BRPI0619665A2 - método para melhorar a expressão de um transgene em uma célula hospedeira, cassete de expressão em mamìfero, vetor, célula hospedeira, vacina de dna e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA MELHORAR A EXPRESSãO DE UM TRANSGENE EM UMA CéLULA HOSPEDEIRA, CASSETE DE EXPRESSãO EM MAMìFERO, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, VACINA DE DNA E COMPOSIçãO FARMACêUTICA. A invenção provê um método para melhorar a expressão de um transgene em uma célula hospedeira, o qual inclui as etapas de inserir um elemento promotor de capsideo (Pcap) , ou uma seqúência compreendendo o complemento reverso do elemento promotor de capsídeo (PcapR) dentro de um cassete de expressão a montante (5') de uma região do promotor/melhorador imediato/precoce de um citomegalovírus (Pcmv); inserir o transgene dentro do cassete de expressão a jusante (3') da região do promotor/melhorador imediato/precoce do citomegalovírus; inserir um vetor contendo o cassete de expressão dentro de um organismo hospedeiro; e motivar a expressão do transgene. O elemento promotor do capsídeo (Pcap) é tipicamente obtido de um circovírus, parvovirus ou anelovírus. O transgene é tipicamente expresso em um nível mais elevado do que quando expresso por um vetor contendo o cassete de expressão sem o elemento de controle de transcrição. São também reivindicados, o cassete de expressão, vetor, vacina de DNA, composição farmacêutica e o método para tratamento.

Description

"MÉTODO PARA MELHORAR A EXPRESSÃO DE UM TRANSGENE EM UMA CÉLULA HOSPEDEIRA, CASSETE DE EXPRESSÃO EM MAMÍFERO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, VACINA DE DNA E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA"

Histórico da invenção

A invenção descreve um novo promotor compósito/elemento de expressão melhorada para mamíferos.

O elemento/promotor imediato/melhorador precoce de citomegalovírus (Pcmv) é atualmente o elemento promotor de mamíferos mais conhecido, e como tal colocado acima do limite na expressão de transgene nos sistemas in vitro e in vivo.

Sumário da invenção

De acordo com uma primeira configuração da invenção, é provido um método para melhorar a expressão de um transgene em uma célula hospedeira, o método incluindo as etapas de:

inserir uma seqüência de um elemento promotor de capsídeo (Pcap) ou um complemento reverso do mesmo (PcapR) dentro de um cassete de expressão a montante (5') de um promotor imediato/precoce de citomegalovírus (Pcmv);

- inserir o transgene dentro de um cassete de expressão a jusante (3') do promotor do citomegalovírus;

- inserir o cassete de expressão dentro do organismo hospedeiro; e

- causar a expressão do transgene.

Um íntron do citomegalovírus pode ser inserido a jusante (3') do Pcmv e, um sítio de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (bgh poliA) pode ser inserido a jusante (3') do transgene.

0 transgene é tipicamente expresso em um nível superior àquele expresso no cassete de expressão sem a seqüência Pcap ou PcapR.

0 elemento promotor de capsídeo ou o complemento reverso do mesmo pode ser obtido de um circovírus tal como um circovírus Porcina tipo 1 (PCV-I), circovírus Porcina tipo 2 (PCV-2) , vírus da doença do bico e das penas (BFDV) , circovírus do canário, circovírus de columbídeos, circovírus de pato, circovírus de tentilhão, circovírus de ganso e circovírus de gaivota ou um elemento correspondente obtido de um parvovírus ou um anelovírus. 0 elemento promotor de capsídeo ou complemento reverso do mesmo pode estar localizado adjacente ao promotor imediato/precoce do citomegalovírus, ou alternativamente pode estar localizado em até 1100 pares de base a montante (5') do promotor imediato/precoce do citomegalovírus.

A célula hospedeira pode ser uma linha de célula de mamífero para expressão de transgene in vitro. Alternativamente, a célula hospedeira pode ser uma célula de um organismo hospedeiro mamífero para expressão de transgene in vivo.

De acordo com uma segunda configuração da invenção, é provido um cassete de expressão em mamífero incluindo: - um promotor citomegalovírus imediato/precoce (Pcmv); e - uma seqüência do elemento promotor de capsídeo (Pcap) ou um complemento reverso (PcapR) do mesmo localizado a montante (5') do promotor do citomegalovírus. Um transgene pode ser inserido dentro de um cassete de expressão a jusante (3') do promotor de CMV.

O cassete de expressão pode ser capaz de expressar o transgene em um nível maior do que mais aquele de um cassete de expressão que não inclui a seqüência Pcap ou PcapR.

O elemento promotor do capsídeo ou o complemento reverso do mesmo pode ser obtido de um circovírus tal como um circovírus tal como um circovírus Porcina tipo 1 (PCV-I) , circovírus Porcina tipo 2 (PCV-2), vírus da doença do bico e das penas (BFDV), circovírus do canário, circovírus de columbídeos, circovírus de pato, circovírus de tentilhão, circovírus de ganso e circovírus de gaivota ou um elemento correspondente obtido de um parvovírus tal como um parvovírus canino, ou um anelovírus tal como um torque teno vírus e um mini torque teno de vírus. A seqüência Pcap ou PcapR pode ser pelo menos 80% idêntica, mais preferivelmente, pelo menos 90% idêntica, e ainda mais preferivelmente pelo menos 95% idêntica, e ainda, mais preferivelmente 100% idêntica à qualquer uma das SEQ.ID.Nos: 1 a 18, 21, 22 ou 24.

De acordo com um aspecto ainda da invenção, é provido um vetor que inclui o cassete de expressão como descrito acima.

O cassete de expressão ou vetor pode ser inserido dentro de uma célula hospedeira, que pode ser uma linha de célula de mamífero para expressão do transgene in vitro ou uma célula de um organismo hospedeiro de mamífero para expressão de transgene in vivo.

Ainda de acordo com um aspecto adicional da invenção é provida uma célula hospedeira transformada com o cassete de expressão ou com o vetor como descrito acima. De acordo com uma configuração adicional da invenção, é provida uma vacina de DNA incluindo um cassete de expressão ou um vetor como descrito acima.

De acordo com uma configuração adicional da invenção, é provida uma composição farmacêutica incluindo o cassete de expressão ou um vetor como descrito acima. Adicionalmente, de acordo com uma configuração da invenção, é provido o uso de um vetor de DNA como descrito acima em um método para fazer um medicamento para uso em um método para tratar uma doença. De acordo com uma configuração adicional da invenção, é provido um método para tratar um paciente, o método incluindo a etapa de administrar uma vacina de DNA como descrito acima para um paciente.

A composição farmacêutica ou a vacina de DNA pode ser utilizada para tratamento terapêutico ou profilático de uma doença ou infecção, tal como HIV e/ou AIDS.

Breve descrição dos desenhos

As figuras Ia e Ib representam um clone do constructo de vetor contendo PCV-I e o constructo contendo Pcap e PcapR, onde:

A figura Ia representa o genoma de um circovírus Porcina circular nativo do tipo 1 (PCV-I) linearizado dentro do gene do capsídeo, com adição de sítios de restrição de um Spe terminal I; pTHRep®grttnC onde o genoma pCV-1 linearizado é imediatamente clonado de 5' para Pcmv (CMV I/E Pr);

A figura Ib é uma representação linear de regiões relevantes dos plasmídeos pTHRepRgrttnC, pTHPcapgrttnC e pTHPcapRgrttnC, ilustrando as posições relativas e orientações da seqüência contendo o Pcap de 184 bp clonado em relação ao Pcmv e grttnC;

As figuras 2a e 2b demonstram que os vetores contendo PCV-I não fazem replicação em células de mamíferos: a quantificação PCR em tempo real do plasmídeo digerido em Dpnl e o intacto extraído de 293 células nos dias 1-3 após a transfecção, onde:

A figura 2a representa células 293 transfectadas com pTHgrttnC, pTHRepgrttnC, ou pTHRepRgrttnC, com ou sem a adição do plasmídeo pcDNARep (expressando as proteínas PCV-I Rep e Rep' sob Pcmv, e potencialmente os DNAs circulares trans-replicados contendo a origem PCV-I de replicação, bem como pTHRepgrttnC e pTHRepRgrttnC). O DNA foi extraído a partir das células transfectadas em 48 horas após a transfecção. Os resultados demonstram que o PCV-I contendo os plasmídeos nem replica ou pode ser trans-replicado a partir do pcDNARep;

A figura 2b representa células 293 transfectadas com pCI e pCIPCV (plasmídeos originais recebidos de LSBC, e presume-se que sejam replicantes). Os resultados demonstram que o tipo de plasmídeo parental não- replicante, pCI, o PCV-I contendo o plasmídeo, pCIPCV, não replica nas células 293.

A figura 3 demonstra que a expressão melhorada de Prep a partir do Pcmv, e que nenhum plasmídeo de replicação está envolvido:

- deleção do íntron do gene rep melhora a expressão sobre o pTHgrttnC, apesar da perda da capacidade de fazer a extensão completa da proteína Rep regressar a Prep. A deleção do sítio de ligação Rep/Rep' em Prep e mais o gene rep em pTHDRepgrttnC permite ainda algumas melhoras da expressão sobre pTHgrttnC, uma vez que o Prep residual ainda codifica todo o sítio de ligação do fator de transcrição em Prep.

A figura 4 demonstra que a incorporação tanto da seqüência de Pcap quanto da seqüência PcapR sozinha dentro de pTHgrttnC resulta em um nível similar de expressão do antígeno p24 para a incorporação de todo o genoma de PCV-I em pTHgrttnC (ou seja, pTHRepRgrttnC). A adição do fragmento de 184 bp (PcapR) na orientação oposta sozinha dentro de pTHgrttnC (para resultar no pTHPcapRgrttnC) melhorando a expressão em uma extensão similar;

A figura 5 representa a longevidade da resposta CTL do prime para o epítopo CD8 e grttnC durante 90 dias pelos vetores contendo a seqüência PCV-I:

- as fêmeas de camundongos BALB/c (5 animais por grupo) foram inoculados intramuscularmente com 2 χ 100 μg doses, dados 28 dias separadamente, de pTHgrttnC, pTHRepgrttnc, pTHRepRgrttnC, ou o vetor vazio (não mostrado). Os camundongos foram sacrificados nos dias 12, 40, 68 e 90 após a segunda inoculação do DNA, e os esplenócitos foram colhidos para o ensaio IFN-γ ELISPOT. A média dos pontos anteriores foi subtraída para dar os pontos líquidos/106 esplenócitos.

A figura 6 representa a resposta CTL para o epítopo RT CD8 de grttnC. A resposta à primeira dose de DNA com e sem uma elevação do MVA:

As fêmeas de camundongos BALB/c (5 animais por grupo) foram inoculadas intramuscularmente com 2 χ 100 μg ou 2 χ 10 ug doses, dados 28 dias separadamente, de pTHgrttnC, pTHRepgrttnc, pTHRepRgrttnC, ou o vetor pTHRepR (não mostrado). Os camundongos foram sacrificados 12 dias após a segunda inoculação do DNA, e os esplenócitos foram colhidos para o ensaio IFN-γ ELISPOT. Os grupos adicionais de camundongos, inoculado como acima, foram elevados com 10e4 pfu SAAVIMVA-C (r.grttnC clonado dentro de MVA) 56 dias após a segunda elevação do DNA. Os camundongos foram sacrificados 12 dias após a elevação de MVA, e os esplenócitos foram colhidos no ensaio IFN-γ ELISPOT. A média dos pontos anteriores foi subtraída para dar os pontos líquidos/106 esplenócitos.

A figura 7 representa a resposta CTL para o epítopo RT CD 8 de grttnC. Comparações entre pTHgrttnC, pTHRepRgrt tnC, pTHPcapgrttnC e pTHPcapRgrttnC quando da primeira dose de DNA:

As fêmeas de camundongos BALB/c (5 animais por grupo) foram inoculadas intramuscularmente com 2 χ 100 μg dose, dados 28 dias separadamente, de pTHgrttnC, pTHRepRgrttnC, pTHPcapgrttnC, ou pTHPcapRgrttnC. Os camundongos foram sacrificados 12 dias após a segunda inoculação do DNA, e os esplenócitos foram colhidos para o ensaio IFN-γ ELISPOT. A média dos pontos anteriores foi subtraída para dar os pontos líquidos/10^6 esplenócitos.

A figura 8 representa a seqüência de nucleotídeos do fragmento Pcap mostrando os sítios de ligação do fator de transcrição da célula hospedeira:

190 bp mostram (SEQ.ID.No: 2 7) - entretanto, na clonagem dentro do sítio de Spe I no vetor, essencialmente, o fragmento pode ser considerado por ter 184 bp (SEQ.ID.NO: 1). A seqüência Pcap é mostrada na mesma orientação que a da direção da transcrição do gene do capsídeo. Observe que como um resultado, a seqüência mostrada abaixo é o complemento reverso da convenção publicada que representa a seqüência do DNA circovírus no sentido (+) do vírion.

O núcleo da região Pcap (102 bp), como identificado em Mankerts et al., 2004, é mostrado sublinhado;

O sítio de clonagem Spe I é mostrado em itálico (ACTAGT).

O nucleotídeo 44 = A é mostrado em negrito = diferença de nucleotídeo (fita C no sentido para a transição T) com relação às seqüências PCV-I publicada; Como relatado em Mankertz et al., 2004;

Seqüência de nucleotídeos destacada 47-59 = Interface para a ligação do fator de transcrição AP3 na célula hospedeira;

Seqüência de nucleotídeos destacada 60-65 = Interface para a ligação do fator de transcrição Spl na célula hospedeira;

Seqüência de nucleotídeos destacada 139-144 = Interface para a ligação do fator de transcrição AP2 na célula hospedeira;

Como identificado usando o dispositivo de busca em banco de dados on-line, TFSEARCH ver 1,3;

Seqüências de nucleotídeos em negrito 28-34 = Interface para a ligação do fator de transcrição cdxA na célula hospedeira;

Seqüências de nucleotídeos em negrito 48-56 = Interface para a ligação do fator de transcrição STATx na célula hospedeira;

Seqüências de nucleotídeos em negrito 73-80 = Interface para a ligação do fator de transcrição CREB na célula hospedeira;

Seqüências de nucleotídeos em negrito 140-152 = Interface para a ligação do fator de transcrição c-Ets- na célula hospedeira;

Seqüências de nucleotídeos em negrito 145-154 = Interface para a ligação do fator de transcrição HSF2 na célula hospedeira;

A figura 9 representa a seqüência de nucleotídeos do fragmento PcapR mostrando os sítios de ligação do fator de transcrição da célula hospedeira:

190 bp mostram (SEQ.ID.No: 28) - entretanto, na clonagem dentro do sítio de Spe I no vetor, essencialmente, o fragmento pode ser considerado por ter 184 bp (SEQ.ID.NO: 2). A seqüência PcapR é mostrada na orientação oposta a da direção da transcrição do gene do capsídeo. Observe que como um resultado, a seqüência mostrada abaixo representa a seqüência do DNA circovírus no sentido (+) do vírion.

O sítio de clonagem Spe I está mostrado em itálico (ACTAGT).

O nucleotídeo 147 = T é mostrado em negrito = diferença de nucleotídeo (fita C no sentido para a transição T) com relação às seqüências PCV-I publicada.

Como identificado usando um dispositivo de busca em banco de dados on-line, TFSEARCH versão 1,3;

Seqüências de nucleotídeos em negrito 37-46 = Interface para a ligação do fator de transcrição HSF1/HSF2 na célula hospedeira;

Seqüências de nucleotídeos em negrito 59-72 = Interface para a ligação do fator de transcrição c/EBPb na célula hospedeira;

Seqüências de nucleotídeos em negrito 91-100 = Interface para a ligação do fator de transcrição GATA-I na célula hospedeira;

Seqüências de nucleotídeos em negrito 125-130 = Interface para a ligação do fator de transcrição AP2 na célula hospedeira;

Seqüências de nucleotídeos em negrito 145-154 = Interface para a ligação do fator de transcrição HSF2 na célula hospedeira;

Seqüência de nucleotídeos destacada 120-129 e 149-158 = conservado o último elemento (CLE), como identificado em Velten ET AL., 2005;

As figuras 10a e 10b representam a seqüência grttnC do DNA (SEQ.ID.NO: 19):

O sítio Hind III (negrito, nucleotídeos destacados 1-6) e o sítio Xba I (negrito, nucleotídeos destacaddos 3682- 3687) = sítios para clonagem da seqüência grttnC dentro de pTH;

A figura 11 representa a seqüência de DNA PCV-I linearizada, como clonado dentro de pTHgrttnC para resultar em pTHRepgrttnC (SEQ.ID.Nos.: 21 e 29). Sítios Spe I terminais (negrito) utilizado para clonar o genoma PCV-I linearizado dentro do sítio de restrição Spe I imediatamente adjacente a 5' para o promotor CMV em pTHgrttnC;

A figura 12 representa a seqüência de DNA PCV-I linearizada, como clonado (complemento reverso) dentro de pTHgrttnC para resultar em pTHRgrttnC (SEQ.ID.Nos.: 22 e 30) .

Sítios Spe I terminais (negrito) utilizado para clonar o genoma PCV-I linearizado dentro do sítio de restrição Spe I imediatamente adjacente a 5' para o promotor CMV em pTHgrttnC;

As figuras 13a e 13b representam a seqüência de PTH linearizada (SEQ.ID.No.: 20):

Mostrando o sítio Spe I terminais (negrito, sublinhado, nucleotídeos destacados 751-756) imediatamente 5' para o núcleo da região do elemento promotor imediato/precoce/melhorador de Pth para CMV. Este é o sítio de inserção para o genoma PCV-I linearizado (na orientação), e Pcap, e PcapR.

0 sítio Hind III (negrito, nucleotídeos destacados 2394- 2315) e o sítio Xba I (negrito, nucleotídeos destacados 2394-2399) = sítios de clonagem para inserir grttnC; A figura 14 representa a seqüência PCV-I mostrando o gene Prep e rep deletado do íntron (codificando a proteína Rep' apenas) (SEQ.ID.NO. :23 ) . Como relatado em Mankertz et al. , 2004.

Seqüência de nucleotídeo destacados 69-80 = Interface para a ligação do fator de transcrição AP3 na célula hospedeira;

Seqüência de nucleotídeo destacados 120-125 = Interface para a ligação do fator de transcrição Spl na célula hospedeira;

Seqüência de nucleotídeo destacada 187-192 = Interface para a ligação do fator de transcrição AP4 na célula hospedeira;

Seqüência de nucleotídeo destacada 153-164 = Interface USF/MLTF na célula hospedeira;

Seqüência de nucleotídeo destacada 166-172 = TATA Box; Seqüência de nucleotideo destacada 174-180 = Interface ISRE ;

Interface de ligação de Rep/Rep' de Hli H2, H3 e H4 são mostrados sublinhados; ATG e TGA (truncada) da região de abertura de leitura de rep' estão mostrados em negrito;

A figura 15 representa a seqüência PCV-I mostrando Prep com deleção do sítio de ligação da proteína Rep/Rep' e do gene rep truncado em 5' severamente (não codificante do remanescente) (SEQ.ID.NO: 24).

A seqüência PCV-I mostrando uma deleção de 6 02 bp, conduzindo a uma deleção inclusive de H2, H3, e H4 no sítio de ligação Rep/Rep' em Prep e a deleção de todos, mas 133 dos nucleotídeos terminais-3' do gene rep. II = s'tio de deleção de 602 bp.

Como relatado em Mankertz et al., 2004.

Seqüência de nucleotideo destacada 69-80 = Interface para a ligação do fator de transcrição AP3 na célula hospedeira;

Seqüência de nucleotideo destacada 120-125 = Interface para a ligação do fator de transcrição Spl na célula hospedeira;

Seqüência de nucleotideo destacada 187-192 = Interface para a ligação do fator de transcrição AP4 na célula hospedeira;

Seqüência de nucleotideo destacada 153-164 = Interface USF/MLTF na célula hospedeira;

Seqüência de nucleotideo destacada 166-172 = TATA Box; Seqüência de nucleotideo destacada 174-180 = Interface ISRE;

Interface de ligação de Rep/Rep' do Hl residual é mostrada sublinhada;

A figura 16a ilustra o alinhamento do circovírus selecionado das seqüências de DNA equivalente a região PCV-I PcapR;

A figura 16b ilustra seqüências de DNA complementar reversa do circovírus selecionado equivalente para uma seqüência de PCV-I Pcap;

Circovírus de canário: número de acesso DQ339095 (SEQ.ID.Nos: 3 e 4);

Circovírus de ganso: número de acesso NC_003054 (SEQ.ID.Nos: 5 e 6);

Circovírus de pato: número de acesso AJ964962(SEQ.ID.Nos: 7 e 8);

Circovírus de columbídeos isolado zj 1: número de acesso DQ090945 (SEQ.ID.Nos: 9 e 10);

Circovírus de gaivota: número de acesso NC_008521 (SEQ.ID.Nos: 11 e 12) ;

Circovírus de tentilhão: número de acesso NC_008522 (SEQ.ID.Nos: 13 e 14);

Vírus da doença do bico e das penas isolado AFG3-ZA: número de acesso AY450443(SEQ.ID.Nos: 15 e 16);

Cepa 375 do circovírus Porcina do tipo 2: número de acesso AY256460 (SEQ.ID.Nos: 17 e 18);

As figuras 17a-17k, representam os sítios de ligação do fator de transcrição potencial nas regiões Pcap do circovírus da figura 16.

Descrição detalhada da invenção

A invenção provê um método para melhorar a expressão de um transgene em uma célula hospedeira, que inclui as etapas de inserir um elemento de controle de transcrição viral dentro de um cassete de expressão de mamífero a montante (5') de um promotor principal para um vetor; inserir o transgene dentro do cassete de expressão a jusante (3') do promotor principal; inserir um vetor contendo o cassete de expressão dentro dos organismos hospedeiros; e causar a expressão de um transgene. Como resultado, o transgene é tipicamente expresso em um nível superior àquele quando expresso por um vetor contendo o cassete de expressão sem o elemento de controle de transcrição.

O elemento de controle de transcrição é um elemento promotor de capsídeo (Pcap) de um circovírus, tal como um circovírus Porcina do tipo 1 (PCV-I), circovírus Porcina do tipo 2 (PCV-2) , vírus da doença do bico e das penas (BFDV), circovírus de canário, circovírus de columbídeos, circovírus de pato, circovírus de tentilhão, circovírus de ganso e circovírus de gaivota ou um elemento correspondente a partir de um parvovírus ou um anelovírus, ou uma seqüência compreendendo o complemento reverso do elemento promotor de capsídeo (PcapR). 0 promotor é geralmente uma região promotora imediata/precoce melhorada/ (Pcmv) e, opcionalmente, sua seqüência A do íntron CMV a jusante (3'), um elemento promotor SV4 0, ou um outro elemento promotor apropriado. Exemplos de células apropriadas são os da linha de célula de mamífero para expressão de transgene in vitro ou um organismo hospedeiro de mamífero para a expressão de transgene in vivo.

O vetor como descrito aqui tem vários usos, incluindo a produção de uma composição farmacêutica ou vacina para tratamento profilático ou terapêutico de um humano ou de um animal com uma infecção ou doença, tal como HIV/AIDS. Nos exemplos abaixo, um fragmento de DNA 184 bp (Figura 8; SEQ.ID.NO: 1) contendo um elemento promotor do capsídeo principal de 102 bp (Pcap) do circovírus de Porcina do tipo 1 (PCV-I); ou o mesmo fragmento de 184 bp clonado na orientação reversa (PcapR) (Figura 9; SEQ.ID.NO: 2), foi inserido imediatamente adjacente 5' e

ao núcleo da região da região do promotor imediato/precoce melhorado do citomegalovírus (Pcmv) e sua seqüência A do íntron CMV a jusante (3') em um vetor de expressão de mamífero (o fragmento foi de 190 bp quando flanqueado pelos sítios de restrição não-cortados (SEQ.ID.NO: 27)). Um transgene foi subseqüentemente clonado dentro de um vetor. 0 plasmídeo purificado contendo nos elementos acima foi tanto transfectado dentro de uma de célula de mamífero para a expressão de transgene in vitro, ou foi inoculado dentro de um organismo hospedeiro mamífero como um agente de terapia gênica ou de vacinação. O híbrido Pcap-Pcmv ou o híbrido PcapR-Pcmv conduz a uma expressão melhorada em 2- a 3 vezes in vitro de um transgene inserido a 3' para o elemento híbrido Peap-Pemv ou o elemento híbrido PcapR- Pcmv em 3'.

O elemento promotor PCV-1 Peap relacionado acima foi previamente mapeado utilizando um sistema de expressão de luciferase (Mankertz et al.), mas até agora não foi contemplado como sendo de utilidade em aplicações práticas de expressão de transgene, uma vez que por si mesmo ele não é um promotor forte. Em adição, o fragmento completo de 184 bp inclui ainda os sítios de ligação do fator de transcrição do hospedeiro ainda não previamente observado por Mankertz et al., Foi observado também previamente que contempla que a seqüência orientada reversa (PcapR) também confere a atividade melhorada a expressão do transgene, e que o sítio de ligação do fator de transcrição do hospedeiro ainda são codificados na seqüência PcapR. O elemento Pcmv foi previamente combinado com elementos diferentes doador/receptor no íntron a jusante (3'), o que aumenta os níveis de expressão do transgene por melhoria da eficiência do processo de transcrição do transgene mRNA (Barouch ET al., 2005). O vetor pTH é um vetor de alto nível de expressão, e contém uma seqüência de íntron resistente a jusante do promotor CMV (Figura IA). Entretanto, a adição de um elemento Pcap ou um elemento PcapR dentro do plasmídeo pTHgrttnC a montante do promotor CMV em pTH (Figura 1B) resultando na elevação para um aumento adicional nos níveis de expressão de grttnC durante e acima da contribuição existente da seqüência do íntron residente em pTHgrttnC.

É contemplado que os elementos Pcap ou PcapR podem reter uma atividade melhorada quando clonada em até 110 0 bp a montante (5') do elemento Pcmv (esta é a distância do elemento Pcap a partir de Pcmv quando Pcap está presente na seqüência parente RepR em pTHRepRgrttnC). Ê também contemplado que a invenção irá trabalhar com os elementos Pcap ou PcapR correspondentes de outros circovírus (Figuras 16 e 17) , tais como o circovírus de Porcina do tipo 2 (PCV-2) (SEQ.ID.NOs: 17 e 18), vírus da doença do bico e das penas (BFDV) (SEQ.ID.Nos: 15 e 16), circovírus de canário (SEQ.ID.Nos: 3 e 4), circovírus de columbídeos (SEQ.ID.Nos: 9 e 10), circovírus de pato (SEQ.ID.Nos: 7 e 8), circovírus de pintassilgo (SEQ.ID.Nos: 13 e 14), circovírus de ganso (SEQ.ID.Nos: 5 e 6) e circovírus de gaivota (SEQ.ID.Nos: 11 e 12) ou parvovírus tais como parvovírus canino, ou anelovírus, tal como torque teno vírus e mini torque teno vírus, uma vez que estes gêneros de vírus pertencem à mesma família que a do circovírus. A presente invenção será ainda descrita pelos exemplos a seguir. Os referidos exemplos, entretanto, não são construídos como limitativos de qualquer forma para o espírito e o escopo de proteção da invenção.

EXEMPLOS

Clonagem e Expressão de PCV:

Para facilitar a comparação com os constructos de vacinas de DNA existentes do depositante, pTHgrttnC (Burges et al., Figura 10 e 13; SEQ.ID.Nos: 19 e 20), um genoma PCV- 1 linearizado (Figura 11; SEQ.ID.Nos: 21 e 2 9) derivado do plasmídeo pCIPCV-9 (obtido de "Large Scale Biology Corporation"; USA; e descrito na publicação do pedido de patente norte-americano No.: US 2003/0143741, o conteúdo destes incorporados aqui por referência em sua íntegra), foi sub-clonado dentro de pTHgrttnC de modo que o genoma foi posicionado imediatamente em 5' para o imediato/promotor precoce/melhorador (Pcmv) em pTHgrttnC.

O genoma de PCV foi clonado em ambas as orientações (Figura 1) , resultando em pTHRepgrttnC, onde o gene associado a replicação de PCV (rep) constitui na mesma orientação como o poli-gene grttnC inserido (figura 11; SEQ.ID.Nos: 21 e 2 9), e pTHRepRgrttnC, onde rep conduz em uma orientação oposta a grttnC (Figura 12; SEQ.ID.Nos: 22 e 30) .

Os níveis aumentados de expressão do antígeno estão demonstrados por ambos pTHRepgrttnC e pTHRepRgrttnC em células HEK2 93 comparado ao pTHgrttnC, com pTHRepRgrttnC mostrando uma expressão elevada. A expressão de grttnC foi ensaiada por ELISA p24 e correlacionada com a quantidade do plasmídeo presente nas amostras de célula (ensaiadas por PCR em temo real) .

Foi observado que a orientação do genoma PCV inserido em pTHgrttnC afetou ambos o nível e o padrão de expressão de grttnC obtido durante o tempo, e isto foi ainda investigado.

Expressão aumentada no vetor PCV devido ao efeito promotor e não devido a replicação do vetor: As células HEK293 (da American Type Culture Collection (ATCC - número do catálogo CRC-1573)) foram transfectados com DNA plasmidial, e colhidas nos dias 1, 2 e 3 após a transfecção. Após as células terem sido lavadas, o DNA total foi extraído e o plasmídeo presente em 2 0 ng do extrato foi quantificado por PCR em tempo real, usando incorporação verde Sybr e primers de oligonucleotídeos vetores-específicos. As seqüências de primer utilizados se ligam ao plasmídeo pTH (pTHgrttnC) , pCI (Promega) e pcDNA3,l/Zeo (Invitrogen) - pTH17F; 5'-CCTAACTACGGCTACAC- 3' (SEQ.ID.No: 25); Pth 18R; 5'-CGTAGTTATCTACACGAC-3' (SEQ.ID.No: 26). As seqüências dos primers foram obtidas de Jo van Harmelen, IIDMM, África do Sul. Adicionalmente, alíquotas totais do DNA foram digeridas durante a noite com a enzima de restrição, Dpn I (da Roche) , que, devido a sua especificidade de metilação, digere apenas o plasmídeo de DNA transfectado produzido bacterianamente (entrada de DNA) , mas não qualquer DNA que pode ter sido replicado em células de mamífero (por exemplo, HEK2 93). 0 plasmídeo digerido (no DNA total) também foi quantificado pelo PCR como acima. Quantidades equivalentes de DNAs totais digeridos e não-digeridos foram utilizadas. (Replicantes refere-se aqui à capacidade do plasmídeo em replicar em células de mamíferos, além das células bacterianas). A expressão melhorada dos vetores PCV sobre pTH (Figura 13; SEQ.ID.NO. 20) foi descoberta e foi demonstrada por ser devido aos promotores PCV agindo em concerto com Pcmv em pTH, e não devido ao vetor de replicação (Figura 2, figura 3). Assim, pTHRepgrttnC, o promotor do gene rep (Prep) age em concerto com Pcmv, e em pTHRepRgrttnC, o promotor de gene do capsídeo PCV (Pcap) age com Pcmv.

Experimentos para demonstrar esta inclusão:

- demonstração (usando digestão por DPn I/PCR em tempo real) que sem o plasmídeo de replicação ocorreu nas células transfectadas. Assim, a proporção do plasmídeo extraído das células transfectadas declinou sobre o tempo na mesma taxa que a do plasmídeo não contendo PCV e sem novos plasmídeos foi formado nas células transfectadas durante aquele tempo. Isto foi determinado para ambos os constructos baseados em PCV, do depositante e da "Large Scale Biology Corporation", (figura 2).

A deleção do íntron rep PCV-I (Figura 14; SEQ.ID.NO: 23) de pTHRepgrttnC resultou no aumento da expressão de grttnC (Figura 3). Esta deleção previne a formação de uma das proteínas Rep requeridas para a replicação. A mesma proteína age para reprimir a Prep, e sua ausência permite a ajuda para a repressão de Prep, com um acumulo aumentado resultante da GrttnC expresso. Assim, a expressão aumentada em pTHRep GrttnC resulta da atividade de Prep mais do que do aumento replicativo no número de cópias do plasmídeo. A deleção dos sítios de ligação da proteína Rep/Rep' em Prep e a deleção de mais do que um gene rep a partir da extremidade 5', mas ainda conduzindo aos sítios de ligação do fator de transcrição do hospedeiro em Prep (Figura 15; SEQ.ID.No: 24), rendendo um aumento modesto na expressão sobre pTH, indicando ainda a ação dos elementos promotores, além dos plasmídeos contendo o plasmídeo de replicação do elemento dirigente PCV-I como a fonte da expressão de transgene aumentada na seqüência PCV-I (figura 3).

A adição das seqüências contendo Pcap de 184 bp sozinha (SEQ.ID.NO: 1) dentro do pTHgrttnC melhorando a expressão de grttnC na mesma extensão do que na adição do genoma PCV completo para a orientação de RepR. Inesperadamente, a adição da seqüência de Pcap na orientação reversa (PcapR) (SEQ.ID.NO: 2) também aumenta o nível de expressão de grttnC sobe àquela do plasmídeo parente, pTHgrttnC (Figura 4).

Comparação da imunogenicidade de murino entre os vetores baseados em pTH e PCV:

As respostas CTL em fêmeas de camundongos BALB/c retiradas pelos clones baseados em PCV protótipo, pTHRepgrttnC e pTHRepRgrttnC foram comparadas contra àquelas retiradas pelo pTHgrttnC.

Ensaios de IFN-γ ELISPOT demonstraram que todos os três constructos gerados pelas respostas CTL para 10 a 15 GrttnC dos epítopos CD4 e CD8 testados. Devido ao epítopo RT CD8de GrttnC parecer ser imuno-dominante em camundongos Balb/c, este epítopo foi escolhido como um marcador para a comparação da imunogenicidade entre os constructos baseados em PCV e pTHgrttnC.

A longevidade das respostas CTL retiradas de 2 administrações intramusculares (i.m) de inoculações de DNA de 10 0 ug cada, dadas em 2 8 dias separadamente, foi medida durante 90 dias seguido de uma segunda inoculação de DNA. Cinco camundongos por grupo de tratamento foram testados. As respostas CTL na mesma faixa de erro foram retiradas por pTHgrttnC e pTHRepRgrttnC, embora pTHRepgrttnC retirou uma resposta superior (Figura 5) . Foi observado que o nível de resposta de CTL para pTHgrttnC e pTHRepRgrttnC declinou para a mesma extensão durante o 90 dias do período de teste. Ao contrário, a resposta CTL para pTHRepgrttnC foi dupla de modo que outros constructos nos 12 dias após a primeira, caíram abaixo do nível de resposta visto para o constructo pTH e para o pTHRepR no 40° dia, porém foi então elevado no 90° dia, após a inoculação, sendo a resposta CTL para o pTHRepgrttnC novamente duas vezes maior do que a vista para o pTHgrttnC e pTHRepRgrttnC. Este efeito foi observado para muitos dos epítopos testados. Os vetores baseados em PCV foram descobertos por serem superiores aos pTH em uma dosagem do primeiro DNA reduzida em 10 vezes (2 χ primeira dose, 28 dias separado, de 10 μg dados i.m., em 5 fêmeas de camundongo Balb/c por tratamento). Neste nível, ambos, pTHRepgrttnC e pTHRepRgrttnC retiradas significativamente melhor as respostas CTL do que àquela de pTHgrttnC tanto em um nível de dose de 10 μg ou em 10 0 μg, com o pTHRepgrttnC retirada na melhor resposta (figura 6).

0 efeito da elevação dos camundongos Balb/c foi testado com uma dose baixa (IO4 pfu) de SAAVIMVA-C administrado i.m. 56 dias após a segunda, de duas inoculações i.m. do DNA tanto em uma dose de 10 μg quanto em uma dose de 100 μg, dadas 2 8 dias separadamente. A resposta elevada para o epítopo RT CD8 nos primeiros camundongos com 2 χ 10 μ9 tanto para pTHRepgrttnC quanto para pTHRepRgrttnC foi mais do que duas vezes do que a retirada nos primeiros camundongos com 2 χ 10 μg de pTHgrttnC (figura 6) . Em adição, a resposta elevada após a primeira dose em um nível de 10 μg com pTHRepgrttnC foi quase maior do que a resposta elevada após a primeira dosagem com 2 χ 100 μg tanto do pTHgrttnC quanto para pTHRepRgrttnC (figura 6).

Em outras palavras, a primeira com um vetor baseado em PCV em um nível de 10 μg resultou quase em uma resposta melhora, após a elevação com IO4 pfu de SAAVIMVA-C, como a primeira com pTHgrttnC em dez vezes a primeira dosagem. Foi observado, entretanto, em experimentos subseqüentes, que as seqüências de de gene Prep/rep no plasmídeo pTHRep contribui para ser instável, e desse modo todo o trabalho foi concentrado no constructo pTHRepR estável e em seus derivados Pcap e PcapR. As seqüências contendo Pcap restrito com 184 bp SPI (figura 8) foram sub-clonadas dentro de pTHgrttnc de modo que o fragmento foi posicionado imediatamente em 5' para o promotor imediato/promotor precoce/melhorador de CMV (Pcmv) em pTHgrttnC, para resultar em pTHPcappgrttnC. A seqüência contendo Pcap restrito por SPeI de 184 bp (figura 9) foi sub-clonada dentro de pTHgrttnC de modo que o fragmento foi posicionado imediatamente em 5' para o promotor imediato/promotor precoce/melhorador (Pcmv) em pTHgrttnC, para resultar em pTHPcapRgrttnC.

Os vetores baseados em Pcap- e PcapR foram descoberto por serem superiores ao pTH na primeira resposta de CTL para um epítopo RT imuno-dominante de Grttnc em camundongos BALB/c (2 χ a primeira dose, 2 8 dias separadamente, de 100 μg dado em i.m., em 5 fêmeas de camundongos BALB/c por tratamento). Ambos pTHPcapgrttnC e pTHPcapRgrttnC deduzida das respostas CTL na mesma faixa de erro que para pTHRepRgrttnC, mas com menos variabilidade de resposta entre os experimentos (figura 7).

Os vetores de expressão em mamíferos descritos aqui demonstraram níveis de expressão de proteína de transgene melhorados. Isto tem utilidade na eficiência da dose aumentada nas vacinas de DNA baseadas em plasmídeo, para estudos de expressão de célula de mamíferos in vitro, e potencialmente para uso na terapia gênica.

No desenvolvimento de vacina de DNA, um nível maior d expressão de transgene ligado através do uso de combinações de promotores de Pcap-Pcmv e do PcapR-Pcmv permite um potencial de redução de 10 vezes na dose da vacina necessariamente para conseguir a mesma resposta imune mediada pela célula que pode ser conseguida através do uso de um constructo de vacina muito próximo que utiliza Pcmv sozinho (como tem sido demonstrado até agora em um modelo de imunogenicidade em murino).

Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes com relação as configurações específicas da mesma, deverá ser entendido pelos técnicos no assunto que várias alterações, modificações e outras mudanças podem ser realizadas nas reivindicações sem fugir do espírito e do escopo de proteção da presente invenção. É portanto, pretendido, que esta invenção cubra e abranja todas as referidas modificações, alterações e/ou mudanças. Referências

- Barouch DH, Yang ZY, Kong WP, et al. , (2005). "A human T-cell leukemia virus type 1 regulatory element enhances the immunogenicity of human immunodeficiency virus type 1 DNA vaccines in mice and nun-human primates", J. Virol.; 79: 8828-8834;

- Burgers W.A. , J.H. van Harmelen, E. Shephard, et al. , (2 005) . "Design and preclinical evaluation of a multigene HIV-I subtype C DNA vaccine for clinicai trial"., J. Gen Virol., 87:399-410;

- Garmory H.S., Brown KA, Titball RW (2003). "DNA vaccines: improving expression of antigens"., Genet. Vaccines. Ther. 1:2;

Hattermann K., Roedner C., Schmitt C., et al. , (2004). "Infection studies on human cell lines with porcine circovírus type 1 and procine circovirus type 2", Xenotransplantation, 11: 284-294;

Mankertz, A., Caliskan R., Hattermann, K., et al. (2004) . "Molecular biology of porcine circovírus; analysis of gene expression and viral replication"., Vet. Microbiol. 98: 81-88;

Quintana, J., Balasch., M., Segales, J. et al., (2002). "Experimental inoculation of procine circoviruses type 1

(PCV-I) and type 2 (PCV-2) in rabbits and mice"., Vet. Rs., 33:229-237;

- Velten, J., Morey, K., Cazzonelli, C., (2005). "Plant viral intergenic DNA sequences repeats with transcription enhancing activity"., Virology Journal, 2:16 doi:10.1186/1743-422 x-2-16.

- http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> South African Medical Research Council

<120> "MÉTODO PARA MELHORAR A EXPRESSÃO DE UM TRANSGENE EM UMA CÉLULA HOSPEDEIRA, CASSETE DE EXPRESSÃO EM MAMÍFERO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, VACINA DE DNA E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA"

<130> PAl40583/PCT

<140> PCT/IB200 6/003150 <141> 2006-11-08

<150> ZA 2005/09036 <151> 2005-11-08

<160> 39

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 184 <212> DNA

<213> Circovirus Porcina 1 <400> 1

ctagtaggtg tcgctaggct cagcaaaatt acgggcccac tgactcttcc cacaaccggg cgggcccact atgacgtgta cagctgtctt ccaatcacgc tgctgcatct tcccgctcac tttcaaaagt tcagccagcc cgcggaaatt tctcacatac gttacaggga actgctccat atga

<210> 2 <211> 184 <212> DNA

<213> Circovirus Porcina 1 <400> 2

ctagtcatat ggagcagttc cctgtaacgt atgtgagaaa tttccgcggg ctggctgaac 60

60 120 180 184 ttttgaaagt gagcgggaag atgcagcagc gtgattggaa gacagctgta cacgtcatag 120 tgggcccgcc cggttgtggg aagagtcagt gggcccgtaa ttttgctgag cctagcgaca 180 ccta 184

<210> 3 <211> 175 <212> DNA

<213> Circovirus canário <400> 3

cgcgcgagag ttcagtgaga tctacgtcaa gtatgggcgt ggtctgaggg atttggccct 60 gatgattgga cagaaacccc gtgacttcaa gacggaagtc gtcgtcatca cagggccttc 120 cggggtgggc aagtcccgac ttgcctctga aatggaagga tcgaagttct acaag 175

<210> 4 <211> 175 <212> DNA

<213> Circovirus canário <400> 4

cttgtagaac ttcgatcctt ccatttcaga ggcaagtcgg gacttgccca ccccggaagg 60 ccctgtgatg acgacgactt ccgtcttgaa gtcacggggt ttctgtccaa tcatcagggc 120 caaatccctc agaccacgcc catacttgac gtagatctca ctgaactctc gcgcg 175

<210> 5 <211> 180 <212> DNA

<213> Circovirus ganso <400> 5

tggcccggaa gtacccgacg acttatgtaa tgtttgggcg gggcttagag cggttgcgtc 60 agctgatcgt ggagaccgct cgtgattgga agacggaggt catcgttctg attgggcggc 120

ctggaagçgg gaagagccgt tacgcgtttg aatttcccgc gcgtgaaaag tattataaat 180 <210> 6

<211> 180

<212> DNA

<213> Circovirus ganso

<4 00> 6

atttataata cttttcacgc gcgggaaatt gccgcccaat cagaacgatg acctccgtct gacgcaaccg ctctaagccc cgcccaaaca

caaacgcgta acggctcttc ccgcttccag 60 tccaatcacg agcggtctcc acgatcagct 120 ttacataagt cgtcgggtac ttccgggcca 180

<210> 7

<211> 190

<212> DNA

<213> Circovírus pato

<400> 7

tgaggtggcc cggaagttcc ccgtcacctg atcgttgaga tccgcccggc accgggaaga caaaccacgc

ccacgactta tgttatcttt cgcaacgtga ttggaagacc gccgttatgc atttgaattt

gggcgtggcc tggaacgcct 60 gaagtcatcg ttctgattgg 120 cccgccgaaa acaagtatta 180

190

<21Ò> 8

<211> 190

<212> DNA

<213> Circovírus pato

<4 00> 8

gcgtggtttg taatacttgt tttcggcggg gccgggcgga ccaatcagaa cgatgacttc caggtgacgg aggcgttcca ggccacgccc ggccacctca

aaattcaaat gcataacggc tcttcccggt 60 ggtcttccaa tcacgttgcg tctcaacgat 120 aaagataaca taagtcgtgg ggaacttccg 180

190

<210> 9

<211> 180

<212> DNA

<213> Circovírus columbídeo

<400> 9

tcgcgcgaga cttcagtgag atatacgtca agtatgggcg tggcttgcgc gacctgaagc 60 tgctgattgg tcagcagcct cgtgacttca aaacggaagt catcgtcatc acgggcccgc 120 ccggttgcgg gaagagccgt tgggcagctg agtaccccgg aagtaaattt tacaagatga 180

<210> 10 <211> 180 <212> DNA

<213> Circovírus columbídeo <400> 10

tcatcttgta aaatttactt ccggggtact cagctgccca acggctcttc ccgcaaccgg 60 gcgggcccgt gatgacgatg acttccgttt tgaagtcacg aggctgctga ccaatcagca 120 gcttcaggtc gcgcaagcca cgcccatact tgacgtatat ctcactgaag tctcgcgcga 180

<210> 11 <211> 180 <212> DNA

<213> Circovírus gaivota <400> 11

gtgaaatcgc gcgagagttc agtgaagtct acgtcaagta tgggcggggc ctccgtgatc 60

tccggttgct gattggttgc ccgccccgcg atttcaaaac agaagtcatc gttctgattg 120

gcccacctgg ctgtggcaag tcaaaattgg ccaatgagat ggaagggtct aagttctaca 180

<210> 12 <211> 180 <212> DNA

<213> Circovírus gaivota <400> 12

tgtagaactt agacccttcc atctcattgg ccaattttga cttgccacag ccaggtgggc 60 caatcagaac gatgacttct gttttgaaat cgcggggcgg gcaaccaatc agcaaccgga 120 gatcacggag gccccgccca tacttgacgt agacttcact gaactctcgc gcgatttcac 180

<210> 13

<211> 180

<212> DNA

<213> Circovírus tentilhão

<400> 13 tcgcgcgaga gttcagtcta gcctacgtca gatatgggcg gggcctgcgt gatcttgcgc 60 tgctgattgg ccagaagccc cgtgacttca aaacggaagt catagtgctg accggcccta 120 gtgggtgtgg caaatcccgc tgggccaatg aacaagaagg aactaagttt tataaaatga 180

<210> 14 <211> 180 <212> DNA

<213> Circovirus tentilhão <4 00> 14

tcattttata aaacttagtt ccttcttgtt cattggccca gcgggatttg ccacacccac 60 tagggccggt cagcactatg acttccgttt tgaagtcacg gggcttctgg ccaatcagca 120 gcgcaagatc acgcaggccc cgcccatatc tgacgtaggc tagactgaac tctcgcgcga 180

<210> 15 <211> 180 <212> DNA

<213> Virus da doença do bico e das penas AFG3-ZA <4 00> 15

cgcgcgagag ttcccagata tctacgtcag gcatgggcgg ggcttacata atctctcgct 60 aatggttggt tcccggccac gtgacttcaa gactgaggtc gacgtcatct acggaccacc 120 ggggtgtggc aagagtagat gggccaatga gcagccgggg accaaatatt ataaaatgcg 180

<210> 16 <211> 180 <212> DNA

<213> Virus da doença do bico e das penas AFG3-ZA <400> 16

cgcattttat aatatttggt ccccggctgc tcattggccc atctactctt gccacacccc 60 ggtggtccgt agatgacgtc gacctcagtc ttgaagtcac gtggccggga accaaccatt 120 agcgagagat tatgtaagcc ccgcccatgc ctgacgtaga tatctgggaa ctctcgcgcg 180

<210> 17

<211> 190

<212> DNA

<213> Circovirus Porcina 2 <400> 17

ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg tcagaaattt ccgcgggctg gctgaacttt 60

tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg attggaagac taatgtacac gtcattgtgg 120

ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg ctgctaattt tgcagacccg gaaaccacat 180

actggaaacc 190

<210> 18 <211> 190 <212> DNA

<213> Circovírus Porcina 2 <400> 18

ggtttccagt atgtggtttc cgggtctgca aaattagcag cccatttgct tttaccacac 60 ccaggtggcc ccacaatgac gtgtacatta gtcttccaat cacgcttctg cattttcccg 120 ctcactttca aaagttcagc cagcccgcgg aaatttctga caaacgttac agggtgctgc 180 tctgcaacgg 190

<210> 19

<211> 3687

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de HIV-I subtipo C gag, transcriptase reversa, regiões tat e nef

<400> 19

aagcttgcca ccatggctgc tcgcgcatct atcctcagag gcgaaaagtt ggataagtgg 60

gaaaaaatca gactcaggcc aggaggtaaa aaacactaca tgctgaagca tatcgtgtgg 120

gcatctaggg agttggagag atttgcactg aaccccggac tgctggaaac ctcagagggc 180

tgtaagcaaa tcatgaaaca gctccaacca gccttgcaga ccggaacaga agagctgaag 240

tccctttaca ataccgtggc aaccctctat tgcgtccacg agaagatcga ggtgagagac 300

acaaaggagg ccctggacaa aatcgaggag gagcagaata agtgccagca gaagacccag 360

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gggcagatgg tgcaccaagc aatcagccct agaaccctga acgcatgggt gaaggtgatc 480

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<211> 4912

<212> DNA

<213> Circovirus Porcina

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<213> Circovirus Porcina <400> 22

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<223> Seqüência do primer <400> 26

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<213> Circovirus Porcina <400> 27

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<213> Circovirus Porcina <400> 29

actagtctcg acattggtgt gggtatttaa atggagccac agctggtttc ttttattatt 60

tggctggaac caatcaattg tttggtccag ctcaggtttg ggggtgaagt acctggagtg 120 gtaggtaaag ggctgcctta tggtgtggcg ggaggagtag ttaatatagg ggtcataggc 180 caagttggtg gagggggtta caaagttggc atccaagata acagcagtgg acccaacacc 240 tctttgatta gaggtgatgg ggtctctggg gtaaaattca tatttagcct ttctaatacg 300 gtagtattgg aaaggtaggg gtagggggtt ggtgccgcct gaggggggga ggaactggcc 360 gatgttgaat ctgagctggt taacattcca agatggctgc gagtgtcctc cttctatggt 420 gagtacaaat tctctagaaa ggcggcaatt gaagataccc gtctttcggc gccatctgta 480 acggtttctg aaggcggggt gtgccaaata tggtcttctg cggaggatgt ttccaagatg 540 gctgcggggg cgggtccttc ttctgcggta acgcctcctt ggccacgtca tcctataaaa 600 gtgaaagaag tgcgctgctg tagtattacc agcgcacttc ggcagcggca gcacctcggc 660 agcgtcggtg aaaatgccaa gcaagaaaag cggcccgcaa ccccataaga ggtgggtgtt 720 cacccttaat aatccttccg aggaggagaa aaacaaaata cgggagcttc caatctccct 780 ttttgattat tttgtttgcg gagaggaagg tttggaagag ggtagaactc ctcacctcca 840 ggggtttgcg aattttgcta agaagcagac ttttaacaag gtgaagtggt attttggtgc 900 ccgctgccac atcgagaaag cgaaaggaac cgaccagcag aataaagaat actgcagctg 960 cagtaaagaa ggccacatac ttatcgagtg tggagctccg cggaaccagg ggaagcgcag 1020 cgacctgtct actgctgtga gtaccctttt ggagacgggg tctttggtga ctgtagccga 1080 gcagttccct gtaacgtatg tgagaaattt ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag 1140 cgggaagatg cagcagcgtg attggaagac agctgtacac gtcatagtgg gcccgcccgg 1200 ttgtgggaag agccagtggg cccgtaattt tgctgagcct agcgacacct actggaagcc 1260 tagtagaaat aagtggtggg atggatatca tggagaagaa gttgttgttt tggatgattt 1320 ttatggctgg ttaccttggg atgatctact gagactgtgt gaccggtatc cattgactgt 1380 agagactaaa gggggtactg ttcctttttt ggcccgcagt attttgatta ccagcaatca 1440 ggccccccag gaatggtact cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag 1500 gattactact ttgcaatttt ggaagactgc tggagaacaa tccacggagg tacccgaagg 1560 ccgatttgaa gcagtggacc caccctgtgc ccttttccca tataaaataa attactgagt 1620 cttttttgtt atcacatcgt aatggttttt atttttattc atttagaggg tcttttagga 1680 taaattctct gaattgtaca taaatagtca gccttaccac ataattttgg gctgtggctg 1740 cattttggag cgcatagccg aggcctgtgt gacaatcact agt 1783 <210> 30 <211> 1783 <212> DNA <213> Circovirus Porcina <400> 30 actagtgatt gtcacacagg cctcggctat gcgctccaaa atgcagccac agcccaaaat 60 tatgtggtaa ggctgactat ttatgtacaa ttcagagaat ttatcctaaa agaccctcta 120 aatgaataaa aataaaaacc attacgatgt gataacaaaa aagactcagt aatttatttt 180 atatgggaaa agggcacagg gtgggtccac tgcttcaaat cggccttcgg gtacctccgt 240 ggattgttct ccagcagtct tccaaaattg caaagtagta atcctccgat agagagcttc 300 tacagctggg acagcagttg aggagtacca ttcctggggg gcctgattgc tggtaatcaa 360 aatactgcgg gccaaaaaag gaacagtacc ccctttagtc tctacagtca atggataccg 420 gtcacacagt ctcagtagat catcccaagg taaccagcca taaaaatcat ccaaaacaac 480 aacttcttct ccatgatatc catcccacca cttatttcta ctaggcttcc agtaggtgtc 540 gctaggctca gcaaaattac gggcccactg gctcttccca caaccgggcg ggcccactat 600 gacgtgtaca gctgtcttcc aatcacgctg ctgcatcttc ccgctcactt tcaaaagttc 660 agccagcccg cggaaatttc tcacatacgt tacagggaac tgctcggcta cagtcaccaa 720 agaccccgtc tccaaaaggg tactcacagc agtagacagg tcgctgcgct tcccctggtt 780 ccgcggagct ccacactcga taagtatgtg gccttcttta ctgcagctgc agtattcttt 840 attctgctgg tcggttcctt tcgctttctc gatgtggcag cgggcaccaa aataccactt 900 caccttgtta aaagtctgct tcttagcaaa attcgcaaac ccctggaggt gaggagttct 960 accctcttcc aaaccttcct ctccgcaaac aaaataatca aaaagggaga ttggaagctc 1020 ccgtattttg tttttctcct cctcggaagg attattaagg gtgaacaccc acctcttatg 1080 gggttgcggg ccgcttttct tgcttggcat tttcaccgac gctgccgagg tgctgccgct 1140 gccgaagtgc gctggtaata ctacagcagc gcacttcttt cacttttata ggatgacgtg 1200 gccaaggagg cgttaccgca gaagaaggac ccgcccccgc agccatcttg gaaacatcct 1260 ccgcagaaga ccatatttgg cacaccccgc cttcagaaac cgttacagat ggcgccgaaa 1320

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tgttatcttg gatgccaact ttgtaacccc ctccaccaac ttggcctatg acccctatat 1620

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ccccaaacct gagctggacc aaacaattga ttggttccag ccaaataata aaagaaacca 1740

gctgtggctc catttaaata cccacaccaa tgtcgagact agt 1783

<210> 31 <211> 180 <212> DNA

<213> Circovírus Porcina 1 <400> 31

gcagttccct gtaacgtatg tgagaaattt ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag 60 cgggaagatg cagcagcgtg attggaagac agctgtacac gtcatagtgg gcccgcccgg 120 ttgtgggaag agccagtggg cccgtaattt tgctgagcct agcgacacct actggaagcc 180

<210> 32 <211> 184 <212> DNA

<213> Circovirus Porcina 2 <400> 32

cagagcagca ccctgtaacg tttgtcagaa atttccgcgg gctggctgaa cttttgaaag 60 tgagcgggaa aatgcagaag cgtgattgga agactaatgt acacgtcatt gtggggccac 120 ctgggtgtgg taaaagcaaa tgggctgcta attttgcaga cccggaaacc acatactgga 180 aacc 184

<210> 33

<211> 166

<212> DNA

<213> Virus da doença do bico e das penas <400> 33

cgagagttcc cagatatcta cgtcaggcat gggcggggct tacataatct ctcgctaatg 60

gttggttccc ggccacgtga cttcaagact gaggtcgacg tcatctacgg accaccgggg 120

tgtggcaaga gtagatgggc caatgagcag ccggggacca aatatt 166

<210> 34 <211> 180 <212> DNA

<213> Circovirus canário <400> 34

tggtggagat cgcgcgagag ttcagtgaga tctacgtcaa gtatgggcgt ggtctgaggg 60 atttggccct gatgattgga cagaaacccc gtgacttcaa gacggaagtc gtcgtcatca 120 cagggccttc cggggtgggc aagtcccgac ttgcctctga aatggaagga tcgaagttct 180

<210> 35 <211> 174 <212> DNA

<213> Circovirus columbideo <400> 35

tcgcgcgaga cttcagtgag atatacgtca agtatgggcg tggcttgcgc gacctgaagc 60 tgctgattgg tcagcagcct cgtgacttca aaacggaagt catcgtcatc acgggcccgc 120 ccggttgcgg gaagagccgt tgggcagctg agtaccccgg aagtaaattt taca 174

<210> 36 <211> 182 <212> DNA

<213> Circovirus pato <400> 36

tgaggtggcc cggaagttcc ccacgactta tgttatcttt gggcgtggcc tggaacgcct 60 ccgtcacctg atcgttgaga cgcaacgtga ttggaagacc gaagtcatcg ttctgattgg 120 tccgcccggc accgggaaga gccgttatgc atttgaattt cccgccgaaa acaagtatta 180 ca 182

<210> 37 <211> 201 <212> DNA

<213> Circovirus tentilhão <400> 37

ccgtgaaagc cggaagaggt atggccgaag tcgcgcgaga gttcagtcta gcctacgtca 60

gatatgggcg gggcctgcgt gatcttgcgc tgctgattgg ccagaagccc cgtgacttca 120 aaacggaagt catagtgctg accggcccta gtgggtgtgg caaatcccgc tgggccaatg 180

aacaagaagg aactaagttt t 201

<210> 38 <211> 200 <212> DNA

<213> Circovirus ganso <400> 38

tggtctgccg ataactgacg tggcccggaa gggcttagag cggttgcgtc agctgatcgt catcgttctg attgggcggc ctggaagcgg gcgtgaaaag tattataaat

gtacccgacg acttatgtaa tgtttgggcg 60 ggagaccgct cgtgattgga agacggaggt 120 gaagagccgt tacgcgtttg aatttcccgc 180

200

<210> 39

<211> 180

<212> DNA

<213> Circovirus gaivota

<400> 39

gtgaaatcgc gcgagagttc agtgaagtct

tccggttgct gattggttgc ccgccccgcg

gcccacctgg ctgtggcaag tcaaaattgg

acgtcaagta tgggcggggc ctccgtgatc 60 atttcaaaac agaagtcatc gttctgattg 120 ccaatgagat ggaagggtct aagttctaca 180

Claims (15)

1. Método para melhorar a expressão de um transgene em uma célula hospedeira, caracterizado pelo fato de incluir as etapas de: (a) inserir uma seqüência de um elemento promotor de capsídeo (Pcap) ou um complemento reverso do mesmo (PcapR) que tem pelo menos 8 0% de identidade com qualquer uma das seqüências selecionadas de SEQ.ID.NOs.: 1, 2, 3, -4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, -22 e 24 dentro de um cassete de expressão de mamíferos a montante (5') de um promotor imediato/precoce do citomegalovírus (Pcmv) ou um elemento promotor SV4 0; (b) inserir o transgene dentro do vetor a jusante (3') do promotor do citomegalovírus ou um elemento promotor SV4 0; (c) inserir o cassete de expressão dentro do organismo hospedeira; e (d) motivar a expressão do transgene.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o íntron do citomegalovírus ser inserido a jusante (3') do Pcmv e um sítio de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (bgh poliA) ser inserido a montante (3') do transgene.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 ou 2, caracterizado pelo fato de o transgene a ser expresso em um mais nível elevado do que quando expresso em um vetor contendo o cassete de expressão sem o elemento promotor do capsídeo (Pcap) ou o complemento reverso do mesmo.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de o elemento promotor do capsídeo ou o complemento reverso do mesmo ser obtido de um circovírus.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de a seqüência Pcap ser com qualquer uma das seqüências de SEQ.ID.NOs.: 1, 3, 5, -7, 9, 11, 13, 15, 17, 21, 24 e 29 ou a seqüência PcapR ser qualquer uma das seqüências de SEQ.ID.NOs.: 2, 4, 6, -8, 10, 12, 14, 16, 18, 22 e 30.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracteri zado pelo fato de o elemento promotor de capsídeo ou o complemento reverso do mesmo ser inserido imediatamente a montante (5') do promotor imediato/precoce do citomegalovírus ou do elemento promotor SV4 0.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de o elemento promotor do capsídeo ou o complemento reverso do mesmo ser inserido no par de base 1100 a montante (5') do promotor imediato/precoce do citomegalovírus ou do elemento promotor SV4 0.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de a célula hospedeira ser uma linha de célula de mamífero para expressão de transgene in vitro ou a célula hospedeira ser uma célula de um organismo hospedeira mamífero para expressão do transgene in vivo.

9. Cassete de expressão em mamífero, caracterizado pelo fato de incluir: (a) um promotor imediato/precoce de citomegalovírus (Pcmv) ou um elemento promotor SV4 0; e (b) uma seqüência do elemento promotor de capsídeo (Pcap) ou um complemento reverso do mesmo (PcapR) localizado a montante (5') do promotor CMV ou do elemento promotor SV40, onde a seqüência Pcap ou a seqüência PcapR tem pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das seqüências selecionadas de SEQ.ID.NOs.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, - 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22 e 24.

10. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação -9.caracterizado pelo fato de incluir um transgene a jusante (3') do promotor imediato/precoce do citomegalovírus.

11. Vetor, caracterizado pelo fato de incluir um cassete de expressão, definido em qualquer uma das reivindicações de 9 ou 10.

12. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de ser transformada com o vetor definido na reivindicação 11.

13. Vacina de DNA, caracterizada pelo fato de incluir o cassete de expressão ou o vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 9 a 11.

14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de incluir um cassete de expressão ou um vetor conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 9 a 11.

15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de ser para tratar HIV ou AIDS.