CN111100876A - CRISPR-Cas9特异性敲除FAH基因的方法及特异性sgRNA - Google Patents

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Abstract

本发明涉及CRISPR‑Cas9特异性敲除FAH基因的方法及特异性sgRNA，所述方法是运用于特异性敲除猪、兔FAH基因，具体步骤包括：步骤S1：FAH基因的sgRNA靶序列选择和设计；步骤S2：构建FAH基因的CRISPR‑Cas9载体；步骤S3：获得表达FAH sgRNA和Cas9蛋白的假型慢病毒；步骤S4：感染目的细胞并检测FAH基因敲除效果。所述特异性sgRNA在猪和兔FAH基因上的靶序列符合5’‑N(20)NGG‑3’的序列排列规律。本发明将特异性sgRNA用于CRISPR‑Cas9特异性敲除猪、兔FAH基因的方法中，能够快速、精确、高效、特异性地分别敲除猪、兔FAH基因，有效地解决构建FAH基因敲除猪、兔周期长和成本高的技术问题。

Description

CRISPR-Cas9特异性敲除FAH基因的方法及特异性sgRNA
【技术领域】
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及基因敲除技术领域，具体涉及CRISPR-Cas9特异性敲除猪、兔FAH基因的方法及用于特异性靶向猪、兔FAH基因的特异性sgRNA。
【背景技术】
人原代肝细胞是指从人肝组织取出后立即培养的肝细胞，可用于基础生命科学研究、药物评价、细胞移植以及肝脏3D打印。然而，肝细胞主要来自于手术切除肝组织、遗体无偿捐献等，由于这些材料存在伦理问题，且中国传统文化致使肝脏或者肝组织捐献率处于世界相对低的水平。肝细胞体内扩增是一种可行的解决办法，既保持了肝细胞的分化状态，又能获得数量可观的原代肝细胞。延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)基因缺失导致动物酪胺酸血症，动物自体肝细胞逐步死亡。如果将正常的人肝细胞移植到FAH基因缺失的动物体内，同时服用免疫抑制剂，人肝细胞可快速增殖并替代动物的肝细胞，长出高度嵌合率的人-鼠嵌合肝。
构建FAH基因敲除动物的方法主要有3种：1)ZFN法,2)TALEN法，3)CRISPR/Cas9法。3种方法的对比如下表所示。CRISPR/Cas9的方法，相较于ZFN法和TALEN法，具有操作简单、敲除效率高、脱靶率低、靶点数量多、可多基因同时敲除、耗时短、费用低。因此，CRISPR/Cas9法在构建FAH敲除动物方面具有不可比拟的优势。
Figure BDA0001840985800000011
目前，在小型模式动物中如大鼠、小鼠模型已有针对FAH基因敲除的报道，现有的方法在兔子、猪模型中尚无CRISPR/Cas9法敲除FAH基因利用。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是提供CRISPR-Cas9特异性敲除FAH基因的方法及特异性sgRNA。
本发明采用如下技术方案：
第一方面提供了一种运用CRISPR-Cas9特异性敲除FAH基因的方法，运用于特异性敲除猪、兔FAH基因，具体步骤包括：
步骤S1：FAH基因的sgRNA靶序列选择和设计；
步骤S2：构建FAH基因的CRISPR-Cas9载体；
步骤S3：获得表达FAH sgRNA和Cas9蛋白的假型慢病毒；
步骤S4：感染目的细胞并检测FAH基因敲除效果。
进一步的，所述步骤S1中sgRNA靶序列选择是在FAH基因外显子编码区寻找符合5’-N(20)NGG-3’规则的靶序列；
选择靠近N端的5个外显子编码区序列，这样的编码区序列的切割会造成FAH基因的功能敲除，残留截短的序列不会形成有功能的蛋白；
sgRNA靶序列设计是将上述靶序列及互补序列分别添加接头，形成正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列。
进一步的，所述sgRNA靶序列的5’-端加上用于连接反应的粘性末端序列，得到正向寡核苷酸序列；所述sgRNA靶序列的互补序列的两端加上用于连接反应的粘性末端序列，合成得到反向寡核苷酸序列；将合成的所述正向寡核苷酸序列与互补寡核苷酸序列经过退火与复性的步骤，形成具有粘性末端的双链寡聚核苷酸。
进一步的，构建FAH基因的CRISPR-Cas9载体是将携带Cas9基因的表达载体通过酶切线性化，将所述双链寡聚核苷酸通过T4连接酶连入携带Cas9基因的表达载体中，得到携带针对靶序列的sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体，转化感受态DH5α细菌，筛选并鉴定阳性克隆，并对所述阳性克隆进行质粒扩增。
进一步的，所述步骤S3的假型慢病毒是用所述携带有sgRNA和Cas9基因的表达载体和包装质粒在细胞系中包装得到的携带sgRNA和Cas9基因的慢病毒。
进一步的，所述包装质粒为商业化质粒，包括pCMV dr8.91质粒、pMD.2G质粒；所述包装细胞系为293T细胞。
进一步的，使用所述慢病毒感染猪、兔肝原代肝细胞，培养一定时间后收集细胞，用试剂盒抽提基因组DNA，以基因组DNA为模板扩增包含所述靶序列的基因片段，经过变性、复性及酶切确定FAH基因的敲除情况。
进一步的，所述确定FAH基因的敲除的步骤如下：
(a)以感染假型慢病毒的猪原代肝细胞、兔原代肝细胞的基因组DNA为模板，分别用猪、兔FAH基因的上下游引物扩增包含所述sgRNA的靶序列的FAH基因片段，同时用相同引物扩增未感染假型慢病毒的野生型细胞的基因组DNA，作为对照；
(b)纯化上述扩增到的FAH基因片段，然后将来自感染假型慢病毒的目的细胞的FAH基因片段与来自野生型细胞的FAH基因片段等量混合、加热变性和复性，形成杂交DNA分子；
(c)用Cruiser酶切割复性后的杂交DNA分子；
(d)电泳检测酶切产物，检测靶序列介导的FAH基因敲除效果。
第二方面还公开了一种特异性sgRNA，用于特异性敲除猪、兔FAH基因，
(1)所述sgRNA在猪和兔FAH基因上的靶序列符合5’-N(20)NGG-3’的序列排列规律，
其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合规律的靶序列可以位于DNA序列的正义链或反义链；
(2)所述sgRNA在猪和兔FAH基因上的靶序列分别位于猪、兔FAH基因的N端的5个外显子编码区，或序列的主要部分位于FAH基因的N端的5个外显子，其余部分跨越与相邻内含子的交界，位于相邻内含子。
进一步的，当用于特异性靶向猪FAH基因时：所述靶序列为序列表1中SEQ ID NO：1～66中任一条序列所示的靶序列；
当用于特异性靶向兔FAH基因时：所述靶序列为序列表2中SEQ ID NO：74～130中任一条序列所示的靶序列。
进一步的，当用于特异性靶向猪FAH基因时：所述靶序列为序列表1中SEQ ID NO：2或4所示的靶序列；
当用于特异性靶向兔FAH基因时：所述靶序列为序列表2中SEQ ID NO：74或77所示的靶序列；
所述表达载体的骨架载体的序列如序列表1中SEQ ID NO：67或表2中SEQ ID NO：131所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
第一方面本发明的针对CRISPR-Cas9特异性敲除猪、兔FAH基因，成功地找到特异性分别靶向猪、兔FAH基因的sgRNA，所述sgRNA分别在猪和兔FAH基因上的靶序列是独一无二的。本发明的靶序列有效的提高sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。
第二方面并且将相应的特异性sgRNA用于CRISPR-Cas9特异性敲除猪、兔FAH基因的方法中，能够快速、精确、高效、特异性地分别敲除猪、兔FAH基因，有效地解决构建FAH基因敲除猪、兔周期长和成本高的技术问题。
【附图说明】
图1为本技术方案中使用的载体质粒lentiCRISPR v2的质粒图谱；
图2为本技术方案中使用的包装质粒pCMV dr8.91的质粒图谱；
图3为本技术方案中使用的包装质粒pMD.2G的质粒图谱；
图4为中酶切验证猪FAH基因的靶序列的基因敲除效果的电泳检测结果图；
图5为中酶切验证兔FAH基因的靶序列的基因敲除效果的电泳检测结果图。
【具体实施方式】
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种特异性sgRNA，用于特异性靶向猪、兔FAH基因，
(1)所述sgRNA在猪和兔FAH基因上的靶序列符合5’-N(20)NGG-3’的序列排列规律，
其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合规律的靶序列可以位于DNA序列的正义链或反义链；
(2)所述sgRNA在猪和兔FAH基因上的靶序列分别位于猪、兔FAH基因的N端的5个外显子编码区，或序列的主要部分位于FAH基因的N端的5个外显子，其余部分跨越与相邻内含子的交界，位于相邻内含子。
进一步的，当用于特异性靶向猪FAH基因时：所述靶序列为序列表1中SEQ ID NO：1～66中任一条序列所示的靶序列；
当用于特异性靶向兔FAH基因时：所述靶序列为序列表2中SEQ ID NO：74～130中任一条序列所示的靶序列。
进一步的，当用于特异性靶向猪FAH基因时：所述靶序列为序列表1中SEQ ID NO：2或4所示的靶序列；
当用于特异性靶向兔FAH基因时：所述靶序列为序列表2中SEQ ID NO：74或77所示的靶序列；
所述表达载体的骨架载体的序列如序列表1中SEQ ID NO：67或表2中SEQ ID NO：131所示。
使用上述特异性sgRNA用于特异性靶向猪、兔FAH基因中，即运用CRISPR-Cas9特异性敲除FAH基因的方法，具体步骤包括：
步骤S1：FAH基因的sgRNA靶序列选择和设计；
步骤S2：构建FAH基因的CRISPR-Cas9载体；
步骤S3：获得表达FAH sgRNA和Cas9蛋白的假型慢病毒；
步骤S4：感染目的细胞并检测FAH基因敲除效果。
具体的：
猪FAH基因敲除实施例中：
Sus scrofa(猪)FAH基因sgRNA靶序列的选择和设计进行说明，具体如下：
靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。
一.FAH基因的sgRNA靶序列选择
针对FAH基因，在靶序列选择上应该遵循下列原则：
(1)在FAH基因外显子编码区寻找符合5’-N(20)NGG-3’规则的靶序列，其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合规则的靶序列可以位于正义链或反义链；
(2)选择靠近N端的5个外显子编码区序列，这样的编码区序列的切割会造成FAH基因的功能敲除，残留截短的序列不会形成有功能的蛋白；
同时，如果存在多种剪切体，则在共有外显子编码区进行选择，针对FAH基因选择靠近N端的5个外显子编码区序列即可满足该条件；
(4)利用在线序列分析工具(http://crispr.mit.edu/)分析以上靶序列在猪基因组中的同源情况，舍弃存在显著同源序列的靶序列，根据评分进一步挑选，所挑选的靶序列在FAH基因上是唯一的。
基于以上原则，选择出表1所示的靶序列集合。
表1靶序列集合
Figure BDA0001840985800000061
Figure BDA0001840985800000071
Figure BDA0001840985800000081
2.FAH基因的sgRNA靶序列设计：
(1)以lentiCRISPR v2质粒作为表达载体，根据lentiCRISPR v2质粒的特点，在上述N(20)靶序列的5’-端添加CACCG序列，形成正向寡核苷酸序列：
5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；
(2)在上述N(20)靶序列的反向互补序列的两端添加序列，形成反向寡核苷酸序列：
5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3’；
正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列可以互补形成具有粘性末端的双链DNA片段：
5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
3’-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’。
二、构建FAH基因的sgRNA表达载体
1.合成DNA插入片段
(1)合成上述设计的正向和反向寡核苷酸序列
寡核苷酸序列可以由商业化的公司(如上海生工公司)根据提供的序列具体合成。这里主要表1中所列的第2号和第4号序列所示的靶序列对FAH基因的敲除效果进行说明。
第2号靶序列对应的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列如下：
CACCGGGTCTTGACTGGGAGAAAGA(SEQ ID NO：68)；
AAACTCTTTCTCCCAGTCAAGACCC(SEQ ID NO：69)。
第4号靶序列对应的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列如下：
CACCGGCTTTATGACACTGAGGTCC(SEQ ID NO：70)；
AAACGGACCTCAGTGTCATAAAGCC(SEQ ID NO：71)。
将对应的正向和反向寡核苷酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链DNA片段。
反应体系(20μL)如下所示：
正向寡核苷酸(10μM)：1μL
反向寡核苷酸(10μM)：1μL
10×PCRbuffer：2μL
ddH2O：16μL
将上述反应体系放入PCR仪，并按以下程序进行反应。
反应程序：
95℃,5min；
80℃,5min；
70℃,5min；
60℃,5min；
50℃,5min；
自然降至室温。
2.构建sgRNA表达载体
(1)利用BsmB I限制性内切酶酶切目标载体lentiCRISPR v2质粒(其序列如序列表1中SEQ ID NO：67所示)。
按照以下反应体系进行配制：
LentiCRISPR v2质粒：1μg
10×酶切buffer：2μL
BsmB I限制性内切酶：2μL
补充ddH2O至总体积20μL
将酶切反应体系置于37℃反应4h。
(2)电泳分离并纯化载体片段
酶切结束后，将酶切混合物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，选择载体片段(约12kb)进行切割，并通过DNA凝胶回收柱进行回收。
(3)将合成的双链DNA片段与载体主片段进行连接并转化大肠杆菌
将复性得到的双链DNA片段与回收得到的载体片段进行连接反应，按照以下反应体系进行配制：
LentiCRISPR v2载体片段：100ng
双链DNA片段：200ng
T4连接酶：1μL
T4连接反应buffer：1μL
补充ddH2O至总体积10μL
将连接混合物置于25℃反应2h。
反应结束后将连接混合物转化大肠杆菌DH5α菌株：向连接混合物中加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰上孵育30min；将混合物放入42℃水浴，热激90s后放入冰上冷却；向混合物加入100μL LB培养基，37℃摇床培养20min；将混合物涂Amp LB平板，37℃培养14h。
(4)鉴定正确的转化克隆
从Amp LB平板上挑选若干菌落进行扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定。挑选可能正确的克隆进行测序，验证插入序列是否正确。对于正确的lentiCRISPR v2-FAH载体克隆进行保种。
三、获得表达FAH sgRNA的假型慢病毒
1.材料准备
扩增并抽提包装质粒pMD.2G和pCMV-Dr8.91(购自Addgenhttp://www.addgene.org，其图谱分别如图2、图3所示)；扩增并抽提载体质粒lentiCRISPR v2-FAH；培养包装细胞系293T细胞(购自ATCC)；DMEM培养基、Opti-MEM培养基和胎牛血清FBS(购自Gibco)；Lipofectamine2000(购自Gibco)；293T细胞培养于5％CO2/37℃细胞培养箱中，培养基为含10％FBS的DMEM培养基。
2.转染和病毒包装
第一天：将包装细胞系293T传代至10cm培养皿中，约30％融合度；
第二天：在293T达到85％融合度时按照下列配方进行转染：
配制混合物1，包含：
lentiCRISPR v2-FAH：15μg
pMD.2G：5μg
pCMV-Dr8.91：10μg
Opti-MEM：500μL。
配制混合物2，包含：
Lipofectamine 2000：30μL
Opti-MEM：500μL。
静置5min后，将混合物1和混合物2混匀成转染混合物，静置20min。
将293T培养基换为无血清Opti-MEM培养基，加入转染混合物，37℃培养8h后换为5％FBS的DMEM培养基，继续培养。
3.病毒收集与保存
第三天：转染48h后收集含病毒的293T培养基上清，将慢病毒上清置于4℃水平离心机中，3800×g/min，离心10min，用0.45μm滤膜过滤后，取15mL过滤液加入到100KD超滤管中，然后再将上述100KD超滤管转移至4℃水平离心机中，4000×g/min，离心30min后，即得到假型慢病毒浓缩液。
4.假型慢病毒滴度测定
测定前1天将肝癌细胞系Huh7细胞以5×104/孔的密度接种于96孔板中；利用含6μg/ml溴化己二甲铵(polybrane)的DMEM培养液对假型慢病毒浓缩液进行10倍梯度稀释，分别得到稀释倍数为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9的稀释液；从96孔板中吸出原有的DMEM培养液，将上述稀释的假型慢病毒感染液分别加入各孔中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜后，换成100μL新鲜的DMEM培养液，继续培养48h后，96孔板中感染的每个细胞孔利用胰酶消化以1:2传代至2个新的培养孔中，其中1孔加入含5μg/mL嘌呤霉素，另1孔空白对照；再培养48h，通过细胞计数分别计算每个稀释比中嘌呤霉素处理孔与空白对照孔中细胞数目，并计算出病毒感染效率和病毒滴度。
其中，病毒感染效率＝(嘌呤霉素处理孔细胞数/空白对照孔中细胞数)×100％，计算得到病毒感染效率，通过约10％感染效率的对应细胞孔计算病毒滴度，病毒滴度(titer/mL)＝病毒感染效率×无嘌呤霉素处理孔细胞数×稀释倍数。
四、感染目的细胞并检测靶序列的敲除效果
1.材料准备
培养猪原代肝细胞；肝细胞维持培养基(William’s medium E培养基里加入1％v/v的ITS+premix、2mmol/l谷氨酰胺、10μg/l表皮生长因子、18mg/l氢化可的松、40μg/l地塞米松、100units/mL青霉素、100mg/mL链霉素和2％v/v DMSO)；不同靶序列(序列2和序列4)的lentiCRISPR v2-FAH假型慢病毒；猪原代肝细胞细胞培养于含5％CO2/37℃细胞培养箱中，培养基为肝细胞维持培养基。
2.慢病毒感染目的细胞
第一天：将猪原代肝细胞铺板至6孔板，约90％融合密度。每一种病毒需要6孔板的一孔，同时效率对照需要6孔板的一孔。
第二天：待猪原代肝细胞100％融合密度时加入含有6μg/ml polybrane、lentiCRISPR v2-FAH假型慢病毒浓缩液(感染复数moi＝10，经滴度测试可使感染效率达到100％)的肝细胞维持培养基。效率对照不需要添加慢病毒。
第三天：感染24h后去除含假型慢病毒的旧培养基，换成新鲜肝细胞维持培养基，继续培养48h。
3.检测FAH基因敲除效果
(1)设计上下游引物以扩增FAH基因片段，其中上下游引物序列如下所示：
AATAAATGGAAGGCAACAAGCACTTTCTTG(SEQ ID NO：72)
CATGTAGTTGCGGGTTTGATCCCTGGCTCCG(SEQ ID NO：73)。
目的扩增片段包含sgRNA靶序列，大小为508bp。靶序列至片段两端的位置不少于100bp。
(2)收集部分猪原代肝细胞，使用Qiagen基因组DNA试剂盒抽提基因组DNA。同时抽提野生型目的细胞的基因组DNA。
(3)以基因组DNA为模板扩增包含靶序列的FAH基因片段(包括感染的突变样品和野生型样品)。
扩增反应体系(20μL)如下：
上游引物(10μM)：1μL
下游引物(10μM)：1μL
2×PCRMix：10μL
基因组DNA：100ng
以上述反应体系进行配制，放入PCR仪，并按下列程序进行反应。
反应程序：
95℃,3min
95℃,30s
58℃,20s
72℃,20s
72℃,3min；
其中第二步至第四步重复35个循环。
(4)电泳检测PCR产物并回收纯化
(5)将纯化后的DNA片段分别加热变性、复性，形成杂交DNA分子(包括突变样品和野生型样品)。
反应体系如下所示：
基因组PCR片段：200ng
5×反应buffer：2μL
反应体系共9μL
以上述反应体系进行配制，放入PCR仪，并按下列程序进行反应。
反应程序：
95℃,5min；
80℃,5min；
70℃,5min；
60℃,5min；
50℃,5min；
自然降至室温。
(6)用Cruiser酶切割复性后的杂交DNA(包括突变样品和野生型样品)
向经过变性、复性的反应混合物加入1μL Cruiser酶，45℃孵育20min。
(7)电泳检测酶切产物，检测靶序列介导的FAH基因敲除效果。
将经过酶切的DNA片段用1.8％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，100V，25min。确定目的片段的切割情况，判断靶序列的基因敲除效果。
对突变DNA的切割识别基于以下原理：经过感染的细胞会表达sgRNA和Cas9。基因组DNA如果被sgRNA介导的Cas9蛋白靶向切割，经过修复后会在切割位点附近引入突变(野生型变为突变型)。由于野生型和突变型序列在该位置不匹配，以此为模板扩增出的野生型DNA与突变型DNA经过变复性形成的杂交分子会就产生局部的环形(loop)结构。而后者可以被Cruiser酶识别并切断，导致杂交DNA分子被切割成小片段。
结果如图4所示，M表示DNA分子大小标记物，对照序列(SEQ ID NO：69)不能有效靶向FAH基因产生切割，因此未检测到小片段(约200bp或300bp)；未经过病毒感染的野生型细胞的PCR产物也未检测到小片段(约200bp或300bp)；而序列2和序列4能够有效靶向FAH基因产生切割，因此检测到小片段(约200bp或300bp)的存在，表明序列2和序列4能够作为CRISPR-Cas9特异性敲除猪FAH基因的靶序列。
兔FAH基因敲除实施例中：
Oryctolagus cuniculus(兔)FAH基因sgRNA靶序列的选择和设计进行说明，具体如下：
一、靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。
1.FAH基因的sgRNA靶序列选择
针对FAH基因，在靶序列选择上应该遵循下列原则：
(1)在FAH基因外显子编码区寻找符合5’-N(20)NGG-3’规则的靶序列，其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合规则的靶序列可以位于正义链或反义链；
(2)选择靠近N端的5个外显子编码区序列，这样的编码区序列的切割会造成FAH基因的功能敲除，残留截短的序列不会形成有功能的蛋白；
(3)如果存在多种剪切体，则在共有外显子编码区进行选择，针对FAH基因选择靠近N端的5个外显子编码区序列即可满足该条件；
(4)利用在线序列分析工具(http://crispr.mit.edu/)分析以上靶序列在猪基因组中的同源情况，舍弃存在显著同源序列的靶序列，根据评分进一步挑选，所挑选的靶序列在FAH基因上是唯一的。
基于以上原则，选择出表2所示的靶序列集合。
表2靶序列集合
Figure BDA0001840985800000141
Figure BDA0001840985800000151
Figure BDA0001840985800000161
2.FAH基因的sgRNA靶序列设计：
(1)以lentiCRISPR v2质粒作为表达载体，根据lentiCRISPR v2质粒的特点，在上述N(20)靶序列的5’-端添加CACCG序列，形成正向寡核苷酸序列：
5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；
(2)在上述N(20)靶序列的反向互补序列的两端添加序列，形成反向寡核苷酸序列：
5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3’；
正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列可以互补形成具有粘性末端的双链DNA片段：
5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
3’-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’。
二、构建FAH基因的sgRNA表达载体
1.合成DNA插入片段
(1)合成上述设计的正向和反向寡核苷酸序列
寡核苷酸序列可以由商业化的公司(如上海吉玛公司)根据提供的序列具体合成。本实施例及以下实施例研究了表2中所列的第74号和第77号序列所示的靶序列对FAH基因的敲除效果。
第74号靶序列对应的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列如下：
CACCGGAAAGCTGGACGGGTCCCCC(SEQ ID NO：132)；
AAACGGGGGACCCGTCCAGCTTTCC(SEQ ID NO：133)。
第77号靶序列对应的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列如下：
CACCGGCCAATCCGGGGTCTGGGCT(SEQ ID NO：134)；
AAACAGCCCAGACCCCGGATTGGCC(SEQ ID NO：135)。
将对应的正向和反向寡核苷酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链DNA片段。
反应体系(20μL)如下所示：
正向寡核苷酸(10μM)：1μL
反向寡核苷酸(10μM)：1μL
10×PCRbuffer：2μL
ddH2O：16μL
将上述反应体系放入PCR仪，并按以下程序进行反应。
反应程序：
95℃,5min；
80℃,5min；
70℃,5min；
60℃,5min；
50℃,5min；
自然降至室温。
2.构建sgRNA表达载体
(1)利用BsmB I限制性内切酶酶切目标载体lentiCRISPR v2质粒(其序列如序列表中SEQ ID NO：131所示)。
按照以下反应体系进行配制：
LentiCRISPR v2质粒：1μg
10×酶切buffer：2μL
BsmB I限制性内切酶：2μL
补充ddH2O至总体积20μL
将酶切反应体系置于37℃反应4h。
(2)电泳分离并纯化载体片段
酶切结束后，将酶切混合物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，选择载体片段(约12kb)进行切割，并通过DNA凝胶回收柱进行回收。
(3)将合成的双链DNA片段与载体主片段进行连接并转化大肠杆菌
将复性得到的双链DNA片段与回收得到的载体片段进行连接反应，按照以下反应体系进行配制：
LentiCRISPR v2载体片段：100ng
双链DNA片段：200ng
T4连接酶：1μL
T4连接反应buffer：1μL
补充ddH2O至总体积10μL
将连接混合物置于25℃反应2h。
反应结束后将连接混合物转化大肠杆菌DH5α菌株：向连接混合物中加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰上孵育30min；将混合物放入42℃水浴，热激90s后放入冰上冷却；向混合物加入100μL LB培养基，37℃摇床培养20min；将混合物涂Amp LB平板，37℃培养14h。
(4)鉴定正确的转化克隆
从Amp LB平板上挑选若干菌落进行扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定。挑选可能正确的克隆进行测序，验证插入序列是否正确。对于正确的lentiCRISPR v2-FAH载体克隆进行保种。
三、获得表达FAH sgRNA的假型慢病毒
1.材料准备
扩增并抽提包装质粒pMD.2G和pCMV-Dr8.91(购自Addgenhttp://www.addgene.org，其图谱分别如图2、图3所示)；扩增并抽提载体质粒lentiCRISPR v2-FAH；培养包装细胞系293T细胞(购自ATCC)；DMEM培养基、Opti-MEM培养基和胎牛血清FBS(购自Gibco)；Lipofectamine2000(购自Gibco)；293T细胞培养于5％CO2/37℃细胞培养箱中，培养基为含10％FBS的DMEM培养基。
2.转染和病毒包装
第一天：将包装细胞系293T传代至10cm培养皿中，约30％融合度；
第二天：在293T达到85％融合度时按照下列配方进行转染：
配制混合物1，包含：
lentiCRISPR v2-FAH：15μg
pMD.2G：5μg
pCMV-Dr8.91：10μg
Opti-MEM：500μL。
配制混合物2，包含：
Lipofectamine 2000：30μL
Opti-MEM：500μL。
静置5min后，将混合物1和混合物2混匀成转染混合物，静置20min。
将293T培养基换为无血清Opti-MEM培养基，加入转染混合物，37℃培养8h后换为5％FBS的DMEM培养基，继续培养。
3.病毒收集与保存
第三天：转染48h后收集含病毒的293T培养基上清，将慢病毒上清置于4℃水平离心机中，3800×g/min，离心10min，用0.45μm滤膜过滤后，取15mL过滤液加入到100KD超滤管中，然后再将上述100KD超滤管转移至4℃水平离心机中，4000×g/min，离心30min后，即得到假型慢病毒浓缩液。
4.假型慢病毒滴度测定
测定前1天将肝癌细胞系Huh7细胞以5×104/孔的密度接种于96孔板中；利用含6μg/ml溴化己二甲铵(polybrane)的DMEM培养液对假型慢病毒浓缩液进行10倍梯度稀释，分别得到稀释倍数为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9的稀释液；从96孔板中吸出原有的DMEM培养液，将上述稀释的假型慢病毒感染液分别加入各孔中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜后，换成100μL新鲜的DMEM培养液，继续培养48h后，96孔板中感染的每个细胞孔利用胰酶消化以1:2传代至2个新的培养孔中，其中1孔加入含5μg/mL嘌呤霉素，另1孔空白对照；再培养48h，通过细胞计数分别计算每个稀释比中嘌呤霉素处理孔与空白对照孔中细胞数目，并计算出病毒感染效率和病毒滴度。
其中，病毒感染效率＝(嘌呤霉素处理孔细胞数/空白对照孔中细胞数)×100％，计算得到病毒感染效率，通过约10％感染效率的对应细胞孔计算病毒滴度，病毒滴度(titer/mL)＝病毒感染效率×无嘌呤霉素处理孔细胞数×稀释倍数。
四、感染目的细胞并检测靶序列的敲除效果
1.材料准备
培养兔原代肝细胞；兔肝细胞维持培养基(William’s medium E培养基里加入1％v/v的ITS+premix、2mmol/l谷氨酰胺、10μg/l表皮生长因子、18mg/l氢化可的松、40μg/l地塞米松、100units/mL青霉素、100mg/mL链霉素、1.7％v/v DMSO和10％FBS)；不同靶序列(序列74和序列77)的lentiCRISPR v2-FAH假型慢病毒；兔原代肝细胞细胞培养于含5％CO2/37℃细胞培养箱中，培养基为兔肝细胞维持培养基。
2.慢病毒感染目的细胞
第一天：将兔原代肝细胞铺板至6孔板，约90％融合密度。每一种病毒需要6孔板的一孔，同时效率对照需要6孔板的一孔。
第二天：待兔原代肝细胞100％融合密度时加入含有6μg/ml polybrane、lentiCRISPR v2-FAH假型慢病毒浓缩液(感染复数moi＝100，经滴度测试可使感染效率达到100％)的肝细胞维持培养基。效率对照不需要添加慢病毒。
第三天：感染24h后去除含假型慢病毒的旧培养基，换成新鲜肝细胞维持培养基，继续培养48h。
3.检测FAH基因敲除效果
(1)设计上下游引物以扩增兔FAH基因片段，其中上下游引物序列如下所示：
CGGAGCACTTAGCAAGCAAA(SEQ ID NO：136)
ATGTAGAGCC CTGGAGACCT(SEQ ID NO：137)。
目的扩增片段包含sgRNA靶序列，大小为460bp。靶序列至片段两端的位置不少于100bp。
(2)收集部分目的细胞，使用promega基因组DNA试剂盒抽提基因组DNA。同时抽提野生型目的细胞的基因组DNA。
(3)以基因组DNA为模板扩增包含靶序列的FAH基因片段(包括感染的突变样品和野生型样品)。
扩增反应体系(20μL)如下：
上游引物(10μM)：1μL
下游引物(10μM)：1μL
2×PCRMix：10μL
基因组DNA：100ng
以上述反应体系进行配制，放入PCR仪，并按下列程序进行反应。
反应程序：
95℃,3min
95℃,30s
58℃,20s
72℃,20s
72℃,3min；
其中第二步至第四步重复35个循环。
(4)电泳检测PCR产物并回收纯化
(5)将纯化后的DNA片段分别加热变性、复性，形成杂交DNA分子(包括突变样品和野生型样品)。
反应体系如下所示：
基因组PCR片段：200ng
5×反应buffer：2μL
反应体系共9μL
以上述反应体系进行配制，放入PCR仪，并按下列程序进行反应。
反应程序：
95℃,5min；
80℃,5min；
70℃,5min；
60℃,5min；
50℃,5min；
自然降至室温。
(6)用Cruiser酶切割复性后的杂交DNA(包括突变样品和野生型样品)
向经过变性、复性的反应混合物加入1μL Cruiser酶，45℃孵育20min。
(7)电泳检测酶切产物，检测靶序列介导的FAH基因敲除效果。
将经过酶切的DNA片段用2％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，100V，25min。确定目的片段的切割情况，判断靶序列的基因敲除效果。
对突变DNA的切割识别基于以下原理：经过感染的细胞会表达sgRNA和Cas9。基因组DNA如果被sgRNA介导的Cas9蛋白靶向切割，经过修复后会在切割位点附近引入突变(野生型变为突变型)。由于野生型和突变型序列在该位置不匹配，以此为模板扩增出的野生型DNA与突变型DNA经过变复性形成的杂交分子会就产生局部的环形(loop)结构。而后者可以被Cruiser酶识别并切断，导致杂交DNA分子被切割成小片段。
结果如图5所示，M表示DNA分子大小标记物，对照序列(序列表中的SEQ ID NO：133)不能有效靶向FAH基因产生切割，因此未检测到小片段(约200bp或300bp)；未经过病毒感染的野生型细胞的PCR产物也未检测到小片段(约200bp或300bp)；而序列74和序列77能够有效靶向FAH基因产生切割，因此检测到小片段的存在，表明序列74和序列77能够作为CRISPR-Cas9特异性敲除兔FAH基因的靶序列。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 立沃生物科技（深圳）有限公司
<120> 运用CRISPR-Cas9特异性敲除FAH基因的方法及特异性sgRNA
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> DNA
<213> FAH基因第2外显子(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
gtcaagaccg aggatcggcg ggtcttgact gggagaaaga gccgatcctc ggtcttgact 60
gctttatgac actgaggtcc ggcgattggt gaccagatcc gtcataaagc acctcttcac 120
<210> 2
<211> 80
<212> DNA
<213> FAH基因第3外显子(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
ggtaaggagc ccatggacct gaagctgtta agagttggct gaatgctctt gcttccttcc 60
gccaactctt aacagcttca 80
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> FAH基因第4外显子(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
ggcaggaaga tgcatcgtgg gatgcatcgt ggcggaggcc ggcggcagga agatgcatcg 60
<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213> FAH基因第5外显子(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
gtttgtggcg tgctgccggg gtctgtgtag tcacctgcgg gaagtctgtg tagtcacctg 60
gtcacctgcg gaggaaaggc gacgtttgtg gcgtgctgcc gaacatgact ccgacgtttg 120
<210> 5
<211> 120
<212> DNA
<213> FAH基因第6外显子(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
ggtagatgca gcctgatgga ggtgccagac accacgacag ggaggcactt acagtcatcg 60
gcacggccat ggtaggccac gcatctgtcc catgggcctg gtcccatggg cctgcggatt 120
<210> 6
<211> 80
<212> DNA
<213> FAH基因第7外显子(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
ggagttggaa atggtaagct gctagaacag catcagaaaa ggaaatggta agctgggtct 60
gtatggtgcc tgcaaactct 80
<210> 7
<211> 140
<212> DNA
<213> FAH基因第8外显子(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
gctctccaag tctgttccca gtccttatga acgactggag gagtggtaat tatggggcgc 60
gctcgtgggc cttggagatg gtaggccctg ggaacagact ggctctccaa gtctgttccc 120
gaatggtcct tatgaacgac 140
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> FAH基因第9外显子(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
gggcacagca aagggcatga gcatccatgg gcaccaccca gggcaccacc catggggata 60
<210> 9
<211> 120
<212> DNA
<213> FAH基因第10外显子(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 9
ggtactgttt tgggatcgca ggagatatgg cagaggcttg gcggagatat ggcagaggct 60
gaggttgatg tcgaacatgt gtgctctgct ctgccctctc ggctggtcgt ggcggagata 120
<210> 10
<211> 140
<212> DNA
<213> FAH基因第11外显子(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 10
gccaagcggc taccatatgc gtgttacttg tcttcacaac gtactgcggg cgaaggacag 60
ggttgcagcc attgacagag ggtgagtatc taatggccct gatactcacc ggcccgctga 120
gcgggccggt gagtatctaa 140
<210> 11
<211> 160
<212> DNA
<213> FAH基因第13外显子(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 11
gaagtcatca taacaggtga gctgtcgtgg aggggaacaa gaacaaaggc catagagctg 60
gtgaaggagc cagaaagctt gctccatgct ggagctgtcg gggaacaaag gccatagagc 120
ggaacaaagg ccatagagct ggggacgaag tcatcataac 160
<210> 12
<211> 120
<212> DNA
<213> FAH基因第14外显子(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 12
gcagtgccct gcaacagagg gagcacgtca cgccggcgag gtcggctttg gccagtgtac 60
gacggttacc gtgtcggctt gccagggcta ccgccacaga gtgctcaagg ctttgtttcc 120
<210> 13
<211> 13459
<212> DNA
<213> lenticrispr v2载体(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 13
gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60
atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120
gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180
tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240
attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300
atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360
acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420
tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480
tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540
attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600
tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660
ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720
accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780
gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct 840
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 900
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 960
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1020
gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1080
ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1140
ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1200
ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1260
aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1320
tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 1380
caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1440
aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1500
aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 1560
agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 1620
gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 1680
ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg 1740
acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 1800
ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 1860
ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 1920
tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1980
aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 2040
aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 2100
aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 2160
acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 2220
agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 2280
tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 2340
gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc ggcactgcgt 2400
gcgccaattc tgcagacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa aaggggggat 2460
tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca tacaaactaa 2520
agaattacaa aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca gggacagcag 2580
agatccagtt tggttaatta aggtaccgag ggcctatttc ccatgattcc ttcatatttg 2640
catatacgat acaaggctgt tagagagata attagaatta atttgactgt aaacacaaag 2700
atattagtac aaaatacgtg acgtagaaag taataatttc ttgggtagtt tgcagtttta 2760
aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatatg cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc 2820
ttggctttat atatcttgtg gaaaggacga aacaccggag acggacgtct ctgttttaga 2880
gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga 2940
gtcggtgctt ttttgaattc gctagctagg tcttgaaagg agtgggaatt ggctccggtg 3000
cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg ggaggggtcg 3060
gcaattgatc cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt 3120
actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg 3180
tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggaccggttc tagagcgctg 3240
ccaccatgga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg caccaactct gtgggctggg 3300
ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt caaggtgctg ggcaacaccg 3360
accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct gttcgacagc ggcgaaacag 3420
ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata caccagacgg aagaaccgga 3480
tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa ggtggacgac agcttcttcc 3540
acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa gcacgagcgg caccccatct 3600
tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta ccccaccatc taccacctga 3660
gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg gctgatctat ctggccctgg 3720
cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg cgacctgaac cccgacaaca 3780
gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta caaccagctg ttcgaggaaa 3840
accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct gtctgccaga ctgagcaaga 3900
gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga gaagaagaat ggcctgttcg 3960
gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt caagagcaac ttcgacctgg 4020
ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga cgacgacctg gacaacctgc 4080
tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc cgccaagaac ctgtccgacg 4140
ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat caccaaggcc cccctgagcg 4200
cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct gaccctgctg aaagctctcg 4260
tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt cgaccagagc aagaacggct 4320
acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt ctacaagttc atcaagccca 4380
tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa gctgaacaga gaggacctgc 4440
tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca ccagatccac ctgggagagc 4500
tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt cctgaaggac aaccgggaaa 4560
agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt gggccctctg gccaggggaa 4620
acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac catcaccccc tggaacttcg 4680
aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat cgagcggatg accaacttcg 4740
ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag cctgctgtac gagtacttca 4800
ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga gggaatgaga aagcccgcct 4860
tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct gttcaagacc aaccggaaag 4920
tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat cgagtgcttc gactccgtgg 4980
aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg cacataccac gatctgctga 5040
aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa cgaggacatt ctggaagata 5100
tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat cgaggaacgg ctgaaaacct 5160
atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa gcggcggaga tacaccggct 5220
ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga caagcagtcc ggcaagacaa 5280
tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa cttcatgcag ctgatccacg 5340
acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca ggtgtccggc cagggcgata 5400
gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc cattaagaag ggcatcctgc 5460
agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg ccggcacaag cccgagaaca 5520
tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa gggacagaag aacagccgcg 5580
agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg cagccagatc ctgaaagaac 5640
accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta cctgtactac ctgcagaatg 5700
ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg gctgtccgac tacgatgtgg 5760
accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg acgactccat cgacaacaag gtgctgacca 5820
gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc cgaagaggtc gtgaagaaga 5880
tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg ccaagctgat tacccagaga aagttcgaca 5940
atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga taaggccggc ttcatcaaga 6000
gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa agcacgtggc acagatcctg gactcccgga 6060
tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga agtgaaagtg atcaccctga 6120
agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt ttacaaagtg cgcgagatca 6180
acaactacca ccacgcccac gacgcctacc tgaacgccgt cgtgggaacc gccctgatca 6240
aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga ctacaaggtg tacgacgtgc 6300
ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc taccgccaag tacttcttct 6360
acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct ggccaacggc gagatccgga 6420
agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat cgtgtgggat aagggccggg 6480
attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt gaatatcgtg aaaaagaccg 6540
aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc caagaggaac agcgataagc 6600
tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg cggcttcgac agccccaccg 6660
tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg caagtccaag aaactgaaga 6720
gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag cagcttcgag aagaatccca 6780
tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa ggacctgatc atcaagctgc 6840
ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag aatgctggcc tctgccggcg 6900
aactgcagaa gggaaacgaa ctggccctgc cctccaaata tgtgaacttc ctgtacctgg 6960
ccagccacta tgagaagctg aagggctccc ccgaggataa tgagcagaaa cagctgtttg 7020
tggaacagca caagcactac ctggacgaga tcatcgagca gatcagcgag ttctccaaga 7080
gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca aagtgctgtc cgcctacaac aagcaccggg 7140
ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct gtttaccctg accaatctgg 7200
gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca ccaccatcga ccggaagagg tacaccagca 7260
ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc accagagcat caccggcctg tacgagacac 7320
ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca agcgacctgc cgccacaaag aaggctggac 7380
aggctaagaa gaagaaagat tacaaagacg atgacgataa gggatccggc gcaacaaact 7440
tctctctgct gaaacaagcc ggagatgtcg aagagaatcc tggaccgatg cccaagaaga 7500
agaggaaggt gtccaattta ctgaccgtac accaaaattt gcctgcatta ccggtcgatg 7560
caacgagtga tgaggttcgc aagaacctga tggacatgtt cagggatcgc caggcgtttt 7620
ctgagcatac ctggaaaatg cttctgtccg tttgccggtc gtgggcggca tggtgcaagt 7680
tgaataaccg gaaatggttt cccgcagaac ctgaagatgt tcgcgattat cttctatatc 7740
ttcaggcgcg cggtctggca gtaaaaacta tccagcaaca tttgggccag ctaaacatgc 7800
ttcatcgtcg gtccgggctg ccacgaccaa gtgacagcaa tgctgtttca ctggttatgc 7860
ggcggatccg aaaagaaaac gttgatgccg gtgaacgtgc aaaacaggct ctagcgttcg 7920
aacgcactga tttcgaccag gttcgttcac tcatggaaaa tagcgatcgc tgccaggata 7980
tacgtaatct ggcatttctg gggattgctt ataacaccct gttacgtata gccgaaattg 8040
ccaggatcag ggttaaagat atctcacgta ctgacggtgg gagaatgtta atccatattg 8100
gcagaacgaa aacgctggtt agcaccgcag gtgtagagaa ggcacttagc ctgggggtaa 8160
ctaaactggt cgagcgatgg atttccgtat ctggtgtagc tgatgatccg aataactacc 8220
tgttttgccg ggtcagaaaa aatggtgttg ccgcgccatc tgccaccagc cagctatcaa 8280
ctcgcgccct ggaagggatt tttgaagcaa ctcatcgatt gatttacggc gctaaggatg 8340
actctggtca gagatacctg gcctggtctg gacacagtgc ccgtgtcgga gccgcgcgag 8400
atatggcccg cgctggagtt tcaataccgg agatcatgca agctggtggc tggaccaatg 8460
taaatattgt catgaactat atccgtaacc tggatagtga aacaggggca atggtgcgcc 8520
tgctggaaga tggcgattag ttaagtcgac aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa 8580
agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta 8640
atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa 8700
tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg 8760
tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc 8820
ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc 8880
cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg 8940
gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg 9000
acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg 9060
ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc 9120
ctttgggccg cctccccgcg tcgactttaa gaccaatgac ttacaaggca gctgtagatc 9180
ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac tggaagggct aattcactcc caacgaagac 9240
aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga gcctgggagc 9300
tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc 9360
aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc agaccctttt 9420
agtcagtgtg gaaaatctct agcagggccc gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg 9480
ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa 9540
ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt 9600
aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa 9660
gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc ggaaagaacc 9720
agctggggct ctagggggta tccccacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt 9780
gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 9840
gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg 9900
gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 9960
tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg 10020
ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct 10080
atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa 10140
aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattaattct gtggaatgtg tgtcagttag 10200
ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 10260
agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 10320
tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 10380
ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 10440
aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 10500
gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcgga tctgatcagc 10560
acgtgttgac aattaatcat cggcatagta tatcggcata gtataatacg acaaggtgag 10620
gaactaaacc atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc 10680
cggagcggtc gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga 10740
cttcgccggt gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt 10800
ggtgccggac aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga 10860
gtggtcggag gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat 10920
cggcgagcag ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca 10980
cttcgtggcc gaggagcagg actgacacgt gctacgagat ttcgattcca ccgccgcctt 11040
ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg 11100
cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccaacttg tttattgcag cttataatgg 11160
ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc 11220
tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctgtatac cgtcgacctc 11280
tagctagagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct 11340
cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg 11400
agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 11460
gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 11520
gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 11580
ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 11640
aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 11700
ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 11760
gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 11820
cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 11880
gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 11940
tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 12000
cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 12060
cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 12120
gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 12180
agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 12240
cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 12300
tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 12360
tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag 12420
ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat 12480
cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc 12540
cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat 12600
accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag 12660
ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg 12720
ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc 12780
tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca 12840
acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg 12900
tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc 12960
actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta 13020
ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc 13080
aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg 13140
ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc 13200
cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc 13260
aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat 13320
actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag 13380
cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc 13440
ccgaaaagtg ccacctgac 13459

Claims (9)

1.一种运用CRISPR-Cas9特异性敲除FAH基因的方法，运用于特异性敲除猪、兔FAH基因，其特征在于，具体步骤包括：
步骤S1：FAH基因的sgRNA靶序列选择和设计；
步骤S2：构建FAH基因的CRISPR-Cas9载体；
步骤S3：获得表达FAHsgRNA和Cas9蛋白的假型慢病毒；
步骤S4：感染目的细胞并检测FAH基因敲除效果。
2.根据权利要求1所述运用CRISPR-Cas9特异性敲除FAH基因的方法，其特征在于：
所述步骤S1中sgRNA靶序列选择是在FAH基因外显子编码区寻找符合5’-N(20)NGG-3’规则的靶序列；
sgRNA靶序列设计是将上述靶序列及互补序列分别添加接头，形成正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述运用CRISPR-Cas9特异性敲除FAH基因的方法，其特征在于：
所述sgRNA靶序列的5’-端加上用于连接反应的粘性末端序列，得到正向寡核苷酸序列；所述sgRNA靶序列的互补序列的两端加上用于连接反应的粘性末端序列，合成得到反向寡核苷酸序列；将合成的所述正向寡核苷酸序列与互补寡核苷酸序列经过退火与复性的步骤，形成具有粘性末端的双链寡聚核苷酸。
4.根据权利要求1所述运用CRISPR-Cas9特异性敲除FAH基因的方法，其特征在于：
构建FAH基因的CRISPR-Cas9载体是将携带Cas9基因的表达载体通过酶切线性化，将所述双链寡聚核苷酸通过T4连接酶连入携带Cas9基因的表达载体中，得到携带含靶序列的sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体。
5.根据权利要求1所述运用CRISPR-Cas9特异性敲除FAH基因的方法，其特征在于：
所述步骤S3的假型慢病毒是用所述携带有sgRNA和Cas9基因的表达载体和包装质粒在细胞系中包装得到的携带sgRNA和Cas9基因的慢病毒。
6.根据权利要求1所述运用CRISPR-Cas9特异性敲除FAH基因的方法，其特征在于：
使用所述慢病毒感染猪、兔肝原代肝细胞，培养一定时间后收集细胞，用试剂盒抽提基因组DNA，以基因组DNA为模板扩增包含所述靶序列的基因片段，经过变性、复性及酶切鉴定FAH基因的敲除情况。
7.根据权利要求6所述运用CRISPR-Cas9特异性敲除FAH基因的方法，其特征在于，所述确定FAH基因的敲除的步骤如下：
(a)以感染假型慢病毒的猪原代肝细胞、兔原代肝细胞的基因组DNA为模板，分别用猪、兔FAH基因的上下游引物扩增包含所述sgRNA的靶序列的FAH基因片段，同时用相同引物扩增未感染假型慢病毒的野生型细胞的基因组DNA，作为对照；
(b)纯化上述扩增到的FAH基因片段，然后将来自感染假型慢病毒的目的细胞的FAH基因片段与来自野生型细胞的FAH基因片段等量混合、加热变性和复性，形成杂交DNA分子；
(c)用Cruiser酶切割复性后的杂交DNA分子；
(d)电泳检测酶切产物，检测靶序列介导的FAH基因敲除效果。
8.一种特异性sgRNA，用于特异性靶向猪、兔FAH基因，其特征在于：
(1)所述sgRNA在猪和兔FAH基因上的靶序列符合5’-N(20)NGG-3’的序列排列规律，
其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合规律的靶序列可以位于DNA序列的正义链或反义链；
(2)所述sgRNA在猪和兔FAH基因上的靶序列分别位于猪、兔FAH基因的N端的5个外显子编码区，或序列的主要部分位于FAH基因的N端的5个外显子，其余部分跨越与相邻内含子的交界，位于相邻内含子。
9.根据权利要求8所述特异性sgRNA，其特征在于：当用于特异性靶向猪FAH基因时：所述靶序列为序列表1中SEQ ID NO：1～66中任一条序列所示的序列；
当用于特异性靶向兔FAH基因时：所述靶序列为序列表2中SEQ ID NO：74～130中任一条序列所示的序列。
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