CN101684457A - I型转化生长因子受体抑制剂在产生诱导多能干细胞中的应用及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了I型转化生长因子受体(ALK5)抑制剂在产生诱导多能干细胞(iPS)中的应用及其方法。本发明提出了将含I型转化生长因子受体抑制剂的培养基应用于产生诱导多能干细胞中。将多能性干细胞因子的cDNA导入小鼠胚胎成纤维细胞；使用添加ALK5抑制剂的培养基培养步骤(1)处理的小鼠胚胎成纤维细胞；鉴定诱导多能性干细胞克隆。本发明的I型转化生长因子受体(ALK5)抑制剂能高效产生诱导多能干细胞(iPS)；本发明提供的高效诱导iPS细胞的方法对推动iPS的医学应用，建立疾病模型，移植治疗以及发展安全的iPS技术有重要意义。

Description

I型转化生长因子受体抑制剂在产生诱导多能干细胞中的应用及其方法

技术领域

本发明涉及诱导多能干细胞的培养方法，具体涉及I型转化生长因子受体抑制剂在产生诱导多能干细胞中的应用及其方法。

背景技术

hES细胞(human embryonic stem cells)研究的应用前景主要是移植治疗，在组织工程学领域中以hES细胞作为种子细胞，可为临床上细胞、组织或器官的移植治疗提供大量的材料。通过控制hES细胞分化培养环境、转染能够促进ES细胞定向分化的关键分子基因等体外诱导分化策略，可获得特异性的组织细胞类型。这类细胞用于移植治疗，将给糖尿病、帕金森氏病、脊髓损伤、白血病、心肌损伤、肾衰竭、肝硬化等疾病的治疗带来新的希望。

2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组采用体外基因转染技术，从24个因子中筛选出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个转录因子，通过逆转录病毒将上述4个转录因子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，在小鼠ES细胞的培养条件下获得了Fbx15+的多潜能干细胞系，该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠ES细胞，故将其命名为诱导多能性干细胞(iPS细胞)(Takahashi K，Yamanaka S.Inductionof pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures bydefined factors.Cell 2006；126：663-676.)(Takahashi K，Yamanaka S.用确定因子从小鼠胚胎和成体成纤维细胞中诱导多能干细胞.细胞2006；126：663-676.)。

2007年7月，Yamanaka研究小组进一步发现，通过使用Nanog代替Fbx15进行筛选，得到了Nanog+的iPS细胞系不仅在细胞形态、生长特性、标志物表达、移植到小鼠皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠ES细胞几乎完全相似。此外，研究还发现重新激活原癌基因c-Myc是嵌合体动物出现肿瘤形成的原因；而转染的上述4个基因在iPS细胞中并没有表达，表明这些基因只在诱导过程中起作用，iPS细胞保持多潜能性状态的原因是内源性转录因子，如Nanog等基因的表达(Okita K，Ichisaka T，etal..Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.Nature 2007；448：313-317.)(Okita K，Ichisaka T，等人.产生具有生殖能力的诱导多能干细胞.自然2007；448：313-317.)。同时独立发表的另一篇来自美国科学家的研究论文同样证实了上述4个转录因子足以使小鼠成纤维细胞在体外诱导重构成为类似小鼠ES细胞的iPS细胞(Wernig M et al..In vitro reprogramming of fibroblasts intoa pluripotent ES cell-like state.Nature 2007；448：318-324.)(Wernig M等人.在体外培养的成纤维细胞重新诱导成为一个多能胚胎干细胞样状态.自然2007；448：318-324.)。

Park IH等人(Park IH，et al..Reprogramming of human somatic cells topluripotency with defined factors.Nature 2008；451：141-146.)(Park IH，等人.以界定因子将人体细胞重编程成多能干细胞.自然2008；451：141-146.)利用来自胎儿、新生儿及成人的皮肤或肺部的原代成纤维细胞，其中包括来自1名健康男性皮肤活检得到的成纤维细胞，采用Yamanaka研究小组的策略也获得了相同的结果。他们还发现Oct4和Sox2在诱导重构为iPS细胞过程中是必需的，正是这两个转录因子维持了人类iPS细胞的多潜能性，而Klf4和c-Myc的作用是改变染色质的结构，从而有利于Oct4和Sox2的结合，以提高诱导的效率。

鉴于导入c-Myc基因可使嵌合体小鼠的肿瘤发生率高达20％，可能会阻碍其未来的临床应用。因此，Yamanaka研究小组新近报道，小鼠和人类皮肤成纤维细胞转染c-Myc以外的其余3个基因，在调整培养条件后也可得到iPS细胞。去除c-Myc基因尽管可使未来临床应用的安全性显著提高，但形成iPS细胞的效率却明显降低。(Nakagawa M，et al..Generation of induced pluripotent stem cellswithout Myc from mouse and human fibroblasts.Nat.Biotechnol.2008；26：101-106.)(Nakagawa M，等人.没有Myc蛋白条件下从小鼠和人成纤维细胞生成诱导多能性干细胞.自然生物工程学2008；26：101-106.)。

针对这一风险，科学家一直在努力寻找一种可以表达外源基因但外源基因非整合到基因组上的方法。2009年3月5日，Cell报道Rudolf Jaenisch研究小组利用Cre-重组酶系统使诱导成功的帕金森病人iPS细胞无外源因子，使iPS的临床应用又推进了一步，但是这种方法的缺点是仍有载体存留在基因组中(FrankSoldne，et al..Parkinson′s Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem CellsFree of Viral Reprogramming Factors.Cell 2009；136：964-977.)(Frank Soldne，等人.无病毒性重编程因子的帕金森氏病病人源性诱导多能性干细胞.细胞2009；136：964-977.)。随后这一缺陷被另一组科学家克服。2009年3月26日，Science报导了俞君英等通过一种非整合质粒Episomal Vector成功诱导出无外源基因也无载体整合到基因组上的iPS(Yu J，et al..Human Induced Pluripotent Stem CellsFree of Vector and Transgene Sequences.Science 2009；324：797-801.)(Yu J，等人.无载体和转基因序列的人类诱导多能干细胞.科学2009；324：797-801.)。他们用一种叫做核转染的方法将这些质粒介入到人包皮细胞中，在质粒中的基因所表达的蛋白质会将细胞重新编程并使其成为iPS细胞。这些iPS细胞在接着的几轮细胞分裂中会开始失去这些质粒，这样研究人员就可以分离出不含质粒的细胞。这一发现非常重要，它是人们向iPS细胞的临床应用迈出了关键性的一步。这一方法虽然临床应用的安全性大大提高，但是重编程过程中培养条件有待优化。

但到目前为止，iPS的形成效率一般都在0.01％到1％之间。可想而知，在导入四个外源基因之后，只有很少数的一部分细胞能最终完成重编程。因此，如何提高诱导全能干细胞的效率，并在此基础上对iPS的机理进行初步阐明，成为iPS研究的重点关键问题。

发明内容

为了克服上述诱导iPS效率极低的问题，本发明提供了I型转化生长因子受体(ALK5)抑制剂在产生诱导多能干细胞(iPS)中的应用及其方法。

为实现该目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明首先提供了I型转化生长因子受体抑制剂在产生诱导多能干细胞中的应用。特别是将含I型转化生长因子受体抑制剂的培养基应用于产生诱导多能干细胞中。

本发明还具体提供了I型转化生长因子受体抑制剂产生诱导多能干细胞的方法，包括如下步骤：

(1)将多能性干细胞因子的cDNA导入小鼠胚胎成纤维细胞；

(2)使用添加ALK5抑制剂的培养基培养步骤(1)处理的小鼠胚胎成纤维细胞；

(3)鉴定诱导多能性干细胞克隆。

优选的，所述步骤(1)中的多能性干细胞因子为Sox2、Klf4和Oct4或Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc；前者称之为三因子，后者称之为四因子。

优选的，所述步骤(1)中将多能性干细胞因子的cDNA导入小鼠胚胎成纤维细胞采用病毒感染的方式。

优选的，所述采用病毒感染的方式为将逆转录病毒载体在plat-E细胞中包装出来的病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞。

优选的，所述步骤(2)中的ALK5抑制剂包括A-83-01(可从TocrisBioscience公司购买)、LY-364947(可从Calbiochem公司购买)、SB-431542(可从Sigma公司购买)、SD-208(可从Tocris Bioscience公司购买)和SB-525334(可从Tocris Bioscience公司购买)。

优选的，所述步骤(2)中的ALK5抑制剂为A-83-01，LY-364947和SB-431542。

优选的，所述A-83-01的工作浓度为0.5μM；所述LY-364947的工作浓度为0.8μM；所述SB-431542的工作浓度为2μM。

所述步骤(2)中的培养基为在DMEM(Dulbcco′s Modifed Eagle′s Medium)中添加15％胎牛血清，1000U/ml白血病抑制因子(LIF)，青霉素/链霉素，L-谷氨酰胺和非必需氨基酸。DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基。非必需氨基酸是可在动物体内合成，作为营养源不需要从外部补充的氨基酸。一般在植物、微生物必需的氨基酸均由自身合成，这些都不称为非必需氨基酸。对人来说非必需氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸(及其胺)、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸、胱氨酸。这些氨基酸由碳水化合物的代谢物或由必需氨基酸合成碳链，进一步由氨基转移反应引入氨基生成氨基酸。

优选的，所述步骤(2)还包括如下步骤：

(2a)往小鼠胚胎成纤维细胞转导四因子或三因子，使用添加有ALK5抑制剂的培养基培养，在第六天(四因子)或第九天(三因子)将细胞消化并接种到饲养层细胞中，并继续使用添加有ALK5抑制剂的培养基培养；其中，四因子代表Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，三因子代表Oct4、Sox2、Klf4；

(2b)挑取具有良好干细胞样形态或Oct3/4-GFP阳性的克隆进行传代。

从感染后第二天开始培养步骤(1)处理的小鼠胚胎成纤维细胞；挑取具有良好干细胞样形态或Oct3/4-GFP阳性的克隆进行传代时仍然使用添加ALK5抑制剂的培养基；

“良好干细胞样形态”是指与小鼠干细胞(mES)形态相似的克隆。

“Oct3/4-GFP阳性”是指转基因Oct3/4阳性的克隆。Oct3/4是mES特异性基因，它的表达比较真实地表征小鼠胚胎成纤维细胞已经重编程为干细胞。

在上述方法中，还可以通过报告基因发挥指示作用，具体来说，在上述方法中导入多能性干细胞因子的cDNA的同时，将报告基因导入小鼠胚胎成纤维细胞，在挑取克隆进行传代前通过报告基因(比如Oct3/4-GFP等)来指示所述多能性干细胞的产生以及检测其产生效率。

步骤(3)中鉴定多能性干细胞克隆包括AP染色，内源Oct3/4表达检测，荧光定量PCR检测多能性标志物表达水平，关键全能性基因启动子区域甲基化水平分析，畸胎瘤的形成，嵌合体的形成。

本发明的I型转化生长因子受体(ALK5)抑制剂能高效产生诱导多能干细胞(iPS)，实验证明，在小鼠胚胎干细胞培养基的基础上添加I型转化生长因子受体(ALK5)抑制剂可以高效诱导为iPS细胞。碱性磷酸酶染色计算效率显示添加ALK5抑制剂的实验组约比对照组提高53％(转导四因子实验)和80％(转导三因子实验)。在四因子诱导iPS过程中添加ALK5抑制剂所挑取的克隆能够更多转化成更均质的Oct3/4-GFP阳性的克隆细胞系。以更为严格的Oct3/4-GFP阳性克隆数计算诱导效率的结果显示，在转导三因子的实验中，添加ALK5抑制剂的实验组的Oct3/4-GFP阳性克隆数约比对照组提高14.3倍。本发明发现的高效诱导iPS细胞的方法对推动iPS的医学应用，建立疾病模型，移植治疗以及发展安全的iPS技术有重要意义。

附图说明

图1是添加ALK5抑制剂的干细胞培养基促进SKOM iPS形成的优选实施例的实验结果图；

图2是添加ALK5抑制剂干细胞培养基促进SKO iPS形成的优选实施例的实验结果图；

图3是添加ALK5抑制剂得到的诱导多能性干细胞(iPS)细胞系的多能性鉴定的优选实施例的实验结果图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

定义和技术

除非另外指明，本发明的实验将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook，Frtsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)；CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY(当代分子生物学操作手册)(F.M.Ausubel等人编著(1987))；丛书METHODS IN ENZYMOLOGY(酶学方法)(Academic Press，Inc.)：PCR 2：A PRACTICAL APPROACH(实验方法)(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编著，(1995))，Harlow和Lane编著，(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE(抗体，实验室手册以及动物细胞培养)(R.I.Freshney编著，(1987))；W.French

等人，HANDBOOK OF STEM CELLS(干细胞手册)，卷2。

除非另外说明，本发明中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本文中使用的一些术语进行了下述定义。

在说明书和权利要求书中使用的单数型“一个”和“这个”包括复数参考，除非上下文另有清楚的表述。例如，术语“(一个)细胞”包括复数的细胞，包括其混合物。

所有的数字标识，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值。要了解，虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。也要了解，虽然不总是明确的叙述，本文中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本领域已知的。

本发明所述的“诱导的多能性干细胞(iPS细胞)”是这样的细胞，其来源是体细胞通过诱导体细胞重编程的干细胞多能性因子体外诱导变化而成，其在ES细胞培养条件下，与ES细胞在细胞形态、生长特性、表面标志物表达、移植到皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠ES细胞几乎完全相似。

本发明所述的“诱导体细胞重编程的干细胞多能性因子”为对于干细胞多能性维持起关键作用的因子，通过向体细胞中导入所述因子可以在一定条件下诱导体细胞重编程为胚胎干细胞。迄今为止众多文献已经报道了多个可以用于重编程的这样的因子，参见例如Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D.Direct generationof ES-like cells from unmodified mouse embryonic fibroblasts byOct4/Sox2/Myc/Klf4.Cell research 2007；17：959-962.(Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.&Pei，D.用Oct4/Sox2/Myc/Klf4从无修饰小鼠胚胎成纤维细胞直接产生干细胞样细胞.细胞研究2007；17：959-962.)Okita，K.，Ichisaka，T.& Yamanaka，S.Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.Nature 2007；448：313-317(Okita K，Ichisaka T，等人.新一代的生殖能力的诱导多能干细胞.自然2007；448：313-317.)；Wernig，M.et al.In vitro reprogramming of fibroblasts into apluripotent ES-cell-like state.Nature 2007；448：318-324.(Wernig M等人.在体外培养的成纤维细胞重新诱导成为一个多能胚胎干细胞样状态.自然2007；448：318-324.)；Yamanaka，S.Strategies and new developments in the generation ofpatient-specific pluripotent stem cells.Cell Stem Cell 2007；1：39-49.(Yamanaka，S.产生病人特异性多能干细胞的策略和新发展.细胞干细胞2007；1：39-49.)；等等。本领域技术人员已知多种可以用于这样的干细胞多能性因子。优选地，所述的多能性因子包括Oct4、Sox2(任选地，Sox1)、C-myc(任选地L-Myc或N-Myc)，以及Klf4(任选地，Klf5或Klf2)、Esrrb、Nanog、以及Lin28。上述多能性因子可以根据所要导入的细胞而是任何来源的，优选为小鼠的多能性因子以及其变体，如Sox2，NCBI登录号为NM_011443.3(小鼠包含SRY-框的基因2)；Oct4，NCBI登录号为NM_013633.2(小鼠POU结构域，5类，转录因子1(Pou5f1))；Klf4，NCBI登录号为NM_010637.2(小鼠Kruppel-样因子4))；c-Myc，NCBI登录号为NM_010849.4(小鼠髓细胞瘤病癌基因(myelocytomatosisoncogene)(c-Myc))；Sox1，NCBI登录号为NM_009233.3，(小鼠包含基因1的SRY-框)；Klf2，NCBI登录号为NM_008452.2，(小鼠Kruppel-样因子2(肺))；Klf5，NCBI登录号为NM_009769.4，(小鼠Kruppel-样因子5)；Nanog，NCBI登录号为NM_028016；或者Lin28，NCBI登录号为NM_145833。C-Myc还可以被换为其突变体L-myc(登录号为NM_008506.2，小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒爱基因同源物1v，肺癌来源的(禽类)((Mycl1)))；或者N-Myc(登录号为NM_008709.3，小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒相关癌基因，神经母细胞瘤衍生的(禽类)(Mycn)。

本发明所述的术语“诱导重编程”(有时也仅被简化为“诱导”)是指将体细胞去分化为多能性干细胞的过程。优选地，通过将维持干细胞多能性所需的多能性因子cDNA导入体细胞可以诱导体细胞去分化成为多能性干细胞(Takahashi K，Yamanaka S.Cell.2006；126：663-676.；Wernig M，Meissner A，Foreman R，等人，Nature.2007；448：318-324.；Yu J，Vodyanik MA，Smuga-Otto K等人Science.2007；318：1917-1920.)。其中，优选地，所述的多能性因子包括Oct4、Sox2(任选地，Sox1)、C-myc(任选地L-Myc或N-Myc)、Klf4(任选地，Klf5或Klf2)、Nanog、以及Lin28中的一个或多个。

将所述干细胞多能性因子cDNA导入体细胞的方法可以是本领域技术人员熟知的多种技术，包括病毒感染、脂质体转染、转座子介导的插入表达、穿膜蛋白、药物诱导、电穿孔、粒子轰击等各种将DNA转入细胞的方法。优选地，使用包含cDNA的病毒载体进行转染，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体等多种病毒载体。优选地逆转录病毒载体(例如pMX载体)，如实施例中所述的。

本发明所述的I型转化生长因子受体(ALK5)抑制剂是指能够强烈地并且特异性地抑制ALK 5酪氨酶激酶活性的小分子化合物，包括A-83-01，LY-364947，SB-431542，SD-208，SB-525334等。优选地，使用A-83-01，LY-364947，SB-431542。本发明所述的ALK5抑制剂工作浓度为：A-83-01：0.5μM；LY-364947：0.8μM；SB-431542：2μM。

本发明所述的培养基是指DMEM添加15％胎牛血清，1000U/ml白血病抑制因子(LIF)，青霉素/链霉素，L-谷氨酰胺和非必须氨基酸。

本发明所述的报告基因是指能够指示细胞通过外加诱导已经转变为类似胚胎干细胞的阶段，包括利用转基因或同源重组手段加入一段表达荧光蛋白或者抗性的序列，这段序列处在胚胎干细胞特异表达的一些基因的启动子的控制下，故而可以在细胞到达胚胎干细胞状态时激活这段荧光蛋白或抗性基因的表达，从而使这个细胞具有某些可以被检测的性状特征(如发出绿光)而区别于其他未重编程至该状态的细胞。本领域技术常用的报告基因包括绿色荧光蛋白，抗性基因例如氨苄青霉素抗性基因等。本领域的技术人员可以根据细胞的培养条件和用途选择适合于各种实施方案的报告基因。参考例如Young II Yeom et al..Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonalcells.Development 1996；122：881-894.(Young II Yeom，等人.Oct4是全能性周期的胚胎细胞的特异性生殖调控元件.发育1996；122：881-894.)；Shin-yaHatano et al..Pluripotential competence of cells associated with Nanog activation.Mechanisms of Development 2005；122：67-79.(Shin-ya Hatano，等人.多潜能细胞的能力与Nanog的活动.发育机理2005；122：67-79.)。本实施例中所使用的小鼠胚胎成纤维细胞为OG2(Oct3/4-GFP^+/-)细胞，分离自纯合OG2(Oct3/4-GFP+/+)雄鼠(从Jackson实验室获得)与129母鼠交配产生的13.5天胚胎。Oct3/4是mES特异性基因，它的表达比较真实地表征小鼠胚胎成纤维细胞已经重编程为干细胞。

本发明所述的检测细胞多能性的方法是本领域技术人员熟知的，参见例如Yamanaka，S.Strategies and new developments in the generation of patient-specificpluripotent stem cells.Cell Stem Cell 2007；1：39-49.(Yamanaka，S.产生病人特异性多能干细胞的策略和新发展.细胞干细胞2007；1：39-49.)等。所述方法包括鉴定多能性分子标记的表达、细胞的甲基化状态检测、胚胎小体EB的形成、畸胎瘤的形成以及施用经诱导的多能性干细胞形成嵌合鼠等等。

下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例。根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。

本发明中所用技术概述：

除了特别说明，本发明中提及的各种物质均来自英杰生命科学公司(Invitrogen)

反转录病毒生产以及产生iPS细胞实验过程如下：

从Addgene公司购置包含小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的DNA的反转录病毒载体(pMXs)。按照现有技术进行病毒的产生和感染(Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D.Direct generation of ES-like cells from unmodified mouseembryonic fibroblasts by Oct4/Sox2/Myc/Klf4.Cell research 2007；17：959-962.)(Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D.用Oct4/Sox2/Myc/Klf4从无修饰小鼠胚胎成纤维细胞直接产生干细胞样细胞.细胞研究2007；17：959-962.)；(Qin，D.，etal..Mouse meningiocytes express Sox2 and yield high efficiency of chimeras afternuclear reprogramming with exogenous factors.J Biol Chem 2008；283：33730-33735.)(Qin，D.，等人.小鼠脑膜细胞表达Sox2和在用外源因子重编程后能产生高效率的嵌合体.生物化学杂志2008；283：33730-33735.)。简言之，利用常规方法将这些质粒转染到PlatE细胞中。48小时后收集病毒上清液并且过滤，补充有1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(8mg/L)后感染MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)。在第二天重复相同的步骤。添加病毒上清液的当天被定义为第0天。将病毒感染后(即已经转染了Oct4、Sox2、Klf4和/或c-Myc，下文中，如无特殊说明，3因子感染代表用Oct4、Sox2、Klf4感染，4因子感染代表用Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc感染)的成纤维细胞培养在mES培养基中，在感染后13-15天(4因子感染实验)或23-25(3因子感染实验)挑取iPS集落，这是基于Oct-GFP(即在荧光显微镜下发射荧光的集落)和典型的mES形态来挑取的。随后如mES细胞样延展和保持挑取的集落(如上所述Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D，2007；以及Qin，D.等人，2008)。

重编程效率的定量的实验过程如下：

用于计算重编程效率的主要方法是计数碱性磷酸酶(AP)阳性克隆和Oct3/4-GFP阳性克隆。具体地，在感染后第14天对四因子诱导iPS进行AP染色，计数AP阳性克隆。对于三因子诱导iPS，第25天先直接在荧光显微镜下计数Oct3/4-GFP阳性集落，然后进行AP染色并计数阳性克隆数。

iPS细胞的鉴定实验过程如下：

进行碱性磷酸酶染色、鉴定多能性分子标记的表达、细胞的甲基化状态检测、拟胚体EB的形成和畸胎瘤的形成(如上所述Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.& Pei，D，2007；以及Qin，D.等人，2008)。

实施例1：添加ALK5抑制剂的干细胞培养基能促进SKOM iPS的形成

A.将四因子(SKOM)的病毒以1∶1∶1∶1混合(每种1ml)后感染到12孔板的一孔中共计2.0万个OG2小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中，并且在37度，5％CO₂培养在mES培养基(DMEM添加15％胎牛血清、1000U/ml白血病抑制因子(LIF)、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸)中。从第3天起，添加ALK5抑制剂(A-83-01：0.5μM；LY-364947：0.8μM；SB-431542：2μM)；第6天使用胰酶将细胞消化下来，计数，接种3000个细胞于预先种满饲养层细胞(培养在用丝裂霉素(10μg/ml)处理的小鼠胚胎成纤维细胞)的6厘米盘里，继续使用添加ALK5抑制剂或溶剂对照进行培养；在第十四天进行碱性磷酸酶染色并计算AP阳性克隆数。

如图1a所示，与对照组相比，添加ALK5抑制剂能提高SKOM诱导的AP阳性克隆数约53％。

B.使用如a所述的方法，从第10天开始，每天直接在倒置显微镜下计算四因子诱导iPS的对照组和ALK5抑制剂实验组出现的ES样iPS克隆数目。为了消除误差，由两到三人各自进行计数，再汇总统计。如图1b所示，ES样克隆更快和更多地出现在添加ALK5抑制剂实验组中，ALK5抑制剂不但提高四因子诱导iPS的效率，并且能够将整个进程加快。

C.使用如a所述的方法，在第14天，从添加ALK5抑制剂和对照DMSO处理的而诱导出来的四因子iPS克隆中用玻璃针挑取下来，直接接种到预先准备的饲养层细胞的24孔板上，48h后使用0.25％胰酶消化并转移到12孔板中。继续使用添加ALK5抑制剂或溶剂对照的mES培养基培养，连续传代培养，计算第5代以内的Oct3/4-GFP阳性克隆数和总克隆数，并计算Oct3/4-GFP阳性克隆数占总克隆数的百分比(n＝23)。如图1c、1d所示，使用添加ALK5抑制剂的mES培养基诱导出来的四因子iPS克隆中，约一半(12/23)Oct3/4-GFP阳性克隆性达到了总克隆数的50％或以上，有约四分之一(7/23)Oct3/4-GFP阳性克隆性达到了总克隆数的90％或以上。而在对照组中，只有约十分之一(3/23)Oct3/4-GFP阳性克隆性达到了总克隆数的50％或以上，没有任何一个克隆的Oct3/4-GFP阳性克隆性达到了总克隆数的90％或以上。

实施例2：添加ALK5抑制剂干细胞培养基促进SKO iPS的形成

A.将三因子(SKO)的病毒以1∶1∶1混合(每种1ml)后感染到12孔板的一孔中共计2.0万个小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中，并且在37度，5％CO₂培养在mES培养基中。从第3天起，添加ALK5抑制剂或溶剂对照；第9天使用胰酶将细胞消化下来，计数，接种6000个细胞于预先种满饲养层细胞(培养在用丝裂霉素(10μg/ml)处理的小鼠胚胎成纤维细胞)的6厘米盘里，继续使用添加ALK5抑制剂或溶剂对照进行培养；在第二十五天在荧光显微镜下计数Oct3/4-GFP阳性克隆数，并进行碱性磷酸酶染色和计算AP阳性克隆数。如图2a所示，与对照组相比，添加ALK5抑制剂能将SKO诱导的AP阳性克隆数提高约80％，Oct3/4-GFP阳性克隆数提高了约13倍。由于Oct3/4-GFP的出现标志着重编程进程的更高阶段(Brambrink T，et al..Sequential expression ofpluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells.Cell StemCell.2008；2：151-9.)(Brambrink T，等人.在小鼠体细胞直接重编程过程全能性标志物的序列性表达.细胞干细胞2008；2：151-9.)，Oct3/4-GFP阳性克隆数的巨大提高更能说明ALK5抑制剂对于重编程是十分重要的作用的。

B.使用如上所述方法，从第19天开始，每天直接在倒置显微镜下计算三因子诱导iPS的对照组和ALK5抑制剂实验组出现的Oct3/4-GFP阳性克隆数目。如图2b所示，Oct3/4-GFP阳性克隆更快和更多地出现在添加ALK5抑制剂实验组中，ALK5抑制剂不但提高三因子诱导iPS的效率，并且能够将整个进程加快。

实施例3：添加ALK5抑制剂得到的诱导多能性干细胞(iPS)细胞系的多能性的鉴定实验

A.如上所述，用3因子感染成纤维细胞，并之后将其一直在添加有ALK5抑制剂的mES培养基中培养，在感染后第25天，根据克隆形态及荧光表达挑取有代表意义的克隆团，经过数代的稳定传代后形成均匀的iPS细胞系。

如图3a所示，左图是正常的胚胎干细胞，右图：上述iPS细胞系。这些细胞系形态与胚胎干细胞非常相似，强烈表达Oct3/4-GFP的绿色荧光。

B.在纯化RNA之前，去除滋养层细胞，在0.2％明胶上传2代。使用Trizol(Takara公司)试剂，按照制造商说明提取总RNA。用M-MLV(Takara公司)试剂盒进行逆转录，并使用

Premix Ex Taq^TM试剂盒(Takara公司)，ABI 7300荧光定量PCR仪(ABI公司)进行Real-Time PCR。所有上述PCR条件均使用常规PCR条件，按照制造商说明进行。其中鉴定iPS各标志物使用引物列表如表1所示，表1为RT-PCR所用引物的列表。

表1

引物名称	引物序列(F：正向；R反向)
		内源mOct4	F：TAGGTGAGCCGTCTTTCCACR：GCTTAGCCAGGTTCGAGGAT
内源mSox2	F：AGGGCTGGGAGAAAGAAGAGR：CCGCGATTGTTGTGATTAGT
		mNanog	F：CTCAAGTCCTGAGGCTGACAR：TGAAACCTGTCCTTGAGTGC
mRex1	F：CAGCCAGACCACCATCTGTCR：GTCTCCGATTTGCATATCTCCTG

如图3b所示，使用本发明的方法获得的iPS表达较高水平的多能性因子，而这些因子在原始MEF细胞中均没有可检测到的表达。

C.根据制造商的说明，使用CpGenome修饰试剂盒(Chemicon公司)进行亚硫酸氢盐处理。处理过程中使用的Nanog启动子的PCR引物见下表2，表2为PCR所用引物的列表。将上述PCR产物克隆到pMD18-T(Takara公司)载体中，随机选择克隆用于对每个基因测序，所述测序用M13正向和M13反向引物。

表2

引物名称	引物序列
		mNanogU	AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT
mNanogL	CCCACACTCATATCAATATAATAAC

如图3c中显示，iPS克隆中内源性Nanog启动子区域没有或只有极低程度的甲基化，而MEF细胞中，上述基因组区域均呈现高度甲基化。这预示，经过诱导重编程的iPS细胞中，内源性Nanog的表达被激活了。

D.ALK5抑制剂处理的小鼠三因子iPS克隆使用胰酶消化收获，100万个细胞皮下注射进裸鼠的拱侧翼。8-9周后，小鼠被处死，畸胎瘤嵌入石蜡中，使用hematoxilin/eosin切片染色后进行组织结构上地分析。图3d表示在免疫缺陷的小鼠中形成的畸胎瘤切片中能够发现有来源于3个胚层的组织，说明ALK5抑制剂处理的小鼠三因子iPS能够像小鼠干细胞那样具有分化成3个胚层的不同类型细胞的多能性。

总之，本发明的小鼠胚胎成纤维细胞在转导四个外源因子(Sox2，Oct3/4，Klf4，c-Myc)或三个外源因子(Sox2，Oct3/4，Klf4)后，在小鼠胚胎干细胞培养基的基础上添加I型转化生长因子受体(ALK5)抑制剂可以高效诱导为iPS细胞。以碱性磷酸酶染色计算效率，结果显示添加ALK5抑制剂的实验组约比对照组提高53％(转导四因子实验)和80％(转导三因子实验)。挑取从转导四因子诱导出来的iPS克隆进行传代，结果发现，在四因子诱导iPS过程中添加ALK5抑制剂所挑取的克隆能够更多转化成更均质的Oct3/4-GFP阳性的克隆细胞系。以更为严格的Oct3/4-GFP阳性克隆数计算诱导效率，结果显示，在转导三因子的实验中，添加ALK5抑制剂的实验组的Oct3/4-GFP阳性克隆数比对照组提高约13倍。

以上所揭露的仅为本发明较佳的实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<120>I型转化生长因子受体抑制剂在产生诱导多能干细胞中的应用及其方法

<160>10

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列内源mOct4-F

<400>1

taggtgagcc gtctttccac                    20

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列内源mOct4-R

<400>2

gcttagccag gttcgaggat                    20

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列内源mSox2-F

<400>3

agggctggga gaaagaagag                    20

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列内源mSox2-R

<400>4

ccgcgattgt tgtgattagt                    20

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列mNanog-F

<400>5

ctcaagtcct gaggctgaca                    20

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列mNanog-R

<400>6

tgaaacctgt ccttgagtgc                    20

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列mRex1-F

<400>7

cagccagacc accatctgtc                    20

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列mRex1-R

<400>8

gtctccgatt tgcatatctc ctg                23

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列mNanogU

<400>9

aatgtttatg gtggattttg taggt                25

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列mNanogL

<400>10

cccacactca tatcaatata ataac                25

Claims (12)

1、I型转化生长因子受体(ALK5)抑制剂在产生诱导多能干细胞中的应用。

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将含I型转化生长因子受体抑制剂的培养基应用于产生诱导多能干细胞中。

3、I型转化生长因子受体抑制剂产生诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将多能性干细胞因子的cDNA导入小鼠胚胎成纤维细胞；

(2)使用添加ALK5抑制剂的培养基培养步骤(1)处理的小鼠胚胎成纤维细胞；

(3)鉴定诱导多能性干细胞克隆。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的多能性干细胞因子为Sox2、K1f4和Oct4或Sox2、K1f4、Oct4和c-Myc。

5、根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中将多能性干细胞因子的cDNA导入小鼠胚胎成纤维细胞采用病毒感染的方式。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述采用病毒感染的方式为使用逆转录病毒载体在Plat-E细胞中包装出来的病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞。

7、根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的ALK5抑制剂包括商品号为A-83-01、LY-364947、SB-431542、SD-208和SB-525334的ALK5抑制剂。

8、根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的ALK5抑制剂为A-83-01，LY-364947和SB-431542。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述A-83-01的工作浓度为0.5μM；所述LY-364947的工作浓度为0.8μM；所述SB-431542的工作浓度为2μM。

10、根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的培养基为在DMEM添加15％胎牛血清、1000U/ml白血病抑制因子(LIF)、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸。

11、根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)还包括如下步骤：

(2a)往小鼠胚胎成纤维细胞转导四因子或三因子，使用添加有ALK5抑制剂的培养基培养，在第六天(转导四因子)或第九天(转导三因子)将细胞消化并接种到饲养层细胞中，并继续使用添加有ALK5抑制剂的培养基培养；

(2b)挑取具有良好干细胞样形态或Oct3/4-GFP阳性的克隆进行传代。

12、根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在所述步骤(2a)中还包括将报告基因导入小鼠胚胎成纤维细胞，通过报告基因来指示所述多能性干细胞的产生以及检测其产生效率。

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