CN114317410A

CN114317410A - 一种猴ips细胞系DT-M001建立及其应用

Info

Publication number: CN114317410A
Application number: CN202111682113.0A
Authority: CN
Inventors: 张雪峰; 赵树立; 聂运中; 窦德虎; 阮海文
Original assignee: Jiangsu Dingtai Pharmaceutical Research Group Co ltd
Current assignee: Jiangsu Dingtai Pharmaceutical Research Group Co ltd
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明公开了一种能快速有效的将猴体细胞诱导重编程为多能性干细胞(induced Pluripotent stem cell,iPS)的制备系统。利用该培养系统，可以在短期内高效快速的制备猴iPS细胞。该系统的特征是所用体细胞来自猴体细胞，在猴耳源成纤维细胞培养条件下，其生物性质与人iPS极为类似。本发明发现利用组蛋白脱乙酰酶抑制剂进行诱导，可以加快猴iPS的重编程，且表达较高水平的多能性因子。本发明能高效诱导猴iPS细胞，并推动iPS的临床应用研究。

Description

一种猴ips细胞系DT-M001建立及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及快速有效诱导性猴多能性干细胞的制备方法以及用于快速有效诱导性猴多能性干细胞的培养基。

背景技术

从植入前的胚胎中第一次提取出人类胚胎干细胞似乎产生了一个新的潜在的细胞来源。许多退行性疾病的植入疗法。在成人体内，胚胎干细胞可以保持和扩展在体外未分化的状态，保持多能性并具有向三个胚层细胞分化的能力。早在1981和1998年，猴和人的胚胎干细胞的建系成功，标志着再生医学的研究拉开了序幕。在未来的再生医学中，直接从患者体内产生多能干细胞是避免排斥反应的主要方法之一。最近证明4个多能因子足以将体细胞重新编程为胚胎样状态，被鉴定为诱导多能干细胞，迄今所获得的人IPS细胞与人胚胎干细胞在形态、增殖速率、基因表达谱、多能基因的表观遗传状态和多血统分化潜能等方面都有相似之处。通过对于胚胎干细胞自我更新和定向分化机制的研究，许多特异性的细胞类型(例如，神经细胞、心肌细胞等:)已经具备了成熟的分化方法的检测标准，这不仅有可能为患者提供未来治疗所需的匹配产品线，从而消除免疫抑制的需求，而且还可以为药物筛选产生具有疾病特征的多能干细胞。然而，胚胎干细胞真正从体外研究到进入临床应用还面临许多技术和伦理问题。

2007年，日本和美国的科学家报道了可将KLF4、OCT4、SOX2和C-MYC四种转录因子导入人的成纤维细胞，使其逆分化成具有胚胎干细胞特性的细胞，并将其命名为诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPS cells)。在这篇发表在《Cell》杂志上的文章中，研究者选取了与胚胎干细胞信号转导相关的24个基因作为候选基因，感染人成纤维细胞，并进行基因组整合，分别以细胞形态学特点、胚胎干细胞关键基因表达，及畸胎瘤的形成等方面特点作为iPS的鉴定指标。最终确定了Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc这四个转录因子，即可由正常体细胞转化成多能干细胞。这种基因诱导而产生的多能干细胞称iPS细胞。这种直接从已分化的细胞得到干细胞为胚胎干细胞领域甚至整个生命科学领域都带来了概念性的革新。我们可以病人的体细胞为来源得到病人特异的iPS细胞，这种iPS细胞又可以分化为具有功能的细胞、组织和器官，用于疾病治疗。这样的应用方式可以避免免疫相容性和伦理问题。自此，iPS细胞的诱导技术的出现也引起了人们对其生物医学应用的极大关注。

尽管iPS细胞的应用仍面临着两大问题：生物安全隐患和较低的诱导效率，近年来随着创新药物和新型医疗技术的发展，iPS细胞分化为免疫细胞(NK、T、巨噬细胞)、神经细胞、肝脏细胞、视网膜细胞等进行肿瘤、帕金森、重症肝衰竭、视网膜黄斑变性等疾病方面的治疗越来越成为一种可行性治疗手段。但由于缺乏遗传背景明确、实验方法稳定的实验动物(特别是猴)iPS的制备方法，iPS来源的细胞治疗技术的临床前安全性评价研究受到严重掣肘。因此，寻找能够提高猴iPS细胞制备方法和培养条件就成为非常重要的一环技术。

本发明针对现存技术中的问题，在猴iPS制备和培养方法上进行了广泛和深入的研究，最终完成本发明。

发明内容

为了提高猴iPS细胞的制备效率，本发明提供了一种诱导性猴多能干细胞的制备方法，该方法包括以下歩骤：

歩骤1，利用采用组织块贴壁培养法、胶原酶消化法、胶原酶与胰酶相结合的双酶培养法分离猴耳源成纤维细胞，将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；

歩骤2，使用添加了蛋白脱乙酰酶抑制剂的培养基培养歩骤1中导入了干细胞多能性因子的猴耳源成纤维细胞；以及饲养层细胞的制备和传代；

歩骤3，观察和鉴定诱导性猴多能干细胞克隆。

优选地，所述方法进一歩包括将报告基因导入体细胞以此通过报告基因来指示所述诱导性猴多能干细胞的产生及其产生效率。且更优选地，所述报告基因为Oct4-GFP或Nanog-GFP，且更优选为Oct4-GFP。

优选地，在歩骤1中，将所述干细胞多能性因子的cDNA以病毒感染方式导入猴耳源成纤维细胞。

优选地，在歩骤1中，所述干细胞多能性因子可选自Oct4、Sox2、Soxl、Klf4、Klf2、Klf5、Nanog,c-Myc、L-Myc、N-Myc、Lin28和Esrrb中。且更优选地，所述干细胞多能性因子可包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。且更优选地，所述干细胞多能性因子可包括Oct4、Sox2和Klf4。

优选地，在歩骤2中，所述蛋白脱乙酰酶抑制剂组蛋白脱乙酰酶抑制剂包括丙戊酸钠、丁酸钠和ALK4/5/7抑制剂等；

优选地，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂的工作浓度为0.1-40mM。更优选地，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂的工作浓度为0.5-20mM。且更优选地，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂的工作浓度为1-10mM。且更优选地，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂的工作浓度为5-10mM。且最优选地，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂的工作浓度为10mM。

更优选的，所述饲养层细胞准备方法。取怀孕12.5天的母鼠，分离小鼠胚胎，去除胚胎四肢、内脏和头部，将余下部分剪碎经胰酶消化成单个细胞后接种于培养后，经75Gyγ射线照射获得照射过的小鼠胚胎成纤维细胞；着用10ug/ml的丝裂霉素C处理2-3小时，即获得饲养层细胞，液氮冻存。实验前1天复苏，接种至孔板或培养皿中备用。iMEF传代前，为接种了iMEF细胞的培养皿更换cmiPS培养液，在培养箱中预热至37℃。机械传代法：克隆生长至可传代时，PBS洗一次，更换培养液，在体视显微镜下用10μl的枪头将克隆划为约含5～10个细胞的小团块，用吸管将细胞团块转移并接种于含iMEF的六孔板内，后置于37℃、5％CO2的培养箱中继续培养。于24h更换培养液，每天换液，6～8天传代一次；0.5mM EDTA或者胶原酶Ⅳ消化传代法：克隆生长至可传代时，吸去旧培养液，PBS洗两次，37℃下加入0.5mM EDTA或者胶原酶Ⅳ消化3～5min。镜下观察克隆中细胞变圆，边缘卷起时，吸走消化液，加入培养液终止消化，用1ml的移液器轻缓反复吹打至小团块状，使细胞充分脱壁。收集细胞悬液，1100rpm离心4min，调整细胞密度后接种于新的iMEF细胞的六孔板内，置于培养箱中继续培养。24h更换培养液，每天换液，6～8天传代一次。

歩骤2中使用的培养基可为为mES培养基和MX培养液，所述mES培养基为添加有15％胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇的DMEM,且所述MX培养基为添加有38％KO-DMEM、24％DMEM/F12、10％KOSR、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、1％青霉素/链霉素和3.9mg/Lβ-巯基乙醇、0.145g/L L-谷氨酰胺、0.5％B27、0.25g/L牛血清白蛋白、和8μg/L碱性成纤维生长因子配制而成。

优选地，所述歩骤2具体包括如下歩骤：

将歩骤1中制备的导入了四因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)或三因子(Oct4,Sox2、Klf4)的猴耳源成纤维细胞在第二天消化并接种到饲养层细胞中使用mES培养基培养，并在第三天使用添加了组蛋白脱乙酰酶抑制剂的mES培养基培养，在第五天换为添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂的MX培养基培养，在第五天换为MX培养基继续培养；以及

挑选具有良好干细胞形态或Oct4-GFP阳性的克隆进行传代。

"良好干细胞样形态"是指与猴干细胞形态相似的克隆。"Oct4-GFP阳性"是指转基因Oct4-GFP报告基因阳性的克隆。Oct4是干细胞特异性基因，其表达比较真实地表征猴耳源成纤维细胞已经重编程为干细胞。

歩骤3中，鉴定诱导多能性干细胞克隆包括内源Oct4表达检测，荧光定量PCR检测多能性标志物表达水平。

本发明的方法中，优选地，所述体细胞来自哺乳动物的体细胞。且更优选地，所述哺乳动物选自小鼠、大鼠、兔、猪、羊、牛、猴或人。

此外，本发明提供了一种用于制备诱导性多能干细胞的培养基，其进一歩包含组蛋白脱乙酰酶抑制剂。优选地，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂包括丙戊酸钠、丁酸钠和ALK4/5/7抑制剂等。

组蛋白脱乙酰酶抑制剂浓度超过40mM时，长期培养将导致细胞死亡；组蛋白脱乙酰酶抑制剂浓度低于0.1mM时，不能显著增加iPS细胞的诱导效率。

优选地，所述培养基为添加了组蛋白脱乙酰酶抑制剂的mES培养基和添加了组蛋白脱乙酰酶抑制剂的MX培养基。

本发明的组蛋白脱乙酰酶抑制剂和饲养层细胞能高效产生猴iPS细胞。流式细胞计数实验计算效率显示添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂和饲养层细胞的实验组比对照组提高约16倍(转导四因子实验)。在iPS诱导过程中添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂和饲养层细胞也可以加快重编程的过程，添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂和饲养层细胞的实验组在感染第5天即可检测到干细胞阳性的克隆，而对照组一般要到10天以后才能检测到干细胞克隆。本发明提供的高效诱导猴iPS细胞的方法对推动iPS的基础研究和临床应用有着重要的意义。

附图说明

图1显示了添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂的干细胞培养基和饲养层细胞提高四因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)诱导iPS效率并加快猴iPS诱导进程。代表性图片分别为感染后第5天和10天96孔板内一孔的的照片，红色箭头为猴IPS，蓝色箭头为饲养层细胞。

图2显示了流式细胞仪检测组蛋白脱乙酰酶抑制剂和饲养层细胞提高四因子诱导猴iPS效率。A为显示了感染后第12天细胞消化后经流式细胞仪分析的GFP阳性细胞百分比的图；B为添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂的干细胞培养基和饲养层细胞的实验组情况。

具体实施方式

定义和技术

除非另外指明，本发明的实验使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook,Fritsch和Maniatis,分子克隆实验指南，第三版(2002)；CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人编著(1987))；丛书MethodsinEnzymology(酶学方法)(AcademicPress,Inc.)；PCR2：APracticalApproach(PCR实验方法)(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编著，(1995))；Antibodies,ALaboratoryManualandAnimalCellCulture(抗体实验手册及动物细胞培养)(R.I.Freshney编著，(1987))；HandbookofStemCells(干细胞手册)，卷2(W.French等人编著)。

除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本文中使用的一些术语进行了下述定义。

本文所述的"诱导性多能干细胞"(iPS细胞)是通过重编程技术外源转入若干干细胞多能性因子在体外重编程而成。这样的细胞在胚胎干细胞(ES)培养条件下，与猴ES细胞在细胞形态、生长特性、特异性基因表达、DNA甲基化方式等方面非常相似，而且在畸胎瘤形成、嵌合体动物形成和生殖系传递等方面也与猴ES细胞非常相似。

本文所述的"诱导体细胞重编程的干细胞多能性因子的制备系统"，是利用干细胞多能性的关键因子，通过向猴耳源成纤维细胞导入这些关键因子可诱导猴耳源成纤维细胞重编程为干细胞。已有多篇文献报导了多个这样的可以诱导重编程的因子。优选地，所述的多能性因子包括选自Oct4、Sox2(或Soxl)、Klf4(或Klf2或Klf5)、Nanog,c-Myc(或L-Myc或N-Myc)、Lin28及Esrrb中的一个或多个。上述干细胞多能性因子可以根据需要来源于任何物种，优选为猴的干细胞多能性因子。

本文所述的"诱导重编程"(有时也仅被简化为"诱导")是指将体细胞去分化为多能性干细胞的过程。优选地，通过将维持干细胞多能性所需的多能性因子的cDNA导入体细胞可以诱导猴耳源成纤维细胞去分化为多能干细胞。其中，优选地，所述的多能性因子包括选自Oct4、Sox2(或Soxl)、Klf4(或Klf2或Klf5)、Nanog,c-Myc(或L-Myc或N-Myc)、Lin28及Esrrb中的一个或多个。

将所述干细胞多能性因子的cDNA导入体细胞的方法可采用多种方法，包括病毒感染、脂质体转染、电穿孔、粒子轰击、转座子介导的插入表达、穿膜蛋白、药物诱导等的各种将DNA转入细胞的方法。优选地，使用包含cDNA的病毒载体进行转染。所述病毒载体包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒等多种病毒载体。优选地，使用逆转录病毒载体(PMX载体)。

本文所述饲养层细胞准备方法。取怀孕12.5天的母鼠，分离小鼠胚胎，去除胚胎四肢、内脏和头部，将余下部分剪碎经胰酶消化成单个细胞后接种于培养后，经75Gyγ射线照射获得照射过的小鼠胚胎成纤维细胞(irradiated mouse embryonic fibroblasts，iMEF)；着用10ug/ml的丝裂霉素C处理2-3小时，即获得饲养层细胞，液氮冻存。实验前1天复苏，接种至孔板或培养皿中备用。

本文所述饲养层细胞传代法，为接种了iMEF细胞的培养皿更换cmiPS培养液，在培养箱中预热至37℃。机械传代法：克隆生长至可传代时，PBS洗一次，更换培养液，在体视显微镜下用10μl的枪头将克隆划为约含5～10个细胞的小团块，用吸管将细胞团块转移并接种于含iMEF的六孔板内，后置于37℃、5％CO2的培养箱中继续培养。于24h更换培养液，每天换液，6～8天传代一次；0.5mM EDTA或者胶原酶Ⅳ消化传代法：克隆生长至可传代时，吸去旧培养液，PBS洗两次，37℃下加入0.5mM EDTA或者胶原酶Ⅳ消化3～5min。镜下观察克隆中细胞变圆，边缘卷起时，吸走消化液，加入培养液终止消化，用1ml的移液器轻缓反复吹打至小团块状，使细胞充分脱壁。收集细胞悬液，1100rpm离心4min，调整细胞密度后接种于新的iMEF细胞的六孔板内，置于培养箱中继续培养。24h更换培养液，每天换液，6～8天传代一次。

本文所述培养基为mES培养基和MX培养液，所述mES培养基为添加有15％胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇的DMEM,且所述MX培养基为添加有38％KO-DMEM、24％DMEM/F12、10％KOSR、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、1％青霉素/链霉素和3.9mg/Lβ-巯基乙醇、0.145g/LL-谷氨酰胺、0.5％B27、0.25g/L牛血清白蛋白、和8μg/L碱性成纤维生长因子配制而成。

本发明所述的"报告基因"是指能够指示细胞已经转变到类似胚胎干细胞的阶段，包括利用转基因或同源重组手段加入一段荧光蛋白序列或针对抗生素的抗性基因序列，这段序列处于胚胎干细胞特异表达的一些基因的启动子控制下，故而可以在细胞到达类似胚胎干细胞状态时激活这段荧光蛋白或抗性基因的表达，从而使这个细胞具有某些可以被检测的特征。本实施例中使用的猴成纤维细胞为OG2(Oct4-GFP^+/-)细胞，分离自纯合OG2(Oct4-GFP^+/+)公猴与129母猴交配产生的胚胎。

本发明所述的检测细胞多能性的方法是本领域技术人员熟知的，包括流式细胞仪及荧光定量PCR分析干细胞特异基因表达等。

实施例

本发明中所用技术概述：

除了特别说明，本说明书中提及的各种物质均购自Invitrogen。

反转录病毒生产以及产生iPS细胞的实验过程如下：

从Addgene公司购置包含猴Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的cDNA的反转录病毒载体(pMXs)。使用FugeneHD(罗氏)按其产品说明书进行转染至PlatE细胞以产生病毒，48小时后收集病毒上清液并且过滤，补充1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(8mg/L)后感染猴成纤维细胞。添加病毒上清液的当天被定义为第0天。将病毒感染后的成纤维细胞培养在mES培养基中，在感染后8-10天(4因子感染实验)或20-24天(3因子感染实验)挑取iPS集落，这是基于Oct-GFP的表达和典型的干细胞形态来挑取的。

重编程效率的定量的实验过程如下：用于计算重编程效率的主要方法是计数Oct-GFP阳性克隆：1.利用流式细胞仪对四因子感染后8-10天或三因子感染后14-16天的iPS细胞测定Oct-GFP阳性的细胞比例；2.在原孔中直接用荧光显微镜计数Oct-GFP阳性克隆数。

iPS细胞的鉴定实验过程如下：

鉴定多能性基因的表达。实施例1:添加了组蛋白脱乙酰酶抑制剂的干细胞培养基能促进四因子诱导的iPS的形成a.将四因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)的病毒以等体积混合，感染到6孔板的一孔中共计18万个OG2猴成纤维细胞中，在37℃、5％C0₂的环境中培养在添加了10％胎牛血清的DMEM培养基中。以加入病毒当天为第0天，第2天将细胞消化并重悬于mES培养基中，并种在预先种满饲养层细胞(放射线处理的猴成纤维细胞：)的96孔板中，每孔5000个细胞，第3天开始使用添加了不同浓度组蛋白脱乙酰酶抑制剂(0.6mM,1.2mM,2.5mM,5mM,10mM,20mM和40mM)的mES培养基，第5天开始换为添加了不同浓度组蛋白脱乙酰酶抑制剂(0.6mM,1.2mM,2.5mM,5mM,10mM,20mM和40mM)的MX培养基，第8天开始再换为MX培养基培养。

b.使用如a所述的方法，从第5天开始，每天在倒置显微镜下观察并计数阳性克隆数，同时使用显微镜拍照。图1为第5天时96孔板中代表性的图片，可以看到10mM组蛋白脱乙酰酶抑制剂处理的孔相对于不处理的孔，有更多克隆。而到第10天，10mM组蛋白脱乙酰酶抑制剂处理的孔可以观察到20个左右克隆，其效率是对照组的5-6倍。在第12天消化细胞，利用流式细胞仪检测Oct-GFP阳性的细胞比例。显示在四因子诱导条件下，10mM组蛋白脱乙酰酶抑制剂及饲养层细胞处理可提高iPS诱导效率5-6倍。实施例2:添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂的干细胞培养基能促进三因子诱导的iPS的形成a.将三因子(Oct4、Sox2、Klf4)的病毒以等体积混合，感染到6孔板的一孔中共计18万个OG2猴成纤维细胞中，在37℃、5％C0₂的环境中培养在添加了10％胎牛血清的DMEM培养基中。以加入病毒当天为第0天，第2天将细胞消化并重悬于mES培养基中，并种在预先种满饲养层细胞(放射线处理的猴成纤维细胞：)的96孔板中，每孔5000个细胞，第3天开始使用添加了不同浓度组蛋白脱乙酰酶抑制剂(0.6mM,1.2mM,2.5mM,5mM,10mM,20mM和40mM)的mES培养基，第5天开始换为添加了不同浓度组蛋白脱乙酰酶抑制剂(0.6mM,1.2mM,2.5mM,5mM,10mM,20mM和40mM)的MX培养基，第8天开始再换为MX培养基培养。

b.使用如a所述的方法，从第5天开始，每天在倒置显微镜下观察并计数细胞克隆数，同时使用显微镜拍照。如图1所示，第5天时，与对照组相比，添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂均能够显著提高猴iPS效率。利用流式细胞仪检测Oct-GFP阳性的细胞比例。如图2所示，对照组的Oct-GFP阳性的细胞比例仅为2.25％。而添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂和饲养层细胞的实验组的Oct-GFP阳性细胞比例可达到32.9％，增加了近16倍。

实施例3:添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂和饲养层细胞得到的iPS细胞系具有多能性

a.如上所述，用4因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)或3因子(Oct4、Sox2、Klf4)感染猴成纤维细胞，在添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂的干细胞培养基和饲养层细胞进行培养，感染后12天根据克隆形态及荧光表达挑取具有代表意义的克隆团，经过传代后形成均匀的iPS细胞系。

b.对于挑选出来的iPS细胞系进行形态观察，并进行定量PCR检测干细胞特异基因的表达。

c.在提取RNA之前，利用差速贴壁法去除滋养层细胞，使用TrizolInvitrogen公司)试剂，按照制造商说明提取iPS细胞的总RNA。用PrimeScriptTM试剂盒(Takara公司)进行逆转录，并使用JumpStart^TM TaqReadyMix^TM试剂盒(Sigma公司)，Mx3000P荧光定量PCR仪(ABI公司)进行Real-TimePCR分析。所有上述PCR条件均使用常规PCR条件，按照制造商说明进行。其中鉴定iPS特异基因使用的引物列表如表1所示。

表1

内源-Oct4FTAGGTGAGCCGTCTTTCCAC

内源-Oct4RGCTTAGCCAGGTTCGAGGAT

内源-NanogFCTCAAGTCCTGAGGCTGACA

内源-NanogRTGAAACCTGTCCTTGAGTGC内源-Sox2FAGGGCTGGGAGAAAGAAGAG内源-Sox2RCCGCGATTGTTGTGATTAGT

RexlFGACGAAGCAAGAGAAGAG

RexlRCGATAAGACACCACAGTAC

利用本发明方法获得的猴iPS细胞系均能够较好地沉默外源的病毒基因，也说明细胞完成了重编程到干细胞的状态。

总之，本发明使用添加了组蛋白脱乙酰酶抑制剂的培养基和饲养层细胞能够高效产生猴iPS细胞。流式细胞计数实验计算效率显示，添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂和饲养层细胞的实验组比对照组提高约16倍(转导四因子实验)，且培养12天后，添加组蛋白酶脱乙酰化抑制剂和饲养层细胞组的克隆细胞表达较高的干细胞特异基因。本发明的高效诱导iPS细胞的方法对推动iPS的基础研究和临床应用有着重要的意义。

以上所示仅为本发明较佳的实施例而已，当然不能以此来限定本发明的权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims

1.一种诱导性猴多能干细胞的制备方法，该方法包括以下歩骤：利用采用组织块贴壁培养法、胶原酶消化法、胶原酶与胰酶相结合的双酶培养法分离恒河猴耳源成纤维细胞，将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；使用添加了组蛋白脱乙酰酶抑制剂的培养基培养歩骤1中导入了干细胞多能性因子的猴耳源成纤维细胞；观察和鉴定诱导性猴多能干细胞克隆。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，进一歩包括将报告基因导入猴耳源成纤维细胞，以此报告基因来指示所述诱导性猴多能干细胞的形成及其形成效率。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述报告基因为Oct4-GFP或Nanog-GFP,且优选为Oct4-GFP。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在歩骤1中，所述干细胞多能性因子选自Oct4、Sox2、Soxl、Klf4、Klf2、Klf5、Nanog,c-Myc、L-Myc、N-Myc、Lin28和Esrrb中。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，在歩骤1中，所述干细胞多能性因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，或者包括Oct4、Sox2和Klf4。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，在歩骤2中，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂包括丙戊酸钠、丁酸钠和ALK4/5/7抑制剂等。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，在歩骤2中，所述丁酸钠的工作浓度为0.1-0.25μM，丙戊酸钠选为5-10μM，ALK4/5/7抑制剂为5-10μM。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，在歩骤2中所述培养基为mES培养基和MX培养液，所述mES培养基为添加有15％胎牛血清、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇的DMEM,且所述MX培养基为添加有38％KO-DMEM、24％DMEM/F12、10％KOSR、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、1％青霉素/链霉素和3.9mg/Lβ-巯基乙醇、0.145g/L L-谷氨酰胺、0.5％B27、0.25g/L牛血清白蛋白、和8μg/L碱性成纤维生长因子配制而成。

9.根据权利要求1所述的方法，在步骤2中，所述饲养层细胞准备方法。取怀孕12.5天的母鼠，分离小鼠胚胎，去除胚胎四肢、内脏和头部，将余下部分剪碎经胰酶消化成单个细胞后接种于培养后，经75Gyγ射线照射获得照射过的小鼠胚胎成纤维细胞(irradiatedmouse embryonic fibroblasts，iMEF)；着用10ug/ml的丝裂霉素C处理2-3小时，即获得饲养层细胞，液氮冻存。实验前1天复苏，接种至孔板或培养皿中备用。

10.据权利要求1所述的方法，在步骤2中，iMEF传代前，为接种了iMEF细胞的培养皿更换cmiPS培养液，在培养箱中预热至37℃。

11.据权利要求1所述的方法，在步骤2中，机械传代法：克隆生长至可传代时，PBS洗一次，更换培养液，在体视显微镜下用10μl的枪头将克隆划为约含5～10个细胞的小团块，用吸管将细胞团块转移并接种于含iMEF的六孔板内，后置于37℃、5％CO2的培养箱中继续培养。于24h更换培养液，每天换液，6～8天传代一次；0.5mM EDTA或者胶原酶Ⅳ消化传代法：克隆生长至可传代时，吸去旧培养液，PBS洗两次，37℃下加入0.5mM EDTA或者胶原酶Ⅳ消化3～5min。镜下观察克隆中细胞变圆，边缘卷起时，吸走消化液，加入培养液终止消化，用1ml的移液器轻缓反复吹打至小团块状，使细胞充分脱壁。收集细胞悬液，1100rpm离心4min，调整细胞密度后接种于新的iMEF细胞的六孔板内，置于培养箱中继续培养。24h更换培养液，每天换液，6～8天传代一次。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述歩骤2进一歩包括：将歩骤1中制备的导入了Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四因子或Oct4、Sox2、Klf4三因子的猴成纤维细胞在第二天消化并接种到饲养层细胞中使用mES培养基培养，并在第三天使用添加了组蛋白脱乙酰酶抑制剂的mES培养基培养，在第六天换为添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂的MX培养基，在第五天换为MX培养基继续培养；以及挑选具有良好干细胞形态或Oct4-GFP阳性的克隆进行传代。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述体细胞来自猴耳源成纤维细胞。

14.一种用于制备猴诱导性多能干细胞的培养基，其进一歩包含组蛋白脱乙酰酶抑制剂。

15.根据权利要求6所述的培养基，其中，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂包括丙戊酸钠、丁酸钠和ALK4/5/7抑制剂等。

16.根据权利要求7所述的培养基，其中，所述蛋白脱乙酰酶抑制剂的工作浓度为0.1-40mM，且优选为0.5-20mM，更优选为5-10mM，最优选为10mM。

17.根据权利要求8所述的培养基，其中，所述培养基为添加了组蛋白脱乙酰酶抑制剂的mES培养基和添加了蛋白脱乙酰酶抑制剂的MX培养基。