CN114958767B - 基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法。hNSC的构建，miR‑93基因突变pegRNA构建，miR‑302d基因突变pegRNA构建，基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的获得。本发明的hNSC制剂的生产，解决了人神经干细胞在医学应用中来源受伦理学影响、相对获取困难的问题，同时提升了Nurr1蛋白在hNSC中的表达功能且解决了hNSC移植后向多巴胺神经元分化效率低的问题，可以用于帕金森疾病及其他神经系统疾病的防治，并能为类似新型细胞的开发提供参考。

Description

基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法。
背景技术
神经干细胞在神经系统疾病治疗方面引起广泛关注，并在临床上取得一定疗效，但临床广泛应用及远期效果仍存在难以逾越的瓶颈。神经干细胞移植治疗目前主要分为异体移植和自体移植。异体移植的常见细胞来源为人类胚胎中脑组织及人类胚胎干细胞，对人类胚胎中脑组织移植研究证实，在胚胎纹状体来源的多巴胺神经元移植到帕金森患者的大脑后能持续存活和生长，在功能整合后可重新支配失神经的纹状体，且恢复纹状体多巴胺释放，明显缓解帕金森症状。鉴于胚胎中脑组织的获得量有限且难以标准化，这使它不可能成为大量移植的可靠来源。而人胚胎干细胞由于其增殖潜能，可提供大量的神经干细胞。此外hESCs能够在体外无限、未分化增殖，并保留分化为所有细胞类型的潜力。在帕金森大鼠模型中，胚胎干细胞移植到纹状体后分化为成熟的神经元，且移植物含有高达20％的多巴胺神经元，这与胚胎中脑组织移植相当。虽然利用人类胚胎干细胞作为细胞移植治疗得到认可，但人类胚胎科学研究的伦理问题限制了这一研究。此外，由于胚胎干细胞保留了分化为各种组织的能力，有在着床部位形成畸胎瘤的风险，且因其异体移植的免疫排斥反应而限制其应用。
因此，目前针对神经系统疾病，人诱导多功能干细胞(hiPSCs)及人神经干细胞(hNSC)为常用细胞移植来源。hiPSCs细胞在形态、基因表达谱和分化潜能上与人胚胎干细胞相似。当hiPSCs移植到6-羟多巴胺介导的帕金森大鼠模型中时，hiPSCs在脑内分化为多巴胺神经元，显著改善帕金森运动行为，且无肿瘤形成。但由于hiPSCs特异性分化能力较差，使其移植后畸胎瘤形成的风险增加。
神经干细胞与这些细胞(人胚胎干细胞、hiPSCs)相比具有的明显优势是具有定向分化能力，且神经干细胞易于体外培养。神经干细胞具有多种来源，其中hiPSC诱导分化成神经干细胞是最便捷的途径之一，而且避免很多伦理学限制。神经干细胞在特定条件下可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。由于这种特定的种系限制，肿瘤的形成风险极低，并且神经干细胞更容易被引导向神经元分化。但是移植的神经干细胞持续存活及定向诱导分化是亟待解决的关键问题。
虽然目前神经干细胞移植在帕金森等神经系统疾病治疗中引起较多关注，但一些研究表明，在成人大脑中移植的神经干细胞偏向于神经胶质细胞和少突胶质细胞分化，向神经元分化的能力很差，无法达到缓解疾病的目的。核受体相关因子(Nurr1)是甲状腺激素/维甲酸核受体超家族的转录因子。有研究发现，鼠来源Nurr1在胚胎10.5d即在中脑腹侧表达，并且持续表达于成年脑组织的中脑腹侧和黑质区。Nurr1被认为是中脑多巴胺神经元发育的重要因子。大量研究表明，Nurr1对多巴胺神经元发育、生存和功能维持起着重要的作用。因此，Nurr1基因过表达的神经干细胞更易向多巴胺神经元分化。但是在帕金森患者或神经干细胞移植后的神经组织中，Nurr1基因表达被抑制而影响多巴胺神经元的生成。其本质原因是miR-93和miR-302d靶向Nurr1 mRNA降低了该基因翻译成蛋白。miR-93在Cops6基因内含子区，miR-302d在基因Larp7内含子区，如果对miR-93和miR-302d进行基因组编辑突变(Primer Editing技术)，并不影响其所在基因Cops6和Larp7在细胞内的功能。
目前，针对帕金森等神经系统疾病在治疗过程中神经干细胞来源不足、伦理学障碍以及移植后神经干细胞向多巴胺神经元分化障碍等问题，至今仍未能有效解决。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法，制得的细胞制剂实现miR-93和miR-302d碱基突变，不再与Nurr1 mRNA互补结合，从而解除对Nurr1mRNA的干扰抑制，实现神经干细胞Nurr1蛋白表达增强，以此解决在帕金森等神经系统疾病治疗过程中，神经干细胞来源的伦理学障碍，以及神经干细胞脑部移植后，向多巴胺神经元分化效率低等问题。
本发明所述的基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)hNSC的构建
采用人成纤维细胞制备成纤维细胞源hiPSC，将hiPSC诱导生成hNSC；
(2)miR-93基因突变pegRNA构建
设计miR-93基因gRNA和miR-93基因突变模板及反转录引物序列，将miR-93基因gRNA、Scaffold序列和miR-93基因突变模板及反转录引物序列合成miR-93基因突变pegRNA；
(3)miR-302d基因突变pegRNA构建
设计miR-302d基因gRNA和miR-302d基因突变模板及反转录引物序列，将miR-302d基因gRNA、Scaffold序列和miR-302d基因突变模板及反转录引物序列合成miR-302d基因突变pegRNA；
(4)基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的获得
将PE2系统mRNA、miR-93基因突变pegRNA和miR-302d基因突变pegRNA混合，然后加入到hNSC中进行电转染，收集细胞，分选单克隆细胞，扩大培养，筛选，得到基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂。
步骤(1)中所述的hiPSC诱导生成hNSC是hiPSC在神经干细胞诱导培养基上诱导生成hNSC。
步骤(2)中所述的miR-93基因gRNA为SEQ ID NO.1所示的序列，Scaffold序列为SEQ ID NO.2所示的序列，miR-93基因突变模板及反转录引物序列为SEQ ID NO.3所示的序列。
步骤(2)中所述的miR-93基因突变pegRNA为SEQ ID NO.4所示的序列。
步骤(3)中所述的miR-302d基因gRNA为SEQ ID NO.5所示的序列，Scaffold序列为SEQ ID NO.2所示的序列，miR-302d基因突变模板及反转录引物序列为SEQ ID NO.6所示的序列。
步骤(3)中所述的miR-302d基因突变pegRNA为SEQ ID NO.7所示的序列。
步骤(4)中所述的PE2系统mRNA的制备方法是按照pCMV-PE2-P2A-GFP质粒的序列合成PE2系统mRNA。
步骤(4)中所述的电转染的时间为72-80h，优选为72h。
步骤(4)中所述的筛选为测序筛选。
本发明所述的基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法，包括如下具体步骤：
(1)人成纤维细胞培养
分离人眼袋皮肤成纤维细胞并培养、储存，得到人成纤维细胞；
(2)hNSC的构建
采用人成纤维细胞制备成纤维细胞源hiPSC，将hiPSC诱导生成hNSC；
(3)miR-93基因突变pegRNA构建
设计miR-93基因gRNA和miR-93基因突变模板及反转录引物序列，将miR-93基因gRNA、Scaffold序列和miR-93基因突变模板及反转录引物序列合成miR-93基因突变pegRNA，实现“AAAGTGC”序列突变为“CACATGA”，突变模板及反转录引物序列与gRNA靶模板的序列一致；
(4)miR-302d基因突变pegRNA构建
设计miR-302d基因gRNA和miR-302d基因突变模板及反转录引物序列，将miR-302d基因gRNA、Scaffold序列和miR-302d基因突变模板及反转录引物序列合成miR-302d基因突变pegRNA，实现“AGGCACTT”序列突变为“ACGCTCAT”，突变模板及反转录引物序列与gRNA靶模板的序列一致；
(5)基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的获得
人工合成pCMV-PE2-P2A-GFP(Addgene ID 132776)质粒中PE2系统mRNA，与miR-93基因突变pegRNA、miR-302d基因突变pegRNA混合，然后与hNSC混合，采用Lonza核转仪CM-130程序进行电转，72h后收集细胞，分选单克隆细胞，扩大培养，然后取样提取基因组进行测序筛选，即得miR-93和miR-302d基因突变型hNSC即基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂；
(6)细胞功能评判
通过CCK-8、流式细胞术、western blot和免疫荧光定位，从分子、细胞和动物三个水平分析miR-93和miR-302d基因突变型hNSC的功能。
步骤(3)中所述的miR-93基因突变pegRNA的设计是仅突变干扰Nurr1 mRNA的互补碱基，解除对Nurr1 mRNA的降解，而不影响该miR-93发挥其他功能及不增加其他可能的靶mRNA。
步骤(4)中所述的miR-302d基因突变pegRNA的设计是仅突变干扰Nurr1 mRNA的互补碱基，解除对Nurr1 mRNA的降解，而不影响该miR-302d发挥其他功能及不增加其他可能的靶mRNA。
本发明不直接过表达Nurr1基因，而是改变其mRNA的干扰microRNA，可以增强Nurr1蛋白水平，提高hNSC在脑组织中向多巴胺神经元转化的效率，而不给细胞带入其他遗传成分。
基于生物信息学，确定miR-93中“AAAGTGC”序列以及miR-302d中“AGGCACTT”序列与Nurr1 mRNA3’非翻译区序列互补配对，从而诱发Nurr1 mRNA降解。本发明将miR-93中“AAAGTGC”序列突变为“CACATGA”；将miR-302d中“AGGCACTT”序列突变为“ACGCTCAT”，并在NCBI blast检索两个突变后的互补序列在人类基因组中不存在，避免干扰其他基因的表达；然后基于David R.Liu《Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency，Nature Biotechnology，2022,40(3):402–410》进行设计gRNA(SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.5)、突变模板及反转录引物(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6)等序列，送云舟生物科技(广州)股份有限公司合成pegRNA(SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7)，Scaffold序列为SEQ ID NO.2。
本发明针对在神经系统疾病治疗过程中，hNSC来源受伦理学影响、hNSC移植机体后分化成多巴胺神经元效率低等问题，构建成纤维细胞源hiPSC和hNSC，并通过基因组编辑实现Nurr1增强表达，有效解决了当前hNSC使用所面临的困难。
本发明基于miR-93和miR-302d干扰Nurr1 mRNA翻译的特点，利用生物信息学技术分析其结构与特点，从而设计出Primer Editing基因组编辑方案，可以实现促进Nurr1表达和促进hNSC向多巴胺神经元分化，而又不妨碍miR-93和miR-302d可能存在的对其他基因mRNA的调控功能，也不会产生靶向细胞内其他mRNA的情况，解决了hNSC移植脑组织后的分化问题。
本发明构建人成纤维细胞源hiPSC，而后诱导成hNSC，并采用Primer Editing技术对miR-93和miR-302d进行基因组编辑突变，获得Nurr1增强表达并具有hNSC向多巴胺神经元分化优势的hNSC细胞制剂，可用于帕金森等神经系统疾病的治疗与预防。
本发明采用Primer Editing基因编辑技术，实现miR-93基因碱基“AAAGTGC”序列突变为“CACATGA”，仅解除miR-93对Nurr1 mRNA的干扰抑制，保留其对可能存在的其他基因的调控功能，同时还避免新序列对细胞内其他RNA的干扰。
本发明采用Primer Editing基因编辑技术，实现miR-302d基因碱基“AGGCACTT”序列突变为“ACGCTCAT”，仅解除miR-302d对Nurr1 mRNA的干扰抑制，保留其对可能存在的其他基因的调控功能，同时还避免新序列对细胞内其他RNA的干扰。
本发明采用Primer Editing基因编辑技术，实现gRNA序列与其互补链序列(突变模板及反转录引物)融合使用。
本发明基于hiPSC细胞以及定向诱导分化和Primer Editong基因组编辑技术，由人成纤维细胞生成hiPSC细胞，然后诱导分化成神经干细胞，而后通过基因组编辑解除miR-93和miR-302d对Nurr1 mRNA的干扰抑制，解决目前细胞使用遇到的难题。
本发明通过Primer Editing基因改造后的hNSC不同于通常的Nurr1过表达型hNSC，该类细胞无过表达载体或病毒成分在细胞内残留，可用于人体颅内直接回输或静脉等其他途径回输。
本发明的有益效果如下：
本发明首先通过成纤维细胞诱导成hiPSC，然后hiPSC再诱导成hNSC，而后使用Primer Editing基因编辑技术同时对miR-93和miR-302d两个基因同时碱基突变编辑，通过单克隆细胞PCR产物测序筛选获得miR-93和miR-302d突变型hNSC，并从分子、细胞和动物水平验证其功能。本发明的hNSC制剂的生产，解决了人神经干细胞在医学应用中来源受伦理学影响、相对获取困难的问题，同时提升了Nurr1蛋白在hNSC中的表达功能且解决了hNSC移植后向多巴胺神经元分化效率低的问题，可以用于帕金森疾病及其他神经系统疾病的防治，并能为类似新型细胞的开发提供参考。
附图说明
图1是miR-93和miR-302d突变型hNSC测序结果图。
图2是miR-93和miR-302d突变型hNSC增殖情况图。
图3是miR-93和miR-302d突变型hNSC细胞凋亡情况图。
图4是miR-93和miR-302d突变型hNSC蛋白Nurr1表达分析图。
图5是细胞移植后小鼠脑组织局部Nurr1荧光定位图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
(1)采用Matrigel铺板和人成纤维细胞培养
1)分离人眼袋皮肤成纤维细胞并培养、储存，得到人成纤维细胞；
2)在6孔板的两孔上涂上2ml的5mg/ml Matrigel基质，37℃孵育30分钟；
3)用1ml新鲜成纤维细胞培养基(高糖DMEM完全培养基：90％高糖DMEM+10％胎牛血清)重悬储存的人成纤维细胞，得到重悬细胞；
4)将重悬细胞以1×105个细胞/孔(10000个细胞/cm2)数量接种于Matrigel包被的6孔培养皿中；
5)37℃、5％CO2孵育24小时。
(2)成纤维细胞染毒
操作按照CytoTuneTM-iPS 2.0Sendai Reprogramming Kit(Thermo Scientific,A16518)试剂盒说明进行。6孔板中培养成纤维细胞至40-50％融合度。从-80℃冰箱取出CytoTuneTM 2.0Sendai aliquots，融化后轻柔离心，然后置于冰上。吸取CytoTuneTM2.0Sendai virus到1ml预热的成纤维细胞培养基中。吸出6孔板中细胞原培养基，添加含病毒和培养基混合物。盖好6孔板盖子，室温1200x g离心45min，然后加1ml预热培养基，37℃、5％CO2培养箱中培养。24h后吸出培养基，换上2ml新鲜培养基。继续培养2-3天，中间换培养基一次。
(3)更换培养基
第四天吸走500μl培养基，添加500μl mTeSR1培养基(STEMCELL Technologies,85850)，第五天替换1ml mTeSR1培养基；第六天替换1.5ml mTeSR1培养基；第七天替换全部2ml mTeSR1培养基。
每天更换2ml新mTeSR1培养基直至单克隆能够传代，大约13-20天。期间用刮刀刮去部分重编程和分化的细胞群落。完全重编程的细胞群落呈圆形，边界清晰，细胞形态相同，核与细胞质比例高，核仁突出。相比之下，部分重编程的细胞群落边界不明确，形状无定形，由不同类型的细胞组成。
(4)单克隆扩大培养
预先Matrigel铺板，吸走没有固定的Matrigel后，添加2ml mTeSR1+10μM ROCK抑制剂。使用22号针将细胞群落切割成网格状，100μl枪头挑碎细胞群落并转移至已经铺Matrigel的培养板上，37℃、5％CO2培养箱中继续培养6-7天。反复进行筛选和传代，大约传7代。后续可以0.5mM EDTA消化传代，即得hiPSC。
(5)hiPSC诱导成hNSC
待hiPSC在6孔板中培养融合度达到80％左右，除去hiPSC mTeSR1培养基(STEMCELL Technologies,85850)，添加2.5ml神经干细胞诱导培养基(Thermo FisherScientific,Gibco,A1647801)，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养；在2、4和6天分别更换2.5ml新神经干细胞诱导培养基，直到第7天，得到hNSC。
(6)hNSC扩繁
预先采用Geltrex铺板，然后采用Accutase消化hNSC细胞，消化后的hNSC细胞转移至Geltrex铺板的新培养板或培养瓶中，并添加预热的NEM培养基进行培养。
(7)miR-93基因突变pegRNA构建
设计将miR-93中“AAAGTGC”序列突变为“CACATGA”，然后在www.benchling.com网站设计突变点对应的最优gRNA序列和对应的突变模板及反转录引物序列，突变模板及反转录引物序列与gRNA靶向的DNA链互补，然后将序列按照5’-gRNA+scaffold+Template&primer-binding site(PBS)+AAAAAA-3’顺序融合排列pegRNA，送云舟生物科技(广州)股份有限公司合成miR-93基因突变pegRNA。
(8)miR-302d基因突变pegRNA构建
设计将miR-302d中“AGGCACTT”序列突变为“ACGCTCAT”，然后在www.benchling.com网站设计突变点对应的最优gRNA序列和对应的突变模板及反转录引物序列，突变模板及反转录引物序列与gRNA靶向的DNA链互补，然后将序列按照5’-gRNA+scaffold+Template&primer-binding site(PBS)+AAAAAA-3’顺序融合排列pegRNA，送云舟生物科技(广州)股份有限公司合成miR-302d基因突变pegRNA。
(9)PE2系统mRNA合成
按照pCMV-PE2-P2A-GFP(Addgene ID 132776)所提供序列送云舟生物科技(广州)股份有限公司合成Primer Editing 2系统mRNA，该系统包括nCas9酶和M-MLV反转录酶，mRNA包括5’-Cap-非翻译区序列-开放阅读框-非翻译区序列-AAAAA……AAA-3’，可以直接在细胞内进行翻译。
(10)PE2 mRNA+pegRNA共转染hNSC
采用电转方式实现PE2 mRNA+pegRNA共转染hNSC，根据Lonza SE Cell Line4D-Nucleofector X Kit说明，每个电击杯中加1μg PE2 mRNA，90pmol miR-93基因突变pegRNA和90pmol miR-302d基因突变pegRNA，以及15μL SF buffer，最终体积17μL，然后加入80μL含有2×105个hNSC细胞的预热培养基并用移液枪轻柔混匀，室温放置10min后采用CM-130程序电转，电转后取出电击杯中hNSC混合物，按照1:1000比例添加预热培养基稀释，然后将细胞悬液转移至10cm培养板上，静置15min后置于倒置显微镜下观察，确保稀释后hNSC在培养板上成单克隆细胞排布，接下来转移至CO2培养箱中培养，直至单克隆细胞生长成细胞群落。
(11)miR-93和miR-302d突变型hNSC细胞测序筛选
将步骤(9)中单克隆细胞生长成的细胞群落用100μL枪头挑碎并吸取、转移至6孔板，待细胞在6孔板中长至80％融合度，Accutase消化hNSC细胞，一部分传代培养，同时取1-2×106cell提取基因组，利用表1鉴定引物进行PCR，PCR产物回收后连接T载体，然后转化大肠杆菌感受态，挑取单克隆细胞进行sanger测序分析，结果如图1所示，选择与miR-93和miR-302d突变预期一致的hNSC。
表1 PCR鉴定引物
Figure BDA0003676562510000081
(12)细胞功能观察
以同批次野生型hNSC对照，采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞增殖情况，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。具体过程如下：
1)细胞增殖检测：按照(CK04-100T，上海研谨生物科技有限公司)试剂盒说明，在96孔板中配置100μL的细胞悬液(103个细胞)，将培养板在培养箱预培养12，24，48，60，72小时(37℃，5％CO2)，向每孔加入10μL CCK溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。结果如图2所示，野生型与miR-93和miR-302d突变型hNSC细胞增殖速度无显著差异。
2)细胞凋亡检测：细胞培养达到85％融合时，移除培养液，PBS清洗贴壁细胞3次，用0.25％的胰酶消化细胞，收集于15ml离心管内，1000rpm离心5min，弃上清收集细胞，PBS轻轻重悬后，加入195μL Annexin V-FITC结合液，吹打混匀，重悬细胞，加入5μL AnnexinV，轻轻混匀，避光室温孵育15min，加入10μL PI染色液，轻轻混匀，避光孵育10min，进行流式细胞仪检测。结果如图3所示，野生型与miR-93和miR-302d突变型hNSC细胞并无显著的凋亡差异。
(13)hNSC中Nurr1蛋白表达分析
①制冰、配置细胞裂解液(裂解液：蛋白酶抑制剂为1ml：10μl)并预冷。
②收集细胞加入配置裂解液(细胞：配置裂解液为0.2g：1.5ml)。
③蛋白含量定量并SDS-PAGE凝胶蛋白电泳
④转膜：将浓缩胶与分离胶分离，保留分离胶。剪下大约粗细为2-3cm的PVDF膜，长度与分离胶接近，放入甲醇中活化3-5min，根据目标蛋白分子量大小在Marker条带上找到对应大概位置，将PVDF膜放在相应位置。转模采用三明治方法，夹子由白到黑为海绵、滤纸、PVDF膜、分离胶、滤纸、海绵，将转膜的夹子夹紧放入转膜槽，放入冰盒，倒入4℃1×转模液，由负极向正极跑，打开电源，恒流200mA，转模2.5h。
⑤封闭：将转模后的PVDF膜放入含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液中，常温摇床1.5h。
⑥一抗孵育：配置含1％脱脂奶粉的TBST缓冲液，按一抗(Nurr1，ab241530；GAPDH，ab9485)说明书的稀释浓度加入一抗，4℃摇床孵育13h。
⑦洗膜：一抗孵育结束，用TBST洗膜，每次5-10min，5次。
⑧二抗孵育：洗膜结束后，配置含1％脱脂奶粉的TBST缓冲液，按二抗(ab205718)说明书的稀释浓度加入二抗，常温摇床孵育1h。
⑨洗膜：二抗孵育结束，用TBST洗膜，每次5-10min，5次。
⑩封膜和曝光：打开暗夹，平铺保鲜膜并固定，按1：1配置发光液(注意避光)，将PVDF膜平铺在保鲜膜上，滴发光液，等其反应5min左右，盖上保鲜膜并去除气泡。进入暗室，如果荧光明显，取出X光片4张，平铺到暗夹中，合上盖子3-5min，取出X光片放入显影液中显影5-10min，取出用清水清洗后再放入定影液中5-10min，取出再次清洗，晾干保存。如果荧光不明显，取出X光片4张，平铺到暗夹中，合上盖子4h，后面操作同上。
结果如图4所示，Nurr1蛋白表达水平无明显差异。
(14)建立帕金森病模型
取全部C57BL/6小鼠，随机选取10只设为正常组，其余35只小鼠建立帕金森病模型(腹腔注射MPTP 30mg/kg)，正常组腹腔注射等量生理盐水；1次/d，持续5d；建模结束后第14d测试小鼠旋转行为，将小鼠置于旋转检测仪5min适应环境，待其安静后耳后皮下注射阿扑吗啡0.5mg/kg，使其向对侧旋转，记录30min内旋转圈数，平均旋转圈数＞7圈/min，即为建模成功，成功30只，并随机分为帕金森病组、帕金森病+野生型细胞组、帕金森病+突变型细胞组，每组各10只。
(15)神经干细胞移植
1)于造模成功后三周进行细胞移植，将造模成功的帕金森病组、帕金森病+野生型细胞组、帕金森病+突变型细胞组分别给予的处理是：帕金森病组给予注射生理盐水3μl，帕金森病+野生型细胞组给予注射3μl含有约1×106个野生型神经干细胞生理盐水悬液，帕金森病+突变型细胞组给予注射3μl含有约1×106个突变型神经干细胞生理盐水悬液。
2)将造模成功的帕金森病小鼠麻醉后，固定于立体定向仪上，剪毛，消毒，剪开皮肤，双氧水处理骨膜，磨钻磨开颅骨。用的是23G注射器针头，使用100μl规格的微量注射器。于小鼠右侧纹状体注入3μl的细胞悬液，注射速度为0.5μl/min。注射位点为：前囟前0.5mm，右侧旁开1.5mm，领骨下3.5mm，注射结束后放置5min，缓慢退出注射器，缝合皮肤。25℃条件下，待小鼠复苏后正常饲养。并于移植后第2周转棒实验检测运动协调能力：小鼠置于静置的旋转棒5min适应环境，后设置滚筒转速为4r/min，后逐渐提速至40r/min，记录小鼠开始运动时间及掉落时间，计算其在滚筒上坚持运动时间，每次测试间隔2h，测试3次，取均值。结果如表2所示，帕金森病+突变型细胞组移植小鼠坚持运动时间显著高于帕金森病+野生型细胞组和帕金森病组，说明移植的miR-93和miR-302d突变型神经干细胞向多巴胺神经元分化能力强于野生型神经干细胞。
表2各组运动协调能力比较结果
Figure BDA0003676562510000101
(16)神经干细胞移植小鼠脑组织Nurr1表达分析
2周后麻醉处死小鼠，取帕金森病+野生型细胞组和帕金森病+突变型细胞组细胞注射脑部位组织，固定，制作冷冻切片，采用荧光定位观察组织中Nurr1变化(抗体：ab227260)。结果如图5显示，在小鼠细胞移植部位脑组织中，帕金森病+突变型细胞组神经元的Nurr1水平明显高于帕金森病+野生型细胞组，说明miR-93和miR-302d的突变，不能再干扰Nurr1的蛋白质表达，从而促进神经干细胞向多巴胺神经元分化。
综上所述，本发明的hNSC与同批次野生型细胞相比，生长速度、细胞凋亡率等无差异；动物实验显示，与野生型细胞相比，miR-93和miR-302d基因突变型hNSC细胞在小鼠脑组织加强Nurr1表达，缓解了帕金森病症状。
本发明基于hiPSC细胞构建具有多巴胺神经元分化优势的神经干细胞制剂，通过实现miR-93和miR-302d的基因组突变，可以增强Nurr1蛋白表达，增强在帕金森病小鼠脑部hiPSC源神经干细胞移植后，向多巴胺神经元转化，可以解决帕金森疾病及其他神经系统疾病在治疗过程中神经干细胞来源的伦理学问题、解决神经干细胞移植后向多巴胺神经元分化效率低的问题。
序列表
<110> 健颐生物科技发展（山东）有限公司
<120> 基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
ggaagtgcta gctcagcagt 20
<210> 2
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgc 76
<210> 3
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
ctgggggctc ccacatgatg ttcgtgcagg tagtgtgatt acccaaccta ctgctgagct 60
agcacttccc gagcccccgg aaaaaa 86
<210> 4
<211> 182
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
ggaagtgcta gctcagcagt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgcctgg gggctcccac atgatgttcg 120
tgcaggtagt gtgattaccc aacctactgc tgagctagca cttcccgagc ccccggaaaa 180
aa 182
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
tgtttgagtg tggtggttcc 20
<210> 6
<211> 85
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
cctctacttt aacatggagg cacttgctgt gacatgacaa aaataagtgc ttccatgttt 60
gagtgtggtg gttcctacca aaaaa 85
<210> 7
<211> 181
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 7
tgtttgagtg tggtggttcc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgccctc tactttaaca tggaggcact 120
tgctgtgaca tgacaaaaat aagtgcttcc atgtttgagt gtggtggttc ctaccaaaaa 180
a 181
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
agcccatggg tcgcctactc acaaaac 27
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 9
gagggtggtt ggggtctgtt tcac 24
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 10
gcaacagtaa tggcctgtag ccaag 25
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 11
aagactgggc tccccaccac tt 22

Claims (6)

1.一种基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）hNSC的构建
采用人成纤维细胞制备成纤维细胞源hiPSC，将hiPSC诱导生成hNSC；
（2）miR-93基因突变pegRNA构建
设计miR-93基因gRNA和miR-93基因突变模板及反转录引物序列，将miR-93基因gRNA、Scaffold序列和miR-93基因突变模板及反转录引物序列合成miR-93基因突变pegRNA；
（3）miR-302d基因突变pegRNA构建
设计miR-302d基因gRNA和miR-302d基因突变模板及反转录引物序列，将miR-302d基因gRNA、Scaffold序列和miR-302d基因突变模板及反转录引物序列合成miR-302d基因突变pegRNA；
（4）基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的获得
将PE2系统mRNA、miR-93基因突变pegRNA和miR-302d基因突变pegRNA混合，然后加入到hNSC中进行电转染，收集细胞，分选单克隆细胞，扩大培养，筛选，得到基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂；
步骤（2）中所述的miR-93基因gRNA为SEQ ID NO.1所示的序列，Scaffold序列为SEQ IDNO.2所示的序列，miR-93基因突变模板及反转录引物序列为SEQ ID NO.3所示的序列；
步骤（2）中所述的miR-93基因突变pegRNA为SEQ ID NO.4所示的序列；
步骤（3）中所述的miR-302d基因gRNA为SEQ ID NO.5所示的序列，Scaffold序列为SEQID NO.2所示的序列，miR-302d基因突变模板及反转录引物序列为SEQ ID NO.6所示的序列；
步骤（3）中所述的miR-302d基因突变pegRNA为SEQ ID NO.7所示的序列。
2.根据权利要求1所述的基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的hiPSC诱导生成hNSC是hiPSC在神经干细胞诱导培养基上诱导生成hNSC。
3.根据权利要求1所述的基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤（4）中所述的PE2系统mRNA的制备方法是按照pCMV-PE2-P2A-GFP质粒的序列合成PE2系统mRNA。
4.根据权利要求1所述的基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤（4）中所述的电转染的时间为72-80h。
5.根据权利要求4所述的基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤（4）中所述的电转染的时间为72h。
6.根据权利要求1所述的基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤（4）中所述的筛选为测序筛选。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1978655A (zh) * 2005-12-09 2007-06-13 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种定向诱导nsc分化为多巴胺能神经细胞的方法及应用
WO2021072328A1 (en) * 2019-10-10 2021-04-15 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing rna
WO2021243289A1 (en) * 2020-05-29 2021-12-02 The General Hospital Corporation Systems and methods for stable and heritable alteration by precision editing (shape)
CN113891936A (zh) * 2019-03-19 2022-01-04 布罗德研究所股份有限公司 编辑核苷酸序列的方法和组合物
WO2022067130A2 (en) * 2020-09-24 2022-03-31 The Broad Institute, Inc. Prime editing guide rnas, compositions thereof, and methods of using the same

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11459586B2 (en) * 2016-04-19 2022-10-04 President And Fellows Of Harvard College Methods for increasing efficiency of nuclease-mediated gene editing in stem cells

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1978655A (zh) * 2005-12-09 2007-06-13 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种定向诱导nsc分化为多巴胺能神经细胞的方法及应用
CN113891936A (zh) * 2019-03-19 2022-01-04 布罗德研究所股份有限公司 编辑核苷酸序列的方法和组合物
WO2021072328A1 (en) * 2019-10-10 2021-04-15 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing rna
WO2021243289A1 (en) * 2020-05-29 2021-12-02 The General Hospital Corporation Systems and methods for stable and heritable alteration by precision editing (shape)
WO2022067130A2 (en) * 2020-09-24 2022-03-31 The Broad Institute, Inc. Prime editing guide rnas, compositions thereof, and methods of using the same

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts;Jongpil Kim等;《Cell Stem Cell》;20111104;第9卷(第5期);第413-419页 *
Highly efficient generation of isogenic pluripotent stem cell models using prime editing;Hanqin Li等;《bioRxiv》;20220215;第1-49页 *
Long 3’UTR of Nurr1 mRNAs is targeted by miRNAs in mesencephalic dopamine neurons;Luis Alberto Pereira等;《PLOS ONE》;20171116;第12卷(第11期);第1-15页 *
Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease;Yong-Hee Rhee等;《The Journal of Clinical Investigation》;20110630;第121卷(第6期);第2326-2335页 *
细胞基因重编程在中枢神经损伤修复中的应用;孙秀等;《第二军医大学学报》;20160630;第37卷(第6期);第729-737页 *

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