KR20230150525A - 신규한 자가면역질환 동물모델 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자가면역질환이 유도된 동물을 제조하는 방법 및 이를 이용하여 제조된 자가면역질환 동물모델을 제공한다. 본 발명의 동물 모델은 Cre-LoxP 시스템을 통해 자가항원 유전자를 도입하여 Cre 재조합효소의 처리만으로 원하는 시점에 자가항원의 발현을 유도함으로써 동물 내에서 자가면역질환의 병인이 되는 유효량의 자가항체를 효율적으로 생성할 수 있다. 본 발명은 누출 발현 및 면역 관용으로 인해 자가항체가 잘 생성되지 않는 종래의 자가항원 유도 방법들과 달리 단 한번의 TAT-Cre 재조합 효소 처리를 통해 지속적으로 유효량의 자가항원을 발현시킴으로써, 난치성 질환인 자가면역질환의 다양한 증상과 분자적 기전을 효율적으로 재연하는 우수한 동물 모델로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 Cre-LoxP 시스템을 통해 원하는 시점에 자가항원을 지속적으로 발현하는 자가면역질환, 구체적으로는 자가면역성 갑상선 질환 동물모델에 관한 것이다.
자가면역질환은 면역 체계가 스스로의 기관을 공격하여 자발적인 반응을 일으킴으로써 조직 손상을 야기하는 질환을 의미하며, 자가 항원에 대한 병리적 반응을 특징으로 한다. 자가면역질환은 전신홍반성낭창, 류마티스 관절염, 그리고 다발성 경화증 등과 같은 전신성 자가면역질환과, 중증근무력증, 인슐린 의존성 당뇨, 그레이브스병 등과 같은 기관 특이적인 질환을 포함한다.
이러한 자가면역질환의 기전 연구 및 치료제의 개발을 위해서는 자가면역질환의 증상 및 메카니즘이 효율적으로 재연되면서 인간을 대상으로 개발된 치료제에 반응할 수 있는 동물 모델이 반드시 필요함에도 아직까지 효율적인 자가면역질환 동물 모델은 개발되지 못하고 있다.
한편, 그레이브스병(Graves’disease)은 자가면역질환의 일종으로 환자 자신의 면역세포가 갑상선 세포에 결합할 수 있는 항체를 생성하는 질환이다. 이렇게 생성된 항체는 갑상선을 자극해서 갑상선호르몬을 과도하게 생성하게 한다. 또한 이 항체는 눈 뒤의 조직에도 반응해서 안구 돌출 등의 눈 증상, 갑상선 안구병증(갑상선-associated opththalmopathy)을 만든다. 그레이브스병 모델을 제작하기 위해 마우스에 자가 항원으로서 TSHR 플라스미드 또는 아데노바이러스를 도입하여 면역반응을 일으키는 선행연구 결과가 보고된 바 있으나 수주간 여러차례 반복 투여가 필요하여 많은 노력이 필요하며, 결과 또한 매우 불균일하여 새로운 치료제 개발 플랫폼으로 사용하기에는 한계가 있었다. 또 다른 자가면역질환인 중증근무력증 등의 동물모델에서도 역시 장기간 반복된 항원 투여가 요구되어 효율적인 자가면역질환 동물 모델은 당업계의 요구에 불구하고 아직까지 개발되지 못하고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 자가항원을 지속적으로 자체 발현함으로써 자가항체의 과도한 활성 또는 원치 않거나 과도한 면역반응을 원인으로 하는 다양한 질환을 효율적으로 재연하는 안정적인 동물모델을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 동물 내에서 Cre-LoxP 시스템을 통해 자가항원 유전자를 도입할 경우 Cre 재조합효소의 처리만으로 원하는 시점에 자가항원의 발현을 유도함으로써 면역관용 및 누출 발현을 피하면서도 자가면역질환의 증상이 효과적으로 재연될 만큼의 유효량의 자가항체가 생성됨을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 자가면역질환이 유도된 동물 제작용 유전자 전달체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 자가면역질환이 유도된 동물을 제조하는 방법 및 이를 이용하여 제조된 자가면역질환 동물모델을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 5’에서 3’방향으로 발현조절서열; loxp(locus of X-over P1) 뉴클레오타이드 서열이 양 측면에 플랭킹(flanking)된 발현차단 뉴클레오타이드; 및 자가항원 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는, 자가면역질환이 유도된 동물 제작용 유전자 전달체를 제공한다.
본 발명자들은 자가항원을 지속적으로 자체 발현함으로써 자가항체의 과도한 활성 또는 원치 않거나 과도한 면역반응을 원인으로 하는 다양한 질환을 효율적으로 재연하는 안정적인 동물모델을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 동물 내에서 Cre-LoxP 시스템을 통해 자가항원 유전자를 도입할 경우 Cre 재조합효소의 처리만으로 원하는 시점에 지속적인 자가항원의 발현을 유도함으로써 면역관용 및 누출 발현을 피하면서도 자가면역질환의 증상이 효과적으로 재연될 만큼의 유효량의 자가항체가 생성됨을 발견하였다.
본 명세서에서 용어“동물”은 인간을 제외한 동물을 의미하며, 보다 구체적으로는 인간을 제외한 포유동물을 의미한다.
본 명세서에서 용어“포유동물”은 포유류에 속하는 동물로서 인간을 제외한 모든 동물을 의미하며, 예를 들어 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로는, 상기 포유동물은 설치류 동물이며, 보다 구체적으로는 마우스이다.
본 명세서에서 용어“동물모델”은 자가면역질환의 형질, 표현형 또는 증상을 가지도록 직접 또는 간접적으로 인위적 변형이 가해진 비-인간 동물을 의미하며, 구체적으로는 Cre-LoxP 시스템을 통해 자가항원 단백질을 인코딩하는 유전자가 도입되어 Cre 재조합효소의 처리 시 자가항원의 발현이 촉발됨으로써 자가항체의 생성에 의해 진행되는 전반적인 생물학적 과정을 재연하는 동물을 의미한다.
본 명세서에서, 용어“뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드(gDNA 및 cDNA) 또는 리보뉴클레오타이드 분자를 포괄적으로 포함하는 의미로서, 특별하게 달리 언급되어 있지 않은 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명에 따르면, 본 발명의 loxp 뉴클레오타이드는 박테리오파지 P1의 Lox p(locus of X-over P1) 부위의 뉴클레오타이드 서열이며, 이는 역으로 상보적인(inverted complementary) 13개의 양 끝 서열 사이에 8개의 비대칭 서열이 존재하는 34bp 길이의 뉴클레오타이드로서 Cre 재조합효소가 인식하여 결합하는 부위이다. 보다 구체적으로는 본 발명의 loxp 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드로 이루어진다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서에 첨부된 서열목록에서 특정하는 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다. 뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(코돈의 축퇴성), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 구체적으로는 70%의 상동성, 보다 더 구체적으로는 80%의 상동성, 가장 구체적으로는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
본 명세서에서, 용어“발현차단 뉴클레오타이드”는 발현을 제어하고자 하는 표적 유전자(본 발명의 경우 자가항원 단백질-인코딩 핵산서열)의 업스트림에 위치하여 발현조절서열과 표적 유전자를 이격시켜 평상시에는 표적 유전자의 발현을 차단시키되, 양 측면에 loxp 뉴클레오타이드 서열이 플랭킹되어 Cre 재조합 효소가 처리될 시 불활성화됨으로써 표적 유전자의 발현이 개시되게끔 하는 스위칭 역할을 하는 핵산 분자를 의미한다. 발현차단 뉴클레오타이드는 예를 들어 DsRed2, GFP(green fluorescent protein), kanaR(kanamycin resistance gene), neoR(neomycin resistance gene) 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않고 발현조절서열, 예를 들어 프로모터와 표적 유전자가 작동적으로 결합(operatively linked)되지 못하도록 적절한 길이를 가지는 핵산 서열이라면 무엇이든 사용될 수 있다.
본 명세서에서, 용어“유전자 전달체”또는“유전자 전달 시스템(gene delivery system)”은 유전자를 세포 내로 운반하여 해당 세포 내에서 발현시키는 모든 수단을 의미하며, 유전자 전달은 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 동물 형질전환에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 구체적으로는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Act . Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀(Metho s in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 유전자 전달체는 본 발명의 뉴클레오타이드 분자를 플라스미드에 적용하여 제조된다.
가장 구체적으로는, 본 발명에서 이용되는 유전자 전달체는 Rosa26 플라스미드이며, 보다 구체적으로는 하기 도 1로 표시되는 유전자 지도를 갖는 Rosa26 벡터이다.
본 명세서에서 용어“발현시키다”는 대상 세포가 외래(exogenous) 유전자를 발현하게 하거나 또는 내인성(endogenous) 유전자의 자연적 발현량을 증가시키기 위해 유전자 전달체를 이용하여 인위적으로 이를 도입함으로써 유전자가 대상체 세포 내에서 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 따라서, 용어“발현”은“형질전환(transformation)”, "형질주입(transfection)" 또는 "형질도입(transduction)"과 동일한 의미이다.
본 발명의 유전자 전달체를 제조하기 위해, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재할 수 있으며, 상기 컨스트럭트 내에서 본 발명의 표적 유전자 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서, 용어“작동적으로 결합된”은 핵산 발현조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명의 표적 유전자에 결합된 프로모터는, 구체적으로는 동물세포, 보다 구체적으로는 포유동물 세포에서 작동하여 표적 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대 CMV(포유동물 사이토 메갈로 바이러스) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 발현조절서열은 CAG 프로모터이다.
본 명세서에서 용어“자가면역질환(autoimmune disease)”은 과도하거나 원치않는 체액성 면역반응 또는 세포성 면역반응에 의해 신체 내 조직이나 기관이 손상되거나 기능을 상실하는 모든 병적 상태를 포괄하는 의미이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 동물에서 재연하고자 하는 자가면역질환은 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 다발성경화증, 특발성섬유성폐포염, 중증근무력증, 다발성근염, 피부근염, 국한피부경화증, 전신피부경화증, 대장염, 염증성 장질환, 조르젠신드롬(Sjorgen's syndrome), 레이노현상(Raynaud's phenomenon), 베쳇병(Bechet's disease), 가와사키병(Kawasaki's disease), 원발성담즙성경화증(primary biliary sclerosis), 원발성경화성담관염(primary sclerosing cholangitis), 궤양성대장염(ulcerative olitis), 크론병(Crohn's disease) 및 자가면역성 갑상선질환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 자가면역질환은 자가면역성 갑상선질환이다.
본 명세서에서 용어“자가면역성 갑상선 질환(Autoimmune Thyroid Diseases)”은 갑상선에 대한 자가항체가 매개하는 면역반응에 의하여 갑상선 호르몬이 과다 분비되거나 또는 결핍되는 질환을 의미한다. 갑상선 호르몬 수용체에 대한 자극 자가항체(Thyroid stimulating antibody (TSAb))가 생성되면 갑상선 호르몬이 과다 생산되어 갑상선 기능 항진증으로 진행하며, 반대로 갑상선 호르몬 수용체에 대한 억제 자가항체(TSH-stimulation blocking antibody (TSBAb))나 갑상선 세포를 파괴하는 자가면역 항체(Thyroid peroxidase antibody (TPOAb))가 생성되면 호르몬 분비가 감소하여 갑상선 기능 저하증으로 발전한다.
보다 구체적으로는, 상기 자가면역성 갑상선 질환은 그레이브스병(Graves’disease), 하시모토 갑상선염(Hashimoto’s thyroiditis), 위축성 갑상선염(atrophic thyroiditis), 무통성 갑상선염(painless thyroiditis) 및 산후갑상선염(postpartum thyroiditis)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
가장 구체적으로는, 상기 자가면역성 갑상선 질환은 그레이브스병(Graves’disease)이다. 그레이브스병은 환자 자신의 면역세포가 갑상선 세포에 결합할 수 있는 항체를 생성하는 질환으로 갑상선호르몬의 과잉분비가 나타나며 안구의 돌출, 갑상선의 종대, 심계항진의 세 가지 증세가 특징이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 자가항원 단백질은 갑상선 자극호르몬 수용체(TSHR) 또는 이의 기능적 일부이다. 본 명세서에서 용어, "TSHR의 기능적 일부(functional portion)"는 TSHR의 전장 단백질에서 일부 아미노산 잔기가 삭제된 단편 또는 전장 단백질의 일부 도메인으로서 그 본연의 생물학적 활성 또는 기능을 유지하는 전장 단백질의 유사체를 의미하며, 보다 구체적으로는 TSHR의 전장 단백질의 면역원성을 유지하는 일부 단편 또는 도메인을 의미한다. 구체적으로 상기“TSHR의 기능적 일부”는 TSHR 알파 서브유닛일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 유전자 전달체를 동물에 도입하는 단계를 포함하는 자가면역질환이 유도된 동물의 제조방법을 제공한다.
본 명세서에서,“유전자 전달체를 동물에 도입”한다 함은 표적 핵산분자를 대상 동물에서 인위적으로 발현시키기 위해 표적 핵산분자가 삽입된 유전자 전달체를 대상 동물의 세포 내로 운반하여 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하도록 만드는 것을 의미한다.
유전자 전달체의 도입은 당업계에 알려진 다양한 동물 형질도입 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자 전달체가 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 상기 접촉시키는 단계는 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다.
본 발명에서 유전자 전달체가 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland et al., J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841 (1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau. etene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau.et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자 전달체를 세포내로 이입시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 유전자 전달체가 도입된 배아줄기세포를 상기 동물에 주입함으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 유전자 전달체가 도입된 배아줄기세포를 대상 동물의 수정란에 주사하여 최종적으로 Cre 재조합효소의 처리를 통해 원하는 시점에 자가항원 단백질을 발현하는 동물모델을 수득할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자 전달체인 환형의 플라스미드를 제한효소로 절단하여 선형화시킨 뒤 타겟 유전자를 포함하는 목적 부위를 전기영동으로 분리하고 배아줄기세포에 삽입한 뒤, 이를 수정란에 이식함으로써 키메라 마우스를 만든 후 교배를 통해 TSHR 유전자가 녹-인(knock in)된 동물을 수득할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 유전자 전달체가 도입된 동물과 반복친과의 역교배를 2회 내지 6회 반복하는 단계를 추가적으로 포함한다. 보다 구체적으로는 역교배를 3회 내지 6회 반복할 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 4회 내지 6회 반복할 수 있고, 가장 구체적으로는 5회 또는 6회 반복할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 유전자 전달체가 도입된 동물에 TAT-Cre 재조합효소를 처리하거나 또는 Cre 재조합효소를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 추가적으로 포함한다.
자가항원 유전자의 단순 과발현을 시도한 종래의 동물 모델은 면역관용에 의해 오히려 자가항체가 생성되지 않았으며, 타목시펜 주사로 원하는 시기에 타목시펜 유도(Tamoxifen-inducible) Cre를 활성화시키는 Cre 재조합효소 유전자가 삽입된 동물과 loxP 서열이 삽입된 동물 간 교배를 통해 표적 유전자의 발현을 유도하는 타목시펜 유도 Cre-loxp 시스템 역시 누출 발현과 면역관용 문제로 인해 유효량의 자가항체가 생성되지 않았다. 이에 반하여, 본 발명의 동물 모델은 표적 유전자와 loxP 서열 녹-인된 동물에 TAT-Cre 재조합효소를 처리하거나 Cre 재조합효소-인코딩 유전자를 공지된 유전자 전달방법(예를 들어 플라스미드를 이용한 전기천공 또는 바이러스 벡터를 이용한 전달 등)으로 이를 도입하는 간단한 공정만으로 자가항원의 발현 시점을 필요에 따라 선택하면서도, 누출발현 없이 자가면역질환을 재연할 수 있을 정도의 자가항체 생성에 적합한 최적량의 자가항원을 효율적으로 발현시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 TAT-Cre 재조합효소는 50-1500U으로 투여한다. 보다 구체적으로는 100-1250U으로 투여하고, 보다 더 구체적으로는 200-1000U로 투여하며, 가장 구체적으로는 250-750U로 투여한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 방법으로 제조된 자가면역질환이 유도된 동물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 loxp(locus of X-over P1) 뉴클레오타이드 서열이 양 측면에 플랭킹(flanking)된 발현차단 뉴클레오타이드; 및 자가항원 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 도입된, 자가면역질환이 유도된 동물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 유전자 전달체, 이를 도입한 동물 모델 및 재연하고자 하는 자가면역질환에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 자가면역질환이 유도된 동물을 제조하는 방법 및 이를 이용하여 제조된 자가면역질환 동물모델을 제공한다.
(b) 본 발명의 동물 모델은 Cre-LoxP 시스템을 통해 자가항원 유전자를 도입하여 Cre 재조합효소의 처리만으로도 원하는 시점에 자가항원의 안정적, 지속적인 발현을 유도함으로써 동물 내에서 자가면역질환의 병인이 되는 자가항체를 효율적으로 생성할 수 있다.
(c) 본 발명은 누출 발현 및 면역 관용으로 인해 자가항체가 잘 생성되지 않거나 수주간 여러차례 반복투여가 필요한 종래의 방법들과 달리 단 한번의 TAT-Cre 재조합 효소 처리만으로도 지속적으로 유효량의 자가항원을 발현시킴으로써, 난치성 질환인 자가면역질환의 다양한 증상과 분자적 기전을 효율적으로 재연하는 우수한 동물 모델로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a은 Cre-LoxP 시스템에 hTSHRa가 삽입된 Rosa26_hTSHRa 플라스미드 지도를 보여주는 그림이다.
도 2a는 본 발명의 Rosa26_hTSHRa 플라스미드에서 필요한 부분을 배아줄기세포의 ROSA26 유전자 부위에 상동 재조합으로 삽입한 것을 보여주는 그림이다. 도 2b는 본 발명의 Rosa26_hTSHRa 플라스미드에서 필요한 부분을 마우스 배아줄기세포에 삽입하여 제작한 세포주에 평상시 hTSHRa가 발현되지 않으나 nls-Cre 플라스미드를 형질도입하여 Cre 재조합효소를 도입한 경우에만 hTSHRa가 발현됨을 RNA단계에서 확인한 RT-PCR 결과이다.
도 3은 본 발명의 자가면역질환 동물모델의 제작과정과 방법을 개괄한 모식도를 보여주는 그림이다. 유전자 삽입을 통해 만들어진 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스를 첫번째 방법으로 B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(cre/ERT2) 마우스와 교배하여 수득한 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(cre/ERT2/hTSHRa) 마우스에 타목시펜을 투여하는 방법을 사용하였다. 두번째 방법으로 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스에 TAT-Cre를 투여하는 방법을 사용하였다. 세번째 방법으로 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스를 BALB/c 마우스와 역교배하여 BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스를 만들고 BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스에 TAT-Cre를 투여하는 방법을 사용하였다.
도 4는 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(cre/ERT2/hTSHRa) 마우스에 다양한 농도의 타목시펜 투여한 후 12주째 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현(도 4a)과 갑상선 호르몬(T4) 증가 여부(도 4b)를 관찰한 결과이다.
도 5는 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(cre/ERT2/hTSHRa) 마우스에 다양한 농도의 TAT-Cre를 투여한 후 12주째 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현(도 5a)과 갑상선 호르몬(T4) 증가 여부(도 5b)를 관찰한 결과이다.
도 6은 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스와 BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스에 다양한 농도의 TAT-Cre를 투여한 후 12주째 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현(도 6a)과 갑상선 호르몬(T4) 증가 여부(도 6b)를 관찰한 결과이다.
도 7은 BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스(동형접합체) 8마리에 500U TAT-Cre, 5마리에 100U TAT-Cre를 투여한 후 4주(도 7a), 8주(도 7b) 및 12주(도 7c)째 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현과 갑상선 호르몬(T4) 증가 여부를 관찰한 결과이다.
도 8은 BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스(동형접합체) 2마리에 500U TAT-Cre를 투여한 후 4, 8, 12, 20주째 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현(도 8a)과 갑상선 호르몬 증가(T4) 지속 여부(도 8b)를 관찰한 결과이다.
도 2a는 본 발명의 Rosa26_hTSHRa 플라스미드에서 필요한 부분을 배아줄기세포의 ROSA26 유전자 부위에 상동 재조합으로 삽입한 것을 보여주는 그림이다. 도 2b는 본 발명의 Rosa26_hTSHRa 플라스미드에서 필요한 부분을 마우스 배아줄기세포에 삽입하여 제작한 세포주에 평상시 hTSHRa가 발현되지 않으나 nls-Cre 플라스미드를 형질도입하여 Cre 재조합효소를 도입한 경우에만 hTSHRa가 발현됨을 RNA단계에서 확인한 RT-PCR 결과이다.
도 3은 본 발명의 자가면역질환 동물모델의 제작과정과 방법을 개괄한 모식도를 보여주는 그림이다. 유전자 삽입을 통해 만들어진 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스를 첫번째 방법으로 B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(cre/ERT2) 마우스와 교배하여 수득한 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(cre/ERT2/hTSHRa) 마우스에 타목시펜을 투여하는 방법을 사용하였다. 두번째 방법으로 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스에 TAT-Cre를 투여하는 방법을 사용하였다. 세번째 방법으로 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스를 BALB/c 마우스와 역교배하여 BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스를 만들고 BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스에 TAT-Cre를 투여하는 방법을 사용하였다.
도 4는 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(cre/ERT2/hTSHRa) 마우스에 다양한 농도의 타목시펜 투여한 후 12주째 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현(도 4a)과 갑상선 호르몬(T4) 증가 여부(도 4b)를 관찰한 결과이다.
도 5는 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(cre/ERT2/hTSHRa) 마우스에 다양한 농도의 TAT-Cre를 투여한 후 12주째 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현(도 5a)과 갑상선 호르몬(T4) 증가 여부(도 5b)를 관찰한 결과이다.
도 6은 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스와 BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스에 다양한 농도의 TAT-Cre를 투여한 후 12주째 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현(도 6a)과 갑상선 호르몬(T4) 증가 여부(도 6b)를 관찰한 결과이다.
도 7은 BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스(동형접합체) 8마리에 500U TAT-Cre, 5마리에 100U TAT-Cre를 투여한 후 4주(도 7a), 8주(도 7b) 및 12주(도 7c)째 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현과 갑상선 호르몬(T4) 증가 여부를 관찰한 결과이다.
도 8은 BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스(동형접합체) 2마리에 500U TAT-Cre를 투여한 후 4, 8, 12, 20주째 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현(도 8a)과 갑상선 호르몬 증가(T4) 지속 여부(도 8b)를 관찰한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. Rosa26_hTSHRa 벡터의 구축 및 마우스 배아줄기세포 삽입
인간 정상 갑상선 조직의 TSHRα 서브유닛(289) cDNA를 클로닝에 사용하였다. 코작시퀀스 GCCACC와 인간 TSHRα 서브유닛(289)과 종결코돈 TAA 서열을 AscI 및 XmaI(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)의 절단부위 클로닝을 이용하여 Rosa26 벡터(평상시에는 발현되지 않으나 Cre를 처리하면 발현되는 Cre-LoxP 시스템)에 삽입하여 Rosa26_hTSHRa 벡터를 만들었다(도 1a). 다음으로, Rosa26_hTSHRa 벡터를 제한효소로 잘라 선형화시킨 다음 필요한 부분을 전기영동으로 분리하고 129S1/SvImJ 마우스 배아줄기세포에 상동 재조합으로 삽입하고 네오마이신으로 선별 후 시퀀싱하여 서열을 확인였다(도 1b). 이후 녹인 마우스의 생산 전에 재조합 배아줄기세포 세포주 단계에서 평상시 hTSHRa가 발현되지 않으나 nls-Cre 플라스미드를 형질도입하여 Cre 재조합효소를 투여한 경우에만 hTSHRa가 발현되는 시스템이 잘 작동하는 것을 RNA단계에서 RT-PCR로 확인하였다(도 2b).
2. 인간 TSHRα 서브유닛 녹-인(knock-in) 마우스의 생산
(1) B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa)
확인된 재조합 배아줄기세포를 마우스 수정란에 미세주입하고 미세주입된 수정란 중 생존한 것을 선별하여 대리모 마우스의 난관에 이식한 후 분만된 키메라 마우스를 획득하였다. 다음으로, C57BL/6 마우스(반복친, recurrent parents)에 역교배 방법을 적용하였다. 이를 통해 수득된 F1 자손은 각 부모의 50%의 유전 물질을 가지며 마우스가 2주 정도 자란 후에 꼬리를 잘라 DNA를 추출하여 hTSHRα 서브유닛 유전자의 삽입 여부를 확인하였다. F1 개체를 반복친과 교배하여 F2 개체를 수득하였다. 이후 F2 개체를 다시 한번 반복친과 교배하였다. 역교배된 각 세대는 공여자 부모의 비율이 절반으로 감소한다. 일반적으로 F5 세대부터는 반복친과 96%이상이 동일하기 때문에, 적어도 F5 세대 이후의 마우스가 실험에 사용되었다.
(2) B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(cre/ERT2/hTSHRa)
hTSHRα 서브유닛 유전자를 가진 F5 세대 이후의 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스를 내재적 마우스 Gt(ROSA)26Sor 프로모터를 통해 타목시펜-유도 Cre-매개 재조합 시스템이 도입된 B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(cre/ERT2)마우스와 교배하여 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(cre/ERT2/hTSHRa) 마우스를 만들었다.
(3) BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스를 BALB/c 마우스(반복친)에 역교배 방법을 적용하였다. 이를 통해 수득된 F1 자손은 각 부모의 50%의 유전 물질을 가지며 마우스가 2주 정도 자란 후에 꼬리를 잘라 DNA를 추출하여 hTSHRα 서브유닛 유전자의 삽입 여부를 확인하였다. F1 개체를 반복친과 교배하여 F2 개체를 수득하였다. 이후 F2 개체를 다시 한번 반복친과 교배하였다. 역교배된 각 세대는 공여자 부모의 비율이 절반으로 감소한다. 일반적으로 F5 세대부터는 반복친과 96%이상이 동일하기 때문에, 적어도 F5 세대 이후의 마우스가 실험에 사용되었다.
3. 표적화 마우스주 지노타이핑
B6;129S- Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa )와 BALBc;129S- Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa)
| 표적 유전자 | 프라이머 | 서열 |
| ROSA 26 | 정방향 | 5’-AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT-3’ |
| 역방향 | 5’-GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG-3’ | |
| hTSH-A | 정방향 | 5’-GCA ACG TGC TGG TTA TTG TG-3’ |
| 역방향 | 5’-GAT CTG GAC GAA GAG CAT CAG-3’ |
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스와 BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스들은 2주 정도 자란 후에 꼬리를 잘라 DNA를 추출하여 위 프라이머를 이용해 PCR진행하여 표적 좌위의 483개 염기쌍 밴드와 야생형 좌위의 603개 염기쌍 밴드를 수득하였다. PCR은 94℃에서 30초, 65℃에서 60초 및 72℃에서 60초로 34사이클을 수행하였다.
B6;129S-
Gt(ROSA)26Sor
tm1(cre/ERT2/hTSHRa)
| 표적 유전자 | 프라이머 | 서열 |
| ROSA 26 | 정방향 | 5’-AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT-3’ |
| 역방향 | 5’-GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG-3’ | |
| CreER | 정방향 | 5’-AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT-3’ |
| 역방향 | 5’-CCT GAT CCT GGC AAT TTC G-3’ | |
| hTSH-A | 정방향 | 5’-GCA ACG TGC TGG TTA TTG TG-3’ |
| 역방향 | 5’-GAT CTG GAC GAA GAG CAT CAG-3’ |
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(cre/ERT2/hTSHRa) 마우스는 2주 정도 자란 후에 꼬리를 잘라 DNA를 추출하여 위 프라이머를 이용해 PCR진행하여 표적 좌위의 483개 염기쌍 밴드 및 823개 염기쌍 밴드와 야생형 좌위의 603개 염기쌍 밴드를 수득하였다. PCR은 94℃에서 30초, 65℃에서 60초 및 72℃에서 60초로 34사이클을 수행하였다.
4. 혈청 항체 및 갑상선 기능의 측정
실험시 각 마우스의 혈청에서 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현과 갑상선 호르몬(T4)을 측정하였다. 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab)는 Fast ELISA 킷(EUROIMMUN, Luebeck, Germany)의 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab)를 이용하여 측정하였다. 제조자의 지시에 따라 시험을 수행하였으며, 갑상선 호르몬(T4)는 ELISA로 측정하였다(DRG, Springfield, NJ, USA).
5. 형질전환 마우스에서 hTSHRα-서브유닛 발현의 유도
무병원균의 형질전환 마우스 (B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스, BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스, B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(cre/ERT2/hTSHRa) 마우스)를 온도(24± 2℃)와 습도(55± 15%)를 조절하면서 12시간(h) 명암 주기 하에서 사육하였다. 마우스를 단일 환기 케이지에서 무병원균 조건 하에 유지하여 환경 노출을 차단하였다. 실험개시 전 마우스를 SPF 환경에서 클린(clean) 환경으로 옮겼다. 6-8주령의 마우스를 이용하여 실험을 진행하였다. 모든 실험은 연세대학교 동물실험윤리위원회(Seoul, Korea)에서 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다.
(1) 타목시펜 투여
첫번째 방법으로 B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1(hTSHRa) 마우스를 B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(cre/ERT2) 마우스와 교배하여 수득한 B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1(cre/ERT2/hTSHRa) 마우스에 타목시펜을 투여하는 방법을 사용하였다(도 3).
옥수수 오일에 10 mg/ml 농도로 용해된 타목시펜(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)을 밤새 37℃에서 교반하였다. 타목시펜은 빛에 민감하므로 빛-차단 용기에 4℃에서 보관하였다. 적절한 농도범위를 찾기 위해 투여량은 0.15 - 75 mg 타목시펜/kg 체중의 다양한 농도로 결정하였다. 주사 전 70% 에탄올로 주사 부위를 민감화시키고 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(cre/ERT2/hTSHRa) 마우스에 타목시펜을 복강주사하였다. 12주째 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현과 갑상선 호르몬(T4) 증가 여부를 관찰한 결과 대조군(0mg/kg)과 비교하여 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab)나 갑상선 호르몬(T4)의 변화는 관찰할 수 없었다(도4a, 도4b). 아마도 누출발현으로 인한 면역관용으로 항체가 잘 생성되지 않은 것으로 보인다.
(2) TAT-Cre 재조합효소 투여
누출발현으로 인한 면역관용으로 항체가 잘 생성되지 않은 것인지 확인하기 위해 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(cre/ERT2/hTSHRa) 마우스의 다리근육에 TAT-Cre 재조합효소(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) 500-1250U을 근육주사하였다. 주사 전 70% 에탄올로 주사 부위를 민감화시켰다. 12주째 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현과 갑상선 호르몬(T4) 증가 여부를 관찰한 결과 대조군(0mg/kg)과 비교하여 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab)나 갑상선 호르몬(T4)의 변화는 관찰할 수 없었다(도5a, 도5b). 이로서 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(cre/ERT2/hTSHRa) 마우스는 누출발현으로 인한 면역관용으로 항체가 잘 생성되지 않는 것으로 판단하였다.
다음으로 누출발현으로 인한 면역관용을 완벽히 피하기 위해 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스와 BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스의 다리근육에 TAT-Cre 재조합효소(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)를 30-2000U의 다양한 농도로 근육주사하였다. 주사 전 70% 에탄올로 주사 부위를 민감화시켰다. 적절한 농도범위를 찾기 위해 B6;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스와 BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스의 이형접합체와 동형접합체를 골고루 모두 사용하였다. 12주째 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현과 갑상선 호르몬(T4) 증가 여부를 관찰한 결과 다양한 농도의 TAT-Cre에서 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab)가 생성되고 갑상선 호르몬(T4)이 증가하는 것을 볼 수 있으며 이 방법을 이용하여 대표적으로 기관 특이적인 자가면역질환인 그레이브스병 동물모델을 만들 수 있음을 확인할 수 있다(도 6a, 6b).
TAT-Cre 30U 미만의 저용량에서는 항원 항체 반응이 충분하게 나타나지 않았으며, TAT-Cre 100U 이상에서는 유효량의 항체가 생성되고 갑상선호르몬의 증가가 관찰되었다. 아울러, TATA-Cre 250~750U의 범위 내에서 가장 효율적으로 항체가 생성 생성되면서 갑상선호르몬도 현저하게 증가함을 알 수 있었다.
단, TAT-Cre의 용량이 1500U 초과시 많은 항원과 접촉함으로써 항체의 중화가 유발되는 것으로 판단된다.
이후 독립된 실험으로 BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스(동형접합체) 8마리의 다리근육에 TAT-Cre 재조합효소(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)를 500U 농도로 근육주사하였다. 또한 보조적으로 다른 5마리에는 100U 농도로 근육주사하였다. 주사 전 70% 에탄올로 주사 부위를 민감화시켰다. 4주째 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현과 갑상선 호르몬(T4) 증가 여부를 관찰한 결과 대조군(0U)과 비교하여 TAT-Cre를 투여한 모든 마우스에서 이미 상당히 의미있게 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab)가 생성되고 갑상선 호르몬(T4)이 증가하기 시작하는 것을 볼 수 있다. 8주와 12주째 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현과 갑상선 호르몬(T4) 증가 여부를 관찰한 결과 대조군(0U)과 비교하여 TAT-Cre를 투여한 모든 마우스에서 매우 높은 수준으로 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab)가 생성되고 500U을 투여한 절반 이상의 마우스에서 매우 높은 수준으로 갑상선 호르몬(T4)이 증가하는 것을 볼 수 있다(도 7a, 7b, 7c). 이는 100U을 투여한 군보다 현저하다.
또한 독립된 실험으로 BALBc;129S-Gt(ROSA)26Sor tm1(hTSHRa) 마우스(동형접합체) 2마리의 다리근육에 TAT-Cre 재조합효소(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)를 500U 농도로 근육주사하였다. 주사 전 70% 에탄올로 주사 부위를 민감화시켰다. 4, 8, 12, 20주째 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab) 발현과 갑상선 호르몬(T4) 증가 여부를 관찰한 결과 항갑상선수용체 항체(TSHR Ab)가 생성되고 갑상선 호르몬(T4)이 증가하는 것이 20주 이상 지속된다는 것을 확인하였다(도 8a, 8b).
결론적으로, 투여되는 TAT-Cre 용량은 다양한 용량에서 가능하나 적어도 50U이상에서 유효량의 항체 생성이 가능한 것으로 생각되며, 1500U 이상 투여시 지나치게 많은 항원 생산으로 인한 항체 중화 현상 및 투여횟수 증가 등의 난점이 있어, 50-1500U, 보다 구체적으로는 100-1250U, 보다 더 구체적으로는 200-1000U, 가장 구체적으로는 250-750U로 투여하는 것이 적절한 것으로 확인되었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Yonsei University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> A Novel Animal Model for Autoimmune Disease
<130> PDPB222125
<160> 9
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Bacteriophage P1
<400> 1
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 2
<211> 870
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hTSHRa
<400> 2
atgaggccgg cggacttgct gcagctggtg ctgctgctcg acctgcccag ggacctgggc 60
ggaatggggt gttcgtctcc accctgcgag tgccatcagg aggaggactt cagagtcacc 120
tgcaaggata ttcaacgcat ccccagctta ccgcccagta cgcagactct gaagcttatt 180
gagactcacc tgagaactat tccaagtcat gcattttcta atctgcccaa tatttccaga 240
atctacgtat ctatagatgt gactctgcag cagctggaat cacactcctt ctacaatttg 300
agtaaagtga ctcacataga aattcggaat accaggaact taacttacat agaccctgat 360
gccctcaaag agctccccct cctaaagttc cttggcattt tcaacactgg acttaaaatg 420
ttccctgacc tgaccaaagt ttattccact gatatattct ttatacttga aattacagac 480
aacccttaca tgacgtcaat ccctgtgaat gcttttcagg gactatgcaa tgaaaccttg 540
acactgaagc tgtacaacaa cggctttact tcagtccaag gatatgcttt caatgggaca 600
aagctggatg ctgtttacct aaacaagaat aaatacctga cagttattga caaagatgca 660
tttggaggag tatacagtgg accaagcttg ctggacgtgt ctcaaaccag tgtcactgcc 720
cttccatcca aaggcctgga gcacctgaag gaactgatag caagaaacac ctggactctt 780
aagaaacttc cactttcctt gagtttcctt cacctcacac gggctgacct ttcttaccca 840
agccactgct gtgcttttaa gaatcagtaa 870
<210> 3
<211> 15501
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rosa26_hTSHRa_vector
<400> 3
ccccgcggca ggccctccga gcgtggtgga gccgttctgt gagacagccg ggtacgagtc 60
gtgacgctgg aaggggcaag cgggtggtgg gcaggaatgc ggtccgccct gcagcaaccg 120
gagggggagg gagaagggag cggaaaagtc tccaccggac gcggccatgg ctcggggggg 180
ggggggcagc ggaggacgct tccggccgac gtctcgtcgc tgattggctt ttttcctccc 240
gccgtgtgtg aaaacacaaa tggcgtgttt tggttggcgt aaggcgcctg tcagttaacg 300
gcagccggag tgcgcagccg ccggcagcct cgctctgccc actgggtggg gcgggaggta 360
ggtggggtga ggcgagctga cgtgcgggcg cggtcggcct ctggcggggc gggggagggg 420
agggagggtc agcgaaagta gctcgcgcgc gagcggccgc ccaccctccc cttcctctgg 480
gggagtcgtt ttacccgccg ccggccgggc ctcgtcgtct gattggctct cggggcccag 540
aaaactggcc cttgccattg gctcgtgttc gtgcaagttg agtccatccg ccggccagcg 600
ggggcggcga ggaggcgctc ccaggttccg gccctcccct cggccccgcg ccgcagagtc 660
tggccgcgcg cccctgcgca acgtggcagg aagcgcgcgc tgggggcggg gacgggcagt 720
agggctgagc ggctgcgggg cgggtgcaag cacgtttccg acttgagttg cctcaagagg 780
ggcgtgctga gccagacctc catcgcgcac tccggggagt ggagggaagg agcgagggct 840
cagttgggct gttttggagg caggaagcac ttgctctccc aaagtcgctc tgagttgtta 900
tcagtaaggg agctgcagtg gagtaggcgg ggagaaggcc gcacccttct ccggaggggg 960
gaggggagtg ttgcaatacc tttctgggag ttctctgctg cctcctggct tctgaggacc 1020
gccctgggcc tgggagaatc ccttgccccc tcttcccctc gtgatctgca actccagtct 1080
ttctagcatc tgtagggcgc agtagtccag ggtttccttg atgatgtcat acttatcctg 1140
tccctttttt ttccacagct cgcggttgag gacaaactct tcgcggtctt tccagtggtt 1200
aattaagtcg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 1260
ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 1320
gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 1380
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 1440
cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 1500
ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1560
tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc 1620
tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt 1680
gtgcagcgat gggggcgggg ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg 1740
gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa 1800
gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg 1860
ggcgggagtc gctgcgcgct gccttcgccc cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg 1920
cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc 1980
tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg 2040
tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc tttgtgcggg gggagcggct cggggggtgc 2100
gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc gtgcggctcc gcgctgcccg gcggctgtga 2160
gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcagt gtgcgcgagg ggagcgcggc 2220
cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg 2280
tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt gggcgcgtcg gtcgggctgc aaccccccct 2340
gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg cccggcttcg ggtgcggggc tccgtacggg 2400
gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg ggggtggcgg caggtggggg tgccgggcgg 2460
ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc gggggagggg cgcggcggcc cccggagcgc 2520
cggcggctgt cgaggcgcgg cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag 2580
ggcgcaggga cttcctttgt cccaaatctg tgcggagccg aaatctggga ggcgccgccg 2640
caccccctct agcgggcgcg gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg 2700
ggagggcctt cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc cctctccagc ctcggggctg 2760
tccgcggggg gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg 2820
tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca 2880
gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattcctcga 2940
gttaattaaa taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatggatccg aacaaacgac 3000
ccaacacccg tgcgttttat tctgtctttt tattgccgat cccctcagaa gaactcgtca 3060
agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg 3120
aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg 3180
tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca 3240
ttttccacca tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg 3300
tcgggcatgc gcgccttgag cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct 3360
tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg 3420
cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc 3480
attgcatcag ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc 3540
tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc 3600
acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc 3660
agttcattca gggcaccgga caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct 3720
gacagccgga acacggcggc atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg 3780
aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatggcc 3840
gatcccatat tggctgcagg gtcgctcggt gttcgaggcc acacgcgtca ccttaatatg 3900
cgaagtggac ctgggaccgc gccgccccga ctgcatctgc gtgttcgaat tcgccaatga 3960
caagacgctg ggcggggttt gctcgacatt gggtggaaac attccaggcc tgggtggaga 4020
ggctttttgc ttcctcttgc aaaaccacac tgctcgacat tgggtggaaa cattccaggc 4080
ctgggtggag aggctttttg cttcctcttg caaaaccaca ctgctcgact agtgattaaa 4140
gtcgactcgg ggacaccaaa tatggcgatc tcggcctttt cgtttcttgg agctgggaca 4200
tgtttgccat cgatccatct accaccagaa cggccgttag atctgctgcc accgttgttt 4260
ccaccgaaga aaccaccgtt gccgtaacca ccacgacggt tgttgctaaa gaagctgcca 4320
ccgccacggc caccgttgta gccgccgttg ttgttattgt agttgctcat gttatttctg 4380
gcacttcttg gttttcctct taagtgagga ggaacataac cattctcgtt gttgtcgttg 4440
atgcttaaat tttgcacttg ttcgctcagt tcagccataa tatgaaatgc ttttcttgtt 4500
gttcttacgg aataccactt gccacctatc accacaacta actttttccc gttcctccat 4560
ctcttttata ttttttttct cgagggatct ttgtgaagga accttacttc tgtggtgtga 4620
cataattgga caaactacct acagagattt aaagctctaa ggtaaatata aaatttttaa 4680
gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttgtgt attttagatt ccaacctatg 4740
gaactgatga atgggagcag tggtggaatg cctttaatga ggaaaacctg ttttgctcag 4800
aagaaatgcc atctagtgat gatgaggcta ctgctgactc tcaacattct actcctccaa 4860
aaaagaagag aaaggtagaa gaccccaagg actttccttc agaattgcta agttttttga 4920
gtcatgctgt gtttagtaat agaactcttg cttgctttgc tatttacacc acaaaggaaa 4980
aagctgcact gctatacaag aaaattatgg aaaaatattc tgtaaccttt ataagtaggc 5040
ataacagtta taatcataac atactgtttt ttcttactcc acacaggcat agagtgtctg 5100
ctattaataa ctatgctcaa aaattgtgta cctttagctt tttaatttgt aaaggggtta 5160
ataaggaata tttgatgtat agtgccttga ctagagatca taatcagcca taccacattt 5220
gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa 5280
atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc 5340
aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg 5400
tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatctgac atggtaagta agcttataac 5460
ttcgtatagc atacattata cgaagttatc ggcgcgccgc caccatgagg ccggcggact 5520
tgctgcagct ggtgctgctg ctcgacctgc ccagggacct gggcggaatg gggtgttcgt 5580
ctccaccctg cgagtgccat caggaggagg acttcagagt cacctgcaag gatattcaac 5640
gcatccccag cttaccgccc agtacgcaga ctctgaagct tattgagact cacctgagaa 5700
ctattccaag tcatgcattt tctaatctgc ccaatatttc cagaatctac gtatctatag 5760
atgtgactct gcagcagctg gaatcacact ccttctacaa tttgagtaaa gtgactcaca 5820
tagaaattcg gaataccagg aacttaactt acatagaccc tgatgccctc aaagagctcc 5880
ccctcctaaa gttccttggc attttcaaca ctggacttaa aatgttccct gacctgacca 5940
aagtttattc cactgatata ttctttatac ttgaaattac agacaaccct tacatgacgt 6000
caatccctgt gaatgctttt cagggactat gcaatgaaac cttgacactg aagctgtaca 6060
acaacggctt tacttcagtc caaggatatg ctttcaatgg gacaaagctg gatgctgttt 6120
acctaaacaa gaataaatac ctgacagtta ttgacaaaga tgcatttgga ggagtataca 6180
gtggaccaag cttgctggac gtgtctcaaa ccagtgtcac tgcccttcca tccaaaggcc 6240
tggagcacct gaaggaactg atagcaagaa acacctggac tcttaagaaa cttccacttt 6300
ccttgagttt ccttcacctc acacgggctg acctttctta cccaagccac tgctgtgctt 6360
ttaagaatca gtaacccggg gggatccact agttctagag cggccgatca gcctcgactg 6420
tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 6480
aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 6540
gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 6600
aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa 6660
ccagctgggg ctcgagatcc actagttcta gcctcgaggc tagagcggcc gccgcgccga 6720
tatcgaattc gctagaagat gggcgggagt cttctgggca ggcttaaagg ctaacctggt 6780
gtgtgggcgt tgtcctgcag gggaattgaa caggtgtaaa attggaggga caagacttcc 6840
cacagatttt cggttttgtc gggaagtttt ttaatagggg caaataggaa aatggaggat 6900
aggagtcatc tggggtttat gcagcaaaac tacaggtata ttgcttgtat ccgcctcgga 6960
gatttccatg aggagataaa gacatgtcac ccgagtttat actctcctgc ttagatccta 7020
ctacagtatg aaatacagtg tgcgaggtag actatgtaag cagatttaat cattttaaag 7080
agcccagtac ttcatatcca tttctcccgc tccttctgca gccttatcaa aaggtattta 7140
gaacactcat tttagcccca ttttcattta ttatactggc ttatccaacc cctagacaga 7200
gcattggcat tttccctttc ctgatcttag aagtctgatg actcatgaaa ccagacagat 7260
tagttacata caccacaaat cgaggctgta gctggggcct caacactgca gttcttttat 7320
aactccttag tacacttttt gttgatcctt tgccttgatc cttaattttc agtgtctatc 7380
acctctcccg tcaggtggtg ttccacattt gggcctattc tcagtccagg gagttttaca 7440
acaatagatg tattgagaat ccaacctaaa gcttaacttt ccactcccat gaatgcctct 7500
ctcctttttc tccattataa ctgagctata ccattaatgg tttcaggtgg atgtctcctc 7560
ccccaatata cctgatgtat ctacatattg ccaggctgat attttaagac ataaaggtat 7620
atttcattat tgagccacat ggtattgatt actgctacta aaattttgtc attgtacaca 7680
tctgtaaaag gtggttcctt ttggaatgca aagttcaggt gtttgttgtc tttcctgacc 7740
taaggtcttg tgagcttgta ttttttctat ttaagcagtg ctttctcttg gactggcttg 7800
actcatggca ttctacacgt tattgctggt ctaaatgtga ttttgccaag cttcttcagg 7860
acctataatt ttgcttgact tgtagccaaa cacaagtaaa atgattaagc aacaaatgta 7920
tttgtgaagc ttggttttta ggttgttgtg ttgtgtgtgc ttgtgctcta taataatact 7980
atccaggggc tggagaggtg gctcggagtt caagagcaca gactgctctt ccagaagtcc 8040
tgagttcaat tcccagcaac cacatggtgg ctcacaacca tctgtaatgg gatctgatgc 8100
cctcttctgg tgtgtctgaa gaccacaagt gtattcacat taaataaata atcctccttc 8160
ttcttctttt ttttttttta aagagaatct gtctccagta gaattactga agtaatgaaa 8220
tactttgtgt ttgttccaat atggagccaa taatcaaata ctcttagcac tggaaatgta 8280
ccaaggaact attttattta agtgactgtg gacagaggag ccataactgc agacttgtgg 8340
gatacagaag accaatgcag acttaatgtc ttttctctta cactaagcaa taaagaaata 8400
aaaattgaac ttctagtatc ctatttgtta aactgctagc tttactaact tttgtgcttc 8460
atctatacaa agctgaaagc taagtctgca gccattacta aacatgaaag caagtaatga 8520
taattttgga tttcaaaaat gtagggccag agtttagcca gccagtggtg gtgcttgcct 8580
ttatgcctta atcccagcac tctggaggca gagacaggca gatctctgag tttgagccca 8640
gcctggtcta cacatcaagt tctatctagg atagccagga atacacacag aaaccctgtt 8700
ggggaggggg gctctgagat ttcataaaat tataattgaa gcattcccta atgagccact 8760
atggatgtgg ctaaatccgt ctacctttct gatgagattt gggtattatt ttttctgtct 8820
ctgctgttgg ttgggtcttt tgacactgtg ggctttctta aagcctcctt ccctgccatg 8880
tggtctcttg tttgctacta acttcccatg gcttaaatgg catggctttt tgccttctaa 8940
gggcagctgc tgagtttgca gcctgatttc cagggtgggg ttgggaaatc tttcaaacac 9000
taaaattgtc ctttaatttt tttttaaaaa atgggttata taataaacct cataaaatag 9060
ttatgaggag tgaggtggac taatattaat gagtccctcc cctataaaag agctattaag 9120
gctttttgtc ttatactaac ttttttttta aatgtggtat ctttagaacc aagggtctta 9180
gagttttagt atacagaaac tgttgcatcg cttaatcaga ttttctagtt tcaaatccag 9240
agaatccaaa ttcttcacag ccaaagtcaa attaagaatt tctgacttta atgttatttg 9300
ctactgtgaa tataaaatga tagcttttcc tgaggcaggg tctcactatg tatctctgcc 9360
tgatctgcaa caagatatgt agactaaagt tctgcctgct tttgtctcct gaatactaag 9420
gttaaaatgt agtaatactt ttggaacttg caggtcagat tcttttatag gggacacact 9480
aagggagctt gggtgatagt tggtaaatgt gtttaagtga tgaaaacttg aattattatc 9540
accgcaacct actttttaaa aaaaaaagcc aggcctgtta gagcatgcta agggatccct 9600
aggacttgct gagcacacaa gagtagtact tggcaggctc ctggtgagag catatttcaa 9660
aaaacaaggc agacaaccaa gaaactacag taaggttacc tgtctttaac catctgcata 9720
tacacaggga tattaaaata ttccaaataa tatttcattc aagttttccc ccatcaaatt 9780
gggacatgga tttctccggt gaataggcag agttggaaac taaacaaatg ttggttttgt 9840
gatttgtgaa attgttttca agtgatagtt aaagcccatg agatacagaa caaagctgct 9900
atttcgaggt ctcttggtta tactcagaag cacttctttg ggtttccctg cactatcctg 9960
atcatgtgct aggcctcctt aggctgattg ttgttcaaat aacttaagtt tcctgtcagg 10020
tgatgtcata tgatttcata tatcaaggca aaacatgtta tatatgttaa acatttgact 10080
taatgtgaaa gttaggtctt tgtgggtttt gattttaatt tcaaaacctg agctaaataa 10140
gtcattttac atgtcttaca tttggtgaat tgtatattgt ggtttgcagg caagactctc 10200
tgacctagta accctcctat agagcacttt gctgggtcac aagtctagga gtcaagcatt 10260
tcaccttgaa gttgagacgt tttgttagtg tatactagtt atatgttgga ggacatgttt 10320
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gttagtgagc attgagtggc ctttaggctt gaattggagt cacttgtata tctcaaataa 10440
tgctggcctt ttttaaaagc ccttgttctt tatcaccctg ttttctacat aatttttgtt 10500
caaagaaata cttgtttgga tctccttttg acaacaatag catgttttca agccatattt 10560
tttttccttt tttttttttt ttttggtttt tcgagacagg gtttctctgt atagccctgg 10620
ctgtcctgga actcactttg tagaccaggc tggcctcgaa ctcagaaatc cgcctgcctc 10680
tgcctcctga gtgccgggat taaaggcgtg caccaccacg cctggctaag ttggatattt 10740
tgtatataac tataaccaat actaactcca ctgggtggat ttttaattca gtcagtagtc 10800
ttaagtggtc tttattggcc cttattaaaa tctactgttc actctaacag aggctgttgg 10860
actagtggac taagcaactt cctacggata tactagcaga taagggtcag ggatagaaac 10920
tagtctagcg ttttgtatac ctaccagctt atactacctt gttctgatag aaatatttag 10980
gacatctagc ttatcgatcc gtcgacggta tcgataagct tgatatcgaa ttctaccggg 11040
taggggaggc gcttttccaa ggcagtctga gcatgcgctt agcagccccg ctggcacttg 11100
gcgctacaca agtggccttg gcctcgcaca cattccacat ccaccggtag gcgccaaccg 11160
gctccgttct ttggtggccc cttcgcgcca ccttctctcc tcccctagtc aggaagttcc 11220
cccccgcccc gcagctcgcg tcgtaggacg tgacaaatgg aagtagcacg tctcactagt 11280
ctcgtcagat ggacagcacc gctgagcaat ggaagcgggt aggcctttgg ggcagcggcc 11340
aatagcagct ttgctccttc gctttctggg ctcagaggct gggaaggggt gggtccgggg 11400
gcgggctcag gggcgggctc aggggcgggg cgggcgcccg aaggtcctcc ggaggcccgg 11460
cattctgcac gcttcaaaag cgcacgtctg ccgcgctgtt ctcctcttcc tcatctccgg 11520
gcctttcgac ctgcaggtcc tcgccatgga tcctgatgat gttgttattc ttctaatctt 11580
ttgtatggaa aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct ggttatgtag attccattca 11640
aaaaggtata caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat tatgacgatg attggaaagg 11700
gttttatagt accgacaata aatacgacgc tgcgggatac tctgtagata atgaaaaccc 11760
gctctctgga aaagctggag gcgtggtcaa agtgacgtat ccaggactga cgaaggttct 11820
cgcactaaaa gtggataatg ccgaaactat taagaaagag ttaggtttaa gtctcactga 11880
accgttgatg gagcaagtcg gaacggaaga gtttatcaaa aggttcggtg atggtgcttc 11940
gcgtgtagtg ctcagccttc ccttcgctga ggggagttct agcgttgaat atattaataa 12000
ctgggaacag gcgaaagcgt taagcgtaga acttgagatt aattttgaaa cccgtggaaa 12060
acgtggccaa gatgcgatgt atgagtatat ggctcaagcc tgtgcaggaa atcgtgtcag 12120
gcgatctctt tgtgaaggaa ccttacttct gtggtgtgac ataattggac aaactaccta 12180
cagagattta aagctctaag gtaaatataa aatttttaag tgtataatgt gttaaactac 12240
tgattctaat tgtttgtgta ttttagattc caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt 12300
ggtggaatgc agatcctaga gctcgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc 12360
catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg 12420
tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc 12480
tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg 12540
ctggggatgc ggtgggctct atggcttctg aggcggaaag aaccagctgg ggctcgacct 12600
cgaggggggg cccgcggccg ccctgcaggg cgatcgctac gtacagcttt tgttcccttt 12660
agtgagggtt aattgcgcgc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt 12720
gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg 12780
gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 12840
cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 12900
tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 12960
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 13020
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 13080
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 13140
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 13200
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 13260
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 13320
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 13380
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 13440
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 13500
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 13560
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 13620
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 13680
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 13740
gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 13800
aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 13860
aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 13920
cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 13980
ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 14040
cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 14100
ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 14160
ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 14220
ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 14280
gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 14340
ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 14400
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ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 14580
cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 14640
ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 14700
aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 14760
gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 14820
gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc 14880
gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc 14940
ttataaatca aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag 15000
tccactatta aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga 15060
tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc 15120
actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa 15180
cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt 15240
agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc 15300
gtcccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc 15360
gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc 15420
agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gagcgcgcgt aatacgactc 15480
actatagggc gaattggagc t 15501
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rosa26 F primer
<400> 4
aaagtcgctc tgagttgtta t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rosa26 R primer
<400> 5
ggagcgggag aaatggatat g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hTSH-A F primer
<400> 6
gcaacgtgct ggttattgtg 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hTSH-A R primer
<400> 7
gatctggacg aagagcatca g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CreER F primer
<400> 8
aaagtcgctc tgagttgtta t 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CreER R primer
<400> 9
cctgatcctg gcaatttcg 19
Claims (16)
- 5’에서 3’방향으로 발현조절서열; loxp(locus of X-over P1) 뉴클레오타이드 서열이 양 측면에 플랭킹(flanking)된 발현차단 뉴클레오타이드; 및 자가항원 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는, 자가면역질환이 유도된 동물 제작용 유전자 전달체.
- 제 1 항에 있어서, 발현조절서열은 CAG 프로모터인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 발현차단 뉴클레오타이드는 DsRed2, GFP(green fluorescent protein), kanaR(kanamycin resistance gene), neoR(neomycin resistance gene) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 자가면역질환은 자가면역성 갑상선질환인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
- 제 4 항에 있어서, 상기 자가면역성 갑상선 질환은 그레이브스병(Graves’disease), 하시모토 갑상선염(Hashimoto’s thyroiditis), 위축성 갑상선염(atrophic thyroiditis), 무통성 갑상선염(painless thyroiditis) 및 산후갑상선염(postpartum thyroiditis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 자가항원 단백질은 갑상선 자극호르몬 수용체(TSHR) 또는 이의 기능적 일부인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 도 1로 표시되는 유전자 지도를 갖는 Rosa26 플라스미드인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 동물은 설치류 동물인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 유전자 전달체를 동물에 도입하는 단계를 포함하는 자가면역질환이 유도된 동물의 제조방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 방법은 상기 유전자 전달체가 도입된 배아줄기세포를 상기 동물에 주입함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 방법은 상기 유전자 전달체가 도입된 동물과 반복친과의 역교배를 2회 내지 6회 반복하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 방법은 상기 유전자 전달체가 도입된 동물에 TAT-Cre 재조합효소를 처리하거나 또는 Cre 재조합효소를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 TAT-Cre 재조합효소는 50-1500U으로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 동물은 설치류 동물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9 항의 방법으로 제조된 자가면역질환이 유도된 동물.
- loxp(locus of X-over P1) 뉴클레오타이드 서열이 양 측면에 플랭킹(flanking)된 발현차단 뉴클레오타이드; 및 자가항원 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 도입된, 자가면역질환이 유도된 동물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220050016A KR20230150525A (ko) | 2022-04-22 | 2022-04-22 | 신규한 자가면역질환 동물모델 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220050016A KR20230150525A (ko) | 2022-04-22 | 2022-04-22 | 신규한 자가면역질환 동물모델 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230150525A true KR20230150525A (ko) | 2023-10-31 |
Family
ID=88543397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220050016A KR20230150525A (ko) | 2022-04-22 | 2022-04-22 | 신규한 자가면역질환 동물모델 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230150525A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030009778A1 (en) | 2000-10-26 | 2003-01-09 | Allen Keith D. | Transgenic mice containing thyroid stimulating hormone receptor (TSH-R) gene disruptions |
-
2022
- 2022-04-22 KR KR1020220050016A patent/KR20230150525A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030009778A1 (en) | 2000-10-26 | 2003-01-09 | Allen Keith D. | Transgenic mice containing thyroid stimulating hormone receptor (TSH-R) gene disruptions |
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