CN114196703B - 一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体、细胞和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体、细胞和方法，属于牦牛克隆胚胎技术领域。该载体为shRNA的真核表达载体，shRNA靶向CBX3基因，靶序列如SEQ ID NO.1所示：GGTCTTGATCCAGAACGAATA。通过该载体转染牦牛体细胞，获得阳性单克隆；利用阳性单克隆作为供体，进行核移植，构建克隆胚，可纠正牦牛克隆胚胎异常重编程，显著提高牦牛克隆胚胎体外发育率，为阐明牦牛克隆胚胎重编程机理提供材料基础及理论依据。

Description

一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体、细胞和方法
技术领域
本发明属于牦牛克隆胚胎技术领域，具体涉及一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体、细胞和方法。
背景技术
牦牛(Bos grunniens)常年生活在海拔3000-5500m的喜马拉雅山脉和青藏高原地区，属于牛科(Bovidae)牛亚科(Bovinae)。因能适应当地高寒、低氧和强辐射等恶劣生态环境，有“高原之舟”之称，是当地重要的畜种之一，可为当地农牧民提供肉、奶和皮毛等生活必需品，可作为当地重要的运输工具。但牦牛繁殖和生长性能低下、优质种畜少等因素极大的限制了高原畜牧业的发展。
通过体细胞核移植技术(即克隆技术)，卵母细胞可将体细胞重编程为全能性的胚胎细胞并最终发育成动物个体，使得该技术在优良家畜扩繁、转基因家畜生产、治疗性克隆等方面展示出巨大的应用前景。目前大多家畜已经通过体细胞核移植技术被成功克隆，但至今牦牛这一青藏地区重要的家畜物种尚未被成功克隆。解析牦牛克隆胚胎异常重编程的机制，对提高牦牛克隆胚胎发育率和完善牦牛克隆技术、以及提高牦牛的克隆效率十分重要。
因此，如何提供一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体、细胞和方法是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明公开了一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体、细胞和方法，可纠正牦牛克隆胚胎异常重编程，显著提高牦牛克隆胚胎体外发育率。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体，
所述载体为shRNA的真核表达载体，所述shRNA靶向CBX3基因，靶序列如SEQ IDNO.1所示：GGTCTTGATCCAGAACGAATA。
优选地，所述shRNA的正义模板链为：
5'-CACCGGTCTTGATCCAGAACGAATATTCAAGAGATATTCGTTCTGGATCAAGACCTTTTTTG-3'，SEQ ID NO.2；
所述shRNA的反义模板链为：
5'-GATCCAAAAAAGGTCTTGATCCAGAACGAATATCTCTTGAATATTCGTTCTGGATCAAGACC-3'，SEQ ID NO.3。
优选地，所述载体的构建方法为：
合成编码shRNA的正义模板链与反义模板链，正义模板链与反义模板链退火合成DNA双链，将DNA双链转入pGPU6/GFP/Neo。
含有上述载体的牦牛体细胞。
优选地，上述牦牛体细胞为牦牛胎儿成纤维细胞。
一种提高牦牛克隆胚胎发育率的方法，包括如下步骤：
(1)将上述载体转染牦牛体细胞，获得阳性单克隆；
(2)利用阳性单克隆作为供体，进行核移植，构建克隆胚。
综上所述，本发明载体、细胞和方法可纠正牦牛克隆胚胎异常重编程，显著提高牦牛克隆胚胎体外发育率，为阐明牦牛克隆胚胎重编程机理提供材料基础及理论依据。
附图说明
图1所示为牦牛胎儿成纤维细胞原代培养结果；
A.原代培养第3d；B.原代培养第6d；
图2所示为shRNA CBX3-yak-500信息；
图3所示为shRNA CBX3-yak-613信息；
图4所示为shRNA CBX3-yak-463信息；
图5所示为shRNA CBX3-yak-433信息；
图6所示为shRNA CBX3-yak-570信息；
图7所示为阴性对照shRNA信息；
图8所示为不同shRNA质粒载体转染入细胞后CBX3 mRNA的相对表达量；
上标不同表示样品间显著性差异(P<0.05)；
图9所示为不同shRNA质粒载体转染入细胞后CBX3蛋白表达量；
图10所示为瞬时转染48h后荧光检测结果(40×)；
A.转染CBX3-463质粒组GFP表达图；B.转染CBX3-463质粒组明场图；
C.转染shNC质粒组GFP表达图；D.转染shNC质粒组明场图；
图11所示为G418筛选2-3周后得到的稳定转染带有荧光的阳性单克隆细胞(40×)；
A.阳性单克隆细胞绿色荧光激发效果；B.阳性单克隆细胞明场图；
图12所示为筛选出的稳定克隆中CBX3 mRNA的相对表达量；
上标不同表示样品间显著性差异(P<0.05)；
图13所示为稳定克隆中CBX3蛋白表达水平；
图14所示为阳性克隆H3K9me3水平；
图15所示为阳性克隆中SUV39H1、SUV39H2、NSD1、EZH2 mRNA的相对表达量；
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例所涉及的试剂和材料如下：
胎牛血清、DMEM高糖培养基、Opti-MEM培养基购自美国Invitrogen公司，G418、EDTA和Trypsin购自美国Sigma公司，细胞培养板和培养皿购自美国Corning公司，质粒提取试剂盒购自美国Omega公司，电转染仪(ECM2001)购自美国BTX公司，Trizol RNA提取液、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司，定量PCR引物由北京擎科生物科技有限公司(西安)合成，BCA蛋白定量试剂盒购自康为世纪公司，shRNA质粒载体均购自上海吉玛公司，CBX3、H3K9me3一抗购自Abcam公司，GAPDH一抗及二抗购自碧云天，其它试剂如无特别说明均购自Sigma公司。
实施例1
1.牦牛胎儿成纤维细胞的原代培养
从青海省西宁市屠宰场取30d-60d胚龄左右的牦牛胚胎，将剖离出的牦牛胎儿连同胎膜完整采下，用含青霉素(200IU/mL)、链霉素(200IU/mL)的生理盐水500mL快速冲洗3次后，转移至保温瓶中(添加含双抗的生理盐水)，半小时内快速带回实验室。
采用组织块培养法培养牦牛胎儿成纤维细胞：
于无菌超净台中，将牦牛胎儿置于灭菌的烧杯中，用提前37℃预热的生理盐水清洗3-5次，灭菌眼科镊轻轻剥离胎儿背部皮肤组织，移置于60mm培养皿中，PBS液清洗3次，灭菌眼科剪剪碎皮肤组织至1mm3大小，DMEM高糖培养液重悬组织，1200r/min离心4min，吸弃上清液，重复清洗两次，然后将组织块均匀贴附于60mm培养皿，在37℃、5％CO2培养箱中培养使组织块微干涸，然后滴加少量新鲜培养液继续培养，8h后加入4mL含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液进行原代培养，以后每3d换液一次，培养2-3d可观察到牦牛胎儿成纤维细胞迁出。
如图1A所示，原代培养第3d成纤维细胞零星迁出；如图1B所示，原代培养第6天成纤维细胞已接近汇合。
2.牦牛胎儿成纤维细胞的传代培养、冻存与复苏
当细胞生长至70％-80％汇合度时进行传代培养：
吸弃培养液，用提前37℃预热好的PBS润洗2次，加入适量0.25％的胰蛋白酶-EDTA混合液进行消化。放入37℃培养箱中孵育消化1min，在倒置显微镜下观察，以大部分细胞的伪足收缩即细胞变圆、少部分细胞脱离培养皿底为消化适宜，然后立即在无菌超净台中加等量含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液终止消化，并用移液枪吹打成单细胞悬液。将细胞悬液移入到1.5mL的离心管中，1500r/min离心5min，吸弃上清液，再用1mL的基础培养液悬浮细胞；调整细胞悬液密度，在新的培养皿中先加入适量的含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，然后将适量的细胞悬液加入至新的培养皿中，用移液枪吹打均匀，放于37℃、5％CO2培养箱中培养，根据所需试验进行操作。
牦牛胎儿成纤维细胞冻存：以血清与DMEM高糖培养液为9:1的比例将细胞冻存于冻存管里，放置于梯度冻存盒中，-80℃冰箱保存24小时，长期保存于液氮罐中。
牦牛胎儿成纤维细胞复苏：将细胞从液氮罐取出后立即于37℃水浴锅解冻，吸入离心管中，1300r/min离心5min，弃去上清，加入DMEM高糖培养液悬浮细胞。转移至新的培养皿中，混匀，放于37℃、5％CO2培养箱中培养，根据所需试验进行操作。
3.CBX3干扰载体的构建
针对牦牛CBX3基因(XM_005903690.2)设计5条shRNA和一条阴性对照shRNA，使用shRNA质粒载体进行瞬时转染以确定具有最佳干扰效率的干扰序列。
编码shRNA的正义模板链(S)、反义模板链(A)的合成，退火以及克隆入pGPU6/GFP/Neo载体步骤均委托上海吉玛公司完成。
5条shRNA序列和阴性对照的序列信息如图2-7所示：
(1)CBX3-yak-500
靶序列：GCAGTGGAGAATTAATGTTCC；
正义模板链：5'-CACCGCAGTGGAGAATTAATGTTCCTTCAAGAGAGGAACATTAATTCTCCACTGCTTTTTTG-3'；
反义模板链：5'-GATCCAAAAAAGCAGTGGAGAATTAATGTTCCTCTCTTGAAGGAACATTAATTCTCCACTGC-3'；
转录产物：GCAGTGGAGAATTAATGTTCCTTCAAGAGAGGAACATTAATTCTCCACTGCTT；
(2)CBX3-yak-613：
靶序列：GAGAGACTAACTTGGCATTCT；
正义模板链：5'-CACCGAGAGACTAACTTGGCATTCTTTCAAGAGAAGAATGCCAAGTTAGTCTCTCTTTTTTG-3'；
反义模板链：5'-GATCCAAAAAAGAGAGACTAACTTGGCATTCTTCTCTTGAAAGAATGCCAAGTTAGTCTCTC-3'；
转录产物：GAGAGACTAACTTGGCATTCTTTCAAGAGAAGAATGCCAAGTTAGTCTCTCTT；
(3)CBX3-yak-463：
靶序列：GGTCTTGATCCAGAACGAATA，SEQ ID NO.1；
正义模板链：5'-CACCGGTCTTGATCCAGAACGAATATTCAAGAGATATTCGTTCTGGATCAAGACCTTTTTTG-3'，SEQ ID NO.2；
反义模板链：5'-GATCCAAAAAAGGTCTTGATCCAGAACGAATATCTCTTGAATATTCGTTCTGGATCAAGACC-3'，SEQ ID NO.3；
转录产物：GGTCTTGATCCAGAACGAATATTCAAGAGATATTCGTTCTGGATCAAGACCTT；
(4)CBX3-yak-433：
靶序列：GCTGCTGATAAACCGAGAGGT；
正义模板链：5'-CACCGCTGCTGATAAACCGAGAGGTTTCAAGAGAACCTCTCGGTTTATCAGCAGCTTTTTTG-3'；
反义模板链：5'-GATCCAAAAAAGCTGCTGATAAACCGAGAGGTTCTCTTGAAACCTCTCGGTTTATCAGCAGC-3'；
转录产物：GCTGCTGATAAACCGAGAGGTTTCAAGAGAACCTCTCGGTTTATCAGCAGCTT；
(5)CBX3-yak-570：
靶序列：GGCAAATATGAAGTGTCCTCA；
正义模板链：5'-CACCGGCAAATATGAAGTGTCCTCATTCAAGAGATGAGGACACTTCATATTTGCCTTTTTTG-3'；
反义模板链：5'-GATCCAAAAAAGGCAAATATGAAGTGTCCTCATCTCTTGAATGAGGACACTTCATATTTGCC-3'；
转录产物：GGCAAATATGAAGTGTCCTCATTCAAGAGATGAGGACACTTCATATTTGCCTT；
(6)阴性对照：
靶序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT；
正义模板链：5’-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3'；
反义模板链：5’-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAC-3'；
转录产物：TTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATT。
构建的干扰载体经测序均可找到正义模板链序列。
4.干扰载体转染牦牛胎儿成纤维细胞
分别设置空白对照(不转染任何干扰载体)、阴性对照(转染阴性对照干扰载体)作为五对干扰载体的对照。质粒转染前一天将状态良好的牦牛胎儿成纤维细胞平铺至90mm培养皿，细胞汇合至80％-90％时进行细胞电转。
电转步骤如下：收集长满至90％的对数期细胞，消化细胞，以Opti-MEM培养液重悬，离心，重复2次，电转液(KCl：120mM；CaCl2：0.15mM；K2HPO4：10mM；MgCl2：2.50mM；pH值为7.6)与Opti-MEM培养液以3:1比例混匀配制电击缓冲液，600μL重悬细胞。加入载体质粒混匀室温静置15min，转移至新的BTX电转杯中，调节电转仪电压为510V，脉冲2ms电击1次后4℃静置10min。
将细胞悬液转移到90mm培养皿中，于37℃、5％的CO2培养箱中继续培养。24h后qPCR检测目的基因mRNA表达水平，48h后Western blot检测目的蛋白表达水平，并利用载体的荧光标记检测转染效率。
qPCR检测方法如下：
(1)胎儿成纤维细胞RNA提取
1)胎儿成纤维细胞转移至无RNase离心管中，用提前预冷的PBS清洗1次；
2)根据RNA提取试剂盒的操作说明进行，每5～10×106个细胞加入1mLTrizol，然后用移液器反复吹打，使细胞和裂解液充分混匀，然后室温静置5min；
3)加入200μL CHCl3，涡旋15～30s，室温放置5min；
4)12000r/min，4℃离心15min，吸取水相，并转移至新的无RNase离心管中，加入等体积异丙醇，上下翻转混匀，室温放置10min，12000r/min，4℃离心10min，小心吸弃上清；
5)加现配的75％乙醇1mL，上下翻转，使白色沉淀充分洗涤，10000r/min，4℃离心5min；
6)小心弃去乙醇溶液，重复一次(5)操作；
7)小心弃去乙醇溶液，室温静置干燥数分钟，见白色沉淀呈半透明状后，吸取适量的无RNase水溶解RNA沉淀，并保存于-80℃冰箱备用；
8)测定RNA的浓度和纯度，使其OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间为宜。
(2)反转录
采用TaKaRa反转录试剂盒的说明进行反转录反应。20μL反转录反应体系如下：
Figure BDA0003427307430000071
以上试剂42℃、反应2min，然后添加
Figure BDA0003427307430000072
反转录反应条件如下：37℃ 15min，85℃ 5sec。
(3)qRT-PCR
上游引物：CTGCAATAAAAGATGGCCTCC；
下游引物：CTCCACTTTCCCGTTCACTAC；
使用TaKaRa公司的定量试剂盒，进行qRT-PCR反应，其中反应体系为20μL：
Figure BDA0003427307430000073
操作全过程需避光在冰上进行，反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，55℃30s，共40个循环。
Western blot检测方法如下：
(1)总蛋白提取
配制蛋白裂解液，混匀放置于冰上备用，试剂配制如下：
Figure BDA0003427307430000074
Figure BDA0003427307430000081
在收集的细胞中加入适量的裂解液，吹打混匀，于振荡器上振荡30s；-20℃冰箱中放置10min，室温下自然解冻；重复冻融操作三次后，12000r/min，4℃离心15min；用提前预冷的离心管收集上清液，然后采用BCA蛋白含量检测试剂盒检测细胞蛋白浓度；每100μL上述蛋白样品中加入25μL 5×SDS-PAGE loading buffer，置于沸水中煮10min，使蛋白变性，放于4℃冰箱保存备用。
(2)Western Blot
1)配制12％的SDS-PAGE分离胶：依次吸取3.3mL ddH2O、4.0mL 30％Acr-Bis、2.5mL 1.5M Tris-HC1(pH 8.8)、100μL 10％SDS、100μL过硫酸铵和4μL TEMED，立即快速充分混匀；取4.5～5.0mL分离胶小心加入至SDS-PAGE电泳玻板之间，并缓慢加入适量异丙醇，静置0.5～1h；待分离胶充分凝固后，弃去异丙醇，ddH2O清洗液面后备用。
2)配制5％浓缩胶：依次吸取ddH2O、30％Acr-Bis、1.0M Tris-HCl(pH6.8)、10％SDS、过硫酸铵和TEMED各3.4mL、0.83mL、0.63mL、50μL、50μL和5μL；立即快速充分混匀，取1.5～2.0mL浓缩胶小心加入分离胶液面上，并小心插入电泳梳，静置0.5～1h。
3)蛋白样品上样：吸取蛋白Marker和样品分别加入上样孔中，电泳槽中加入新配制的电泳液进行电泳。
4)凝胶电泳：80V电压电泳至Marker条带均匀分开时，可调至120V电压进行电泳，直到溴酚蓝至凝胶底部停止电泳。
5)转膜电泳：根据凝胶大小裁剪PVDF膜，剪其一角留作标记，放入甲醇中活化；以“三明治”结构放置，除去气泡后以恒定功率8W转膜，时间按目的蛋白大小1KDa≈1min计算。
6)封闭：用TBST液配制5％～10％脱脂奶粉，提前放置于摇床摇匀；将PVDF膜放置于奶粉中，室温摇床上封闭2～4h。
7)抗体孵育：TBST洗涤PVDF膜两次，将PVDF膜分别放于一抗中(CBX3稀释比为1:1000，GAPDH稀释比为1:2000)，4℃孵育过夜；TBST洗涤10min×3次，按1:5000比例配制抗兔和抗鼠二抗，孵育1h。
8)PVDF膜显色：现用现配ECL发光液，凝胶成像系统曝光拍照保存。
qRT-PCR和Western bloting结果表明，以GAPDH为内参，与空白对照(Control)和阴性对照(shNC)相比，CBX3-463载体干扰效率最高，可以显著的抑制CBX3 mRNA和蛋白的表达(图8、9)；转染效率荧光检测结果如图10所示。
5.阳性细胞克隆的筛选及验证
(1)阳性细胞克隆的筛选
将状态良好的牦牛胎儿成纤维细胞均匀平铺接种至12孔板中。第二天，吸弃培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同的浓度G418：400μg/mL、500μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1000μg/mL、1200μg/mL，继续培养。每隔3-5天更换一次加入G418的培养液。在筛选2-3周内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。最终确定本实验所用细胞的最适G418筛选浓度为800μg/mL。
选用筛选出的最佳干扰效率的shRNA序列，利用电穿孔转染技术将CBX3-463表达载体转入牦牛胎儿成纤维细胞中，外源质粒在转染入细胞后，有一定的几率整合到基因组，根据载体上的相应的筛选标记，利用G418抗性筛选阳性细胞克隆(G418筛选浓度为800μg/mL)，每隔3天更换一次加入G418的培养液，并观察细胞的生长和死亡情况。筛选2-3周，载体未整合的细胞大量死亡，根据细胞克隆的生长情况及克隆的大小进行单克隆细胞的挑取；同时阳性细胞克隆表达绿色荧光，在荧光显微镜下找到绿色荧光明显、长势良好的单克隆(图11)，用记号笔在皿底做标记，随后将单克隆移入24孔板、48孔板、6孔板，进行扩大培养。单克隆挑出后细胞培养液中继续加入G418维持筛选，G418浓度适当减小。单克隆经扩大培养后，可用于后续的其他实验。
(2)CBX3表达水平
实时荧光定量PCR检测所挑选的7个阳性克隆的CBX3表达水平，结果如图12所示，七个克隆中CBX3水平均已被显著干扰，且干扰效率都达到85％以上。
Western blot检测另外挑选的4个克隆中的CBX3蛋白表达水平，结果显示所挑选的几株阳性克隆中CBX3蛋白表达水平与对照组相比显著降低(图13)。
(3)H3K9me3表达水平
通过细胞免疫荧光检测阳性克隆与对照组H3K9me3表达水平，如图14所示，CBX3蛋白在牦牛胎儿成纤维细胞中主要定位于细胞核中。与对照组相比，CBX3干扰细胞株的组蛋白甲基化修饰H3K9me3表达水平显著降低。
(4)实时荧光定量PCR检测mRNA相关表达量
对上述所筛选的阳性克隆，实时荧光定量PCR检测SUV39H1、SUV39H2、NSD1、EZH2等组蛋白甲基化修饰相关基因的mRNA相对表达，引物信息见表1。
表1基因引物序列
Figure BDA0003427307430000091
Figure BDA0003427307430000101
结果表明(图15)干扰CBX3可显著降低SUV39H1、SUV39H2的mRNA表达水平，但对NSD1、EZH2的mRNA表达水平没有明显影响。
6.阳性克隆在提高牦牛克隆胚胎发育率中的应用
卵母细胞的收集和成熟培养：
牦牛卵巢采自青海省西宁市裕泰屠宰场，卵巢保存在16℃～25℃的含有青、链霉素生理盐溶液中，放置保温桶内并在4h内带回试验室。使用连接到10毫升注射器的12号针头从直径2～8mm的窦状卵泡中抽吸卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，并用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次。仅选择被至少3层卵丘细胞层包裹且具有均匀胞质的卵母细胞，并用卵母细胞成熟液清洗2次，然后移入提前预热平衡的卵母细胞成熟液中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养24-26h。
牦牛体细胞克隆胚的构建、激活与克隆胚胎培养：
将培养成熟的卵母细胞在含有0.1％透明质酸酶的无Ca2+、Mg2+的PBS液中消化1-2min，选择具有极体和均匀胞质的卵母细胞待用，使用内径为20μm的去核管，通过在含有7.5μg/mL细胞松弛素B、10ug/ml Hoechst 33342和10％FBS的PBS微滴中抽吸第一极体和少量周围细胞质，进行去核。
将筛选得到的低表达CBX3蛋白的牦牛胎儿成纤维细胞与去核的卵母细胞融合，融合过程使用一对铂电极连接到Zimmermann融合介质中的微操作器上，32V双电脉冲20μs。重建的SCNT胚胎在含有细胞松弛素B的mSOF溶液中保存2h，接着进行激活处理，在含2～5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4min，然后在含1～2mmol/L 6-DMAP的mSOF溶液中，于38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养4h。牦牛体细胞克隆胚胎在进行激活处理后，转移到G1.5培养液中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养4h，再用G1.5培养液清洗3次，继续在G1.5培养液中培养至36h。并且设置未进行CBX3干扰的对照。
如表2所示，低表达CBX3克隆组第7天的克隆囊胚发育率显著高于对照克隆组(P<0.05)。结果表明低表达CBX3可纠正牦牛克隆胚胎异常重编程，并显著提高牦牛克隆胚胎体外发育率。
表2低表达CBX3提高牦牛克隆胚胎体外发育率
Figure BDA0003427307430000111
注：括号内是胚胎发育率(平均值±标准误％)，其他数字是三次重复的卵母细胞或胚胎总数。卵裂率和囊胚率分别是统计发育第二天和第七天的胚胎发育率。同组内上标不同显示差异显著(P<0.05)。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体、细胞和方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
ggtcttgatc cagaacgaat a 21
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
caccggtctt gatccagaac gaatattcaa gagatattcg ttctggatca agaccttttt 60
tg 62
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
gatccaaaaa aggtcttgat ccagaacgaa tatctcttga atattcgttc tggatcaaga 60
cc 62

Claims (6)

1.一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体，其特征在于，
所述载体为shRNA的真核表达载体，所述shRNA靶向CBX3基因，靶序列如SEQ ID NO.1所示：GGTCTTGATCCAGAACGAATA。
2.根据权利要求1所述的一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体，其特征在于，
所述shRNA的正义模板链为：
5'-CACCGGTCTTGATCCAGAACGAATATTCAAGAGATATTCGTTCTGGATCAAGACCTTTTTTG-3'，SEQID NO.2；
所述shRNA的反义模板链为：
5'-GATCCAAAAAAGGTCTTGATCCAGAACGAATATCTCTTGAATATTCGTTCTGGATCAAGACC-3'，SEQID NO.3。
3.根据权利要求2所述的一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体，其特征在于，
所述载体的构建方法为：
合成编码shRNA的正义模板链与反义模板链，正义模板链与反义模板链退火合成DNA双链，将DNA双链转入pGPU6/GFP/Neo。
4.含有权利要求1-3任一项所述载体的牦牛体细胞。
5.根据权利要求4所述的牦牛体细胞，其特征在于，
所述牦牛体细胞为牦牛胎儿成纤维细胞。
6.一种提高牦牛克隆胚胎发育率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1-3任一项所述载体转染牦牛体细胞，获得阳性单克隆；
(2)利用阳性单克隆作为供体，进行核移植，构建克隆胚。
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