CN112342216B - 用于提高CHO细胞的表达效率的CRISPR-Cas13d系统以及重组CHO细胞 - Google Patents

用于提高CHO细胞的表达效率的CRISPR-Cas13d系统以及重组CHO细胞 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于提高CHO细胞的表达效率的CRISPR‑Cas13d系统以及采用该系统制备得到的重组CHO细胞。本发明提供了用于抑制AMPK基因表达的物质在促进CHO细胞表达外源蛋白中的应用。本发明保护sgRNAAMPK‑1，其靶序列结合区如序列3中第1至21位核苷酸所示。本发明保护一种特异重组质粒，其表达所述sgRNAAMPK‑1和Cas13d蛋白。本发明保护表达sgRNAAMPK‑1和Cas13d蛋白的重组慢病毒。本发明的发明人通过CRISPR/Cas13d系统有效抑制了CHO细胞中的AMPK基因表达，得到了重组CHO细胞,表达外源蛋白的能力极其显著的提高,可以作为生物反应器大大提高生物制品的产量。本发明对于生物制药领域具有巨大的应用前景。

Description

用于提高CHO细胞的表达效率的CRISPR-Cas13d系统以及重组 CHO细胞
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于提高CHO细胞的表达效率的CRISPR-Cas13d系统以及采用该系统制备得到的重组CHO细胞。
背景技术
生物制药离不开细胞表达系统，而最常用的细胞系则是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)表达系统。
1987年，基因泰克公司的tPA被FDA批准，这是第一个CHO细胞表达的上市药品。之后，CHO细胞作为哺乳动物蛋白表达系统全面走入制药行业。CHO细胞大规模培养技术及其生物反应器工程可广泛应用于抗体、基因重组蛋白质药物、病毒疫苗等生物技术产品的研究开发和工业化生产。
通过几十年的发展，CHO细胞已成为生物技术药物最重要的表达或生产系统，成为了基因工程和生物制药的重要工具。2013年，在当年20个最畅销的生物药中，有11个是用CHO细胞表达的。据估计，如今用CHO细胞表达的药品份额已经占到数千亿美元。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于提高CHO细胞的表达效率的CRISPR-Cas13d系统以及采用该系统制备得到的重组CHO细胞。
本发明提供了用于抑制AMPK基因表达的物质在促进CHO细胞表达外源蛋白中的应用。
本发明还保护一种促进CHO细胞表达外源蛋白的方法，包括如下步骤：在CHO细胞中导入抑制AMPK基因表达的物质。在CHO细胞中导入抑制AMPK基因表达的物质的同时，可以导入表达外源蛋白的DNA分子。也可以先在CHO细胞中导入抑制AMPK基因表达的物质，得到重组细胞，再在重组细胞中导入表达外源蛋白的DNA分子。
以上任一所述抑制AMPK基因表达的物质为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)用于降解AMPK基因的mRNA的物质；
(a2)基于CRISPR-Cas13d系统对AMPK基因的mRNA进行编辑的物质；
(a3)用于降低AMPK蛋白的丰度的物质。
基于CRISPR-Cas13d系统对AMPK基因的mRNA进行编辑的物质具体可为下述任一CRISPR-Cas13d系统。
本发明还保护一种sgRNA，命名为sgRNAAMPK-1，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至21位核苷酸所示。具体来说，所述sgRNAAMPK-1如序列表的序列3所示。
本发明还保护一种特异DNA分子，其转录得到所述sgRNAAMPK-1。
本发明还保护一种特异重组质粒，其表达所述sgRNAAMPK-1和Cas13d蛋白。
本发明还保护表达sgRNAAMPK-1和Cas13d蛋白的重组慢病毒。所述重组慢病毒的制备方法具体如下：将Cas13d-AMPK-1质粒、psPAX2质粒和VSVG质粒共转染哺乳动物细胞(具体可为293T细胞)，然后培养细胞并收集上清，即为重组慢病毒病毒液。
本发明还保护一种CRISPR-Cas13d系统，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)：
(b1)包括sgRNAAMPK-1和Cas13d蛋白；
(b2)包括所述特异DNA分子和Cas13d基因；
(b3)包括具有所述特异DNA分子的质粒和具有Cas13d基因的质粒；
(b4)包括所述特异重组质粒；
(b5)包括所述重组慢病毒。
以上任一所述特异重组质粒具体可为Cas13d-AMPK-1质粒。
Cas13d-AMPK-1质粒如序列表的序列2所示。
对于(b4)来说，所述CRISPR-Cas13d系统还包括psPAX2质粒和VSVG质粒。具体的，所述CRISPR-Cas13d系统还包括用于慢病毒包装的哺乳动物细胞(具体可为293T细胞)。
本发明还保护将所述重组慢病毒导入CHO细胞得到的重组CHO细胞。所述重组CHO细胞表达外源蛋白的能力显著提高，可以作为生物反应器用于生物制药。
本发明还保护所述重组CHO细胞在表达外源蛋白中的应用。
以上任一所述AMPK基因为编码AMPK蛋白的基因。
AMPK蛋白为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列4所示的蛋白质；
(c2)来源于CHO细胞且与(c1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
AMPK基因为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)编码区如序列表的序列1中第200-1576位核苷酸所示的DNA分子；
(d2)序列表的序列1所示的DNA分子；
(d3)来源于CHO细胞且与(d1)或(d2)具有98％以上同一性且编码AMPK蛋白的DNA分子。
以上任一所述Cas13d基因为编码Cas13d蛋白的基因。
Cas13d蛋白为如下(e1)或(e2)：
(e1)序列表的序列5所示的蛋白质；
(e2)来源于CHO细胞且与(e1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
Cas13d基因为如下(f1)或(f2)：
(f1)编码区如序列表的序列2中第2645-5551位核苷酸所示的DNA分子；
(f2)来源于CHO细胞且与(f1)具有98％以上同一性且编码Cas13d蛋白的DNA分子。
本发明的发明人筛选特定的靶点，设计了特定的sgRNA，通过CRISPR/Cas13d系统有效抑制了CHO细胞中的AMPK基因表达，得到了重组CHO细胞。与野生型CHO细胞相比，重组CHO细胞表达外源蛋白的能力极其显著的提高。所述重组细胞可以作为生物反应器，大大提高生物制品的产量。本发明对于生物制药领域具有巨大的应用前景。
附图说明
图1为Cas13d-AMPK-1质粒的结构示意图。
图2为实施例3中试验第17天的细胞照片。
图3为实施例3中细胞直径统计的结果。
图4为实施例3中Western Blot的结果图。
图5为实施例3中实时定量PCR检测的结果。
图6为pDsRed2-N1质粒的结构示意图。
图7为实施例3中流式细胞仪检测的结果。
图8为实施例3中红色荧光蛋白的表达的统计结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。无缝连接试剂盒：北京擎科新业生物技术有限公司，货号为TSV-S2。psPAX2质粒：addgene，addgene#12260。VSVG质粒(全称为pCMV-VSV-G)：addgene，addgene#8454。EF1a-CasRx-2A-EGFP质粒：addgene，addgene#109049。lentiCRISPR v2质粒：addgene，addgene#52961。Megatran 1.0转染试剂：ORIGEN，TT200004。CHO细胞：国家生物医学实验细胞资源库。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、重组质粒的构建
一、构建慢病毒表达载体lentiCRISPR-Cas13d-EGFP
1、以EF1a-CasRx-2A-EGFP质粒为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物(约3.8kb)，PCR扩增产物中具有Cas13d蛋白和EGFP蛋白的编码基因。
F1：5'-CAGAACACAGGACCGGTATGAGCCCCAAGAAGAAG-3'；
R1：5'-GTTTGTTGCGCCGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCAT-3'。
2、取lentiCRISPR v2质粒，采用限制性内切酶XhoⅠ和HindⅢ进行双酶切，回收线性大片段(约8.8kb)。
3、采用无缝连接试剂盒，将步骤1得到的扩增产物和步骤2得到的线性大片段连接，得到环形质粒，即为慢病毒表达载体lentiCRISPR-Cas13d-EGFP，简称lentiCRISPR-Cas13d-EGFP质粒。
二、构建Cas13d-AMPK-1质粒和Cas13d-AMPK-2质粒
发明人通过分析仓鼠AMPK基因序列(如序列表的序列1所示，序列1中编码框为第200-1576位)，选择确定了靶向AMPK mRNA的特异性序列。
AMPK-1正义链：5'-TGGCTTTATATATCTTCACCCGTCCTGCTTGATGCACACATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'；
AMPK-1反义链：5'-GCTATTTCTAGCTCTAAAACATGTGTGCATCAAGCAGGACGGGTGAAGATATATAAAGCCA-3'。
AMPK-2正义链：5'-TGGCTTTATATATCTTCACCCATATATCTAAGGATTGGCCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'；
AMPK-2反义链：5'-GCTATTTCTAGCTCTAAAACAGGCCAATCCTTAGATATATGGGTGAAGATATATAAAGCCA-3'。
AMPK-1正义链、AMPK-1反义链、AMPK-2正义链和AMPK-2反义链均为单链DNA分子。分别合成AMPK-1正义链和AMPK-1反义链，然后混合并进行退火，得到双链DNA分子，命名为DNA分子AMPK-1。分别合成AMPK-2正义链和AMPK-2反义链，然后混合并进行退火，得到双链DNA分子，命名为DNA分子AMPK-2。
取lentiCRISPR-Cas13d-EGFP质粒，用限制性内切酶BsmB I进行酶切，回收线性载体。
采用无缝连接试剂盒，将DNA分子AMPK-1与线性载体连接，得到重组质粒lentiCRISPR-Cas13d-EGFP-AMPK-1，简称Cas13d-AMPK-1质粒。采用无缝连接试剂盒，将DNA分子AMPK-2与线性载体连接，得到重组质粒lentiCRISPR-Cas13d-EGFP-AMPK-2，简称Cas13d-AMPK-2质粒。
经测序，Cas13d-AMPK-1质粒的全序列如序列表的序列2所示。与Cas13d-AMPK-1质粒相比，Cas13d-AMPK-2质粒的差异仅在于将“CGTCCTGCTTGATGCACACAT”替换为了“CATATATCTAAGGATTGGCCT”。
Cas13d-AMPK-1质粒的结构示意图见图1。Cas13d-AMPK-1质粒表达序列表的序列3所示的sgRNAAMPK-1。Cas13d-AMPK-1质粒中，第2645-5551位核苷酸为Cas13d基因(2907bp)，第5687-6403位核苷酸为EGFP基因(717bp)，第6469-7065位核苷酸为PuroR基因(597bp)。
实施例2、利用哺乳动物细胞表达慢病毒，得到重组慢病毒病毒液
1、将293T细胞接种于培养皿(直径为6cm)，采用DMEM培养基培养24h(此时细胞密度为50％-70％，细胞数量约为1×106个)。
2、将1μg Cas13d-AMPK-1质粒、0.5μg psPAX2质粒和0.5μg VSVG质粒加至200μL不含血清双抗的DMEM培养基中，振荡混匀，然后加入10μL Megatran 1.0转染试剂，再次振荡混匀，然后室温静置10min。此为1个培养皿的加入量。
3、将步骤2得到的混合液加入至完成步骤1的培养皿中，37℃培养48h。
4、完成步骤3后，收集上清液，即为AMPK-1病毒液。
用Cas13d-AMPK-2质粒代替Cas13d-AMPK-1质粒，依次进行上述步骤1至4，得到AMPK-2病毒液。
实施例3、重组CHO细胞的制备和表达能力比较
1、采用DMEM培养基在6cm培养皿中培养CHO细胞，至密度约为60％，每个培养皿中的细胞数量约为1×106个。
2、AMPK-1组：完成步骤1后，加入300μL实施例1制备的AMPK-1病毒液并培养24小时；然后更换新的DMEM培养基，再加入300μL实施例1制备的AMPK-1病毒液并培养24小时；然后采用含1μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基培养7天(每隔一天更换新的含1μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基)；然后采用DMEM培养基培养(每隔一天更换新的DMEM培养基)。只有重组CHO细胞才可以在含有嘌呤霉素的培养基中存活，野生型CHO细胞被嘌呤霉素杀死。步骤2中连续计天数，试验第1天第一次加入病毒液，试验第2天第二次加入病毒液，试验第3天至第9天采用含1μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基培养，试验第10天开始采用DMEM培养基培养。
3、AMPK-2组：用AMPK-2病毒液代替AMPK-1病毒液，其他同AMPK-1组。
4、野生型组：不加入病毒液，其他同AMPK-1组。
步骤2、3、4为平行操作。
二、每天取样细胞，拍照并统计细胞直径大小。
试验第17天的细胞照片见图2。感染AMPK-1病毒液后，得到了具有EGPF荧光的重组CHO细胞。感染AMPK-2病毒液后，得到了具有EGPF荧光的重组CHO细胞。
细胞直径统计结果见图3。与正常CHO细胞相比，感染AMPK-1病毒液后的重组CHO细胞的直径显著增大，感染AMPK-2病毒液后的重组CHO细胞的直径无显著差异。
三、Western印迹检测
试验第12天，收集细胞。提取细胞总蛋白，进行Western Blot。Western Blot采用的抗体为AMPK抗体(Cell Signaling,#2532)或β-actin抗体(Santa Cruz Biotechnology,sc-47778HRP)。β-actin作为内参。
结果见图4。感染AMPK-1病毒液后的重组CHO细胞的全蛋白中基本观察不到AMPK蛋白。感染AMPK-2病毒液后的重组CHO细胞的全蛋白中的AMPK蛋白丰度相对正常CHO细胞无显著差异。
四、逆转录和实时定量PCR检测
试验第12天，收集细胞。提取细胞的总RNA，然后反转录得到cDNA。以cDNA为模板，采用实时定量PCR检测AMPK基因的表达水平。以β-actin基因为内参基因。利用2-ΔΔCt公式计算基因的AMPK基因的相对表达量。
用于检测AMPK基因的引物如下：
上游引物：5'-GTCATCAGTACACCATCTGAT-3'；
下游引物：5'-GAAATTACTTCCGGTGCAGC-3'。
用于检测β-actin基因的引物如下：
上游引物：5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3'；
下游引物：5'-CAATGCCTGGGTACATGGTG-3'。
结果见图5。与正常CHO细胞相比，感染AMPK-1病毒液后的重组CHO细胞的AMPK基因表达水平极其显著下降，感染AMPK-2病毒液后的重组CHO细胞的AMPK基因表达水平无显著差异。
五、以红色荧光蛋白为示例检测重组CHO细胞表达外源蛋白的能力
1、试验第17天，收集细胞。
2、取步骤1得到的细胞，利用Bio-Rad Gene Pulsers系统，转染pDsRed2-N1质粒(Clontech，质粒图谱见图6)。细胞和质粒的配比约为：106个细胞：5微克pDsRed2-N1质粒。
3、完成步骤2后，采用EX-CELL CD CHO融合培养基(Sigma-Aldrich)培养。
4、分别于步骤3中培养3天后或培养8天后，离心收集细胞，用PBS缓冲液洗涤，然后通过流式细胞仪(BD Biosciences)分析细胞中红色荧光蛋白的表达情况，使用FlowJo软件(Treestart)分析FACS数据。
结果见图7和图8。与正常CHO细胞相比，感染AMPK-1病毒液后的重组CHO细胞表达红色荧光蛋白的能力极其显著的增高，感染AMPK-2病毒液后的重组CHO细胞表达红色荧光蛋白的能力无显著差异。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 用于提高CHO细胞的表达效率的CRISPR-Cas13d系统以及重组CHO细胞
<130> GNCYX202828
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4595
<212> DNA
<213> Chinese Hamster
<400> 1
aatcagcaag cccaacagag cagtgggcaa acatgaattg actggacata aagtcgctgt 60
gaagatactc aaccggcaga agatccgaag ccttgatgtg gtcgggaaga tccgaaggga 120
gatccagaac ttgaagcttt tccggcaccc tcacataatt aaactgtacc aggtcatcag 180
tacaccatct gatattttca tggtgatgga atatgtctca ggaggagagc tatttgatta 240
tatctgtaaa aatggaaggt tggatgaaaa ggaaagtcga cgtctgttcc agcagatcct 300
ttctggtgtg gattattgtc acaggcacat ggtggtccac agggacctga aacctgaaaa 360
cgtcctgctt gatgcacaca tgaatgcaaa gatagctgat ttcggtcttt caaacatgat 420
gtcagatggt gaatttttaa gaacaagctg tggctcaccc aattacgctg caccggaagt 480
aatttcagga agattgtatg caggccctga ggtggatatc tggagcagtg gggtcattct 540
ctatgccttg ttatgtggaa ccctcccctt tgatgatgac cacgtgccaa ctctttttaa 600
gaagatatgc gatgggattt tctatacccc tcagtattta aatccctctg tgatcagcct 660
tttgaagcat atgctgcagg tagatcccat gaagagggcc acaataaaag acatcaggga 720
acatgaatgg tttaaacagg accttccaaa atatctcttt ccggaggatc catcatacag 780
ttcaaccatg attgatgatg aagccttaaa agaagtgtgt gaaaagtttg aatgttcgga 840
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accattcttg gttgctgaaa caccaagggc acggcacacc cttgatgaat taaacccaca 1080
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ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 10800
tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 10860
tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 10920
cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 10980
aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 11040
atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 11100
cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga 11160
tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 11220
atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt 11280
taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt 11340
tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat 11400
gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 11460
cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 11520
cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 11580
gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 11640
aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 11700
accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 11760
ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 11820
gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 11880
aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 11940
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tcgacggatc 12000
gggagatctc ccgatcccct atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag 12060
ttaagccagt atctgctccc tgcttgtgtg ttggaggtcg ctgagtagtg cgcgagcaaa 12120
atttaagcta caacaaggca aggcttgacc gacaattgca tgaagaatct gcttagggtt 12180
aggcgttttg cgctgcttcg cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca ttgattattg 12240
actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 12300
cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 12360
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 12420
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 12480
ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 12540
tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 12600
accatgg 12607
<210> 3
<211> 97
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cguccugcuu gaugcacaca uguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60
ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugc 97
<210> 4
<211> 458
<212> PRT
<213> Chinese Hamster
<400> 4
Met Val Met Glu Tyr Val Ser Gly Gly Glu Leu Phe Asp Tyr Ile Cys
1 5 10 15
Lys Asn Gly Arg Leu Asp Glu Lys Glu Ser Arg Arg Leu Phe Gln Gln
20 25 30
Ile Leu Ser Gly Val Asp Tyr Cys His Arg His Met Val Val His Arg
35 40 45
Asp Leu Lys Pro Glu Asn Val Leu Leu Asp Ala His Met Asn Ala Lys
50 55 60
Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Asn Met Met Ser Asp Gly Glu Phe Leu
65 70 75 80
Arg Thr Ser Cys Gly Ser Pro Asn Tyr Ala Ala Pro Glu Val Ile Ser
85 90 95
Gly Arg Leu Tyr Ala Gly Pro Glu Val Asp Ile Trp Ser Ser Gly Val
100 105 110
Ile Leu Tyr Ala Leu Leu Cys Gly Thr Leu Pro Phe Asp Asp Asp His
115 120 125
Val Pro Thr Leu Phe Lys Lys Ile Cys Asp Gly Ile Phe Tyr Thr Pro
130 135 140
Gln Tyr Leu Asn Pro Ser Val Ile Ser Leu Leu Lys His Met Leu Gln
145 150 155 160
Val Asp Pro Met Lys Arg Ala Thr Ile Lys Asp Ile Arg Glu His Glu
165 170 175
Trp Phe Lys Gln Asp Leu Pro Lys Tyr Leu Phe Pro Glu Asp Pro Ser
180 185 190
Tyr Ser Ser Thr Met Ile Asp Asp Glu Ala Leu Lys Glu Val Cys Glu
195 200 205
Lys Phe Glu Cys Ser Glu Glu Glu Val Leu Ser Cys Leu Tyr Asn Arg
210 215 220
Asn His Gln Asp Pro Leu Ala Val Ala Tyr His Leu Ile Ile Asp Asn
225 230 235 240
Arg Arg Ile Met Asn Glu Ala Lys Asp Phe Tyr Leu Ala Thr Ser Pro
245 250 255
Pro Asp Ser Phe Leu Asp Asp His His Leu Thr Arg Pro His Pro Glu
260 265 270
Arg Val Pro Phe Leu Val Ala Glu Thr Pro Arg Ala Arg His Thr Leu
275 280 285
Asp Glu Leu Asn Pro Gln Lys Ser Lys His Gln Gly Val Arg Lys Ala
290 295 300
Lys Trp His Leu Gly Ile Arg Ser Gln Ser Arg Pro Asn Asp Ile Met
305 310 315 320
Ala Glu Val Cys Arg Ala Ile Lys Gln Leu Asp Tyr Glu Trp Lys Val
325 330 335
Val Asn Pro Tyr Tyr Leu Arg Val Arg Arg Lys Asn Pro Val Thr Ser
340 345 350
Thr Phe Ser Lys Met Ser Leu Gln Leu Tyr Gln Val Asp Ser Arg Thr
355 360 365
Tyr Leu Leu Asp Phe Arg Ser Ile Asp Asp Glu Ile Thr Glu Ala Lys
370 375 380
Ser Gly Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ser Gly Ser Ile Ser Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Ser Cys Gln Arg Ser Asp Ser Asp Ala Glu Ala Gln Gly Lys Pro Ser
405 410 415
Glu Val Ser Leu Thr Ser Ser Val Thr Ser Leu Asp Ser Ser Pro Val
420 425 430
Asp Leu Ala Pro Arg Pro Gly Ser His Thr Ile Glu Phe Phe Glu Met
435 440 445
Cys Ala Asn Leu Ile Lys Ile Leu Ala Gln
450 455
<210> 5
<211> 969
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Ala Ser Ile Glu Lys Lys Lys Ser Phe Ala Lys Gly Met Gly Val
1 5 10 15
Lys Ser Thr Leu Val Ser Gly Ser Lys Val Tyr Met Thr Thr Phe Ala
20 25 30
Glu Gly Ser Asp Ala Arg Leu Glu Lys Ile Val Glu Gly Asp Ser Ile
35 40 45
Arg Ser Val Asn Glu Gly Glu Ala Phe Ser Ala Glu Met Ala Asp Lys
50 55 60
Asn Ala Gly Tyr Lys Ile Gly Asn Ala Lys Phe Ser His Pro Lys Gly
65 70 75 80
Tyr Ala Val Val Ala Asn Asn Pro Leu Tyr Thr Gly Pro Val Gln Gln
85 90 95
Asp Met Leu Gly Leu Lys Glu Thr Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Gly Glu
100 105 110
Ser Ala Asp Gly Asn Asp Asn Ile Cys Ile Gln Val Ile His Asn Ile
115 120 125
Leu Asp Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Tyr Ile Thr Asn Ala Ala Tyr
130 135 140
Ala Val Asn Asn Ile Ser Gly Leu Asp Lys Asp Ile Ile Gly Phe Gly
145 150 155 160
Lys Phe Ser Thr Val Tyr Thr Tyr Asp Glu Phe Lys Asp Pro Glu His
165 170 175
His Arg Ala Ala Phe Asn Asn Asn Asp Lys Leu Ile Asn Ala Ile Lys
180 185 190
Ala Gln Tyr Asp Glu Phe Asp Asn Phe Leu Asp Asn Pro Arg Leu Gly
195 200 205
Tyr Phe Gly Gln Ala Phe Phe Ser Lys Glu Gly Arg Asn Tyr Ile Ile
210 215 220
Asn Tyr Gly Asn Glu Cys Tyr Asp Ile Leu Ala Leu Leu Ser Gly Leu
225 230 235 240
Arg His Trp Val Val His Asn Asn Glu Glu Glu Ser Arg Ile Ser Arg
245 250 255
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260 265 270
Thr Leu Asn Tyr Leu Tyr Asp Arg Ile Thr Asn Glu Leu Thr Asn Ser
275 280 285
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290 295 300
Gly Ile Asn Pro Ala Glu Phe Ala Glu Gln Tyr Phe Arg Phe Ser Ile
305 310 315 320
Met Lys Glu Gln Lys Asn Leu Gly Phe Asn Ile Thr Lys Leu Arg Glu
325 330 335
Val Met Leu Asp Arg Lys Asp Met Ser Glu Ile Arg Lys Asn His Lys
340 345 350
Val Phe Asp Ser Ile Arg Thr Lys Val Tyr Thr Met Met Asp Phe Val
355 360 365
Ile Tyr Arg Tyr Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Lys Val Ala Ala Ala Asn
370 375 380
Lys Ser Leu Pro Asp Asn Glu Lys Ser Leu Ser Glu Lys Asp Ile Phe
385 390 395 400
Val Ile Asn Leu Arg Gly Ser Phe Asn Asp Asp Gln Lys Asp Ala Leu
405 410 415
Tyr Tyr Asp Glu Ala Asn Arg Ile Trp Arg Lys Leu Glu Asn Ile Met
420 425 430
His Asn Ile Lys Glu Phe Arg Gly Asn Lys Thr Arg Glu Tyr Lys Lys
435 440 445
Lys Asp Ala Pro Arg Leu Pro Arg Ile Leu Pro Ala Gly Arg Asp Val
450 455 460
Ser Ala Phe Ser Lys Leu Met Tyr Ala Leu Thr Met Phe Leu Asp Gly
465 470 475 480
Lys Glu Ile Asn Asp Leu Leu Thr Thr Leu Ile Asn Lys Phe Asp Asn
485 490 495
Ile Gln Ser Phe Leu Lys Val Met Pro Leu Ile Gly Val Asn Ala Lys
500 505 510
Phe Val Glu Glu Tyr Ala Phe Phe Lys Asp Ser Ala Lys Ile Ala Asp
515 520 525
Glu Leu Arg Leu Ile Lys Ser Phe Ala Arg Met Gly Glu Pro Ile Ala
530 535 540
Asp Ala Arg Arg Ala Met Tyr Ile Asp Ala Ile Arg Ile Leu Gly Thr
545 550 555 560
Asn Leu Ser Tyr Asp Glu Leu Lys Ala Leu Ala Asp Thr Phe Ser Leu
565 570 575
Asp Glu Asn Gly Asn Lys Leu Lys Lys Gly Lys His Gly Met Arg Asn
580 585 590
Phe Ile Ile Asn Asn Val Ile Ser Asn Lys Arg Phe His Tyr Leu Ile
595 600 605
Arg Tyr Gly Asp Pro Ala His Leu His Glu Ile Ala Lys Asn Glu Ala
610 615 620
Val Val Lys Phe Val Leu Gly Arg Ile Ala Asp Ile Gln Lys Lys Gln
625 630 635 640
Gly Gln Asn Gly Lys Asn Gln Ile Asp Arg Tyr Tyr Glu Thr Cys Ile
645 650 655
Gly Lys Asp Lys Gly Lys Ser Val Ser Glu Lys Val Asp Ala Leu Thr
660 665 670
Lys Ile Ile Thr Gly Met Asn Tyr Asp Gln Phe Asp Lys Lys Arg Ser
675 680 685
Val Ile Glu Asp Thr Gly Arg Glu Asn Ala Glu Arg Glu Lys Phe Lys
690 695 700
Lys Ile Ile Ser Leu Tyr Leu Thr Val Ile Tyr His Ile Leu Lys Asn
705 710 715 720
Ile Val Asn Ile Asn Ala Arg Tyr Val Ile Gly Phe His Cys Val Glu
725 730 735
Arg Asp Ala Gln Leu Tyr Lys Glu Lys Gly Tyr Asp Ile Asn Leu Lys
740 745 750
Lys Leu Glu Glu Lys Gly Phe Ser Ser Val Thr Lys Leu Cys Ala Gly
755 760 765
Ile Asp Glu Thr Ala Pro Asp Lys Arg Lys Asp Val Glu Lys Glu Met
770 775 780
Ala Glu Arg Ala Lys Glu Ser Ile Asp Ser Leu Glu Ser Ala Asn Pro
785 790 795 800
Lys Leu Tyr Ala Asn Tyr Ile Lys Tyr Ser Asp Glu Lys Lys Ala Glu
805 810 815
Glu Phe Thr Arg Gln Ile Asn Arg Glu Lys Ala Lys Thr Ala Leu Asn
820 825 830
Ala Tyr Leu Arg Asn Thr Lys Trp Asn Val Ile Ile Arg Glu Asp Leu
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Leu Arg Ile Asp Asn Lys Thr Cys Thr Leu Phe Arg Asn Lys Ala Val
850 855 860
His Leu Glu Val Ala Arg Tyr Val His Ala Tyr Ile Asn Asp Ile Ala
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Glu Val Asn Ser Tyr Phe Gln Leu Tyr His Tyr Ile Met Gln Arg Ile
885 890 895
Ile Met Asn Glu Arg Tyr Glu Lys Ser Ser Gly Lys Val Ser Glu Tyr
900 905 910
Phe Asp Ala Val Asn Asp Glu Lys Lys Tyr Asn Asp Arg Leu Leu Lys
915 920 925
Leu Leu Cys Val Pro Phe Gly Tyr Cys Ile Pro Arg Phe Lys Asn Leu
930 935 940
Ser Ile Glu Ala Leu Phe Asp Arg Asn Glu Ala Ala Lys Phe Asp Lys
945 950 955 960
Glu Lys Lys Lys Val Ser Gly Asn Ser
965

Claims (3)

1.用于抑制AMPK基因表达的物质在促进CHO细胞表达外源蛋白中的应用；
所述抑制AMPK基因表达的物质为基于CRISPR-Cas13d系统对AMPK基因的mRNA进行编辑的物质，即CRISPR-Cas13d系统；
所述CRISPR-Cas13d系统为如下（b1）或（b2）或（b3）或（b4）或（b5）：
（b1）包括特异sgRNA和Cas13d蛋白；所述特异sgRNA，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至21位核苷酸所示；
（b2）包括特异DNA分子和Cas13d基因；所述特异DNA分子，其转录得到特异sgRNA；所述特异sgRNA，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至21位核苷酸所示；
（b3）包括具有特异DNA分子的质粒和具有Cas13d基因的质粒；所述特异DNA分子，其转录得到特异sgRNA；所述特异sgRNA，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至21位核苷酸所示；
（b4）包括特异重组质粒；所述特异重组质粒，其表达所述sgRNA和Cas13d蛋白；所述特异sgRNA，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至21位核苷酸所示；
（b5）包括特异重组慢病毒；所述特异重组慢病毒为表达所述特异sgRNA和Cas13d蛋白的重组慢病毒；所述特异sgRNA，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至21位核苷酸所示。
2.一种促进CHO细胞表达外源蛋白的方法，包括如下步骤：在CHO细胞中导入抑制AMPK基因表达的物质；
所述抑制AMPK基因表达的物质为基于CRISPR-Cas13d系统对AMPK基因的mRNA进行编辑的物质，即CRISPR-Cas13d系统；
所述CRISPR-Cas13d系统为如下（b1）或（b2）或（b3）或（b4）或（b5）：
（b1）包括特异sgRNA和Cas13d蛋白；所述特异sgRNA，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至21位核苷酸所示；
（b2）包括特异DNA分子和Cas13d基因；所述特异DNA分子，其转录得到特异sgRNA；所述特异sgRNA，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至21位核苷酸所示；
（b3）包括具有特异DNA分子的质粒和具有Cas13d基因的质粒；所述特异DNA分子，其转录得到特异sgRNA；所述特异sgRNA，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至21位核苷酸所示；
（b4）包括特异重组质粒；所述特异重组质粒，其表达所述sgRNA和Cas13d蛋白；所述特异sgRNA，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至21位核苷酸所示；
（b5）包括特异重组慢病毒；所述特异重组慢病毒为表达所述特异sgRNA和Cas13d蛋白的重组慢病毒；所述特异sgRNA，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至21位核苷酸所示。
3.重组CHO细胞在表达外源蛋白中的应用；
所述重组CHO细胞为将特异重组慢病毒导入CHO细胞得到的重组CHO细胞；
所述特异重组慢病毒为表达特异sgRNA和Cas13d蛋白的重组慢病毒；
所述特异sgRNA，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至21位核苷酸所示。
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