CN105154471A - 低表达或不表达perv的肝细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其包括以下步骤：(1)分别制备含有应用于RNA干扰技术的siRNA的重组载体、应用于CRIPRS/Cas9技术的gRNA的重组载体和含有应用于所述CRIPRS/Cas9技术的Cas9的载体；(2)将所述三种载体共同转染至猪体细胞，培养所述经转染的猪体细胞，筛选并鉴定以获得单克隆转基因猪体细胞；(3)利用体细胞核移植技术获得含有所述转基因猪体细胞的核基因的转基因猪；(4)提取所述转基因猪的肝细胞。本发明低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法对PERV基因实现了转录前敲除和转录后抑制，技术方案有效可行。

Description

低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及一种转基因技术，尤其涉及一种低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法。

背景技术

当今，重型肝炎、肝衰竭以及肝癌是我国肝病死亡的主要原因，肝移植是治疗此类疾病最有效的方法。但是，人类同种器官移植供体却早已日益短缺，大多患者在等待器官供体的过程中丧失生命。寻找肝衰竭患者在肝移植前替代手段成为重中之重。生物人工肝(BAL)是目前国内外公认的最接近自然肝脏，功能也最全面的人工肝脏支持系统。生物人工肝由反应器和细胞材料组成，肝细胞是整个生物人工肝系统的核心材料。在生物人工肝领域中，因猪解剖、生理特点与人类相似，猪细胞来源广泛，经济适用，因此目前应用最多的生物部分是猪肝脏细胞。但目前已知，作为异种细胞猪肝细胞内存在着猪内源性逆转录病毒(porcineendogenousretrovirus,PERV)，有引起生物人工肝治疗患者PERV感染的危险。体外培养实验、假型实验和感染性实验已经证实PERV可以感染人源细胞。

PERV是一种RNA病毒，其前DNA整合到猪的基因组中。它在猪的基因组中多拷贝而且与mRNA的表达量在不同猪种有很大的差异。现有的PERV减活或消除手段都未能很好地降低PERV的感染风险。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的不足提供一种低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法。

为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：

一种低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其包括以下步骤：

(1)分别制备含有应用于RNA干扰技术的siRNA的重组载体、应用于CRIPRS/Cas9技术的gRNA的重组载体和含有应用于所述CRIPRS/Cas9技术的Cas9的载体；

(2)将所述三种载体共同转染至猪体细胞，培养所述经转染的猪体细胞，筛选并鉴定以获得单克隆转基因猪体细胞；

(3)利用体细胞核移植技术获得含有所述转基因猪体细胞的核基因的转基因猪；

(4)提取所述转基因猪的肝细胞。

优选地，所述含有siRNA的重组载体、含有gRNA的重组载体和含有Cas9的载体以1：1：1的比例混合以进行共同转染。

进一步地，所述siRNA根据PERV基因的编码区pol和gag片段进行设计。

优选地，用于将所述siRNA转染到目标细胞的载体为Psilencer3.1-H1-Neo。

更进一步地，所述gRNA的序列为SEQNo.1所示。所述gRNA的PCR引物的序列为SEQNo.2和SEQNo.3所示。

再进一步地，用于将所述gRNA转染到目标细胞的载体为U6-gRNA。

优选地，所述含有Cas9的载体为pCMV-hCAS9。

优选地，所述猪体细胞为猪胚胎成纤维细胞。

与现有技术相比较，本发明具有如下优势：

(1)本发明的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，通过RNA干扰技术和CRIPRS/Cas9技术相结合，既抑制了PERV的转录后表达，又实现了对PERV的转录前敲除，有效降低了转基因猪体细胞的PERV的活性；

(2)本发明的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，对PERV的保守编码区进行重组载体的设计，几乎实现完全沉默，由此可以应用于不同品种的猪种，增加了可提供异源肝细胞的猪的品种；

(3)本发明的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，将三种质粒载体共同转染到目标细胞，节约了转基因猪体细胞的制备时间，提高了转基因猪体细胞的制备效率；

(4)本发明的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法所获得的转基因猪因其自身的PERV具有低表达或不表达的特性，该转基因猪的其他细胞、组织或器官都可以用于作为人的异源供体。

附图说明

图1为本发明低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法中含有siRNA的重组载体结构示意图。

图2为图1所示的载体的酶切鉴定结果示意图。

图3为本发明低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法中用于连接gRNA的载体的结构示意图。

图4为本发明低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法中所使用的Cas9载体的结构示意图。

图5为本发明低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法中单克隆转基因猪体细胞的PERV基因序列检测结果，其中样品号为P2-2。

图6为本发明低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法中单克隆转基因猪体细胞的PERV基因序列检测结果，其中样品号为P2-3。

图7为本发明低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法中单克隆转基因猪体细胞的PERV基因序列检测结果，其中样品号为P2-6。

图8为本发明低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法中单克隆转基因猪体细胞的PERV基因序列检测结果，其中样品号为P2-9。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。

本发明的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法包括以下步骤：

一、重组载体的设计与制备

(1)制备应用于RNA干扰的重组载体

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。

病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约21～23bp)，即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

所谓RNAi技术，就是人们在真核细胞中引入针对特定基因的siRNA，便可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，实现所述特定基因的转录后水平的基因沉默。

针对本发明所涉及的PERV基因，查文献获得针对PERV编码区pol和gag片段，设计并筛选出四个干扰PERV表达相对高效的siRNA，使用RNAi软件，针对筛选到的siRNA合成shRNA并加入折叠序列的编码DNA序列，四个片段分别为：gag1、gag4、pol2、pol3；每个片段分别对应连接一个启动子，连接后的长片段为gag1-H1-gag4-h7sk-pol2-mU6-pol3，其中H1、h7sk和mU6分别为启动子。所述长片段两端再连入HindIII和BamhI酶切位点，连入Psilencer3.1-H1-Neo载体，最后得到如图1所示的Psilencer3.1-H1-Neo-shRNA重组载体。

进一步地，所述Psilencer3.1-H1-Neo-shRNA重组载体的酶切鉴定体系如下：

若鉴定结果出现如图2所示的条带，证明所述Psilencer3.1-H1-Neo-shRNA重组载体构建成功。

(2)分别制备应用于CRIPRS/Cas9的gRNA重组载体和Cas9载体

CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白(Cas9蛋白)即可，故Ⅱ类系统为CRIPRS/Cas9系统。所述CRIPRS/Cas9系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA，或可以表示为gRNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割，由此形成CRIPRS/Cas9技术。

作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifyingfactor)，能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合，并表达适当的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。

A)gRNA的设计及对应的重组载体的制备

针对本发明所涉及的PERV基因，根据PERV相对保守的编码序列，根据gRNA设计原则设计序列为SEQNo.1所示的gRNA。

进一步地，设计所述gRNA的PCR引物(Oligo)，所述引物的序列为SEQNo.2和SEQNo.3所示。人工合成的Oligo需要进行退火以形成粘性末端，所述Oligo的退火体系如下：

退火条件为：98℃加热10min，自然冷却至室温。

更进一步地，优选U6-gRNA(如图3所示)作为连接所述gRNA的载体。所述U6-gRNA在连接所述gRNA之前需要进行载体的线性化，线性化的反应体系及反应条件如下：

37℃反应2h，切胶回收线性化片段。

下一步，将所述gRNA与所述线性化的U6-gRNA进行连接，连接反应体系如下：

连接反应完毕，得到包含所述gRNA的重组载体，将所述重组载体转化到合适的大肠杆菌菌种中，经过质粒鉴定获得重组子后，对所述重组子进行扩大培养以获得更多的所述重组载体。

B)Cas9基因的载体的制备

针对本发明所涉及的PERV基因，可以选取含有人Cas9的载体pCMV-hCAS9(如图4所示)，将所述pCMV-hCAS9转染到合适的大肠杆菌中，并且对大肠杆菌进行扩增以获得更多的pCMV-hCAS9。

二、获得单克隆转基因猪体细胞

将所述Psilencer3.1-H1-Neo-shRNA重组载体、包含gRNA的重组载体和Cas9载体以1：1：1的比例混合共同转染至猪体细胞，培养所述经转染的猪体细胞，筛选并鉴定以获得单克隆转基因猪体细胞。

具体地，所述猪体细胞优选猪胚胎成纤维细胞，所述猪胚胎成纤维细胞需要预先培养继代至有足够数量。

所述三种载体采用电穿孔法对所述猪胚胎成纤维细胞进行转染，将约3×10⁶个经过消化的猪胚胎成纤维细胞与10μg所述Psilencer-H1-neo-shRNA载体、10μg所述包含gRNA的重组载体和10μg所述Cas9载体进行混合，然后置于电转仪中进行电穿孔转染。

经过转染后的猪胚胎成纤维细胞转移至10cm培养皿培养，每皿放置数量适宜的细胞。待细胞大部分都贴壁后，加G418筛选。每3天换药一次，待细胞大量死亡，可根据情况降低G418的浓度。15天左右待细胞单克隆长至0.5cm左右，可对该细胞单克隆进行转基因鉴定：分别挑取不同的细胞单克隆于24孔板中进行裂解，以所述各裂解液分别作为模板进行PCR，各PCR产物分别与T载体连接后进行转化，转化后进行细菌单克隆培养，随机挑选5个细菌单克隆作为样品进行核苷酸序列测定。

测序结果显示，所述5个样品中有4个样品的PERV基因发生移码突变，实现了PERV基因的敲除。其中样品P2-2、P2-3、P2-6和P2-9的测序结果参考图5～8。

三、获得转基因猪

根据上述测序结果，从所述4个发生移码突变样品中再挑选有Psilencer-H1-neo-shRNA载体的表达产物的样品，将所述被选出的样品所对应的单克隆转基因猪体细胞作为细胞核供体细胞，把所述细胞核移入去核的猪卵母细胞中，使其发生再分化并发育为新的猪胚胎，将该猪胚胎注入发情母猪的子宫中，使所述猪胚胎最终发育为独立的个体，该个体即为含有所述转基因猪体细胞的核基因的转基因猪。

四、获得低表达或不表达PERV的肝细胞

鉴定阳性的转移基因猪，待转基因猪长至适宜年龄，取出肝脏，灌注法提取肝细胞，由此获得低表达甚至不表达PERV的猪来源的肝细胞。

综上所述，本发明低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法对PERV基因实现了转录前敲除和转录后抑制，技术方案有效可行。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：

(1)分别制备含有应用于RNA干扰技术的siRNA的重组载体、应用于CRIPRS/Cas9技术的gRNA的重组载体和含有应用于所述CRIPRS/Cas9技术的Cas9的载体；

(2)将所述三种载体共同转染至猪体细胞，培养所述经转染的猪体细胞，筛选并鉴定以获得单克隆转基因猪体细胞；

(3)利用体细胞核移植技术获得含有所述转基因猪体细胞的核基因的转基因猪；

(4)提取所述转基因猪的肝细胞。

2.如权利要求1所述的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于：所述含有siRNA的重组载体、含有gRNA的重组载体和含有Cas9的载体以1：1：1的比例混合以进行共同转染。

3.如权利要求1所述的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于：所述siRNA根据PERV基因的编码区pol和gag片段进行设计。

4.如权利要求3所述的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于：用于将所述siRNA转染到目标细胞的载体为Psilencer3.1-H1-Neo。

5.如权利要求1所述的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于：所述gRNA的序列为SEQNo.1所示。

6.如权利要求5所述的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于：所述gRNA的PCR引物的序列为SEQNo.2和SEQNo.3所示。

7.如权利要求5所述的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于：用于将所述gRNA转染到目标细胞的载体为U6-gRNA。

8.如权利要求1所述的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于：所述含有Cas9的载体为pCMV-hCAS9。

9.如权利要求1所述的低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，其特征在于：所述猪体细胞为猪胚胎成纤维细胞。