemia Virus (MLV) LTR.
  • (Long terminal repeat) promoter adenovirus early promoter, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, HSV tk promoter, RSV promoter, EF1 alpha promoter, metallotionine promoter, beta-actin promoter, Promoter of human IL-2 gene, promoter of human IFN gene, promoter of human IL-4 gene, promoter of human lymphotoxin gene, promoter of human GM-CSF gene, human phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, mouse phosphatase a phosphoglycerate kinase (PGK) promoter and a Survivin promoter.
  • PGK phosphoglycerate kinase
  • PGK mouse phosphatase a phosphoglycerate kinase
  • the polynucleotide sequence encoding the above-described fusion protein may be operably linked to a promoter.
  • operably linked refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (eg, a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby The regulatory sequence will regulate the transcription and/or translation of the other nucleic acid sequence.
  • Another aspect is to provide a host cell transformed with the recombinant vector.
  • transformation refers to the genetic character of a cell by allowing a DNA chain fragment or plasmid having a foreign gene different from that of the original cell to penetrate between the cells and combine with the DNA present in the original cell. It means a molecular biological technology to change the.
  • transformation is encoding (coding) a fusion protein comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 and an immune enhancing substance linked to the C-terminus of the amino acid sequence It means that a polynucleotide is inserted into a host cell to produce it.
  • the host cell is preferably any one selected from the group consisting of microorganisms such as bacteria ( E. Coli) or yeast, CHO cells, F2N cells, and HEK293 cells, but is not limited thereto.
  • microorganisms such as bacteria ( E. Coli) or yeast, CHO cells, F2N cells, and HEK293 cells, but is not limited thereto.
  • Another aspect is an antigen derived from an infectious virus; And to provide a vaccine composition comprising a fusion protein comprising a linker peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and an immune enhancing substance linked to the C-terminus of the linker peptide.
  • the term "vaccine” refers to a biological agent containing an antigen that gives immunity to a living body, and refers to an immunogen or antigenic substance that induces immunity in a living body by injecting or orally administering to a person or animal for the prevention of infection.
  • In vivo immunity is largely divided into automatic immunity, which is obtained automatically after infection with a pathogen, and passive immunity, which is obtained by an externally injected vaccine. While autoimmunity has a long period of generation of immunity-related antibodies and has the characteristics of continuous immunity, passive immunity by vaccine works immediately to treat infections, but has a disadvantage in that it has poor durability.
  • the vaccine may be used interchangeably with the term "immunogenic composition", for example, it may be an immunogenic composition for infection of porcine epidemic diarrhea virus or porcine reproductive and respiratory syndrome virus, but is not limited thereto. .
  • the term "immunogen” or "antigenic substance” refers to a peptide, a polypeptide, a lactic acid bacterium expressing the polypeptide derived from the virus, a protein, a lactic acid bacterium expressing the protein, an oligonucleotide, a polynucleotide, and a recombinant virus. It may be any one selected from the group.
  • the antigenic material may be in the form of an inactivated whole or partial virus preparation, or in the form of an antigenic molecule obtained by conventional protein purification, genetic engineering technique, or chemical synthesis.
  • the virus is not particularly limited, but may be an RNA-type virus or a DNA-type virus.
  • the RNA virus is a generic term for viruses that have RNA as a gene, and includes (+)-stranded RNA that becomes mRNA, (-)-stranded RNA of complementary chain, and double-stranded RNA as genes in virus particles, and only one molecule of RNA There are viruses (coronavirus, paramyxovirus) that have two identical RNA molecules (retrovirus), and viruses that have eight different RNA molecules as their genes (influenza virus). Usually, there is an RNA synthetase (DNA synthetase in the case of retroviruses) using RNA as a template.
  • RNA synthetase DNA synthetase in the case of retroviruses
  • DNA viruses are classified as circular DNA viruses or linear DNA viruses according to the shape of their genes.
  • Linear DNA viruses include parvoviruses with single-stranded linear DNA in viral particles, adenoviruses with double-stranded linear DNA, herpesviruses, and poxviruses. Most of them have a special repeating arrangement at the end of the genome, and each exhibits unique infection and proliferation patterns due to differences in genome structure or size.
  • DNA viruses with circular DNA molecules as their genomes are largely classified into two families.
  • Hepadnavi-ridae which has a double-stranded closed-loop DNA molecule as its genome (polyomavirus, SV40, papilloma virus, etc.) ) viruses (hepatitis B virus, Woodchuck hepatitis virus, etc.).
  • the virus capable of binding the linker peptide to the surface protein is not particularly limited, and may include both RNA-type viruses and DNA-type viruses as described above.
  • the antigen derived from the infectious virus is porcine epidemic diarrhea virus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, dengue virus, Japanese encephalitis virus ), Zika virus, Ebola virus, Rotavirus, Dengue virus, West Nile virus, Yellow fever virus, Adenovirus ), BK virus, Smallpox virus, Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus Herpes simplex virus, Epstein-Barr virus, Hepatitis A virus, Hepatitis B virus, Hepatitis C virus, Hepatitis D virus, Hepatitis E virus, It may be an antigen derived from Hantan virus, or Cytomegalovirus, but is not limited thereto.
  • the vaccine composition may be a live attenuated vaccine, an inactivated vaccine, a subunit vaccine, or a virus like particle vaccine.
  • virus-like particle may refer to a non-infectious viral subunit with or without a viral protein.
  • the virus-like particle may mean a recombinant protein having a shape similar to a virus, and the virus-like particle self-assembles into a shape similar to an actual virus through binding between structural proteins of the virus. ), but in the assembly process, the virus gene may not be included in the virus-like particle.
  • Virus-like particles having the above characteristics have a shape very similar to an actual virus, and thus can exhibit high immunogenicity when injected into the body, and can act as a safe antigen that cannot be propagated in the body because it does not contain a virus gene.
  • the virus-like particle may comprise a spike protein, a membrane protein, an envelope protein and a nucleocapsid protein of a virus, such as a coronavirus.
  • the spike protein is present on the surface of the virus and is a structural protein in the form of a club-shaped projection.
  • the protein is known to bind to the glycoprotein receptor of the host cell, which can cause the fusion of the cell membrane and the viral outer membrane, and the production of neutralizing antibodies.
  • the nucleocapsid protein is present inside the envelope and is known to be involved in cellular immune responses.
  • the vaccine composition may further comprise a pharmaceutically acceptable excipient, diluent or carrier.
  • a pharmaceutically acceptable excipient, diluent or carrier may mean an excipient, diluent or carrier that does not inhibit the biological activity and properties of the injected compound without irritating the organism.
  • pharmaceutically acceptable means that it does not inhibit the activity of the active ingredient and does not have toxicity beyond what the application (prescription) target can adapt.
  • Suitable carriers for vaccines are known to those skilled in the art and include, but are not limited to, proteins, sugars, and the like. Such carriers may be aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions.
  • a regular or atypical organic or inorganic polymer may be used as an adjuvant for increasing immunogenicity.
  • Adjuvants are generally known to promote immune responses through chemical and physical binding to antigens.
  • an adjuvant an atypical aluminum gel, an oil emulsion, or a double oil emulsion and an immunosol may be used.
  • the immune composition as described above may be used as a composition for inducing an optimal immune response by a combination of various adjuvants and immune response promoting additives.
  • a stabilizer, an inactivating agent, an antibiotic, a preservative, and the like may be used as the composition to be added to the vaccine.
  • the vaccine antigen may be mixed with distilled water or a buffer solution.
  • the vaccine composition is formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories or unit dosage ampoules, or injections in multiple dosage forms, respectively, according to a conventional method.
  • oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc.
  • external preparations suppositories or unit dosage ampoules, or injections in multiple dosage forms, respectively, according to a conventional method.
  • a diluent or excipient such as a generally used filler, extender, binder, wetting agent, disintegrant, or surfactant.
  • the vaccine composition When the vaccine composition is prepared for parenteral use, it may be formulated in the form of injections, transdermal administrations, nasal inhalants and suppositories together with suitable carriers according to methods known in the art.
  • suitable carriers include sterile water, ethanol, polyols such as glycerol or propylene glycol, or mixtures thereof, preferably Ringer's solution, PBS (phosphate buffered saline) containing triethanolamine, or sterilization for injection. Water, an isotonic solution such as 5% dextrose, etc. can be used.
  • formulated for transdermal administration it may be formulated in the form of an ointment, a cream, a lotion, a gel, an external solution, a pasta agent, a liniment agent, an air roll, and the like.
  • a suitable propellant such as dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide, and the like.
  • tween 61 polyethylene glycols, cacao fat, laurin fat, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene stearate, sorbitan fatty acid esters, etc. may be used.
  • the route of administration of the vaccine composition may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue, and specifically, the vaccine composition is for intramuscular administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, oral administration , may be selected from the group consisting of compositions for dermal administration, ocular administration, and intracerebral administration.
  • the vaccine composition may be administered in a pharmaceutically effective amount, and the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat or prevent a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment or prevention, , the effective dose level depends on the severity of the disease, the activity of the drug, the patient's age, weight, health, sex, the patient's sensitivity to the drug, the time of administration of the composition of the present invention used, the route of administration and the rate of excretion, the duration of treatment, and the present It can be determined according to factors including drugs used in combination with or concomitantly with the composition of the invention and other factors well known in the medical field.
  • the vaccine composition may be administered alone or in combination with a component known to exhibit a prophylactic or therapeutic effect on a known infectious disease. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects.
  • the dosage of the vaccine composition can be determined by those skilled in the art in consideration of the purpose of use, the degree of addiction of the disease, the patient's age, weight, sex, history, or the type of substance used as an active ingredient.
  • the vaccine composition of the present invention may be administered in an amount of about 0.1 ng to about 1,000 mg/kg, preferably, 1 ng to about 100 mg/kg per adult, and the administration frequency of the composition of the present invention is particularly limited thereto. Although not limited, it may be administered once a day or administered several times in divided doses. The dosage or frequency of administration is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • Another aspect provides a method for preventing or treating an infectious disease comprising administering the vaccine composition to a subject.
  • the same parts as those described above are equally applied to the above method.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays infection of an infectious disease and the onset of the infectious disease due to the administration of the vaccine composition.
  • treatment refers to any action in which the symptoms of a disease already caused by infection of an infectious disease are improved or beneficial due to the administration of the vaccine composition.
  • infectious disease refers to a viral infectious disease, preferably a disease caused by viral infection, but is not limited thereto.
  • the subject is a mammal, aquaculture, including cattle, horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, dogs, cats, rats, livestock, humans, etc., which develop or are at risk of developing viral infections and diseases caused by the infections. It may include, without limitation, fish and the like.
  • the term "administration" means introducing a predetermined substance to an individual by an appropriate method, and the administration route of the vaccine composition of the present invention may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • Intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration may be administered intrarectally, but is not limited thereto.
  • the protein is digestible, so it is preferred that the oral composition be formulated to coat the active agent or to protect it from degradation in the stomach.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device capable of transporting the active agent to a target cell.
  • the vaccine composition may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. and may be administered single or multiple. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the linker peptide has a property of being able to attach to a virus, and thus it can be used as a linker that can effectively bind an immune enhancing substance that activates the immune system to the surface of the virus to improve the immunogenicity of the vaccine.
  • an immune enhancing material can be attached to the virus surface, which can be usefully used as an immune-enhanced vaccine platform.
  • VES peptide linker peptide
  • Figure 2 confirms the binding activity of the linker peptide to the viral surface according to an aspect
  • Fig. 2A schematically shows the antigen-antibody complex formation and detection thereof for evaluating the adhesion activity to the viral surface
  • Fig. 2B is a diagram showing quantitatively the result of evaluating the adhesion activity to the virus surface.
  • VSE-hFc recombinant proteins
  • VSE-sFc recombinant proteins
  • Figure 4 confirms the adhesion activity of the recombinant protein to the viral surface according to an aspect
  • Figure 4 A schematically shows the antigen-antibody complex formation and detection thereof for evaluating the adhesion activity to the viral surface
  • Figure 4B is a diagram showing quantitatively the result of evaluating the adhesion activity to the virus surface.
  • FIG. 5 is a diagram schematically illustrating a process for preparing a recombinant antigen (PEDV-VSE-sFc) according to an aspect.
  • FIG. 8 is a diagram schematically illustrating a process for preparing a recombinant antigen (DENV-VSE-hFc) according to an aspect.
  • 13 is a result of confirming the level of neutralizing antibody present in the serum of the animal model after administration of PEDV-Fc according to an aspect to the animal model.
  • a linker peptide having an effective binding ability with a virus surface or virus-derived antigen was derived and prepared.
  • the amino acid sequence of the linker peptide and the polynucleotide sequence encoding the same are shown in Table 1 below.
  • VSE polynucleotide after cloning the VSE polynucleotide into pcDNA3.1-Myc-His vector, which is an expression vector of eukaryotic cells, it was expressed in CHO cells, and purified using Myc tag, as shown in FIG. 1 , VSE The peptide was obtained.
  • the negative control group had a very low level of detection of labeled HRP, whereas the group using the VES peptide according to an aspect was detected at a similar level to the positive control group.
  • Example 3 Confirmation of adhesion activity of immune enhancing material to virus surface
  • VES peptide and human Fc VSE-hFc
  • VSE-sFc swine Fc
  • pcDNA3.1-Myc-His vector which is a eukaryotic expression vector
  • VSE-hFc or VSE-sFc a recombinant protein containing an immune enhancing substance
  • porcine epidemic diarrhea virus PEDV
  • porcine reproductive and respiratory syndrome virus PRRSV
  • dengue virus DEV
  • JEV Japanese encephalitis virus
  • ZIKV Zika virus
  • PEDV porcine epidemic diarrhea virus
  • PRRSV porcine reproductive and respiratory syndrome virus
  • DEV dengue virus
  • JEV Japanese encephalitis virus
  • ZIKV Zika virus
  • HRP horseradish peroxidase-labeled anti-IgG antibody was added to induce a reaction, and the HRP level was quantitatively detected to evaluate the adhesion activity to the virus surface (FIG. 4A).
  • a negative control group was set as a group using Scrambled peptide
  • a positive control group was set as a group using mouse serum immunized with each virus.
  • the negative control group had a very low detection level of labeled HRP
  • the group (VSE-hFc, VSE-sFc) using the VES peptide according to an aspect had a similar level to the positive control group.
  • the VES peptide according to an aspect can contribute to improving the efficacy of a vaccine formulation including a viral antigen by attaching or binding an immune enhancing substance to the viral surface.
  • Example 4 Confirmation of immune response enhancing effect through virus surface engineering
  • a recombinant antigen was prepared by attaching/binding VSE-sFc to the virus surface, and then, using a mouse model, it was attempted to confirm the immune response enhancing effect of the recombinant antigen.
  • Example 5 Confirmation of immune response enhancing effect against virus-derived antigen
  • a recombinant antigen comprising a protein derived from spike protein S1 of PEDV as an antigen capable of inducing a vaccine response to PEDV, and an Fc-derived protein of IgG as an immune enhancing material for enhancing antibody formation, using VSE peptide 4 was prepared in the same way. In addition, it was expressed in CHO cells to obtain PEDV-Fc, a recombinant antigen containing an immune enhancing substance, as shown in FIG. 11 .
  • the amino acid sequence of the protein derived from the VSE peptide-Fc used in the recombinant antigen (PEDV-Fc) is shown in Table 4 below.
  • the recombinant antigen according to one embodiment showed a higher level of IgG titer than the control group in the serum and colostrum of sows, and the neutralizing antibody in the serum also showed the same tendency as above. seemed
  • a recombinant antigen comprising the GP5 protein of PRRSV as an antigen capable of inducing a vaccine response to PRRSV, and an Fc-derived protein of IgG as an immune enhancing material for enhancing antibody formation, using VSE peptide, the same as in Example 4 made in this way.
  • VSE peptide the same as in Example 4 made in this way.
  • it was expressed in CHO cells and Marc 145 cells to obtain PRRSV-Fc, a recombinant antigen containing an immune enhancing substance, as shown in FIG. 14 .
  • the amino acid sequence of the protein derived from the VSE peptide-Fc used in the recombinant antigen (PRRSV-Fc) is shown in Table 5 below.
  • the recombinant antigen according to an embodiment showed a higher level of IgG titer than the control group in both serum and colostrum of sows.
  • the vaccine composition according to an embodiment has increased immunogenicity, thereby maximizing the efficacy of the vaccine.

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Abstract

바이러스 표면 엔지니어링 기반의 면역 증강된 바이러스 백신에 관한 것이다. 일 양상에 따른 링커 펩티드는 바이러스에 부착될 수 있는 특성을 가져, 면역체계를 활성화시키는 면역 증강 물질을 바이러스 표면에 효과적으로 결합시킬 수 있는 링커로서 사용되어 백신의 면역원성을 향상시킬 수 있다. 상기 링커 펩티드를 바이러스 표면 엔지니어링 기술에 접목시키면 바이러스 표면에 면역 증강 물질을 부착할 수 있어, 면역 증강된 백신 플랫폼으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

바이러스 표면 엔지니어링 기반의 면역 증강된 바이러스 백신
바이러스 표면 엔지니어링 기반의 면역 증강된 바이러스 백신에 관한 것이다. 본 출원은 2021년 3월 31일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2021-0042027호, 2021년 10월 26일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2021-0143999호를 우선권으로 주장하고, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
해외 여행의 증가로 열대-아열대 지역에서 만연하고 있는 풍토병 질환들의 국내 유입이 증가하고, 특히 뎅기열이나 신종 코로나 바이러스와 같은 해외유입 전염병으로 인해 전세계적으로 연간 수억명의 환자가 발생하고 있다. 사람뿐만 아니라, 동물에서도 구제역, 아프리카 돼지 열병과 같은 한국내 자생 질병 및 해외에서 유입된 전염병으로 인해 경제적 피해가 막심하여 국가 경제에 악영향을 미치고 있다. 이러한 바이러스성 질병을 예방하기 위해서는 백신 개발이 무엇보다 가장 중요하며, 이는 많은 시간과 비용이 소요되기 때문에 보다 효율적으로, 높은 효과를 갖는 백신 제조 플랫폼의 개발이 매우 중요하다.
통상적으로, 백신에는 제조방법에 따라 1세대 백신인 약독화 백신, 불활성화 백신, 2세대 백신인 아단위 백신, 톡소이드 백신, 3세대 백신인 DNA, RNA, 재조합 바이러스 백신 등 다양한 형태가 존재한다. 이들 백신의 효능은 매우 다양하며, 각 형태별 면역활성 효능이 매우 다르게 나타난다. 예를 들어, 아단위 백신, 바이러스 백신은 안전성이 우수한 반면 면역원성을 향상시키기 위해서는 면역 증강 물질 또는 어쥬번트(adjuvant)가 필요하다. 어쥬번트는 면역체계의 일시적 활성화를 유도해 항원에 대한 면역반응을 증가시키는 물질로, 많은 백신 회사들은 백신 제조 시 어쥬번트를 첨가하여 백신 효능을 증가시킨다. 그러나, 특정 어쥬번트의 경우 백신의 면역 반응을 너무 심하게 일어나게 하여 알러지 반응과 같은 부작용을 유발하는 경우가 있다. 따라서, 백신의 효능을 극대화할 수 있으면서도 어쥬번트 사용에 따른 부작용을 최소화하고, 나아가 방법론적으로 간단하여 백신 제조 공정을 단축시킬 수 있는 새로운 백신 제조 기술이 필요한 실정이다. 이를 위해서는 기존 바이러스 백신 개발이 가지고 있는 단점을 해결할 수 있는, 근본적으로 새로운 바이러스 백신 개발 플랫폼의 구축이 요구된다.
한편, 바이러스의 항원결정기(epitope)는 대개 바이러스 표면의 스파이크 단백질이나 외부로 튀어나온 돌기로 구성되어 있으며, 바이러스 표면 단백질에 항체가 결합하면 바이러스가 숙주세포의 수용체에 결합하는 것을 방해할 수 있다. 상기 바이러스 표면 단백질은 면역원성 및 중화능이 가장 높아 바이러스 감염에서 가장 중요하다. 예를 들어, 코로나 바이러스의 경우 바이러스 표면에는 바이러스 구조 단백질인 스파이크 단백질(spike protein, S), 막 단백질(membrane protein, M) 및 외피 단백질(envelope protein, E)이 돌출되어 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 다른 단백질과 친화성이 높으며 바이러스 표면에 부착될 수 있는 신규 링커 펩티드를 제조하고, 상기 링커 펩티드와 함께 바이러스 표면 엔지니어링 기술을 이용하여 면역 증강 물질을 바이러스 표면에 도입하는 새로운 백신 제조 플랫폼을 구축하였으며, 상기 백신 플랫폼을 이용하여 제조된 백신 조성물의 우수한 항원성을 검증하여 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 링커 펩티드를 제공한다.
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 링커 펩티드; 및 상기 링커 펩티드의 C-말단에 연결된 면역 증강 물질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
다른 양상은 감염성 바이러스 유래 항원; 및 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 감염성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 링커 펩티드를 제공하는 것이다.
본 명세서에서 용어, "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미할 수 있다. 상기 펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술 또는 액상 합성 기술 (US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다. 본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 펩티드를 개발하고자 예의 노력한 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 규명하였다. 여기서, 생물학적으로 유효한 활성은 바이러스 고유의 항원성은 유지한 상태로, 바이러스의 표면 또는 적어도 어느 하나의 영역에 연결 또는 결합되는 것을 나타내는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "링커(linker)" 또는 "링커 펩티드(linker peptide)"는 별개의 폴리펩티드 영역을 연결하는 펩티드로서, 바람직하게는 바이러스 표면 단백질과 면역 증강 물질을 직접 또는 간접적으로 연결할 수 있는 펩티드를 의미한다.
상기 링커 펩티드는 20 내지 30개의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 1로 구성된 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 제한 없이 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 당업자에게 자명하다.
본 명세서에서, 용어 "상동성"이란 단백질을 암호화하는 염기 서열이나 단백질을 구성하는 아미노산 서열의 유사한 정도를 의미하는데, 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물 및 단백질은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 상기 상동성은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도에 따라 백분율로 표시될 수 있고, 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건(stringent condition)하에서 썼던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor,New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
상기 링커 펩티드는 다른 단백질들과 친화성이 높으며, 특히, 바이러스 표면에 부착될 수 있어 바이러스 표면 단백질에 대하여 면역 증강 물질을 연결시켜 기존의 바이러스 백신보다 면역원성이 향상된 백신 조성물의 개발에 사용될 수 있다. 상기 링커 펩티드는 예를 들어, 바이러스, 바이러스 유래 서브 유닛 또는 항원, 바이러스 유사 입자에 면역 증강 물질을 연결 또는 결합시키기 위하여 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 링커 펩티드는 바이러스 유래 항원과의 결합능을 지님과 동시에 항원 자체로부터 비롯되는 항원성은 유효하게 유지시킬 수 있는 바, 백신 조성물로서의 효용성을 향상시키는데 기여할 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 링커 펩티드; 및 상기 링커 펩티드의 C-말단에 연결된 면역 증강 물질을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.
상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 융합 단백질에도 공히 적용된다.
본 명세서에서 용어 "면역 증강 물질" 또는 "어쥬번트(adjuvant)"는 면역반응 형성에서 면역원을 보조할 수 있는 물질로, 항원의 생물학적 또는 면역학적 반감기 증가; 항원 제공 서열로의 항원 전달 개선; 항원 제공 세포에 의한 항원 프로세싱 및 제공의 개선; 및 면역 조절성 사이토카인의 생산 유도를 포함하는 하나 이상의 기작과 같은 여러 기작을 통해 작용할 수 있다.
상기 면역 증강 물질은 특별히 제한되지는 않으나, 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 기타 다른 알루미늄 염, 인산칼슘, DNA CpG 모티프, 모노포스포릴 지질 A, 콜레라 독소, 대장균 열불활화 독소, 백일해 독소, 뮤라밀 디펩티드, 프로인트 불완전 어쥬반트, MF59, SAF, 면역자극성 복합체, 리포좀, 생체분해성 미소구, 사포닌, 비이온성 블록 공중합체, 뮤라밀 펩티드 유사체, 폴리포스파젠, 합성 폴리뉴클레오티드, 항체의 Fc 영역, 플라젤린(flagellin), IFN-γ, IL-2(interleukin-2) 또는 IL-12(interleukin-12) 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으며, 바람직하게는 항체의 Fc 영역, 플라젤린(flagellin) 및 IL-2(interleukin-2)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 융합 단백질 내 링커 펩티드의 N-말단은 바이러스 표면 단백질에 결합하는 것일 수 있고, 링커 펩티드의 C-말단은 면역 증강 물질에 결합하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 링커 펩티드는 (바이러스 표면 단백질)-(링커 펩티드)-(면역 증강 물질)의 순서로 배열될 수 있으며, 이를 통해, 바이러스의 면역원성을 향상시킬 수 있다.
일 실시예에 따르면, PEDV, PRRSV 및 SARS-CoV-2 등 다양한 바이러스를 대상으로 백신 반응을 유도할 수 있는 항원 펩티드 및 상기 항원 펩티드의 항체 형성을 효과적으로 유도하기 위한 면역 증강 물질로서 IgG의 Fc 유래 단백질을 사용하여, 일 양상에 따른 링커 펩티드에 의해 바이러스 표면에 면역 증강 물질이 부착된 백신 조성물의 증가된 면역원성을 확인하였다. 따라서, 상기 링커 펩티드는 바이러스의 감염에 의해 유발되는 감염성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물 및 방법 등에 이용될 수 있다.
다른 양상은 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 명세서에서의 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드가 결합한 고분자 물질로서, 유전 정보를 코딩하고 있는 DNA를 의미한다.
본 발명에서 상기 링커 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기 서열은 서열번호 1로 기재한 아미노산을 코딩하는 염기 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기 서열이라면 제한 없이 포함한다.
또한, 상기 링커 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 각 단백질들을 암호화하는 염기 서열이면 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 공지의 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 상기 단백질과 동일한 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃ 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃ 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃ 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 명세서는 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 지칭한다. 일 실시예에 따른 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 및/또는 인핸서와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있으며, 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 상기 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 융합 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 벡터를 함유 하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우, 복제 기원을 포함할 수 있다.
상기 벡터는 동물세포, 예를 들어, 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터를 포함한다. 일 실시예에 따라 적합한 프로모터는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (Cytomegalovirus) 프로모터, U6 프로모터 및 H1 프로모터, MLV(Murine Leukemia Virus) LTR(Long terminal repeat) 프로모터, 아데노바이러스 초기 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 마우스 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터 및 설바이빈 (Survivin) 프로모터를 포함할 수 있다.
또한, 상기 벡터에서, 전술한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
다른 양상은 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 명세서에서 용어, "형질전환”은, 본래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 외래 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합함으로써 세포의 유전형질을 변화시키는 분자생물학적 기술을 의미한다. 본 발명의 목적상 형질전환은 상기 서열번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열의 C-말단에 연결된 면역 증강 물질을 포함하는 융합 단백질을 암호화(코딩)하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내로 삽입되어 이를 생산하는 것을 의미한다.
상기 숙주세포는 바람직하게는 박테리아 (E.Coli)나 효모 (Yeast)등의 미생물, CHO 세포, F2N 세포, 및 HEK293 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양상은 감염성 바이러스 유래 항원; 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 링커 펩티드 및 상기 링커 펩티드의 C-말단에 연결된 면역 증강 물질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 백신 조성물에도 공히 적용된다.
본 명세서에서 용어, "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동면역이 면역에 관계하는 항체의 생성 기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다. 상기 백신은 용어, "면역원성 조성물"과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 예를 들어, 돼지 유행성 설사병 바이러스, 또는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 감염증에 대한 면역원성 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어, "면역원" 또는 "항원성 물질"은 상기 바이러스 유래의 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 단백질, 상기 단백질을 발현하는 유산균, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 및 재조합 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 구체적인 예를 들면, 상기 항원 물질은 불활성화된 전체 또는 부분 바이러스 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 바이러스는 특별히 제한되지 않으나, RNA형 바이러스 또는 DNA형 바이러스일 수 있다.
상기 RNA 바이러스는 RNA를 유전자로 갖고 있는 바이러스의 총칭으로서 mRNA가 되는 (+)사슬 RNA, 상보사슬의 (-)사슬 RNA, 이중가닥 RNA를 바이러스 입자내 유전자로서 갖는 것이 있고, 1분자의 RNA만을 갖는 바이러스(코로나바이러스, 파라믹소바이러스), 동종의 RNA분자를 2개 갖는 바이러스(레트로바이러스), 8개의 다른 RNA분자를 유전자로 삼는 바이러스(인플루엔자바이러스) 등이 있다. 보통 RNA를 주형으로 하는 RNA합성효소(레트로바이러스의 경우에는 DNA 합성효소)가 존재한다.
DNA 바이러스는 유전자의 형상에 따라 환형 DNA 바이러스 또는 선형 DNA 바이러스로 분류한다. 선형 DNA 바이러스에 속하는 것으로는 바이러스 입자에 외가닥 선형 DNA가 있는 파보바이러스와 2중 가닥 사슬선형 DNA가 있는 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스 등이 있다. 대부분은 유전체 말단에 특수한 반복배열이 있고, 유전체 구조나 크기의 차이에 의해 각각 고유한 감염, 증식양식을 나타낸다. 환형 DNA 분자를 유전체로 갖고 있는 DNA 바이러스는 크게 2개 바이러스과로 분류된다. 즉, 이중나선 닫힌고리형 DNA 분자를 유전체로 갖는 파포바이러스과 바이러스(폴리오마바이러스, SV40, 파필로마 바이러스 등)와 외가닥부분을 포함한 이중나선 고리형 DNA 분자를 유전체로 하는 헤파드나바이러스과(Hepadnavi-ridae) 바이러스(B형 간염바이러스, 우드척(Woodchuck) 간염 바이러스 등)이다.
본 명세서에서, 상기 링커 펩티드가 표면 단백질과 결합할 수 있는 바이러스는 특별히 제한되지는 않으며, 상기와 같은 RNA형 바이러스 또는 DNA형 바이러스를 모두 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 감염성 바이러스 유래 항원은 돼지 유행성 설사병 바이러스 (Porcine epidemic diarrhea virus), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 댕기열 바이러스 (Dengue virus), 일본 뇌염 바이러스 (Japanese encephalitis virus), 지카바이러스 (Zika virus), 에볼라　바이러스 (Ebola virus), 로타바이러스 (Rotavirus), 댕기열 바이러스 (Dengue virus), 웨스트 나일　바이러스 (West Nile virus), 황열 바이러스 (Yellow fever virus), 아데노바이러스 (Adenovirus), BK　바이러스 (BK virus), 천연두　바이러스 (Smallpox virus), 중증 열성 혈소판 감소 증후군　바이러스　(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus) 단순 포진 바이러스 (Herpes simplex virus), 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus), A형 간염 바이러스 (Hepatitis A virus), B형 간염 바이러스 (Hepatitis B virus), C형 간염 바이러스 (Hepatitis C virus), D형 간염 바이러스 (Hepatitis D virus), E형 간염 바이러스 (Hepatitis E virus), 한탄 바이러스(Hantan virus), 또는 거대 세포 바이러스 (Cytomegalovirus) 유래 항원일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 백신 조성물은 약독화 생백신 (Live attenuated vaccine), 불활화 백신(Inactivated vaccine), 서브 유닛 백신(Subunit vaccine), 또는 바이러스 유사입자 백신 (Virus like Particle vaccine)일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "바이러스 유사 입자(Virus-Like Particle, VLP)"는 바이러스성 단백질을 수반하거나 수반하지 않는 비감염성 바이러스성 소단위체를 의미하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 바이러스 유사 입자는 바이러스와 유사한 형태를 띠고 있는 재조합 단백질을 의미하는 것일 수 있으며, 상기 바이러스 유사 입자는 바이러스의 구조 단백질들간 결합을 통하여 실제 바이러스와 유사한 형태로 자가 조립(self-assembly)이 되지만, 조립 과정에서 바이러스의 유전자는 바이러스 유사 입자 내부로 포함되지 않는 것일 수 있다. 상기의 특성을 갖는 바이러스 유사 입자는 실제 바이러스와 매우 유사한 형태를 띠고 있어 체내 주입 시 높은 면역원성을 나타낼 수 있고, 바이러스의 유전자를 포함하고 있지 않으므로 체내에서 증식이 불가능한 안전한 항원으로 작용할 수 있다.
상기 바이러스 유사 입자는 바이러스, 예를 들어, 코로나바이러스의 스파이크 단백질, 막 단백질, 외피 단백질 및 뉴클레오캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 여기서, 스파이크 단백질은 바이러스 표면에 존재하며, 곤봉 모양의 돌기 형태로 이루어진 구조 단백질이다. 상기 단백질은 숙주세포의 당 단백질 수용체와 결합하는 것으로 알려져 있으며, 이는 세포막과 바이러스 외막의 융합, 그리고, 중화 항체의 생성을 야기할 수 있다. 또한, 뉴클레오캡시드 단백질은 외피의 내부에 존재하며, 세포성 면역 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다.
상기 백신 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 부형제, 희석제 또는 담체를 의미할 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용가능한"의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액, 또는 비-수용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 면역원성을 증가시키기 위한 면역보조제로서 정형 또는 비정형 유기 또는 무기 고분자등이 사용될 수 있다. 면역보조제는 일반적으로 항원에 대한 화학적 물리적 결합을 통해 면역반응을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 면역보조제로서는 비정형 알루미늄 겔, 오일 에멀젼, 또는 이중 오일 에멀젼 그리고 이뮤노졸 등이 사용될 수 있다. 또한, 면역반응의 촉진을 위해 다양한 식물 유래 사포닌, 레바미솔, CpG 다이뉴클레오티드, RNA, DNA, LPS, 다양한 종류의 사이토카인 등이 사용될 수 있다. 상기와 같은 면역 조성물은 다양한 보조제와 면역반응 촉진 첨가물의 조합에 의해 최적의 면역반응 유도를 위한 조성으로 사용될 수 있다. 또한 백신에 추가될 있는 조성물로는 안정제, 불활화제, 항생제, 보존제, 등이 사용될 수 있다. 백신의 투여 경로에 따라 백신 항원은 증류수, 완충용액 등과도 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태의 주사제의 형태로 제제화하여 사용될 수 있다. 상기 백신 조성물을 제제화할 경우, 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 추가하여 조제될 수 있다.
상기 백신 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.
상기 백신 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로 상기 백신 조성물은 근육 투여용, 피하 투여용, 복강 투여용, 정맥 투여용, 경구 투여용, 진피 투여용, 안구 투여용, 및 뇌 내 투여용 조성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 백신 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 백신 조성물은 단독으로 투여하거나, 공지된 감염성 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 성분과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
상기 백신 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 백신 조성물은 성인 1인당 약 0.1ng 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 100 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량 또는 투여횟수는 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또 다른 양상은 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 감염성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.
본 명세서에서, 용어 "예방"은 상기 백신 조성물의 투여로 인해 감염성 질환의 감염 및 상기 감염성 질환 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "치료"는 상기 백신 조성물의 투여로 인해 감염성 질환의 감염에 의해 이미 유발된 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "감염성 질환"은 바이러스성 감염 질환을 의미하며, 바람직하게는 바이러스의 감염에 의해 유발된 질환을 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개체는 바이러스 감염 및 상기 감염에 의한 질환이 발병되거나 발병할 위험이 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이, 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 백신 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 그러나 경구 투여시, 단백질은 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 백신 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 양상에 따른 링커 펩티드는 바이러스에 부착될 수 있는 특성을 가져, 면역체계를 활성화시키는 면역 증강 물질을 바이러스 표면에 효과적으로 결합시킬 수 있는 링커로써 사용되어 백신의 면역원성을 향상시킬 수 있다. 상기 링커 펩티드를 바이러스 표면 엔지니어링 기술에 접목시키면 바이러스 표면에 면역 증강 물질을 부착할 수 있어, 면역 증강된 백신 플랫폼으로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 링커 펩티드 (VES peptide)의 발현을 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다.
도 2는 일 양상에 따른 링커 펩티드의 바이러스 표면에 대한 부착 활성을 확인한 것으로서, 도 2의 A는 바이러스 표면에 대한 부착 활성을 평가하기 위한 항원-항체 복합체 형성 및 이의 검출을 개략적으로 나타낸 것이고, 도 2의 B는 바이러스 표면에 대한 부착 활성을 평가한 결과를 정량적으로 나타낸 도이다.
도 3은 일 양상에 따른 재조합 단백질 (VSE-hFc, VSE-sFc)의 발현을 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다.
도 4는 일 양상에 따른 재조합 단백질의 바이러스 표면에 대한 부착 활성을 확인한 것으로서, 도 4의 A는 바이러스 표면에 대한 부착 활성을 평가하기 위한 항원-항체 복합체 형성 및 이의 검출을 개략적으로 나타낸 것이고, 도 4의 B는 바이러스 표면에 대한 부착 활성을 평가한 결과를 정량적으로 나타낸 도이다.
도 5는 일 양상에 따른 재조합 항원(PEDV-VSE-sFc)을 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 6은 일 양상에 따른 PEDV-VSE-sFc를 마우스에 복강 투여한 후, 상기 마우스의 혈청 내 존재하는 PEDV에 대한 특이적인 IgG의 수준을 확인한 결과이다.
도 7은 일 양상에 따른 PEDV-VSE-sFc를 마우스에 복강 투여한 후, 상기 마우스의 혈청 내 존재하는 중화 항체의 수준을 확인한 결과이다.
도 8은 일 양상에 따른 재조합 항원 (DENV-VSE-hFc)을 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 9는 일 양상에 따른 DENV-VSE-hFc를 마우스에 복강 투여한 후, 상기 마우스의 혈청 내 존재하는 DENV 에 대한 특이적인 IgG의 수준을 확인한 결과이다.
도 10은 일 양상에 따른 DENV-VSE-hFc를 마우스에 복강 투여한 후, 상기 마우스의 혈청 내 존재하는 중화 항체의 수준을 확인한 결과이다.
도 11은 일 양상에 따른 재조합 항원 (PEDV-Fc)의 발현을 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다.
도 12는 일 양상에 따른 PEDV-Fc를 동물 모델에 투여한 후, 상기 동물 모델의 혈청 및 초유 내 존재하는 IgG의 수준을 확인한 결과이다.
도 13은 일 양상에 따른 PEDV-Fc를 동물 모델에 투여한 후, 상기 동물 모델의 혈청 내 존재하는 중화 항체의 수준을 확인한 결과이다.
도 14는 일 양상에 따른 재조합 항원 (PRRSV-Fc)의 발현을 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다.
도 15는 일 양상에 따른 PRRSV-Fc를 동물 모델에 투여한 후, 상기 동물 모델의 혈청 및 초유 내 존재하는 IgG의 수준을 확인한 결과이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 링커 펩티드 제작
바이러스 표면 또는 바이러스 유래 항원과 유효한 결합능을 갖는 링커 펩티드 (VES 펩티드)를 도출 및 제조하였다. 상기 링커 펩티드의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
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본 실시예에서는 진핵 세포의 발현 벡터인 pcDNA3.1-Myc-His vector에 상기 VSE 폴리뉴클레오티드를 클로닝한 뒤, 이를 CHO 세포에 발현시키고, Myc tag을 이용하여 정제하여 도 1에 나타낸 바와 같이, VSE 펩티드를 수득하였다.
실시예 2: 바이러스 표면에 대한 부착 활성 확인
본 실시예에서는 VES 펩티드의 바이러스 표면에 대한 부착 활성을 ELISA를 통하여 확인하고자 하였다. 구체적으로, 돼지 유행성 설사병 바이러스 (PEDV), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV), 댕기열 바이러스 (DENV), 일본 뇌염 바이러스 (JEV), 또는 지카 바이러스 (ZIKV) 각각을 immunoplate의 표면에 코팅한 뒤, 실시예 1의 Myc가 표지된 VES 펩티드 (VSE-Myc tag)를 첨가하여 부착/결합 반응을 유도하였다. 이후, 여기에 HRP (Horseradish peroxidase)가 표지된 anti-Myc tag 항체를 첨가하여 반응을 유도하 뒤, HRP 수준을 정량적으로 검출하여 바이러스 표면에 대한 부착 활성을 평가하였다 (도 2의 A). 한편, 음성 대조군은 Scrambled 펩티드와 반응시킨 군, 양성 대조군은 각각의 바이러스로 면역화된 마우스 혈청을 사용한 군으로 설정하였다.
그 결과, 도 2의 B에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군은 표지된 HRP의 검출 수준이 매우 낮았던 반면, 일 양상에 따른 VES 펩티드를 사용한 군은 양성 대조군과 유사한 수준으로 검출되었다. 이러한 실험 결과는 일 양상에 따른 VES 펩티드는 바이러스의 표면과의 유효한 부착 활성을 지님을 보여주는 것이다.
실시예 3: 바이러스 표면에 대한 면역 증강 물질의 부착 활성 확인
본 실시예에서는 상기 VES 펩티드의 바이러스 표면에 대한 부착 활성을 이용하여, 면역 증강 물질을 바이러스 표면에 부착 또는 결합시키고자 하였다. 구체적으로, VES 펩티드와 human Fc (VSE-hFc) 또는 swine Fc (VSE-sFc)를 진핵세포 발현 벡터인 pcDNA3.1-Myc-His vector에 클로닝하고, 이를 CHO 세포에서 발현시켜 도 3에 나타낸 바와 같이, 면역 증강 물질을 포함하는 재조합 단백질인 VSE-hFc 또는 VSE-sFc를 수득하였다. 상기 재조합 단백질 (VSE-hFc, VSE-sFc)의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 하기 표 2 및 표 3에 나타내었다.
[표 2]
Figure PCTKR2022004491-appb-img-000002
[표 3]
Figure PCTKR2022004491-appb-img-000003
이후, 돼지 유행성 설사병 바이러스 (PEDV), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV), 댕기열 바이러스 (DENV), 일본 뇌염 바이러스 (JEV), 또는 지카 바이러스 (ZIKV) 각각을 immunoplate의 표면에 코팅한 뒤, 상기 VSE-hFc 또는 VSE-sFc를 첨가하여 부착/결합 반응을 유도하였다. 이후, 여기에 HRP (Horseradish peroxidase)가 표지된 anti-IgG 항체를 첨가하여 반응을 유도한 뒤, HRP 수준을 정량적으로 검출하여 바이러스 표면에 대한 부착 활성을 평가하였다 (도 4의 A). 한편, 음성 대조군은 Scrambled 펩티드를 사용한 군, 양성 대조군은 각각의 바이러스로 면역화된 마우스 혈청을 사용한 군으로 설정하였다.
그 결과, 도 4의 B에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군은 표지된 HRP의 검출 수준이 매우 낮았던 반면, 일 양상에 따른 VES 펩티드를 사용한 군 (VSE-hFc, VSE-sFc)은 양성 대조군과 유사한 수준으로 검출되었다. 이러한 실험 결과는 일 양상에 따른 VES 펩티드는 면역 증강 물질을 바이러스 표면에 부착 또는 결합시킴으로써, 바이러스 항원을 포함하는 백신 제제의 효능을 향상시키는데 기여할 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 4: 바이러스 표면 엔지니어링을 통한 면역 반응 증강 효과 확인
본 실시예에서는 바이러스 표면에 VSE-sFc를 부착/결합시켜 재조합 항원을 제조한 뒤, 마우스 모델을 이용하여 상기 재조합 항원의 면역 반응 증강 효과를 확인하고자 하였다.
4-1. PEDV-VSE-sFc
도 5에 도시한 바와 같이, 돼지 유행성 설사병 바이러스 (PEDV)와 실시예 3의 VSE-sFc를 혼합한 뒤, 상온에서 2시간 동안 이들간 부착/결합 반응을 유도하여, 재조합 항원 (PEDV-VSE-sFc)을 제조하였다.
구체적으로, 4 주령의 Balb/C 마우스에 PEDV-VSE-sFc를 2주 간격으로 3회 복강 투여하여 면역화한 후, 마우스의 혈청 내 존재하는 PEDV에 대한 특이적인 IgG의 수준을 확인하였다. 이와 함께, 상기 면역화된 마우스의 혈청을 대상으로, Plaque reduction neutralization test를 수행하여, PEDV 항원에 대한 중화 항체 수준을 평가하였다. 한편, 음성 대조군으로는 PBS를 투여한 군, 비교군으로는 PEDV만을 투여한 군으로 설정하였다.
그 결과, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 일 양상에 따른 PEDV-VSE-sFc를 투여한 군에서는 마우스 혈청 내 높은 수준의 IgG 및 중화 항체를 확인하였다. 특히, PEDV-VSE-sFc를 면역화한 마우스의 혈청 내 중화 항체 수준은 비교군에 비해, 약 4.5 배 증진되었다.
4-2. DENV-VSE-hFc
도 8에 도시한 바와 같이, 댕기열 바이러스 (DENV)와 실시예 3의 VSE-hFc를 혼합한 뒤, 상온에서 2시간 동안 이들간 부착/결합 반응을 유도하여, 재조합 항원 (DENV-VSE-hFc)을 제조하였다.
구체적으로, 4 주령의 Balb/C 마우스에 DENV-VSE-hFc를 2주 간격으로 3회 복강 투여하여 면역화한 후, 마우스의 혈청 내 존재하는 DENV에 대한 특이적인 IgG의 수준을 확인하였다. 이와 함께, 상기 면역화된 마우스의 혈청을 대상으로, Plaque reduction neutralization test를 수행하여, DENV 항원에 대한 중화 항체 수준을 평가하였다. 한편, 음성 대조군으로는 PBS를 투여한 군, 비교군으로는 DENV 만을 투여한 군으로 설정하였다.
그 결과, 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 일 양상에 따른 DENV-VSE-hFc를 투여한 군에서는 마우스 혈청 내 높은 수준의 IgG 및 중화 항체를 확인하였다. 특히, DENV-VSE-hFc를 면역화한 마우스의 혈청 내 중화 항체 수준은 비교군에 비해, 약 4.5 배 증진되었다.
이러한 실험 결과를 종합해 보면, 일 양상에 따른 VES 펩티드를 사용하여 바이러스 표면에 면역 증강 물질을 부착시킨 경우, 바이러스 항원의 면역 반응 유도 효과가 현격하게 향상됨을 알 수 있었다. 이에 따라, 상기의 재조합 항원은 백신 제제의 유효 성분으로서, 그 효용성이 향상되었음을 나타내는 것이다.
실시예 5: 바이러스 유래 항원에 대한 면역 반응 증강 효과 확인
본 실시예에서는 바이러스 유래 항원에 VSE-sFc를 부착/결합시켜 재조합 항원을 제조한 뒤, 상기 재조합 항원의 면역 반응 증강 효과를 확인하고자 하였다.
5-1. PEDV 유래 스파이크 단백질
PEDV에 대한 백신 반응을 유도할 수 있는 항원으로서 PEDV의 스파이크 단백질 S1 유래 단백질, 및 항체 형성을 증진시키기 위한 면역 증강 물질로서 IgG의 Fc 유래 단백질을 포함하는 재조합 항원을 VSE 펩티드를 사용하여 상기 실시예 4와 동일한 방식으로 제작하였다. 또한, 이를 CHO 세포에서 발현시켜 도 11에 나타낸 바와 같이 면역 증강 물질을 포함하는 재조합 항원인 PEDV-Fc를 수득하였다. 상기 재조합 항원(PEDV-Fc)에 사용된 VSE 펩티드-Fc 유래 단백질의 아미노산 서열을 하기 표 4에 나타내었다.
[표 4]
Figure PCTKR2022004491-appb-img-000004
또한, 면역 증강된 PEDV 바이러스 백신의 면역원성을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다. 실험 동물에 상기 제조된 백신(PEDV-Fc)을 2주 간격으로 2회 근육접종 하였다(투여용량: 100 ul). 2차 접종 2주 후, 혈청 및 초유를 채취하여 IgG 역가를 측정하였으며, ELISA와 중화능 시험을 수행하여 혈청 및 초유 내 항체가를 검사하였다. 한편, 대조군으로 PBS를 첨가한 군, 비교군으로 PEDV만을 투여한 군을 설정하였다.
그 결과, 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이 일 실시예에 따른 재조합 항원은 모돈의 혈청, 초유에서 비교군에 비해 높은 수준의 IgG 역가를 보여주었으며, 혈청 내 중화 항체가 역시 상기와 동일한 경향성을 보였다.
5-2. PRRSV 유래 GP5 단백질
PRRSV에 대한 백신 반응을 유도할 수 있는 항원으로서 PRRSV의 GP5 단백질, 및 항체 형성을 증진시키기 위한 면역 증강 물질로서 IgG의 Fc 유래 단백질을 포함하는 재조합 항원을 VSE 펩티드를 사용하여 상기 실시예 4와 동일한 방식으로 제작하였다. 또한, 이를 CHO 세포 및 Marc 145 세포에서 발현시켜 도 14에 나타낸 바와 같이 면역 증강 물질을 포함하는 재조합 항원인 PRRSV-Fc를 수득하였다. 상기 재조합 항원(PRRSV-Fc)에 사용된 VSE 펩티드-Fc 유래 단백질의 아미노산 서열을 하기 표 5에 나타내었다.
[표 5]
Figure PCTKR2022004491-appb-img-000005
또한, 면역 증강된 PRRS 바이러스 백신의 면역원성을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다. 실험 동물에 상기 제조된 백신(PRRSV-Fc)을 2주 간격으로 2회 근육접종 하였다(투여용량: 100 ul). 2차 접종 2주 후, 혈청 및 초유를 채취하여 IgG 역가를 측정하였으며, ELISA와 중화능 시험을 수행하여 혈청 및 초유 내 항체가를 검사하였다. 한편, 대조군으로 PBS를 첨가한 군, 비교군으로 PRRSV 만을 투여한 군을 설정하였다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이 일 실시예에 따른 재조합 항원은 모돈의 혈청, 및 초유에서 모두 비교군에 비해 높은 수준의 IgG 역가를 보여주었다.
상기의 실험 결과를 통해, 일 실시예에 따른 백신 조성물은 면역원성이 증가되어 백신의 효능을 극대화시킬 수 있음을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 링커 펩티드.
  2. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 링커 펩티드; 및
    상기 링커 펩티드의 C-말단에 연결된 면역 증강 물질을 포함하는 융합 단백질.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 면역 증강 물질은 항체의 Fc 영역, 플라젤린 (flagellin) 또는 IL-2 (interleukin-2) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 융합 단백질.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 면역 증강 물질은 항체의 Fc 영역인 것인, 융합 단백질.
  5. 청구항 2의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 청구항 5의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  7. 청구항 6의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  8. 감염성 바이러스 유래 항원; 및
    서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 링커 펩티드 및 상기 링커 펩티드의 C-말단에 연결된 면역 증강 물질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 백신 조성물.
  9. 청구항 9에 있어서, 상기 링커 펩티드의 N-말단은 감염성 바이러스 유래 항원과 연결되어 있는 것인, 백신 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 감염성 바이러스 유래 항원은 돼지 유행성 설사병 바이러스 (Porcine epidemic diarrhea virus), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 댕기열 바이러스 (Dengue virus), 일본 뇌염 바이러스 (Japanese encephalitis virus), 지카바이러스 (Zika virus), 에볼라　바이러스 (Ebola virus), 로타바이러스 (Rotavirus), 댕기열 바이러스 (Dengue virus), 웨스트 나일　바이러스 (West Nile virus), 황열 바이러스 (Yellow fever virus), 아데노바이러스 (Adenovirus), BK　바이러스 (BK virus), 천연두　바이러스 (Smallpox virus), 중증 열성 혈소판 감소 증후군　바이러스　(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus) 단순 포진 바이러스 (Herpes simplex virus), 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus), A형 간염 바이러스 (Hepatitis A virus), B형 간염 바이러스 (Hepatitis B virus), C형 간염 바이러스 (Hepatitis C virus), D형 간염 바이러스 (Hepatitis D virus), E형 간염 바이러스 (Hepatitis E virus), 한탄 바이러스(Hantan virus), 또는 거대 세포 바이러스 (Cytomegalovirus) 유래 항원인 것인, 백신 조성물.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 백신 조성물은 약독화 생백신 (Live attenuated vaccine), 불활화 백신(Inactivated vaccine), 서브 유닛 백신(Subunit vaccine), 또는 바이러스 유사입자 백신 (Virus like Particle vaccine)인 것인, 백신 조성물.
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