CN108285906B - 一种定点整合外源dna转基因猪的构建方法 - Google Patents

一种定点整合外源dna转基因猪的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法，包括以下步骤：S1、安全靶点筛选及靶点绑定gRNA切割效率验证；S2、构建同源臂供体质粒，并获得定点整合转基因细胞系；S3、外源DNA定点整合转基因猪的构建。本发明在供体质粒中引入gRNA靶点序列，利用细胞内转录gRNA诱导Cas9核酸酶切割靶基因同时，线性化供体质粒，大大简化试验步骤，节约人力，且有利于提高共转染效率。本发明定点整合所用载体较少，同源臂大小适中，更有利于获得转基因细胞系，将高效定点整合技术，高活力定点转基因细胞培育技术与体细胞克隆技术结合，有利于定点整合转基因动物高效制备，加快转基因动物新品种培育速度。

Description

一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，主要涉及一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法，应用于制备定点整合外源DNA片段的转基因动物，适用于长片段多基因定点整合转基因动物新品种培育。
背景技术
转基因大动物的获得依赖于体细胞克隆技术(SCNT)，成功构建相关转基因细胞系是转基因大动物获得的关键步骤。传统转基因技术，如显微注射，转座子，病毒载体包被侵染等把目的基因插入基因组内的整合方式是随机的，这些随机整合对后期转基因动物品系组建和育种带来诸多不利，因此急需开发高效的定点整合转基因技术，构建定点整合外源DNA的转基因细胞系，用于家畜新品种培育。
动物基因组定点整合转基因技术是指动物基因组靶位点产生DNA双链断裂(double-strand break,DSB)后，通过同源重组修复(homologous-directed repair,HDR)机制，微同源重组机制(MMEJ)及单链寡核苷酸(SSODN)介导的重组修复机制，将外源基因及其调控区整合特定靶位点，获得定点整合外源基因的转基因动物。
定点整合技术的效率主要取决于两个方面，一是靶位点产生双链断裂(DSB)的效率。二是断裂后的靶位点与携带同源臂及外源基因的供体质粒(donor plasmid)发生重组的效率。传统同源重组技术依赖自然DSB产生，利用供体同源重组模板和自然产生的DSB，重组效率仅10-5e～10-7e，为科研和生产带来了极大的困难。有研究报道为矫正小鼠β-globin基因突变，需要提供8kb～24kb以上的同源序列，才能发生低频重组(0.48％～2.05％)。同源序列过长会增加供体质粒构建难度同时导致较低的转染效率，传统的同源重组技术成功率极低。
随着基因编辑技术突飞猛进，如ZFN、Talen和CRISPR/Cas9等，在基因组特定位点高效获得DSB已不再是同源重组的限制性条件。如在斑马鱼中研究显示，利用Talen技术，借助238bp～1168bp的左臂和673bp～3716bp的右臂，可轻松实现小片段2A-GFP基因(约700bp)定点插入Sox2基因下游，整合效率10～90％。2015年，Byrne等使用CRISPR/Cas9系统将人内源hTHY1基因(2.7kb)置换为鼠源mTHY1(2.5kb)时，发现置换效率与同源臂长度和同源臂长度比例有关，当右臂不变时(R2466bp)，置换效率随左臂长度增加而升高(L100～800bp)，但L821与L1550效率接近(17.8％Vs 16.8％)，均高于L4573bp和R4803bp组(10.1％)。Kung等(2013)研究显示，将1.1kb外源片段整合到叶缘焦枯病菌(Xylellafastidiosa)时，同源臂在96～1000bp范围内，HR效率呈指数上升，但同源臂在1kb～4kb范围，其重组效率不在增加，而是出现平台期。置换效率还有切割位置有关，位于左侧gRNA切割的置换效率高于右测。
定点整合效率与整合片段的长度存在正比例的线性关系，片段越大，其重组率越低。Kung等(2013)研究显示，将1.1kb的片段整合到叶缘焦枯病菌的基因组，同源臂1kb时最高，其HR效率为5.62×10-5；但若采用1.1bp同源臂整合的片段长度达到6kb，就检测不到重组的发生。获得整合相同位点的不同家系的转基因动物是转基因新品种培育的基础，但受限于长片段较低的整合效率，转基因新品种培育难度很大。
近年来，有学者报道一种PITCh((precise Integration into targetchromosome)介导基因定点整合技术，结合ZFN、Talen和CRISPR/Cas9高效三大基因编辑系统，利用5～40bp微同源臂，可介导小片段(<1000bp)外源基因高效整合到生物基因组，并在斑马鱼，青蛙，蚯蚓和细胞系CHO，HeLa HEK293T中应用，其KI效率达10％～85％。目前利用该技术可将中等长度片段(5.7kb～9.6kb)整合到CHO细胞，其效率为(10％～17％)[10]。但该技术同源重组效率不稳定，且在长片段定点整合中，效率极低，目前尚无成功实现10kb以上片段定点整合，另外PITCh技术因采用40bp微同源臂，更容易受基因组同源相似序列干扰，其效果并不稳定。
Yoshimi等(2005)报道了CRISPR-Cas9结合单链寡核苷酸(ssODN)开发了两种基因改造的新技术，分别为LsODN(long single-stranded oligodeoxynucleotide)和2H2OP(two-hit two-oligo with plasmid)技术[11]。利用显微注射技术，以ssODNs(lsODNs)作为靶向供体，将相应的gRNA和cas9mRNA注射到大鼠受精卵，可将720bp左右的GFP整合到大鼠Thy1基因座整合其效率11.1～13.5％。该技术缺点是SSODN在细胞内容易被核酸外切酶降解，需要侧翼同源臂(HA)在60～300bp以上才能发生KI，并容易在切割位点造成缺失。大于100bp的LSODN合成极其困难，目前国内如华大基因仅能提供100bp SSODN合成，极大限制其应用。
2H2OP方法需要共同注射两个gRNAs作为“剪刀”分别切割基因组DNA和供体质粒DNA中的靶位点，接着用两个短ssODNs作为“缝合接头”连接DSB与供体质粒。利用受精卵显微注射技术，该研究小组成功实现了定点导入了近200kb的大片段基因组区域，其效率为1/15(6.7％)，并用人源基因替代了大鼠基因，构建出了基因人源化的动物其效率为1/23(4.3％)。但2H2OP方法需要同时导入受精卵2条切割gRNA，2条120bp oligo DNA，供体质粒，仅适合显微注射受精卵技术。对猪等具有重大育种价值的大动物转基因常采用体细胞克隆技术，克隆效率仅0.5％～1.5％，若利用2H2OP技术，其获得KI动物效率仅为0.03％～0.09％，很难获得KI动物。
发明内容
本发明的目的是提供一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法，包括以下步骤：
S1、靶点筛选及靶点绑定gRNA切割效率验证；
S2、构建同源臂供体质粒，并获得定点整合阳性细胞系；
S3、外源DNA定点整合转基因猪的构建。
其中，S1步骤包括以下步骤：
S1.1、构建sgRNA载体
根据定点整合位点基因序列，设计并合成sgRNA引物，再与合成得到的退火双链引物配制混合，在PCR仪中运行如下程序：95℃，5min，10℃，1min；95℃，5min，10℃，1min，95℃，5min，10℃，3min，结束后将退火产物与Bbs I线性化后的PX330进行T4连接，连接产物进行转化，挑菌和测序验证，测序引物hU6-F：GAGGGCCTATTTCCCATGATT，构建成功的菌种保存备用；
S1.2、电转染与DNA抽提
将猪胎儿成纤维细胞复苏后，汇合度达到50％～80％时，使用0.05％Trytin-EDTA消化，终止消化后细胞计数，吸取含有1×106个细胞的悬浮液至新的离心管中，90g离心5min，弃上清，使Lonza AMAXA Nucleofector2b核转仪进行PX330-sgRNA质粒3ug电转染，转染程序为A-033，然后立即转移电转杯中所有细胞至6孔板，培养48小时后，去除上清，取细胞抽提DNA，抽提后的细胞DNA为模板，用外源引物通过PCR仪扩增靶序列片段，将扩增的目的条带切胶回收，回收产物-20℃保存备用；
S1.3、gRNA切割效率验证
回收得到的PCR产物，使用T7E1酶进行酶切处理，进行充分混合后，PCR仪上95℃加热5min，95℃-85℃，-2℃/s，85-25℃，-0.1℃/s进行退火，上述反应体系分别加入0.5ulT7E1酶，37℃反应30min后，立刻跑2～3％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果，同时，切胶回收的PCR产物进行平末端连接，转化，涂板，蓝白斑筛选测序分析，获得gRNA切割效率最佳的靶点进行后续研究。
进一步地，S2步骤包括以下步骤：
S2.1、扩增定点整合位点处的不同长度的同源臂
以猪基因组DNA为模板，分别扩增同源臂序列，PCR反应程序为：98℃2min；98℃10s，55～60℃，5s；72℃,5～60s；35个循环；72℃2min，4℃1h，反应结束后用1％琼脂糖电泳，并将对应目的条带切胶回收，-20℃保存备用；
S2.2、酶切与回收目的基因载体
将质粒ppb-mpsp-neoGFP-BEXA使用Not I，Xho I内切酶双酶切后，用1％琼脂糖电泳，并将目的条带切胶回收，-20℃保存备用；
S2.3、连接片段，构建供体质粒
使用In-Fusion HD Cloning kits 639648试剂盒进行无缝克隆，连接后转化至Trans 2Blue感受态细胞中，转化过程如下：冰浴30min，42℃，45s，然后加入LB培养基复苏30～60min，质粒ppb-mpsp-neoGFP-BEXA带有氨苄抗性，取150ul涂平板，过夜培养后每组挑取6个菌落于500ul抗性培养基中扩大培养并测序，测序正确的菌落留种备用；
S2.4、重组供体质粒抽提及纯化
构建成功的质粒进行抽提及纯化；
S2.5、电转染与单克隆细胞筛选
猪胎儿成纤维细胞复苏汇合度达到50％～80％时，使用电转仪Nucleofector 2b，按，将负责切割载体和重组供体载体质粒(质粒为环状或体外线性化)组合后分别共转染猪PFFs细胞，转染条件为：切割载体质粒用量3μg，重组供体质粒10μg。转染程序为A-033，共转后将电转杯中所有细胞均分至10～30个10cm板，添加12％FBS完全培养基，8～10mL/板，轻轻吹打混匀，转染12～24h后，更换含400mg/ml G418、12％FBS筛选培养液，3天后小心移去培养基，使用PBS清洗培养板2-3次，再添加含400mg/ml G418的12％FBS筛选培养液，8～10mL/板，培养3天；第7天，使用PBS清洗培养板2-3次，再添加含200mg/ml G418的12％FBS完全培养基8ml培养3天，第10天时，荧光倒置显微镜下观察有荧光的单克隆细胞，并作标记，使用直径8mm单克隆环挑选荧光阳性细胞至48孔板中，添加含15％FBS培养基，1～5ng/mlbFGF因子的完全培养基行传代扩大培养，由此获得作为核供体的定点整合细胞系。
进一步地，S3步骤包括以下步骤：
S3.1、猪卵母细胞－颗粒细胞复合体的采集及体外成熟培养
从猪屠宰场收集猪卵巢，放入含有1％双抗的28～37℃生理盐水中并于4h内送回实验室。用37℃的生理盐水清洗后拿带有18号针头的10mL注射器抽取直径为2～6mm卵泡中的卵母细胞，在显微镜下挑选出细胞质均匀、卵丘致密且包裹3层以上的卵丘细胞-卵母细胞复合体，用M199成熟培养液洗涤后，转入提前置于CO2培养箱中孵育4h以上的加有500μLM199培养液的四孔板内，在39℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养42～44h；
S3.2、成熟培养后猪卵母细胞－颗粒细胞复合体上颗粒细胞去除和成熟卵的挑选
卵母细胞成熟后，将猪卵母细胞－颗粒细胞复合体转移到含透明质酸酶的离心管中用移液器吹打后将液体转移到30mm培养皿中，用口吸管将脱去卵丘的卵母细胞拣出，洗涤后于实体显微镜下挑选排出第一极体的卵母细胞；
S3.3、供核细胞的准备
用胰酶消化后离心洗涤，用HN操作液将定点整合外源DNA的细胞沉淀重悬并吹打均匀后用作核供体，HN操作液的配方如下：
成分 用量(g)/100ml
NaCl 0.076965
NaHCO<sub>3</sub> 0.0168
KCl 0.0356
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.0162
MgSO<sub>4</sub>7H<sub>2</sub>O 0.0293
Glucose 0.1
Glutamine 0.0146
Taurine 0.15012
HEPES 0.2383
BSA 0.4
PenicillinG 0.0065
Streptomycin 0.005
S3.4、卵母细胞的去核与注核
挑选已排出第一极体且形态良好的卵母细胞，用外径为100～120μm的固定针，内径为15～20μm的去核针采用Hoechest 3342染色法去核，挑选一个体细胞注入卵周隙中即完成胚胎重构过程，重构胚胎放入胚胎培养液中恢复培养1h；
S3.5、卵母细胞和体细胞的融合及激活
将重构卵分批转移到融合液中平衡2min后用融合/激活液洗涤3遍，按每批5～8个放入已铺满融合液的融合槽内，用实心玻璃针拨动重构卵使供核细胞-受体卵的细胞膜接触面与电极平行，施加120v/mm,100μs,2DC的直流电脉冲诱导融合同时激活重构胚，接着用胚胎培养液洗涤3遍后立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，置于39℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中，4h后在体视显微镜下判定融合情况，将已融合的重构胚用胚胎培养液洗涤5遍后，转入预平衡好的胚胎培养液，置于39℃，饱和湿度，低氧的条件下培养；
S3.6、手术移植克隆胚生产转基因猪
受体母猪为广东省华农温氏畜牧股份有限公司的优质母猪，胚胎发育2细胞期前时进行移植，将装有胚胎的吸胚管从输卵管伞口插入，小心将胚胎吹入，即能得到定点整合外源DNA的转基因猪。
进一步地，S1.1步骤中挑菌和测序验证过程为：
回收PCR产物，使用T7E1酶进行酶切处理，与退火体系进行充分混合后，置于PCR仪上95℃加热5min，95℃-85℃，-2℃/s，85-25℃，-0.1℃/s进行退火，退火体系由10μMOligo-F和10μM Oligo-R各5μL组成，然后在上述反应体系加入0.5ul T7E1酶，37℃反应30min后，立刻跑2～3％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果；同时，将切胶回收的PCR产物进行平末端连接，转化，涂板，蓝白斑筛选测序分析。
进一步地，S2步骤还包括：S2.6、挑取的单克隆细胞在24孔板满后，消化后取约1/5细胞，用10ul NP40裂解液(碧云天公司)56℃消化1h，95℃灭活10min，获得的基因组裂解液作为模板用于PCR扩增，PCR引物为跨同源臂设计。
进一步地，S2.1步骤中同源臂中短臂的长度小于500bp。
进一步地，S2.1步骤中同源臂的短臂与长臂长度比例为1:5-1:15。
本发明采用的同源臂策略有效突破长片段定点整合技术难题，将长片段定点整合由几乎不可能，变成稳定而可靠，突破长片段外源DNA定点整合技术难题。
供体质粒细胞转染中，本方法采用环状化超螺旋质粒进行转染，超螺旋质粒比线性化质粒具有更简便的操作和更高的转染效率。同时，本发明在供体质粒中引入gRNA靶点序列，利用细胞内转录gRNA，切割靶基因同时，线性化供体质粒，是的线性化的供体质粒具有更高的整合效率。因而本发明，通过引入gRNA切割质粒，可以实现环状超螺旋质粒进行转染后，在细胞内同时进行靶点与供体质粒的线性化切割，从而提高整合效率，本发明大大简化试验步骤，节约人力，且有利于提高共转染效率，且具有提高定点整合效率的潜力。
传统认为，长同源臂更有利于同源重组的发生，本发明通过对同源臂比例优化，将左臂LA长度缩减到200bp，右臂长度仅需3000bp左右，降低大载体构建技术难度，降低长片段DNA定点整合的难度，提高长片段DNA定点整合效率，本发明实现长达26kb外源DNA定点整合到猪基因猪。本发明定点整合所用载体较少，同源臂大小适中，更有利于获得转基因细胞系，便于体细胞克隆转基因动物的制备。
本发明在转基因细胞后期培养基中，添加bFGP因子，降低长期筛选的转基因细胞的培养难度，增强转基因细胞活性，有利于快速获得足量的定点整合转基因猪细胞，结合克隆技术，可快速制备定点整合多基因共表达的转基因大动物模型，加快转基因新品系培育速度。
通过采用以上的技术方案，本发明还具有以下技术效果：
(1)与以往随机整合转基因技术相比，该发明实现定点整合，靶位点明确，更有利于发挥基因组活跃高表达位点和安全位点的作用，有利于转基因新品系的培育，有利于转基因技术生产应用。
(2)定点整合效率与插入片段长度成反比，插入片段越大，重组效率越低，目前研究多集中于5kb以下DNA片段定点整合，大大限制转基因动物开发。本发明实现了小同源臂高效介导长片段DNA的定点整合，不但可实现多基因共表达定点整合转基因动物制备，还可以用于组织特异表达外源蛋白(如腮腺和乳腺启动子10kb以上)转基因动物的制备。
(3)与以往技术相比，本发明在供体质粒引入gRNA靶点设计，简化试验操作，节约了人力，提高转染效率及整合效率。
(4)以往技术认为，实现转基因定点整合，同源臂长度不宜小于500bp，一般采用1000bp以上同源臂，但本发明发现长片段定点整合外源DNA左臂小于500bp，更有利于长片段DNA定点整合，降低载体构建难度，有利于快速获得定点整合外源DNA的细胞，构建定点整合转基因动物新品系。
(5)在定点整合阳性细胞系筛选的培养基中添加1～5ng/ml bFGF因子，针对长期筛选老化的细胞，增强细胞活力，提高阳性细胞筛选效率和成功率。
(6)定点整合技术与体细胞克隆技术结合，更有利于转基因新品系快速培育及建立。
附图说明
图1本发明的一种实施方式中gRNA切割效率验证及靶点序列测序分析结果
图2为CEP112和ROSA26靶点重组供体质粒模式图。
图3为Rosa26和Cep112位点定点整合转基因细胞荧光鉴定结果示意图。
图4为CEP112位点和Rosa26位点定点整合转BEXA基因模式图。
图5为本发明的一种实施方式制备的CEP112位点定点整合转BEXA基因猪及其PCR检测结果示意图。
图6为本发明的一种实施方式制备的Rosa26位点定点整合转BEXA基因猪及其PCR检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
图1至图6示意性地显示了根据本发明的一种实施方式的定点整合外源DNA转基因猪的构建方法。
该构建方法包括以下步骤。
S1、靶点筛选及靶点绑定gRNA切割效率验证
S1.1、sgRNA载体构建
根据猪Rosa26基因第一内含子序列和CEP112基因第5内含子序列，使用在线网站http://crispr.mit.edu:8079/？，设计并合成sgRNA引物(如表1所示)。合成得到的退火双链引物按下表2体系配制混合，在PCR仪中退火形成双链DNA。
表1 gRNA靶位点和引物设计
Figure BDA0001533175440000111
Figure BDA0001533175440000121
Figure BDA0001533175440000131
表2 gRNA双链退火体系
组分 用量(μL)
Oligo-F(10μM) 5
Oligo-R(10μM) 5
Total 10
在PCR管中按照表2配制好gRNA双链退火体系混均后，在PCR仪中运行如下程序：95℃，5min，10℃，1min；95℃，5min，10℃，1min；95℃，5min，10℃，3min。结束后将退火产物与Bbs I线性化后的PX330(addgene,美国)进行T4连接(参考Takara T4DNA Ligase说明书)。连接产物进行转化，挑菌和测序验证，测序引物hU6-F：GAGGGCCTATTTCCCATGATT，构建成功的菌种保存备用。
1.2电转染与DNA抽提
猪胎儿成纤维细胞复苏后，汇合度达到50％～80％时，使用0.05％Trytin-EDTA消化，终止消化后细胞计数，吸取含有1X106个细胞的悬浮液至新的离心管中，90g离心5min；弃上清，使用电转仪Nucleofector2b(LONZA)，按Amaxa Basic Nucleofector Kit forPrimary Mammalian Fibroblasts(Lonza)说明书进行PX330-sgRNA质粒3ug电转染，转染程序为A-033。然后立即转移电转杯中所有细胞至6孔板(12％FBS完全培养基2mL/孔)，培养48小时后，去除上清，取细胞抽提DNA，DNA抽提方法参考Tissue DNAKit D3396(omega)。
抽提后细胞DNA，使用表3中所示的PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara)扩增靶序列片段，扩增的目的条带切胶回收，实验过程参考Gel Extraction Kit D2500说明书(omega)，回收产物-20℃保存备用。
S1.3、gRNA切割效率验证
回收得到的PCR产物，使用T7E1酶(NEB)进行酶切处理(参考T7核酸内切酶I(NEB)说明书)，具体体系见表4。进行充分混合后，PCR仪上95℃加热5min，95℃-85℃，-2℃/s，85-25℃，-0.1℃/s进行退火。上述反应体系分别加入0.5ul T7E1酶，37℃反应30min后，立刻跑2～3％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果，如图1所示。同时，切胶回收的PCR产物进行平末端连接，转化，涂板，蓝白斑筛选测序分析如图1所示。图1中，A部分表示的的是T7E1酶切方法验证靶点切割效率的结果；B部分表示的是靶点编辑测序分析结果。
实验过程参考pEASY-Blunt Cloning Kit(全式金)说明书。
表3扩增gRNA靶点序列引物
Figure BDA0001533175440000141
Figure BDA0001533175440000151
Figure BDA0001533175440000161
试验结果显示，大多数gRNA均可试验靶点切割，选择C5(55.1％)和R5(49.7％)分别作为CEP112和Rosa26的靶点gRNA继续开展试验。
表4 T7E1酶切体系
组分 体积/μL
PCR产物 5
10×Buffer 1.1
ddH2O 4.4
Total 10.5
S2、构建同源臂供体质粒(cep112和rosa26)
S2.1、CEP112和ROSA26同源臂扩增
合成表3中所示的引物，以猪基因组DNA为模板，使用PrimeSTAR Max DNAPolymerase(Takara)分别扩增CEP112和Rosa26位点不同长度的同源臂序列。PCR反应程序：98℃2min；98℃10s，55～60℃，5s；72℃,5～60s；35个循环；72℃2min，4℃1h。
反应结束后用1％琼脂糖电泳，并将对应目的条带切胶回收，-20℃保存备用。实验过程参考Gel Extraction Kit D2500说明书(omega)。
实验结果如表5所示。
表5.CEP112和Rosa26同源臂扩增序列
Figure BDA0001533175440000171
Figure BDA0001533175440000181
Figure BDA0001533175440000191
表5的序列(5’-3’)中，斜体字为infusion连接同源序列部分，加粗字为cep112-sgRNA靶向序列，其他部分为基因组扩增序列部分，其中，画线部分为酶切位点，NotI:5'GCGGCCGC3'；XhoI:5'CTCGAG3'。
S2.2、目的基因载体酶切与回收
将实验室保存质粒ppb-mpsp-neogfp-BEXA使用NotI，XhoI内切酶(Thermofisher)双酶切(如表6)后，用1％琼脂糖电泳，并将目的条带(19646bp，2998bp)切胶回收，-20℃保存备用。实验过程参考Gel Extraction KitD2500说明书(omega)。
表6 ppb-mpsp-neogfp-B2aXET载体线性化体系
Figure BDA0001533175440000192
S2.3连接片段，构建供体质粒
按照表7中的片段，使用In-Fusion HD Cloning kits 639648(Takara)试剂盒进行无缝克隆(实验参考In-Fusion HD Cloning kits 639648说明书)，连接后转化至Trans2Blue(全式金)感受态细胞中，转化过程如下：冰浴30min，42℃，45s，然后加入LB培养基复苏30～60min。质粒ppb-mpsp-neogfp-BEXA带有氨苄抗性，取150ul涂平板，过夜培养后每组挑取6个菌落于500ul抗性培养基中扩大培养并测序，测序正确的菌落留种备用，如图2所示。
表7供体质粒构建
Figure BDA0001533175440000201
Figure BDA0001533175440000211
S2.4、质粒抽提和重组供体质粒线性化
构建成功的质粒依照Endo-free Plasmid Maxi Kit(Omega)说明书进行抽提，纯化后，乙醇沉淀回收后备用。
S2.5、电转染与单克隆细胞筛选
猪胎儿成纤维细胞复苏汇合度达到50％～80％时，使用电转仪Nucleofector 2b(LONZA)，按Amaxa Basic Nucleofector Kit for Primary Mammalian Fibroblasts(Lonza)说明书，将负责切割载体PX330-sgRNA-C5和CEP112重组修复载体组合后(共4组)，分别共转染猪PFFs细胞；将负责切割载体PX330-sgRNA-R5和Rosa26重组修复载体组合后(共6组)，见表8。分别共转染猪PFFs细胞，转染条件：切割载体质粒用量3μg，重组供体质粒10μg。转染程序为A-033。
表8切割质粒与供体质粒组合
Figure BDA0001533175440000212
Figure BDA0001533175440000221
共转后将电转杯中所有细胞均分至10～30个10cm板，添加12％FBS完全培养基，8～10mL/板，轻轻吹打混匀。转染12～24h后，更换含400mg/ml G418、12％FBS筛选培养液。3天后小心移去培养基，使用PBS清洗培养板2-3次，再添加含400mg/ml G418的12％FBS筛选培养液，8～10mL/板，培养3天；第7天，使用PBS清洗培养板2-3次，再添加含200mg/ml G418的12％FBS完全培养基8ml培养3天。第10天时，荧光倒置显微镜下观察有荧光的单克隆细胞，如图3所示，并作标记。使用直径8mm单克隆环挑选荧光阳性细胞至48孔板中，进行传代扩大培养。
图3中，A部分表示的是Rosa26位点定点整合转BEAX基因猪细胞克隆团；B部分表示的是CEP112位点定点整合转BEXA基因猪细胞克隆团
S2.6、阳性细胞鉴定
挑取的单克隆细胞在24孔板满后，消化后取约1/5细胞，用10ul NP40裂解液(碧云天公司)56℃消化1h，95℃灭活10min。获得的基因组裂解液作为模板用于PCR扩增。如图4所示，PCR引物为跨同源臂设计，引物信息见表8。图4中，小箭头为定点整合检测引物。
表8定点打靶阳性细胞鉴定引物信息表
Figure BDA0001533175440000222
Figure BDA0001533175440000231
S2.7打靶效率鉴定与分析
对筛选到荧光细胞克隆团进行扩增，凝胶电泳检测和测序，结果如表9和表10所示。
表9 Rosa26位点定点整合事件及HDR效率检测
Figure BDA0001533175440000241
表10 CEP112位点定点整合事件及HDR效率检测
Figure BDA0001533175440000242
由上表可知，重组供体质粒ROSA26-LA320RA3769的定点整合效率最高，其效率达7.94％，等长同源臂并不能将长片段DNA定点整合到猪基因组，LA长度较短时(500bp以下)，其与RA的比值应在1:6以下，才能实验定点整合，其最适比例1:9～1:13；当LA长度在1000bp左右时，其与RA比例应在1:2以下才可实现重组。
对以CEP112位点，上述研究结果得到验证，该位点最高效达6.47％，其重组供体质粒为CEP112-LA340RA3219，LA/RA比值为1:9。
S2.8、不同质粒结构对定点整合效率的影响
如下表11所示，为简化试验操作，本研究在LA侧翼引入gRNA靶点序列，利用gRNA切割基因组同时线性化供体质粒，与线性化质粒相比，CEP112位点，LA/RA比值达1:13时，超螺旋质粒具有更高的定点整合效率，对于Rosa26位点，当LA/RA比值1：9时，线性化供体质粒重组效率更高，但二者效率差异不大。表明采用该设计，使用超螺旋质粒基本实现线性化质粒等同的效果，但其操作更为简单。
表11超螺旋质粒与线性化供体质粒重组效率比较
Figure BDA0001533175440000251
S3、定点整合转基因猪的构建
以上述获得定点整合细胞为核供体，按下面方法制备定点整合转基因猪：S3.1、猪卵母细胞－颗粒细胞复合体(COCs)的采集及体外成熟培养
从猪屠宰场(广东省天河肉联厂)收集猪卵巢，放入含有1％双抗(双抗为lifetechnology的产品：Penicillin-Streptomycin-Glutamine)的28～37℃生理盐水中并于4h内送回实验室。用37℃的生理盐水清洗后拿带有18号针头的10mL注射器抽取直径为2～6mm卵泡中的卵母细胞。在显微镜下挑选出细胞质均匀、卵丘致密且包裹3层以上的卵丘细胞-卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes，COCs)，用M199成熟培养液洗涤后，转入提前置于CO2培养箱中孵育4h以上的加有500μLM199培养液的四孔板内，在39℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养42～44h。
S3.2、成熟培养后COCs上颗粒细胞去除和成熟卵的挑选
卵母细胞成熟后，将COCs转移到含透明质酸酶的离心管中用移液器吹打后将液体转移到30mm培养皿中，用口吸管将脱去卵丘的卵母细胞拣出。洗涤后于实体显微镜下挑选排出第一极体的卵母细胞。
S3.3、供核细胞的准备
用胰酶消化后离心洗涤，用HN操作液(无钙H-NCSU-23显微操作液)将细胞沉淀重悬并吹打均匀后用作核供体。
HN操作液的配方如下表12，表中所有试剂均为分析纯级别，购自广州康龙生物科技有限公司：
表12 HN操作液的配方组成表
成分 用量(g)/100ml
NaCl 0.076965
NaHCO<sub>3</sub> 0.0168
KCl 0.0356
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.0162
MgSO<sub>4</sub>7H<sub>2</sub>O 0.0293
Glucose 0.1
Glutamine 0.0146
Taurine 0.15012
HEPES 0.2383
BSA 0.4
PenicillinG 0.0065
Streptomycin 0.005
S3.4、卵母细胞的去核与注核
挑选已排出第一极体且形态良好的卵母细胞，用外径为100～120μm的固定针，内径为15～20μm的去核针采用Hoechest 3342核染法去核：在65mm无菌培养盘中加入约50μL的操作液滴，并用石蜡油覆盖，然后将30个左右的卵母细胞和适量的体细胞移入其中。用固定针固定住卵母细胞，用去核针拨动卵母细胞使极体在大约5点钟的位置。用去核针沿3点钟位置刺进去，去除极体及附近的胞质，之后把针撤出并将极体和胞质吐出，挑选一个体细胞注入卵周隙中即完成胚胎重构过程。重构胚胎放入胚胎培养液中恢复培养1h。
S3.5、卵母细胞和体细胞的融合及激活
将重构卵分批转移到融合液中平衡2min后用融合/激活液洗涤3遍，按每批5～8个放入已铺满融合液的融合槽内，用实心玻璃针拨动重构卵使供核细胞-受体卵的细胞膜接触面与电极平行，施加120v/mm,100μs,2DC的直流电脉冲诱导融合同时激活重构胚，接着用胚胎培养液洗涤3遍后立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，置于39℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中，4h后在体视显微镜下判定融合情况。将已融合的重构胚用胚胎培养液洗涤5遍后，转入预平衡好的胚胎培养液，置于39℃，饱和湿度，低氧(5％O2+5％CO2+90％N2)的条件下培养。
S3.6、手术移植克隆胚生产转基因猪
受体母猪为广东省华农温氏畜牧股份有限公司的优质母猪。本实施例采用输卵管移植法，胚胎发育处于为2细胞或4细胞期时进行移植。手术当天对母猪禁食，手术前保定母猪并对它进行全身静脉麻醉。手术部位选择在倒数第二对乳头中间部位，先用清水清洗手术部位及四周，擦干后先用碘酒大范围消毒，再用75％酒精脱碘。盖上手术布同时暴露手术部位，沿腹中线切开皮肤和皮下肌肉，然后分离皮下脂肪和腹膜，手探入腹腔，慢慢牵引出子宫和输卵管，检查排卵情况。将装有胚胎的吸胚管从输卵管伞口插入，小心将胚胎吹入。然后恢复子宫和输卵管到腹腔内。常规手术缝合，术后连续4天注射抗生素消炎。即能得到定点整合外源DNA的转基因猪。S4、定点整合外源大片段DNA的转基因猪的PCR检测
采集克隆猪耳组织，抽提DNA。接着以猪基因组DNA为模板，使用PrimeSTAR MaxDNA Polymerase(Takara)分别扩增两批克隆猪CEP112，RASA26同源臂序列及BEXA目的基因，PCR过程参考Takara PrimeSTAR Max DNA Polymerase说明书。PCR引物为跨同源臂设计，引物信息如表8所示。
经检测，发现有3头克隆猪实现在cep112位点定点整合外源大片段DNA，8头克隆猪实现在Rosa26位点定点整合外源大片段DNA。
图5和图6中，LA表示左同源臂(left arm)，RA表示右侧同源臂(right arm)；mPSP表示启动子；BEXA表示目的基因
制备案例
案例1.、CEP112位点定点整合转BEXA基因猪的制备
利用已优化同源臂比例的超螺旋供体质粒CEP112-LA340RA3219及gRNA切割载体(C5),共转染猪PEFs细胞，经过筛选获得定点整合转基因细胞系，接着利用体细胞克隆技术CEP112位点定点整合转BEXA基因猪。转基因猪及其PCR检测结果如图5所示。图5中，LA表示左同源臂(left arm)，RA表示右侧同源臂(right arm)；mPSP表示启动子；BEXA表示目的基因。CEP112位点定点整合转BEXA基因猪的关键核苷酸系列如SEQ ID NO：1所示。
案例2、Rosa26位点定点整合转BEXA基因猪
利用已优化同源臂比例的线性化供体质粒ROSA26-LA320RA3769及gRNA切割载体(R5),共转染猪PEFs细胞，经过筛选获得定点整合转基因细胞系，接着利用体细胞克隆技术Rosa26位点定点整合转BEXA基因猪。转基因猪及其PCR检测结果如图6所示。图6中，LA表示左同源臂(left arm)，RA表示右侧同源臂(right arm)；mPSP表示启动子；BEXA表示目的基因。Rosa26位点定点整合转BEXA基因猪的关键核苷酸系列如SEQ ID NO：2所示。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东温氏食品集团股份有限公司，华南农业大学
<120> 一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法
<130> ZSP170415
<140> 2017114778055
<141> 2017-12-29
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 1
gacctgcagg cggccgccca tccatagtgt gtccttcact tgttttatgc tccagagggc 60
ctt 63
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 2
atggcgcgcg cggccggatg ggagactgtg tcctacct 38
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 3
gacctgcagg cggccgccca tccatagtgt gtccttcacc ctctgaagtt catgtgcgaa 60
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 4
atggcgcgcg cggccggatg ggagactgtg tcctacct 38
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 5
gacctgcagg cggccgcagg cgtaatgggg cttgat 36
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 6
atggcgcgcg cggccgcgga tgggagactg tgtcctacct 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 7
gacctgcagg cggccgccta atcagtaaga gccccaggaa 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 8
atggcgcgcg cggccgcgga tgggagactg tgtcctacct 40
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 9
gatctgtcga ctcgagatag tgtgtccttc acacatca 38
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 10
attgcagatc ctcgagtgtt tccttatctc cattcac 37
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 11
gatctgtcga ctcgacacat cacggttaca attaggc 37
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 12
attgcagatc ctcgaggctc tttctaaggc tataactgg 39
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 13
gacctgcagg cggccgcttg agcaggtgta cgaggac 37
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 14
atggcgcgcg cggccggtaa ggatgcaagt gaggg 35
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 15
gacctgcagg cggccgcagg gtcagtgaaa gtggct 36
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 16
atggcgcgcg cggccggtaa ggatgcaagt gaggg 35
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 17
gatctgtcga ctcgacggtc agataactct cactcatac 39
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 18
attgcagatc ctcgagatac ttccaaggct caaca 35
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 19
gatctgtcga ctcgacggtc agataactct cactcatac 39
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 20
attgcagatc ctcgagtgat tagacataca gtttccct 38
<210> 21
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 21
gatctgtcga ctcgacggtc agataactct cactcatac 39
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成(Sus scrofa)
<400> 22
attgcagatc ctcgaggttt ctcacccact tcatc 35

Claims (8)

1.一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、安全靶点筛选及靶点绑定gRNA切割效率验证；
S2、构建同源臂供体质粒，并获得定点整合转基因细胞系：所述供体质粒的同源臂中LA长度小于500bp时，LA/RA比例应在1:9~1:13；LA长度在大于1000bp时，LA/RA比例应小于1：2；并且在筛选定点整合阳性细胞系时在培养基中添加1~5ng/ml bFGF因子；
S3、外源DNA定点整合转基因猪的构建。
2.根据权利要求1所述的定点整合外源DNA转基因猪的构建方法，其特征在于，所述S1步骤包括以下步骤：
S1.1、构建sgRNA载体：
根据定点整合位点基因序列，设计并合成sgRNA引物，再与合成得到的退火双链引物配制混合，在PCR仪中运行如下程序：95℃，5min，10℃，1min；95℃，5min，10℃，1min，95℃，5min，10℃，3min，结束后将退火产物与Bbs I线性化后的PX330进行T4连接，将连接产物进行转化，挑菌和测序验证，构建成功的菌种保存备用；
S1.2、电转染与DNA抽提：
将猪胎儿成纤维细胞复苏后，汇合度达到50%~80%时，使用0.05%Trytin-EDTA消化，终止消化后细胞计数，吸取含有1×106个细胞的悬浮液至新的离心管中，90g离心5min，弃上清，使用Lonza 2b核转仪进行PX330-sgRNA质粒3ug电转染，转染程序为A-033，然后立即转移电转杯中所有细胞至6孔板，培养48小时后，去除上清，取细胞抽提DNA，抽提后的细胞DNA为模板，用外源引物通过PCR仪扩增靶序列片段，将扩增的目的条带切胶回收，回收产物-20℃保存备用；
S1.3、 gRNA切割效率验证：
回收得到的PCR产物，使用T7E1酶进行酶切处理，进行充分混合后，PCR仪上95℃加热 5min，95℃-85℃，-2℃/s，85-25℃，-0.1℃/s进行退火，上述反应体系分别加入0.5 ul T7E1酶，37℃反应30 min后，立刻跑2~3%的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果，同时，切胶回收的PCR产物进行平末端连接，转化，涂板，蓝白斑筛选测序分析，获得 gRNA切割效率最佳的靶点进行后续研究。
3.根据权利要求1所述的定点整合外源DNA转基因猪的构建方法，其特征在于，S1.2步骤中，PCR的反应程序为：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55~60℃，5s；72 ℃, 5~60s ; 35个循环；72 ℃ 2 min，4℃ 1h。
4.根据权利要求1所述的定点整合外源DNA转基因猪的构建方法，其特征在于，S2步骤包括以下步骤：
S2.1、扩增定点整合位点处的侧翼不同长度的同源臂：
以猪基因组DNA为模板，从靶序列切割位点侧翼40 bp内设计引物，分别扩增不同长度的同源臂序列，PCR反应程序为：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55~60℃，5s；72 ℃, 5~60s ;35个循环；72 ℃ 2 min，4℃ 1h，反应结束后用1%琼脂糖电泳，并将对应目的条带切胶回收，-20℃保存备用；
S2.2、酶切与回收目的基因载体：
将质粒ppb-mpsp-neoGFP-BEXA使用Not I，Xho I内切酶双酶切后，用1%琼脂糖电泳，并将目的条带切胶回收，-20℃保存备用；
S2.3、连接片段，构建供体质粒：
使用In-Fusion HD Cloning kits 639648试剂盒进行无缝克隆，连接后转化至Trans2 Blue 感受态细胞中，转化过程如下：冰浴30 min，42℃，45 s，然后加入LB培养基复苏30~60 min，质粒ppb-mpsp-neoGFP-BEXA带有氨苄抗性，取150 ul涂平板，过夜培养后每组挑取6个菌落于500 ul抗性培养基中扩大培养并测序，测序正确的菌落留种备用；
S2.4、重组供体质粒抽提及纯化：
将构建成功的质粒进行抽提及纯化；
S2.5、电转染与单克隆细胞筛选：
猪胎儿成纤维细胞复苏汇合度达到50%~80%时，使用Lonza核转仪 Nucleofector 2b，按，将负责切割载体和重组供体质粒混合后共转染猪PFFs细胞，转染条件为：切割载体质粒用量3 μg，重组供体质粒10 μg，转染程序为A-033，共转后将电转杯中所有细胞均分至10~30个10 cm板，添加12% FBS完全培养基，8~10 mL/板，轻轻吹打混匀，转染12~24 h后，更换含400 mg/ml G418、 12% FBS筛选培养液，3天后小心移去培养基，使用PBS清洗培养板2-3次，再添加含400 mg/ml G418的12% FBS筛选培养液，8~10 mL/板，培养3天；第7天，使用PBS清洗培养板2-3次，再添加含200 mg/ml G418的12% FBS完全培养基8ml培养3天，第10天时，荧光倒置显微镜下观察有荧光的单克隆细胞，并作标记，使用直径8 mm单克隆环挑选荧光阳性细胞至48孔板中，添加含15%FBS培养基，1~5ng/ml bFGF因子的完全培养基进行扩大培养进行传代扩大培养，经PCR和DNA测序鉴定后，获得作为核供体的定点整合细胞系。
5.根据权利要求4所述的定点整合外源DNA转基因猪的构建方法，其特征在于，所述S2.5步骤中的供体质粒以环状形式质粒转染猪胎儿成纤维细胞。
6.根据权利要求1或2或3所述的定点整合外源DNA转基因猪的构建方法，其特征在于，所述S3步骤包括以下步骤：
S3.1、猪卵母细胞－颗粒细胞复合体的采集及体外成熟培养：
从猪屠宰场收集猪卵巢，放入含有1% 双抗的28～37℃生理盐水中，用37℃的生理盐水清洗后拿带有18号针头的10 mL注射器抽取直径为2～6 mm卵泡中的卵母细胞，在显微镜下挑选出细胞质均匀、卵丘致密且包裹3层以上的卵丘细胞-卵母细胞复合体，用M199成熟培养液洗涤后，转入提前置于CO2培养箱中孵育4 h以上的加有500 μLM199培养液的四孔板内，在39℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养42～44 h；
S3.2、成熟培养后猪卵母细胞－颗粒细胞复合体上颗粒细胞去除和成熟卵的挑选：
所述卵母细胞成熟后，将所述猪卵母细胞－颗粒细胞复合体转移到含透明质酸酶的离心管中用移液器吹打后将液体转移到30 mm培养皿中，用口吸管将脱去卵丘的卵母细胞拣出，洗涤后于实体显微镜下挑选排出第一极体的卵母细胞；
S3.3、供核细胞的准备：
用胰酶消化后离心洗涤，用HN操作液将细胞沉淀重悬并吹打均匀后用作核供体，所述HN操作液的配方如下：
成分 用量（g）/100ml NaCl 0.076965 NaHCO3 0.0168 KCl 0.0356 KH2PO4 0.0162 MgSO47H2O 0.0293 Glucose 0.1 Glutamine 0.0146 Taurine 0.15012 HEPES 0.2383 BSA 0.4 Penicillin G 0.0065 Streptomycin 0.005
S3.4、卵母细胞的去核与注核：
挑选已排出第一极体且形态良好的卵母细胞，用外径为100～120 µm的固定针，内径为15～20µm的去核针采用Hoechest 3342 3342核染法去核，挑选一个定点整合外源DNA的体细胞注入卵周隙中即完成胚胎重构过程，重构胚胎放入胚胎培养液中恢复培养1h；
S3.5、卵母细胞和体细胞的融合及激活
将重构卵分批转移到融合液中平衡2 min后用融合/激活液洗涤3遍，按每批5～8个放入已铺满融合液的融合槽内，用实心玻璃针拨动重构卵使供核细胞-受体卵的细胞膜接触面与电极平行，施加120v/mm,100μs，2DC的直流电脉冲诱导融合同时激活重构胚，接着用胚胎培养液洗涤3遍后立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，置于39℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中，4 h后在体视显微镜下判定融合情况，将已融合的重构胚用胚胎培养液洗涤5遍后，转入预平衡好的胚胎培养液，置于39℃，饱和湿度，低氧的条件下培养；
S3.6、手术移植克隆胚生产转基因猪
受体母猪选择优质母猪，胚胎发育2细胞期前进行移植，将装有胚胎的吸胚管从输卵管伞口插入，小心将胚胎吹入，即能得到定点整合外源DNA的转基因猪。
7.根据权利要求1所述的定点整合外源DNA转基因猪的构建方法，其特征在于，所述S1.1步骤中挑菌和测序验证过程为：
回收PCR产物，使用T7E1酶进行酶切处理，与退火体系进行充分混合后，置于PCR仪上95℃加热 5 min，95℃-85℃，-2℃/s，85-25℃，-0.1℃/s进行退火，退火体系由10 μM Oligo-F 和 10 μM Oligo-R各5 μL组成，然后在上述反应体系加入0.5 ul T7E1酶，37℃反应30min后，立刻跑2~3%的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果；同时，将切胶回收的PCR产物进行平末端连接，转化，涂板，蓝白斑筛选测序分析。
8.根据权利要求3所述的定点整合外源DNA转基因猪的构建方法，其特征在于，所述S2步骤还包括以下步骤：
S2.6、挑取的单克隆细胞在24孔板满后，消化后取1/5细胞，用10 ul NP40裂解液56℃消化1h，95℃灭活10 min，获得的基因组裂解液作为模板用于PCR扩增，PCR引物为跨同源臂设计。
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