CN101899472A - 一种猪内源性反转录病毒载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪内源性反转录病毒载体及其构建方法与应用。本发明构建的载体具有以下优点：1)能高效感染多种细胞，具有广泛的宿主范围；2)能高效地将目的基因整合进所侵染的细胞基因组中，并高水平表达；3)具有高效侵染的特性，能将重组目的基因传递给整个细胞群体，更适合于基因治疗等用途；4)与组织特异性启动子结合，则可能达到目的基因在特定组织或器官中定位表达的目的。

Description

一种猪内源性反转录病毒载体及其构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及反转录病毒载体及其构建方法，特别是涉及猪内源性反转录病毒载体及其构建方法。

背景技术

反转录病毒载体是临床基因治疗试验中较常使用的基因转移载体，与其它非病毒载体和病毒载体相比具有许多独特的优点，包括可高效转导多种类型的细胞、能够整合进宿主细胞染色体中并长期稳定表达其携带的外源基因。目前人们使用的反转录病毒载体中都移除了结构蛋白编码序列gag、pol、env基因的大部分，使病毒丧失复制形成病毒粒子的能力。

载体包装系统中需包括这三种病毒结构蛋白，方法是构建表达这三种蛋白的共转染质粒，或将这三种基因预先整合到包装细胞系中。病毒结构还应包括必须的包装病毒RNA的序列(包装信号ψ⁺)、编码病毒RNA的反转录以及前病毒整合的序列(长末端重复序列LTR，RNA引物结合位点PBS以及聚嘌呤区域PP)。

绝大多数反转录病毒载体都是基于莫罗尼小鼠白血病病毒(Mo-MLV)构建的，含有延伸包装信号(extended ψ⁺)，普遍认为它能提高定位于gag基因开放读码框(ORF)上的RNA分子在核质传输中的效率，并且能增加病毒滴度。延伸包装信号(extended ψ⁺)即包装信号(ψ⁺)延伸至gag基因编码区的5’端，gag基因起始密码子ATG需突变为终止密码子TAG，以防止野病毒(RCR)的产生。

小鼠干细胞病毒(MSCV)载体来源于小鼠胚胎干细胞病毒(MESV)以及LN系列反转录病毒载体(L代表逆转录病毒的LTR，具有启动子功能，N代表了neo基因)。MSCVneo载体转染到包装细胞系后瞬时表达或者整合后稳定表达，载体包含延伸的包装信号ψ⁺，新霉素抗性基因，以及目的基因。该载体通过一段经特殊设计的5’长末端重复序列(LTR)在造血和胚胎细胞中稳定高表达。LTR使目的基因在干细胞或者其他哺乳动物细胞系中高水平持续表达。目的基因被插入到LTR下游调控序列-多克隆位点(MSC)中。鼠磷酸甘油酸脂激酶(PKG)启动子调控其下游序列在真核细胞中用于抗性筛选的新霉素抗性基因(Neo^r)。MSCVneo载体还包含有大肠杆菌质粒骨架，包括大肠杆菌(E.coli ori.)和氨苄青霉素抗性β内酰胺酶基因(Amp^r)。

反转录病毒的整合可以发生在基因组的任何位置，存在着激活原癌基因的潜在危险性。猪内源性反转录病毒(PERV)是在长期的进化过程中整合进猪基因组中的前病毒序列，迄今为止，未有文献报道PERV在猪体内的整合能引发猪体的病变或变异(如原癌基因的激活等)，由此看来，与其它常用的反转录病毒相比，用PERV构建载体可能具有更好的安全性。

目前，已经发现多群PERV，包括γ群的1～5亚群、β群的1～4亚群等。Akiyoshi(Akiyoshi DE，et al.Identification of a full-length cDNA for an endogenousretrovirus of miniature swine.J Virol，1998，72(5)：4503-4507.)等克隆的小型猪PERV-MSL的序列长度为8132bp。与其它反转录病毒相似，PERV的基因组结构包括5’区、gag、pol、env、3’区等5部分。

1997年，PERV在体外对人源细胞具有感染性的发现，引起了人们对猪-人异种移植病原安全性的广泛性关注，也使得PERV的研究成为了一个热点问题。经过了几年的努力，有关PERV的生物学及分子生物学特性已比较清楚，对其遗传背景及特性也比较清晰。PERV感染的人源细胞从其生长特性及折光性上均未发现变化，且感染的细胞也无细胞病变的发生，对其病原性的评估还未有一致的结论。应该指出的是，人与猪有着几千年的亲密接触史，至今未见PERV感染人的报道，Heneine等(Heneine W，et al.No evidence of infection with porcine endogenous retrovirus inrecipients of porcine islet-cell xenografts.Lancet.1998，352(9129)：695-9.)曾对接受过猪胰岛移植的160例糖尿病病人进行了多年的跟踪检测，未发现有PERV感染的证据，这暗示着PERV对人致病的可能性很小。

由于PERV是以前病毒的形式存在于猪细胞基因组中的，根据基因同源重组的原理，在PERV清晰的分子生物学背景的基础上，用其构建新型的反转录病毒载体，对于转基因猪及PERV生物学特性的研究具有重要的意义。

目前，国际上对PERV的研究均着眼于异种移植中其病原安全性的评价等方面，至今尚未见有利用其作为反转录病毒载体的报道。

发明内容

本发明提供了在猪源细胞中特异表达或可在其它哺乳动物细胞表达的质粒型反转录病毒载体PM-1。

本发明所提供的猪内源性反转录病毒载体PM-1由下列DNA元件组成：

1)PERV的5’LTR启动子；

2)MSCVneo的延伸包装信号(extended ψ⁺)；

3)小鼠磷酸甘油酸脂激酶(PGK)启动子及位于PGK启动子下游并受其调控的新霉素抗性基因(neor)；

4)PERV的聚嘌呤区域PP及其3’LTR启动子；

5)大肠杆菌质粒骨架，包括大肠杆菌(E.coli ori.)和氨苄青霉素抗性β内酰胺酶基因(Ampr)。

具体来讲，所述反转录病毒载体PM-1的核苷酸序列如序列表中序列11所示。

本发明还提供了上述猪内源性反转录病毒载体PM-1的构建方法。

本发明所提供的构建方法，包括以下步骤：

1)按照猪PERV全基因序列与MSCVneo序列设计5对引物，扩增P-5’LTR片段的引物对具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列，扩增ψ片段的引物对具有序列表中序列3和序列4的核苷酸序列，扩增P-3’LTR片段的引物对具有序列表中序列5和序列6的核苷酸序列，扩增neo片段的引物对具有序列表中序列7和序列128的核苷酸序列，扩增O-Amp片段的引物对具有序列表中序列9和序列10的核苷酸序列，然后PCR扩增得到P-5’LTR、ψ、P-3’LTR、neo和O-Amp片段；

2)通过重叠PCR技术及酶切连接的方法构建出猪内源性反转录病毒载体PM-1。

在上述载体的构建方法中，所述步骤1)的PCR反应体系包括：0.5μl cDNA(100ng/μl)，引物R和F各1μl(20μM)，4μl dNTP(2.5mM)，0.5μl Super-Ltaq DNA聚合酶，5μl 10×PCR Buffer，38μl灭菌水。PCR反应条件为：先94℃变性3min；然后94℃ 30s，56℃ 45s，72℃ 1min30s，30个循环；最后72℃ 7min。

步骤2)的重叠PCR的反应体系包括：0.5μl cDNA 1(100ng/μl)+0.5μl cDNA2(100ng/μl)，引物R和F各1μl(20μM)，4μl dNTP(2.5mM)，0.5μ1 Super-Ltaq DNA聚合酶，5μl 10×PCR Buffer，37.5μl灭菌水。反应条件为：先94℃变性3min；然后94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min30s，30个循环；最后72℃ 7min。

含有猪内源性反转录病毒载体PM-1的表达载体、转基因细胞系和宿主菌也属于本发明的保护范围。

上述在猪源细胞中特异表达或可在其它哺乳动物细胞表达的质粒型反转录病毒载体PM-1可在多克隆位点处插入外源基因。

本发明提供了在猪源细胞中特异表达或可在其它哺乳动物细胞表达的质粒型反转录病毒载体PM-1及其构建方法。本发明构建的载体具有以下优点：

1)能高效感染多种细胞，具有广泛的宿主范围；

2)能高效地将目的基因整合进所侵染的细胞基因组中，并高水平表达；

3)具有高效侵染的特性，能将重组目的基因传递给整个细胞群体，更适合于基因治疗等用途；

4)与组织特异性启动子结合，则可能达到目的基因在特定组织或器官中定位表达的目的。

由于我国有着异常非富的小型猪种资源，其遗传背景清晰。本发明以我国特有五指山猪来源的PERV为基础，进行反转录病毒载体的研究。以此为基础所进行的新型反转录病毒载体包装细胞系的探索工作也是对病毒载体基因转移系统的完善和发展，特别是能为转基因猪的建立和开发以及基因转移技术提供一条新的途径。本发明为转基因猪的研究提供一种新的思路，可利用此载体进行封闭PERV转录的研究，培育无PERV表达的猪品系。

此外，通过建立猪内源性反转录病毒新型载体以及筛选高滴度重组病毒的包装细胞株，以达到高效表达外源基因，可以用于转基因猪的建立和开发；也可用于无内源性反转录病毒表达的猪品系的培育，消除人们对异种移植病毒安全性的疑虑，为我国特有小型猪种的开发奠定基础；还有可能成为基因治疗的一种工具。

本发明通过与猪源细胞DNA的同源重组，从而达到目的基因的高效定点整合和表达，为转基因猪源细胞/转基因猪的研究和应用及重组基因疫苗的研究奠定基础，还有可能成为基因治疗的一种工具。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为PERV全长序列结构图

图2为MSCVneo载体的图谱

图3A-图3C为重组PERV载体PM-1的构建流程图

图4为从PERV和MSCVneo模板中PCR扩增的目的片段的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图5为重叠PCR方法扩增的P-5’LTR+ψ、P-5’UTR+P-gag、neo+P-3’LTR的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图6为酶切回收目的片段的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图7为PM-1的酶切鉴定结果

图8为PCR扩增的GFP基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图9为PM-1-GFP-21的酶切鉴定结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、猪内源性反转录病毒载体PM-1的构建

用本发明的方法构建猪内源性反转录病毒载体PM-1(如图3A-图3C所示)，具体方法如下：

按照五指山小型猪PERV(WZS-PERV)全基因序列(GenBank号：EF133960，结构如图1所示)与MSCVneo序列(序列见www.clontech.com，Protocol # PT3301-5，图谱见图2)设计了5对引物。P-5’LTR和P-3’LTR片段通过PCR方法从WZS-PERV的基因组DNA中扩增得到，ψ、neo和O-Amp片段通过PCR方法从MSCVneo载体中扩增得到。引物序列如下：

P1：5’LTR-F CGGTGAAAGGATGAAAATGCAACCT(序列表中序列1)

P2：5’LTR-R ATCTCGGTGGAACCTCCATGAAAGGCCAGTCGA(序列表中序列2)

P3：ψ-F CTCGACTGGCCTTTCATGGAGGTTCCACCGAGA(序列表中序列3)

P4：ψ-R CCG

GTTAACGAATTCCGGCGCC(序列表中序列4)

P5：3’LTR-F ACCTGTAGGTTTGGCAAGAACTATTAACAAGAG(序列表中序列5)

P6：3’LTR-R CTAG

CTGAAAGGCCAGTCGAGTTA(序列表中序列6)

P7：Pneo-F CCG

AGATCTAATTCTACCGGGT(序列表中序列7)

P8：Pneo-R TCTCTTGTTAATAGTTCTTGCCAAACCTACAGG(序列表中序列8)

P9：OAmp-F CTAGTGGGTAACAGTTTCTTGAAGTTGGA(序列表中序列9)

P10：OAmp-R CGG

TTCCCCCCTTTTTCTGGAGACT(序列表中序列10)

50μl反应体系包括：0.5μl cDNA(100ng/μl)，引物R(上游引物)和F(下游引物)各1μl(20μM)，4μl dNTP(2.5mM)，0.5μl Super-L taq DNA聚合酶(NEB公司)，5μl 10×PCR Buffer，38μl灭菌水。反应条件为：94℃变性3min；94℃ 30s，56℃ 45s，72℃ 1min30s，30个循环；72℃ 7min。将PCR扩增的P-5’LTR、P-3’LTR、ψ、neo和O-Amp片段进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示(a.P-5’LTR 702bp，b.P-3’LTR 730bp，c.f.DL2000 Marker，g.ψ 890bp，h.neo1453bp，i.DL15000 Marker，j.O-Amp 3125bp，k.Marker III)，与预期结果相符。反应产物经

SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega公司，美国)回收纯化，得到目的DNA片段。

P-5’LTR+ψ、neo+P-3’LTR片段分别由P-5’LTR与ψ，neo与P-3’LTR片段通过重叠PCR(SOE)方法得到。50μl反应体系包括：0.5μl cDNA 1(100ng/μl)+0.5μl cDNA 2(100ng/μl)，引物R和F各1μl(20μM)，4μl dNTP(2.5mM)，0.5μl Super-L taq DNA聚合酶(NEB公司)，5μl 10×PCR Buffer，37.5μl灭菌水。反应条件为：94℃变性 3min；94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min30s，30个循环；72℃ 7min。将重叠PCR扩增的P-5’LTR+ψ、neo+P-3’LTR片段进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示(a.P-5’LTR+ψ 1592bp，c.重叠PCR扩增neo+P-3’LTR 2183bp，d.DL2000 Marker)，与预期结果相符。反应产物经

SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega公司，美国)回收纯化，得到目的DNA片段。

然后用限制性内切酶Kpn I和XhoI消化PCR回收产物P-5’LTR+ψ，用Xho I和Xba I消化PCR回收产物neo+P-3’LTR，用Xba I与Kpn I消化PCR回收产物Oamp，37℃消化4h后将酶切片段进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6所示(a.Kpn I和Xho I双酶切P-5’LTR+ψ回收产物1592bp，c.DL2000 marker，d.Xho I和XbaI双酶切neo+P-3’LTR回收产物2183bp，e.Marker III，f.Xba I与Kpn I双酶切OAmp回收产物3125bp)，与预期结果相符。反应产物经

SV Gel and PCRClean-Up System回收纯化。

将上述酶切回收产物P-5’LTR+ψ，neo+P-3’LTR和Oamp三个片段用T4 DNA连接酶(NEB公司)4℃连接16h，转化入E.coli DH5α感受态细胞，筛选获得克隆质粒，命名为PM-1。提取质粒，用限制性内切酶消化鉴定，鉴定结果如图7所示(a.DL15000Marker，b.Xho I酶切鉴定PM-1 6900bp，c.Kpn I和Xba I酶切鉴定PM-13775bp和3125bp，d.10kb DNA ladder)，与预期结果相符，再送华大中生科技发展有限公司测序(3730自动测序仪)，测序结果表明PM-1具有序列表中序列11的核苷酸序列，全长6900bp，序列正确，上述结果表明获得了序列正确的猪内源性反转录病毒载体PM-1。

实施例2、表达质粒PM-1-GFP-21的构建

根据GFP基因编码区的序列分别引入Xho I和Bgl II酶切位点合成引物，引物序列及多聚酶链式反应(PCR)的条件如下：

P15：GFPXho I CCGCCATGGTGAGCAAGGGCGA

P16：GFPBgl II GGA

TTACTTGTACAGCTCGTCCAT

50μl反应体系包括：0.5μl cDNA(100ng/μl)，引物R和F各1μl(20μM)，4μl dNTP(2.5mM)，0.5μl Super-L taq DNA聚合酶(NEB公司)，5μl 10×PCRBuffer，38μl灭菌水。反应条件为：94℃变性3min；94℃ 30s，54℃ 45s，72℃1min30s，，30个循环；72℃ 7min。将PCR扩增的GFP基因片段进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图8所示(a.DL2000 Marker，b.GFP基因740bp)，与预期结果相符。反应产物经

SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega公司，美国)回收纯化，得到目的DNA片段。

用限制性内切酶Xho I和Bgl II消化PCR回收纯化产物GFP以及PM-1和PM-2载体，经

SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega公司，美国)回收纯化，得到目的DNA片段。将酶切消化的GFP片段分别插入酶切消化的PM-1载体，筛选得到目的表达载体PM-1-GFP-21。提取质粒用限制性内切酶消化鉴定，PM-1-GFP-21的酶切鉴定结果如图9所示(a.Marker III，b.Nco I酶切PM-1-GFP-21 1840bp和5800bp，c.Xho I与Bgl II酶切PM-1-GFP-21 6900bp和740bp，d.Xho I酶切PM-1-GFP-21 7640bp，e.DL1000 Marker)，均与预期结果相符。送华大中生科技发展有限公司(3730自动测序仪)测序，测序结果表明获得了序列及插入位置正确的GFP基因目的表达载体PM-1-GFP-21。

序列表

<160>11

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

cggggtacct gaaaggatga aaatgcaacc t                31

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

atctcggtgg aacctccatg aaaggccagt cga              33

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ctcgactggc ctttcatgga ggttccaccg aga                33

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

ccgctcgagg ttaacgaatt ccggcgcc

28

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

acctgtaggt ttggcaagaa ctattaacaa gag               33

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

ctagtctaga ctgaaaggcc agtcgagtta                30

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

ccgctcgaga gatctaattc taccgggt

28

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

tctcttgtta atagttcttg ccaaacctac agg            33

<210>9

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

ctagtctaga tgggtaacag tttcttgaag ttgga            35

<210>10

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

cggggtacct tccccccttt ttctggagac t                31

<210>11

<211>6900

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

tgaaaggatg aaaatgcaac ctaactctcc cagaacccag gaagttaata agaagctcta     60

aatgccctcg aaatccagac cctgttccct ataggtaaaa gatcatactt tttgctgttt    120

tagggcttgc tttctgctct gtacaaaact ttgtggaagg ggaaaaacag gcccctgagt    180

atgtgcctct atgcttgaaa cttcttgaaa ctgctcctaa ctgcttgttt ggcttctgta    240

aacctgcttg cataagataa aaagaggaga agtcaattgc ctaacggacc ccagtaagat     300

cgggcgtgcc acaaaatgtt gaaaatcctg ataaatatat cttggtgaca atatgtctcc     360

cccacccaga gacaggcaca aacatgtaac tccagaacaa cttaaaatta attggtccac     420

aaagcgcggg ctctcgaagt tttgaattga ctggtttgcg atattttaaa aatgattagt     480

ttgtaaaagc gcgggctttg ttgtgaaccc cataaaagct gtcccgactc cacactcggg     540

gccgcagtcc tctacccctg cgtggcgtac gactgtgggc cccagcgcgc tcggaataaa     600

aatcctcttg ctgtttgcat caagaccgct tctcgtgagt gatttggggt gtcgcctctt     660

ccgagtcagg acgagaggga ttttaactcg actggccttt catggaggtt ccaccgagat     720

ttggagaccc ctgcccaggg accaccgacc cccccgccgg gaggtaagct ggccagcggt     780

cgtttcgtgt ctgtctctgt ctttgtgcgt gtttgtgccg gcatctaatg tttgcgcctg     840

cgtctgtact agttagctaa ctagctctgt atctggcgga cccgtggtgg aactgacgag     900

ttctgaacac ccggccgcaa ccctgggaga cgtcccaggg actttggggg ccgtttttgt     960

ggcccgacct gaggaaggga gtcgatgtgg aatccgaccc cgtcaggata tgtggttctg    1020

gtaggagacg agaacctaaa acagttcccg cctccgtctg aatttttgct ttcggtttgg    1080

aaccgaagcc gcgcgtcttg tctgctgcag cgctgcagca tcgttctgtg ttgtctctgt    1140

ctgactgtgt ttctgtattt gtctgaaaat tagggccaga ctgttaccac tcccttaagt    1200

ttgaccttag gtcactggaa agatgtcgag cggatcgctc acaaccagtc ggtagatgtc    1260

aagaagagac gttgggttac cttctgctct gcagaatggc caacctttaa cgtcggatgg    1320

ccgcgagacg gcacctttaa ccgagacctc atcacccagg ttaagatcaa ggtcttttca    1380

cctggcccgc atggacaccc agaccaggtc ccctacatcg tgacctggga agccttggct    1440

tttgaccccc ctccctgggt caagcccttt gtacacccta agcctccgcc tcctcttcct    1500

ccatccgccc cgtctctccc ccttgaacct cctcgttcga ccccgcctcg atcctccctt    1560

tatccagccc tcactccttc tctaggcgcc ggaattcgtt aacctcgaga gatctaattc    1620

taccgggtag gggaggcgct tttcccaagg cagtctggag catgcgcttt agcagccccg    1680

ctgggcactt ggcgctacac aagtggcctc tggcctcgca cacattccac atccaccggt    1740

aggcgccaac cggctccgtt ctttggtggc cccttcgcgc caccttctac tcctccccta    1800

gtcaggaagt tcccccccgc cccgcagctc gcgtcgtgca ggacgtgaca aatggaagta    1860

gcacgtctca ctagtctcgt gcagatggac agcaccgctg agcaatggaa gcgggtaggc    1920

ctttggggca gcggccaata gcagctttgc tccttcgctt tctgggctca gaggctggga    1980

aggggtgggt ccgggggcgg gctcaggggc gggctcaggg gcggggcggg cgcccgaagg    2040

tcctccggag gcccggcatt ctgcacgctt caaaagcgca cgtctgccgc gctgttctcc    2100

tcttcctcat ctccgggcct ttcgacctgc agccaatatg ggatcggcca ttgaacaaga    2160

tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc    2220

acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc    2280

ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc    2340

gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac    2400

tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc    2460

tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac    2520

gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg    2580

tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct    2640

cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt    2700

cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg    2760

attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac    2820

ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg    2880

tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg    2940

aggggatccg tcgacctgca gccaagctta tcgataaaat aaaagatttt atttagtctc    3000

cagaaaaagg ggggaatgaa agaccccacc tgtaggtttg gcaagaacta ttaacaagag    3060

aagaagtggg gaatgaaagg atgaaaatgc aacctgactc tcccagaacc caggaagtta    3120

ataagaagct ctaaatgccc tcgaattcca gaccctgttc cctataggta aaagatcata    3180

ctttttgctg ttttagggct tgctttctgc tctgtacaaa actttgtgga aggggaaaaa    3240

caggcccctg agtatgtgcc tctatgcttg aaacttcttg aaactgctcc taactgcttg    3300

tttggcttct gtaaacctgc ttgcataaga taaaaagagg agaagtcaat tgcctaacgg    3360

accccagtaa gatcgggcgt gccacaaaat gttgaaaatc ctgataaata tatcttggtg    3420

acaatatgtc tcccccaccc agagacaggc acaaacatgt aactccagaa caacttaaat    3480

taattggtcc acaaagcgcg ggctctcgaa gttttgaatt gactggtttg cgatatttta    3540

aaaatgatta gtttgtaaaa gcgcgggctt tgttgtgaac cccataaaag ctgtcccgac    3600

tccacactcg gggccgcagt cctctacccc tgcgtggcgt acgactgtgg gccccagcgc    3660

gctcggaata aaaatcctct tgctgtttgc atcaagaccg cttctcgtga gtgatttggg    3720

gtgtcgcctc ttccgagtca ggacgagagg gattttaact cgactggcct ttcagtgggt    3780

aacagtttct tgaagttgga gaacaacatt ctgagggtag gagtcgaata ttaagtaatc    3840

ctgactcaat tagccactgt tttgaatcca catactccaa tactcctgaa atagttcatt    3900

atggacagcg cagaagagct ggggagaatt aattcgtaat catggtcata gctgtttcct    3960

gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt    4020

aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc    4080

gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg    4140

agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg    4200

gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca    4260

gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac    4320

cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac    4380

aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg    4440

tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac    4500

ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat    4560

ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag    4620

cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac    4680

ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt    4740

gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt    4800

atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc    4860

aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga    4920

aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac    4980

gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc    5040

cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct    5100

gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca    5160

tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct    5220

ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca    5280

ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc    5340

atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg    5400

cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct    5460

tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa    5520

aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta    5580

tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc    5640

ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg    5700

agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa    5760

gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg    5820

agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc    5880

accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg    5940

gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat    6000

cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata    6060

ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc    6120

atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt    6180

gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa    6240

gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg    6300

ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt    6360

gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc gccattcagg    6420

ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg    6480

aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga    6540

cgttgtaaaa cgacggcgca aggaatggtg catgcaagga gatggcgccc aacagtcccc    6600

cggccacggg gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc gctcatgagc ccgaagtggc    6660

gagcccgatc ttccccatcg gtgatgtcgg cgatataggc gccagcaacc gcacctgtgg    6720

cgccggtgat gccggccacg atgcgtccgg cgtagaggcg attagtccaa tttgttaaag    6780

acaggatatc agtggtccag gctctagttt tgactcaaca atatcaccag ctgaagccta    6840

tagagtacga gccatagata aaataaaaga ttttatttag tctccagaaa aaggggggaa    6900

Claims (7)

1.猪内源性反转录病毒载体PM-1，由下列DNA元件组成：

1)PERV的5’LTR启动子；

2)MSCVneo的延伸包装信号；

3)小鼠磷酸甘油酸脂激酶启动子及位于PGK启动子下游并受其调控的新霉素抗性基因；

4)PERV的聚嘌呤区域PP及其3’LTR启动子；

5)大肠杆菌质粒骨架，包括大肠杆菌和氨苄青霉素抗性β内酰胺酶基因。

2.根据权利要求1所述的猪内源性反转录病毒载体PM-1，其特征在于：所述反转录病毒载体PM-1的核苷酸序列如序列表中序列11所示。

3.权利要求1所述猪内源性反转录病毒载体PM-1的构建方法，包括以下步骤：

1)按照猪PERV全基因序列与MSCVneo序列设计5对引物，扩增P-5’LTR片段的引物对具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列，扩增ψ片段的引物对具有序列表中序列3和序列4的核苷酸序列，扩增P-3’LTR片段的引物对具有序列表中序列5和序列6的核苷酸序列，扩增neo片段的引物对具有序列表中序列7和序列8的核苷酸序列，扩增O-Amp片段的引物对具有序列表中序列9和序列10的核苷酸序列，然后PCR扩增得到P-5’LTR、ψ、P-3’LTR、neo和O-Amp片段；

2)通过重叠PCR技术及酶切连接的方法构建出猪内源性反转录病毒载体PM-1。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1)的PCR反应体系包括：0.5μl cDNA(100ng/μl)，引物R和F各1μl(20μM)，4μl dNTP(2.5mM)，0.5μl Super-L taq DNA聚合酶，5μl 10×PCR Buffer，38μl灭菌水；PCR反应条件为：先94℃变性3min；然后94℃ 30s，56℃ 45s，72℃ 1min30s，30个循环；最后72℃ 7min。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2)的重叠PCR的反应体系包括：0.5μl cDNA 1(100ng/μl)+0.5μl cDNA 2(100ng/μl)，引物R和F各1μl(20μM)，4μl dNTP(2.5mM)，0.5μl Super-L taq DNA聚合酶，5μl 10×PCR Buffer，37.5μl灭菌水；反应条件为：先94℃变性3min；然后94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min 30s，30个循环；最后72℃ 7min。

6.含有权利要求1或2所述猪内源性反转录病毒载体PM-1的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。

7.一种表达外源基因的方法，是在权利要求1或2所述在猪源细胞中特异表达或可在其它哺乳动物细胞表达的质粒型反转录病毒载体PM-1的多克隆位点处插入其它外源基因，当转染细胞后可被包装成复制缺陷型的猪内源性反转录病毒粒子，直接感染体外培养的细胞系，在细胞系中表达外源基因。

Images