CN113046311B - 一种诱导多能干细胞定向分化为淋巴组织诱导细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域,具体涉及一种诱导多能干细胞定向分化为淋巴组织诱导细胞的方法,在诱导多能干细胞中过表达转录因子Runx1、转录因子Tcf1、转录因子Id2、转录因子Rorγt、转录因子Batf3、转录因子Nfil3中的至少一种。本发明利用干细胞技术构建诱导多能干细胞系克服了对不同阶段淋巴祖细胞的转录因子基因报告小鼠的构建需求,并且通过稳定过表达特定转录因子组合提高分化的可重复性,提高诱导所得淋巴组织诱导细胞的功能完整性。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,尤其是涉及一种诱导多能干细胞定向分化为淋巴组织诱导细胞的方法。
背景技术
诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)是近年来干细胞研究领域中具有里程碑意义的突破。其是通过异位表达几个与维持胚胎干细胞(EmbryonicStem Cells,ESCs)多潜能性相关的关键性核转录因子,使体细胞发生重编程,得到的一种类似ESCs的多潜能细胞,可以在体内外分化为三胚层的所有组织细胞。由体细胞重编程而来的iPSCs为获得与患者自身遗传背景一致的多能干细胞增加了一个新途径,且不再使用人类早期胚胎和卵母细胞,故伦理学的争论将随之平息,核移植技术缺乏卵母细胞和技术繁杂的窘境也得到了合理的解决。是组织工程和再生医学、疾病模型、药物筛选的理想种子细胞,因此具有广阔的临床应用背景。目前,研究者已在体外将人iPSCs向各种组织细胞诱导分化,如造血干/祖细胞、红细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、胰岛β细胞、肝脏细胞等;建立了多种遗传性疾病人iPSCs疾病模型,用于发病机制的研究,并在动物模型上尝试通过对有遗传缺陷的iPSCs进行基因改造,治疗遗传性疾病;建立多种肿瘤iPSCs疾病模型,用于发病机制的研究和药物筛选。
天然免疫淋巴细胞(innate immune cells,ILCs)是一群在淋巴结发育、组织损伤修复、抗微生物感染等过程中发挥重要作用的天然免疫细胞,其功能失调与过敏性疾病、慢性感染、代谢性疾病、肿瘤等多种疾病密切相关。淋巴组织诱导细胞(LTiCs)是一种对人和小鼠外周淋巴组织发育必不可少的新型天然淋巴细胞,现有文献中涉及淋巴组织诱导细胞或天然免疫淋巴细胞的研究常常需要构建转基因小鼠,从活体分离淋巴祖细胞,然后在体外通过添加细胞因子诱导不同先天免疫淋巴细胞亚群及淋巴组织诱导细胞分化,但是从活体分离淋巴祖细胞(common lymphoid progenitor),成本高,周期长,分化效率低,可重复性低。2006年8月,Yamanaka实验室利用外源表达Oct4,Sox2,c-Myc,Klf4 四个转录因子,成功诱导小鼠胚胎成纤维细胞为类似小鼠胚胎干细胞的“可诱导的多能干细胞”,这项实验结果说明分化细胞可以通过几个转录因子诱导,重编码到全能性的状态,目前暂无相关文献报道从小鼠诱导多能干细胞通过体外克隆培养诱导分化淋巴组织诱导细胞。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种诱导多能干细胞体外诱导定向分化为淋巴组织诱导细胞的方法,利用干细胞技术构建诱导多能干细胞系克服了对不同转录因子基因报告小鼠的构建需求,并且通过稳定过表达特定转录因子组合提高分化的可重复性,提高诱导所得淋巴组织诱导细胞的功能完整性。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
一种诱导多能干细胞定向分化为淋巴组织诱导细胞的方法,在诱导多能干细胞中过表达转录因子Runx1、转录因子Tcf1、转录因子Id2、转录因子Rorγt、转录因子Batf3、转录因子Nfil3中的至少一种。
本发明发明人经过大量研究及试验发现,通过过表达转录因子Runx1、转录因子Tcf1、转录因子Id2、转录因子Rorγt、转录因子Batf3、转录因子Nfil3中的至少一种,可使得诱导多能干细胞定向分化为淋巴组织诱导细胞,可重复性高,并且淋巴组织诱导细胞的功能完整性较高,具有本体细胞的功能特征。
作为本发明所述方法的优选实施方式,在诱导多能干细胞中过表达转录因子Runx1、转录因子Tcf1、转录因子Id2、转录因子Rorγt、转录因子Batf3和转录因子Nfil3。
通过稳定过表达特定转录因子组合提高分化淋巴细胞的可重复性,提高了诱导所得淋巴组织诱导细胞的功能完整性。
作为本发明所述方法的优选实施方式,所述编码转录因子Runx1的基因为 Runx1基因;所述编码转录因子Tcf1的基因为Tcf7基因;所述编码转录因子Id2 的基因为Id2基因,所述编码转录因子Rorγt的基因为Rorc基因,所述编码转录因子Batf3的基因为Batf3基因,所述编码转录因子Nfil3的基因为Nfil3基因。
作为本发明所述方法的优选实施方式,诱导多能干细胞转分化为天然免疫淋巴细胞(innate immune cells)的方法包括以下步骤:
S1.构建携带转录因子的表达载体,所述转录因子包括转录因子Runx1、转录因子Tcf1、转录因子Id2、转录因子Rorγt、转录因子Batf3、转录因子Nfil3 中的至少一种;
S2.将步骤S1构建得到的慢病毒载体转至诱导多能干细胞中,然后在分化培养基组中培养,收集分化获得的淋巴组织诱导细胞。
作为本发明所述方法的优选实施方式,所述分化培养基组包括第一分化培养基、第二分化培养基、第三分化培养基和第四分化培养基,所述第一分化培养基包括胎牛血清、IMDM、谷氨酰胺、抗坏血酸和骨形态发生蛋白4,所述第二分化培养基包括胎牛血清、IMDM、谷氨酰胺、抗坏血酸、骨形态发生蛋白4 和血管内皮生长因子,所述第三分化培养基包括胎牛血清、IMDM、谷氨酰胺、抗坏血酸、KL、FL、IL-3和IL-6,所述第四分化培养基包括胎牛血清、IMDM、谷氨酰胺、抗坏血酸、KL、FL和IL-7。
第一分化培养基可以诱导多能干细胞向中胚层细胞的分化;第二分化培养基可以促进中胚层细胞进一步成熟,第三分化培养基促进中胚层细胞向造血祖干细胞的分化;第四分化培养基促进造血祖干细胞向淋巴组织诱导细胞的分化。
在本发明的第一分化培养基至第四分化培养基中,基础培养基为IMDM (GIBCO,12440046)和抗坏血酸((Sigma,A92902)。
作为本发明所述方法的优选实施方式,所述表达载体为慢病毒。
作为本发明所述方法的优选实施方式,所述转录因子过表达中还含有检测转录因子的扩增引物,所述转录因子为转录因子Runx1、转录因子Tcf1、转录因子Id2、转录因子Rorγt、转录因子Batf3、转录因子Nfil3中的至少一种。
作为本发明所述方法的优选实施方式,所述检测转录因子Runx1的扩增引物为SEQID NO:1-SEQ ID NO:2,所述检测转录因子Tcf1的扩增引物为SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4,所述检测转录因子Id2的扩增引物为SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:6,所述检测转录因子Rorγt的扩增引物为SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8,所述检测转录因子Batf3的扩增引物为SEQ IDNO:9-SEQ ID NO:10;所述检测转录因子Nfil3的扩增引物为SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12。
作为本发明所述方法的优选实施方式,利用过表达的转录因子Runx1、转录因子Tcf1、转录因子Id2、转录因子Rorγt、转录因子Batf3、转录因子Nfil3中的至少一种将诱导多能干细胞定向分化为淋巴组织诱导细胞。
本发明还提供了一种淋巴组织诱导细胞,所述淋巴组织诱导细胞由上述方法分化诱导产生。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明利用六种转录因子(转录因子Runx1、转录因子Tcf1、转录因子Id2、转录因子Rorγt、转录因子Batf3和转录因子Nfil3)在诱导多能干细胞过表达,最大程度地在体外将诱导多能干细胞命运定向分化为淋巴组织诱导细胞,具有极高的可重复性;此外,分化得到的淋巴组织诱导细胞具有本体细胞的功能特征;并且本发明通过利用干细胞技术构建诱导多能干细胞系,解决从不同阶段分离淋巴祖细胞对不同转录因子基因报告小鼠的构建需求。
附图说明
图1为Klf4、c-Myc、Oct4、Sox2多顺反子基因表达载体包装构建的慢病毒示意图;
图2为诱导多能干细胞克隆团经碱性磷酸酶(AP)染色的多能性初筛图;
图3为扩增的诱导多能干细胞的多能性标志物免疫荧光染色图;
图4为免疫缺陷鼠NOD-SCID小鼠皮下注射诱导多能干细胞的畸胎瘤形成实验图;
图5为不同转录因子组合诱导造血祖干细胞的效率图;
图6为不同转录因子组合诱导淋巴组织诱导细胞的效率图;
图7为第四组转录因子组合过表达诱导的的淋巴组织诱导细胞比例流式染色的检测图;
图8为不同转录因子组合诱导淋巴组织诱导细胞的特征性标记分子表达情况图;
图9为第三组转录因子组合过表达诱导的淋巴组织诱导细胞采用流式染色检测对IL-1β和IL-23刺激的细胞因子反应图;
图10为不同转录因子组合诱导的淋巴组织诱导细胞与间充质干细胞系共培养,间充质干细胞系的黏附分子表达情况改变图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。本发明及下列实施例中所用的试剂等除特别说明外,均为可从试剂公司商业购买得到。
在以下实施例中,所述编码转录因子Runx1的基因为Runx1基因(NCBI 登录号为NM_001111021.2);所述编码转录因子Tcf1的基因为Tcf7基因(NCBI 登录号为NM_009331.4);所述编码转录因子Id2的基因为Id2基因(NCBI登录号为NM_010496.3),所述编码转录因子Rorγt的基因为Rorc基因(NCBI登录号为NM_001293734.1),所述编码转录因子Batf3的基因为Batf3基因(NCBI 登录号为NM_030060.2),所述编码转录因子Nfil3的基因为Nfil3基因(NCBI 登录号为017373.3)。
ES培养基(15%FBS+knock-out DMEM+1%非必需氨基酸+1%谷氨酰胺 +1%核苷酸混合物+2-巯基乙醇+1000U/ml白血病抑制因子),FBS(来源于 GIBCO,10099141C)、非必需氨基酸(来源于GIBCO,11140050),谷氨酰胺 (来源于GIBCO,35050061),核苷酸混合物(来源于Merck millipore,ES-008-D), 2-巯基乙醇(来源于Sigma,M6250),白血病抑制因子(来源于Merck millipore, ESG1106),培养基中所添加的其他细胞因子均购自Peprotech,knock-out DMEM (来源于GIBCO,10829018)。
实施例1、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)制备诱导多能干细胞(iPS)
1)取5-6周龄的C57/BL6小鼠,以雌雄比例为2:1于当天18点合笼,次日晨检查雌鼠交配情况,以雌鼠阴道可见白色阴栓为受孕标志,并分笼饲养,记为孕0.5天。取怀孕第13.5天的C57/BL6小鼠胚胎,去除胚胎的头部/内脏和四肢部分,加入适量0.25%胰酶-EDTA消化制备小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),洗涤离心后用含10%FBS的完全培养基种至T75培养瓶置37℃,5%CO2培养箱培养,待细胞生长至85~90%融合度即可消化传代。取3代以内的MEF按合适密度种板,加入Klf4、c-Myc、Oct4、Sox2多顺反子基因表达载体包装构建的慢病毒(参照图1),次日开始每天更换ES培养基(15%FBS+knock-out DMEM+1%非必需氨基酸+1%谷氨酰胺+1%核苷酸混合物+2-巯基乙醇 +1000U/ml白血病抑制因子),待诱导多能干细胞克隆团大小适宜时在倒置显微镜下挑取单个克隆团扩增鉴定。
2)从小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)至诱导多能干细胞的重编程过程及碱性磷酸酶(AP)染色的多能性初筛:
实验方法:取三代以内的小鼠原代成纤维细胞MEF,消化计数,种板,贴壁12hr后按照MOI=10加入stemcca慢病毒,感染16-18hr后换走病毒液,此后每天更换新鲜的ES培养基。直至克隆团长至合适大小。用AP碱性磷酸酶试剂盒(货品编号:碧云天.C3206)按照说明书的方法对长出的克隆团进行多能干性的初筛。如附图所示,感染stemcca病毒的MEF在第8天即出现小克隆团,我们在第11天进行AP染色,所有克隆团均呈深蓝色,而未感染病毒的NC组MEF 则不着色,初步说明克隆团为多能性克隆团,见图2。
3)将扩增的单克隆诱导多能干细胞的多能性标志物免疫荧光染色:
待诱导多能干细胞克隆团长至合适大小,在倒置显微镜下挑取单个克隆团,消化,种48孔板,每天更换新鲜培养基,每3~4天传代扩增。消化细胞,用PBS 洗涤后重悬,滴于载玻片,待液滴风干后用4%多聚甲醛固定,0.5%TritonX-100 冰上破膜10min,后PBS洗涤2次,1%BSA室温封闭1hr,分别加多能干性marker OCT4A/SOX2;和SSEA1/Nanog荧光抗体,4度孵育过夜;次日用PBS洗涤3 次,在滴加相应抗体种属的荧光二抗,室温孵育1hr,PBS洗涤3次,后滴加工作浓度DAPI染料,室温孵育10-15min,PBS洗涤两次,封片。荧光显微镜LSM780(德国蔡司)下观察拍照。未感染病毒的MEF除DAPI外均无着色,而扩增的单克隆iPSC则呈OCT4A/SOX2/SSEA1/Nanog阳性染色。说明诱导多能干细胞具有多能干性,见图3。
4)免疫缺陷鼠NOD-SCID小鼠皮下注射诱导多能干细胞的畸胎瘤形成实验:
将细胞扩增,消化计数,按照1x107 cells/ml重悬于PBS:Matrige 1:1稀释的液体中,对NOD-SCID小鼠进行背侧部位的皮下接种,每只小鼠接种100ul; 4周后颈椎脱臼处死小鼠,取出皮下肿物,测量和标记后置于4%多聚甲醛中,固定后脱水,包埋,切片,染色(HE),镜下观察。如附图所示,可在同一个肿物中观察到iPSC向外胚层(表皮组织角化珠)、中胚层(软骨组织)、内胚层(消化道腺体组织)的分化。说明诱导多能干细胞系具有多能干性,见图4。
实施例2、构建转录因子组合过表达的诱导多能干细胞
经多能性鉴定的单克隆诱导多能干细胞扩增培养,取对数生长期的诱导多能干细胞,消化计数,按照5x10的4次方/ml种孔板,并按照MOI=100加入混合的转录因子慢病毒感染诱导多能干细胞,q-PCR验证外源TF基因过表达。其中检测转录因子的所用引物序列如表1所示。
本发明人选定了六种转录因子(转录因子Runx1、转录因子Tcf1、转录因子Id2、转录因子Rorγt、转录因子Batf3和转录因子Nfil3),发现这六种转录因子在导入诱导多能干细胞中过表达后,可以使得诱导多能干细胞定向分化为淋巴组织诱导细胞,具有极高的可重复性;此外,诱导所得的淋巴组织诱导细胞具有本体细胞的功能特征。
将这六种转录因子进行组合,构成四组转录因子组合,第一组转录因子组合(命名为iPS-3F)为转录因子Runx1、转录因子Id2和转录因子Rorγt的组合;
第二组转录因子组合(命名为iPS-4F)为转录因子Runx1、转录因子Id2、转录因子Rorγt和转录因子Tcf1的组合;
第三组转录因子组合(命名为iPS-5F)为转录因子Runx1、转录因子Id2、转录因子Rorγt、转录因子Tcf1和转录因子Nfil3的组合;
第四组转录因子组合(命名为iPS-6F)为转录因子Runx1、转录因子Id2、转录因子Rorγt、转录因子Tcf1、转录因子Nfil3和转录因子Batf3的组合。
表1
实施例3、转录因子组合过表达的诱导多能干细胞分化为淋巴组织诱导细胞
(1)将细胞消化重悬在第一分化培养基(15%胎牛血清+IMEM+1%谷氨酰胺 +50ug/ml抗坏血酸+5ng/ml骨形态发生蛋白4)中至细胞密度为1x105/ml,以 20ul/滴用悬滴培养方法培养2.5天制备拟胚体(embryonic body,EB)。
(2)收集D2.5的EB,转移至0.1%明胶预包被的孔板中。在第二分化培养基中(15%FBS+IMEM+1%谷氨酰胺+50ug/ml抗坏血酸+5ng/ml骨形态发生蛋白4+5ng/ml血管内皮生长因子)继续培养至第6天。
(3)将分化至D6的细胞加0.25%胰酶-EDTA消化,收集离心,加入至 OP9-DL1饲养层细胞中共培养,在第三分化培养基(15%胎牛血清+IMEM+1%谷氨酰胺+50ug/ml抗坏血酸+KL+FL+IL-3+IL-6)中继续培养至第10-12天,收集共培养体系中的悬浮或半贴壁细胞。
(4)将离心收集的细胞重新种于新制备的OP9-DL1饲养层细胞中共培养,继续培养至D28-D31,收集悬浮的淋巴样细胞即为TF-iPS诱导所得的天然免疫淋巴细胞祖细胞。
(5)将离心收集的细胞重新种于新制备的OP9-DL1饲养层细胞中共培养,在第四分化培养基(15%胎牛血清+IMEM+1%谷氨酰胺+50ug/ml抗坏血酸 +KL+FL+IL-7)中培养成熟两天所得淋巴组织诱导细胞即可进行进一步检测和功能实验。
实施例4、淋巴组织诱导细胞功能实验
1、以小鼠原代分离的造血组干细胞分化作为阳性对照,排除粘连体后,通过活死细胞染料(Fixable viability dye,FVD)和小鼠造血谱系流式抗体混合物染色圈门,圈出活细胞中谱系阴性的细胞群;进一步通过白细胞共同抗原CD45 和天然免疫淋巴细胞亚群3(ILC3)的特征性转录因子RORγt圈出双阳性细胞群;进一步通过CD4区分ILC3中的LTiC和其他ILC3细胞。可以看到经第四组转录因子组合过表达的诱导多能干细胞分化的淋巴组织诱导细胞可明显分为 CD4阴性和阳性两个亚群,见图7。
通过流式细胞技术将培养第10天至第12天的淋巴组织诱导细胞染色检测造血祖干细胞标志物(Lineage/Sca-1/c-Kit),其不同转录因子组合诱导造血祖干细胞效率的结果如图5所示,其不同转录因子组合诱导淋巴组织诱导细胞效率的结果如图6所示,不同转录因子组合诱导的淋巴组织诱导细胞的特征性标记分子表达情况如图8所示。
2、对实施例3诱导培养第30天至第33天所得的淋巴组织诱导细胞的细胞因子反应进行流式细胞技术检测:对第三组转录因子组合过表达的诱导多能干细胞诱导所得淋巴组织诱导细胞加入IL-1β和IL-23刺激,相较于未经处理的亲本iPS,经第三组转录因子组合过表达的诱导多能干细胞诱导所得淋巴组织诱导细胞对于IL-1β和IL-23的刺激可较大量产生IL-22和IL-17,此细胞因子反应类似于天然免疫淋巴细胞亚群3(ILC3)和其下属亚群淋巴组织诱导细胞(LTiC),见图9。
3、取实施例3诱导培养第30天至第33天所得的淋巴组织诱导细胞与间充质干细胞系OP9(VCAM1高表达的变异株)共培养,检测MSC细胞系的黏附分子表达情况,见图10。
结论:相较于未经过表达的iPS诱导所得细胞产物,经上述转录因子组合过表达的诱导多能干细胞诱导所得淋巴样细胞可以在体外共培养上调间充质细胞的表面黏附分子ICAM1即CD54的表达;最终圈门的细胞表型即为 VCAM1+ICAM1+MAdCAM1+的间质细胞,此表型为胚胎期淋巴结发生过程中激活的间质细胞表型,此特征类似于ILC3的LTiC亚群的细胞功能活性。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学孙逸仙纪念医院
<120> 一种诱导多能干细胞定向分化为淋巴组织诱导细胞的方法
<130> 2021.02.03
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Runx1基因的正向引物
<400> 1
tggtggaggt actagctgac c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Runx1基因的反向引物
<400> 2
cgagtagttt tcatcgttgc ctg 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Tcf7基因的正向引物
<400> 3
agctttctcc actctacgaa ca 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Tcf7基因的反向引物
<400> 4
aatccagaga gatcgggggt c 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Id2基因的正向引物
<400> 5
tccggtgagg tccgttagg 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Id2基因的反向引物
<400> 6
cagactcatc gggtcgtcc 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Rorc基因的正向引物
<400> 7
tccactacgg ggttatcacc t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Rorc基因的反向引物
<400> 8
agtaggccac attacactgc t 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Batf3基因的正向引物
<400> 9
cagagcccca aggacgatg 19
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Batf3基因的反向引物
<400> 10
gcacaaagtt cataggacac agc 23
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Nfil3基因的正向引物
<400> 11
tattgggaga aacggcggaa a 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Nfil3基因的反向引物
<400> 12
agccttggat gtctggtagt c 21
Claims (8)
1.一种诱导多能干细胞定向分化为淋巴组织诱导细胞的方法,其特征在于,在诱导多能干细胞中过表达转录因子组合;
所述转录因子组合为:
Runx1、转录因子Id2和转录因子Rorγt;或
转录因子Runx1、转录因子Tcf1、转录因子Id2和转录因子Rorγt;或
转录因子Runx1、转录因子Tcf1、转录因子Id2、转录因子Rorγt和转录因子Nfil3;或
转录因子Runx1、转录因子Tcf1、转录因子Id2、转录因子Rorγt、转录因子Batf3和转录因子Nfil3。
2.如权利要求1所述的方法,所述编码转录因子Runx1的基因为Runx1基因;所述编码转录因子Tcf1的基因为Tcf7基因;所述编码转录因子Id2的基因为Id2基因,所述编码转录因子Rorγt的基因为Rorc基因,所述编码转录因子Batf3的基因为Batf3基因,所述编码转录因子Nfil3的基因为Nfil3基因。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.构建表达权利要求1中所述转录因子组合的表达载体;
S2.将步骤S1构建得到的表达载体转至诱导多能干细胞中,然后在分化培养基组中培养,收集分化获得的淋巴组织诱导细胞。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述分化培养基组包括第一分化培养基、第二分化培养基、第三分化培养基和第四分化培养基,所述第一分化培养基包括胎牛血清、IMDM、谷氨酰胺、抗坏血酸和骨形态发生蛋白4,所述第二分化培养基包括胎牛血清、IMDM、谷氨酰胺、抗坏血酸、骨形态发生蛋白4和血管内皮生长因子,所述第三分化培养基包括胎牛血清、IMDM、谷氨酰胺、抗坏血酸、KL、FL、IL-3和IL-6,所述第四分化培养基包括胎牛血清、IMDM、谷氨酰胺、抗坏血酸、KL、FL和IL-7。
5.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述表达载体为慢病毒表达载体。
6.如权利要求3所述的方法,其特征在于,将步骤S1构建得到的表达载体转至诱导多能干细胞中后还含有检测权利要求1中所述转录因子组合的步骤。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述检测转录因子Runx1的扩增引物为SEQIDNO:1-SEQ ID NO:2,所述检测转录因子Tcf1的扩增引物为SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4,所述检测转录因子Id2的扩增引物为SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:6,所述检测转录因子Rorγt的扩增引物为SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8,所述检测转录因子Batf3的扩增引物为SEQ IDNO:9-SEQ ID NO:10;所述检测转录因子Nfil3的扩增引物为SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法,其特征在于,利用过表达的权利要求1中所述转录因子组合将诱导多能干细胞定向分化为淋巴组织诱导细胞。
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