CN102260646B - 一种制备诱导多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备诱导多潜能干细胞的方法。在体细胞中加入4个小分子化合物的组合(HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂)或其中至少两个小分子化合物的组合(例如GSK3-beta抑制剂和TGF-beta抑制剂)，可在只导入一个转录因子(Oct4)的情况下，诱导产生诱导多潜能干细胞(iPS细胞)。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备诱导多潜能干细胞的方法，试剂盒及用途。
背景技术
(一)干细胞多能性(pluripotency)的特点：
胚胎干细胞因为具有向三个胚层细胞的分化能力而被称为“多潜能”干细胞，此外，胚胎瘤(EC)细胞和胚胎生殖(EG)细胞均具有和胚胎干细胞类似的多能性。多潜能干细胞共同的特点是：细胞核质比比较大，克隆样生长(人胚胎干细胞较扁平，而小鼠胚胎干细胞较为隆起，细胞界限不明显)，具有AP酶活性，特异地表达SSEA4，TRA1-60，TRA1-81等表面标志(小鼠胚胎干细胞还特异性地表达SSEA1，而人胚胎干细胞不表达SSEA1)，及Oct4，Nanog，Sox2，rex1(ZFP42)，GDF3，lin28，TDGF1等标志性基因。此外，还可以在悬浮培养条件下，形成胚胎小体(Embryonid bodies)结构，并发生自发分化，EB形成6-9天后贴壁培养，可检测到向内、中、外三个胚层分化的细胞。
(二)诱导多能性干细胞(IPS细胞)的研究
2006年8月，日本京都大学再生医科学研究所教授山中伸弥(Yamanaka)实验室首先宣布在小鼠的成纤维细胞中导入4个基因(Oct4，Sox2，c-Myc和KLF4)成功地将其诱导成为全能性的干细胞，其性质和胚胎干细胞类似，(Takahashi and Yamanaka，2006)从而首次揭示了通过转基因可以在分化的细胞中建立全能性。这是对许多年来的生物学观念的一次巨大的冲击，并且有望使基于干细胞技术的治疗性克隆彻底摆脱卵子来源的困境和破坏胚胎引起的伦理争议。目前使用这种人工干细胞米进行细胞治疗患者尚存在安全隐患，但它不久后可能被应用于疾病模型的制作和新药研发等研究工作。这一成果加快了再生医学的研究步伐，具有划时代的意义。
在该实验中，Yamanaka等人首先选取了和小鼠胚胎干细胞自我更新及维持多能性相关的24个基因，分别将他们克隆到逆转录病毒载体，对胚胎成纤维细胞进行共转染，在进行基于Fbx15报告体系的筛选之后，他们观察到了ES-like的细胞集落的形成。
经过对这24个基因的进一步分析，他们发现，仅转导Oct4，Sox2，c-Myc，KLF4就可以使胚胎成纤维细胞完全转变成为诱导的多潜能干细胞(iPS细胞-Induced Pluripotent Stem Cells，俗称“诱导的多潜能干细胞”)。该IPS细胞拥有正常的核型，表达类似胚胎干细胞的分子标志，可以在体外被诱导分化为内、中、外三个胚层的终末分化的细胞，能够在裸鼠体内形成畸胎瘤，在畸胎瘤中含有内、中、外三个胚层的分化细胞。此外，和胚胎干细胞一样，IPS细胞在Nanog和Oct4promoter上检测到H3的低甲基化和高乙酰化。然而，采用Fbx15基因作为reporter筛选出来的细胞并不具有完整的全能性，如：内源Oct4等干性基因仍然没有能够正常地启动表达，不能通过囊胚注射的方法制成嵌合小鼠等。
此后，2007年5月份，Yamanaka实验室和Jaenisch实验室同时在Nature杂志上发表文章声明(Okita et al.，2007；Wernig et al.，2007)，他们采用新的报告基因(基于Oct4或nanog的promoter)进行抗药性筛选可以产生完全重编程的IPS细胞，新的IPS细胞可以使内源基因重新启动，并且可以通过囊胚注射制备成为嵌合小鼠，并整合到生殖系统中，产生完全由该IPS细胞生成的后代小鼠。Jaenisch实验室的实验结果表明，该IPS细胞甚至通过四倍体胚胎嵌合技术制备发育正常的小鼠胚胎。此外，新的IPS细胞的Oct4启动子及Nanog启动子的甲基化修饰也几乎被完全擦除。
同时，Hochedlinger实验室和Plath实验室合作在Cell stem cells上发表文章，用更加丰富的手段验证了IPS细胞完全重编程的效果。(Maheraliet al.，2007)例如，同分化细胞融合使分化细胞去分化的能力，雌性细胞的X染色体失活现象，H3K4和H3K27的甲基化谱等等。由此，4个因子诱导分化细胞成为全能性干细胞的事实被完全确认！
同时，研究发现只用Oct4，Sox2和KLF4一样可以获得IPS细胞，cMyc并不是体细胞重编程所必需的转录因子。(Nakagawa et al.，2008)随后发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂内戊酸(Valproic acid，VPA)(0.5mM-3mM)(Huangfu et al.，2008)能够在Oct4，Sox2和KLF4三因子水平大大提高重编程的效率。随后的研究发现，重编程因子Sox2也能够被进一步替代，对于人和小鼠的体细胞如胚胎成纤维细胞，在Oct4和KLf4两个因子的作用下就能够实现重编程，虽然效率会明显降低。多家实验室筛选鉴定了一系列小分子以提高Oct4和Klf4诱导重编程的效率：如组蛋白甲基转移酶G9a抑制剂BIX01294，H3K4组蛋白甲基化酶抑制剂tranylcypromine(2μM)(Lin et al.，2009)，GSK3beta抑制剂CHIR99021(2μM-10μM)(Lin et al.，2009)，TGFbeta抑制剂616452(2-5μM-4μM)(Maherali and Hochedlinger，2009)等。但是，目前在小鼠成纤维细胞上利用单因子诱导体细胞重编程的方法仍未见报道。
发明内容
本发明提供了一种小分子组合，在只导入一个转录因子(Oct4)的情况下，诱导产生诱导多潜能干细胞(iPS细胞)的方法。该方法通过向分化的细胞中提供特定组合的小分子，在外源表达Oct4因子的作用下，诱导产生IPS细胞-诱导的多潜能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells，俗称“万能细胞”)，其中所使用的小分子包括一个HDAC抑制剂，一个GSK3-beta抑制剂，一个TGF-beta抑制剂和一个H3K4去甲基化抑制剂。在一个特例中，所使用的小分子组合是VPA(HDAC抑制剂)，CHIR99021(GSK3-beta抑制剂)，Tranylcypromine(H3K4去甲基化抑制剂)，和616452(TGF-beta抑制剂)。
具体地，一个方面，本发明提供由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合或它们中的至少两种组成的组合用于诱导多潜能干细胞产生的用途。
在一个具体的实施方案中，所述至少两种的组合是GSK3-beta抑制剂和TGF-beta抑制剂的组合，是由GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，是由HDAC抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，或是由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂组成的组合。
优选地，所述HDAC抑制剂是VPA，Butyrate，TSA，Scriptaid等；所述GSK3-beta抑制剂是CHIR99021，BIO，Gene ID：22416的wnt3a编码的Wnt3a蛋白等；所述TGF-beta抑制剂是616452，SB431542等；所述H3K4去甲基化抑制剂是tranycypromine和phenelzine等。
在本发明的另一个方面，提供一种制备诱导多潜能干细胞的方法，包括向分化的细胞中提供诱导因子，所述诱导因子是Oct4和由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合或它们中的至少两种组成的组合。
在一个具体的实施方案中，所述至少两种的组合是GSK3-beta抑制剂和TGF-beta抑制剂的组合，是由GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，是由HDAC抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，或是由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂组成的组合。优选地，所述HDAC抑制剂是VPA，Butyrate，TSA，Scriptaid等；所述GSK3-beta抑制剂是CHIR99021，BIO，Wnt3a等；所述TGF-beta抑制剂是616452，SB431542等；所述H3K4去甲基化抑制剂是tranycypromine和phenelzine等。
在一个优选的实施方案中，所说方法还使用碱性成纤维细胞生长因子bFGF。
在一个具体的实施方案中，所述分化的细胞是皮肤细胞，肝细胞，胃细胞，角质细胞或血液细胞。优选地，所述分化的细胞来源于哺乳动物。更优选地，所述哺乳动物是人、鼠或灵长类动物。
在另一个具体的实施方案中，Oct4是DNA，mRNA或蛋白等形式。优选地，Oct4的序列为SEQ ID NO：1所示的序列。
在本发明的另一个方面，提供一种制备诱导多潜能干细胞的试剂盒，包括向分化的细胞中提供的诱导因子，所述诱导因子包括Oct4和由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合或它们中的至少两种组成的组合。
在一个具体的实施方案中，所述至少两种的组合是GSK3-beta抑制剂和TGF-beta抑制剂的组合，是由GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，是由HDAC抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，或是由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂组成的组合。
优选地，其中所述HDAC抑制剂是VPA，butyrate，TSA等；所述GSK3-beta抑制剂是CHIR99021，BIO，wnt3a(蛋白编码自基因wnt3a，GeneID：22416)等；所述TGF-beta抑制剂是616452，SB431542等；所述H3K4去甲基化抑制剂是tranycypromine，phenelzine。
优选地，Oct4是DNA，mRNA或蛋白等形式。更优选地，Oct4的序列为SEQ ID NO：1所示的序列。
在一个优选的实施方案中，所说试剂盒还包含碱性成纤维细胞生长因子bFGF。
在本发明的另一个方面，提供利用上述方法或试剂盒制备的多潜能干细胞。
对于HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂的用量，对于本领域的普通技术人员而言是可以常规选择的。通常为：HDAC抑制剂如VPA(0.5mM-3mM)；H3K4去甲基化抑制剂如tranylcypromine(2μM)；GSK3beta抑制剂如CHIR99021(2μM-10μM)，TGFbeta抑制剂如616452(2-5μM-4μM)，优选地，VPA使用0.1mM-1mM，CHIR99021使用0.5μM-10μM，616452使用0.5μM-5μM，tranylcypromine使用0.5μM-5μM。
附图说明
图1.小分子化合物促进重编程的效率
图2.用4个小分子组合(VPA，CHIR 99021，616452，Tranylcypromine)和单基因(Oct4)诱导iPS细胞的时间表示意图
图3.用4个小分子组合(VPA，CHIR 99021，616452，Tranylcypromine)和单基因(Oct4)诱导的iPS原代细胞集落，phase为细胞克隆的形态图，GFP为绿色荧光视野。
图4.用4个小分子组合(VPA，CHIR 99021，616452，Tranylcypromine)和单基因(Oct4)诱导的iPS细胞系经长期传代保持胚胎干细胞的形态，呈AP染色阳性(见图AP)，并且其整合的pOct4-GFP报告体系表达绿色(见图GFP)荧光。图phase表示细胞集落的形态图。
图5.用4个小分子组合(VPA，CHIR 99021，616452，Tranylcypromine)和单基因(Oct4)诱导的iPS细胞系表达多潜能性标志蛋白，即Oct4，Sox2，Nanog，Utf1，Rex1和SSEA1。
图6.用4个小分子组合(VPA，CHIR 99021，616452，Tranylcypromine)和单基因(Oct4)诱导的iPS细胞系中只有Oct4一个外源重编程基因的整合。O-iPS-1a，1b，1c，2a，2b，3a，3b指单基因(oct4)诱导的不同的iPS细胞系。4F-iPS指4个因子(Oct4，sox2，klf4，c-myc)诱导的iPS细胞系，MEF是未导入外源基因的靶细胞(阴性对照)，H2O是RT-PCR实验的无样本阴性对照。
图7.用4个小分子组合(VPA，CHIR 99021，616452，Tranylcypromine)和单基因(Oct4)诱导的iPS细胞系表达干性标志基因。O-iPS-1a，1b，1c，2a，2b指单基因(oct4)诱导的不同的iPS细胞系。H2O是RT-PCR实验的无样本阴性对照。
图8.用4个小分子组合(VPA，CHIR 99021，616452，Tranylcypromine)和单基因(Oct4)诱导的iPS细胞系的Oct4，Nanog启动子DNA甲基化水平很低，和胚胎干细胞类似。
图9.用4个小分子组合(VPA，CHIR 99021，616452，Tranylcypromine)和单基因(Oct4)诱导的iPS细胞系基因表达谱和胚胎干细胞接近。O-iPS-1a，1b，1c，2a指单基因(oct4)诱导的不同的iPS细胞系，4F-iPS指4个因子(Oct4，sox2，klf4，c-myc)诱导的iPS细胞系。
图10.用4个小分子组合(VPA，CHIR 99021，616452，Tranylcypromine)和单基因(Oct4)诱导的iPS细胞系具有三个胚层组织细胞类型的分化能力。左上：软骨组织(中胚层)；右上：类神经管和黑素细胞(外胚层)；下图：类小肠上皮(内胚层)。4个图中均可见大量肌肉纤维(中胚层)。
图11.用4个小分子组合(VPA，CHIR 99021，616452，Tranylcypromine)和单基因(Oct4)诱导的iPS细胞系具有囊胚注射产生嵌合小鼠的能力。
图12.用4个小分子组合(VPA，CHIR 99021，616452，Tranylcypromine)和单基因(Oct4)诱导的iPS细胞系具有囊胚注射产生生殖嵌合的能力。
图13.用4个小分子组合(VPA，CHIR 99021，616452，Tranylcypromine)和单基因(Oct4)诱导的iPS细胞系经囊胚注射产生的嵌合小鼠的各个组织器官均可检测到供体iPS细胞的嵌合。其中，泳道1的ICR小鼠尾尖和泳道2的129小鼠尾尖细胞不含有pOct4-GFP基因片段，作为阴性对照，泳道3的OG小鼠尾尖细胞和泳道4的OG小鼠胚胎成纤维细胞均含有pOct4-GFP基因片段，作为实验的阳性对照；泳道5：嵌合鼠肺；泳道6：嵌合鼠尾尖；泳道7：嵌合鼠肝脏；泳道8：嵌合鼠心脏；泳道9：嵌合鼠胃；泳道10：嵌合鼠脑；泳道11：嵌合鼠睾丸；泳道12：嵌合鼠肾脏；泳道13：嵌合鼠脾脏；泳道14：嵌合鼠皮肤；泳道15：水(PCR阴性对照)。
图14.用于诱导单基因(oct4)的iPS的小分子的结构式。
图15.用更少的小分子和单基因(Oct4)诱导得到iPS细胞克隆。A.用VC6诱导MEF细胞成为iPS细胞克隆；B.用VC6诱导成体成纤维细胞成为iPS细胞克隆；C.用C6诱导MEF细胞成为iPS细胞克隆；D.在bFGF存在时，用C6诱导MEF成为iPS细胞克隆。
图16.小分子组合在一定浓度范围内均有效诱导iPS细胞。图A中VPA浓度单位为mM，其余小分子(CHIR99021，616452，tranylcypromine)的浓度单位为μM。
图17.成体小鼠的成纤维细胞被Oct4和4个小分子的组合诱导成为iPS细胞。A：新产生的iPS细胞克隆的形态和GFP荧光图；B：传代培养后的iPS细胞形态，荧光，AP染色，免疫荧光染色结果图。C：成体小鼠成纤维细胞诱导的iPS细胞克隆(Adult-O-iPS1a，1b，2a)经基因组PCR检测确认只有Oct4一种外源基因的整合。其中O-iPS-1a，1b，1c，2a指单基因(oct4)诱导小鼠胚胎成纤维细胞得到的不同的iPS细胞系。Adult-O-iPS-1a，1b，2a指单基因(oct4)诱导成体小鼠细胞得到的几株不同的iPS细胞系。MEF是未导入外源基因的靶细胞(阴性对照)，H2O是RT-PCR实验的无样本阴性对照。
图18.小分子用相同靶点的其它因子替代后得到单oct4诱导的iPS细胞。右列为克隆形态图，左列是GFP荧光下的视野图。a：用wnt3a(R&D)替代CHIR99021；b：butyrate(Tocris)替代VPA得到的iPS细胞克隆。
具体实施方式
以通过实施例进一步举例说明本发明。本领域的普通技术人员可以理解本发明并不限于所述实施例，并且本领域的普通技术人员可以基于说明书的教导对实施例进行修改。这些修改同样包含在本发明由后附的权利要求所定义的本发明的范围内。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
在本发明的实施例中，“VPA”用“V”表示；“CHIR 99021”用“C”或“CHIR”表示；“616452”用“6”表示；“Tranylcypromine”用“T”表示。例如，“VC6”表示“VPA，CHIR99021和616452的组合”。
实施例1：
小鼠品系：
转基因鼠品系：TgN(GOFGFP)11Imeg(简称为OG)购自RIKENBioResource Center。其他小鼠品系ICR，129S2/SvPasCrlVr(简称为129)和C57BL/6NCrlVr (简称为C57)均购自维通利华。
细胞培养：
原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)均来自ICR×OG，129×OG和C57×OG转基因小鼠。MEF和129T细胞培养基为含10％胎牛血清(FBS，Invitrogen)的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM，Hyclone)培养基。小鼠胚胎干细胞系R1和iPS细胞培养基为：80％DMEM/F12(Invitrogen)，10％Knockout serum replacement(KSR)(Invitrogen)，10％FB S，并包含1mM L-glutamine，1％non-essential amino acids，0.1mMbeta-mercaptoethanol(均购自Invitrogen)以及1000U/mL Lif(Millipore)。小鼠胚胎干细胞系R1和iPS细胞培养在丝裂霉素C处理后的MEF饲养层细胞上，培养基每天换液。
实施例2.慢病毒感染及iPS重编程
分别包括oct4(SEQ ID NO：1)，sox2(SEQ ID NO：2)，klf4(SEQ IDNO：3)以及c-myc(SEQ ID NO：4)的慢病毒载体的构建以及感染方法见(zhao et al.，2008)。用上述分别包含oct4(SEQ ID NO：1)，sox2(SEQ IDNO：2)，klf4(SEQ ID NO：3)以及c-myc(SEQ ID NO：4)的慢病毒载体感染MFF细胞，48小时后换为诱导重编程的培养基。诱导重编程的培养基为80％DMEM/F 12(Invitrogen)，10％Knockout serum replacement(KSR)(Invitrogen)，10％FBS，并包含1mM L-glutamine，1％non-essential aminoacids，0.1mM beta-mercaptoethanol，1000U/mL Lif以及包含诱导重编程的小分子组合：VPA(0.5mM，Sigma)，CHIR99021(3uM，Stemgent)，616452(2uM，Calbiochem)和Tranylcypromine(2uM，Tocris)。
为了促进MEF细胞的扩增，在部分实验中，10ng/ml basic FibroblastGrowth Factor(P&A Biotech)在病毒感染后连续8天持续加入。诱导培养基每四天换一次液。GFP阳性的iPS克隆在病毒感染后30天左右时间挑出，并在小鼠胚胎干细胞基础培养基(即上述小鼠胚胎干细胞系R1和iPS细胞培养基)内长期培养。
实施例3.碱性磷酸酶和组化染色
碱性磷酸酶的存在是胚胎干细胞保持未分化状态的一个重要指标，通过检测其的存在与否，可进一步判定胚胎干细胞。胚胎干细胞中含有丰富的碱性磷酸酶(AP)，而已分化的胚胎干细胞AP呈弱阳性或阴性。
按照制造商的说明，用Alkaline Phosphatase Detection Kit(Chemicon)检测诱导的多潜能干细胞的碱性磷酸酶(AP)的表达。结果如图4所示。
为进一步检测用本发明诱导方法获得的细胞是否真的像形态上所表现出来的一样保持了细胞的未分化状态，使用细胞免疫荧光染色的方法进一步检测IPS细胞内源性干性基因的表达情况。组化染色所用抗体为：一抗：SSEA-1(1∶200，Millipore)，Oct4(1∶200，Abcam)，Sox2(1∶200，SantaCruz)，Rex1(1∶200，Santa Cruz)，Nanog(1∶40，R&D)，Utf1(1∶200，Abcam)，。二抗：Rhodamine-labeled donkey anti-mouse IgG(1∶100，Santa Cruz)，Rhodamine-labeled donkey anti-rabbit IgG(1∶100，Santa Cruz)，Rhodamine-labeled donkey anti-goat IgG(1∶100，Santa Cruz)，Rhodamine-labeled donkey anti-goat IgM(1∶100，Santa Cruz)，Rhodamine-labeled goat anti-mouse IgG3(1∶100，Santa Cruz)。DAPI(Beyotime)用于染细胞核。见结果部分涉及的图5，图17B。免疫荧光SSEA-1，Oct4，Sox2，Rex1，Nanog和UTF1的阳性结果证实所得到的细胞克隆确实是具有类似胚胎干细胞特性的iPS细胞。
实施例4.DNA甲基化分析
用EZ-96DNA甲基化试剂盒(Zymo Research，Orange County，CA)完成全基因组DNA亚硫酸钠转化。采用Sequenom’s MassARRAY分析平台进行量化甲基化分析(Kim et al.，2009)。用EpiDESIGNER软件(http://www.epidesigner.com)根据扩增的Naong序列(SEQ ID NO：39)及Oct4序列(SEQ ID NO：40)设计PCR引物。检测DNA甲基化情况。
1.组织、细胞及血样DNA提取
v使用Wizard Genomic DNA purification Kit(Promega)或Tissue(MN)提取组织、细胞或血样中的DNA，用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检。质检合格的DNA将浓度调整到50ng/μL，-20℃储存备用。
2.亚硫酸氢盐转化反应
使用EZ 96DNA Methylation Kit(Zymo Research)进行DNA的转化。
3.PCR扩增
以亚硫酸氢盐转化后的DNA为模板，在384孔板进行PCR扩增反应。每个反应总体积5μL，包含模板DNA 1μL(DNA浓度＞5ng//μL)，5U/μL Hotstar Taq 0.2U，引物每条1pmol，25mM dNTP，0.04μL，反应条件为94℃15分钟；94℃20秒，62℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃放置。
4.PCR产物纯化
PCR反应产物使用2μL SAP(shrimp alkaline phosphatase来自试剂盒)处理，去除体系中游离的dNTP。反应体系7μL，其中PCR产物5μL，SAP混合液2μL(SAP 0.3μL，RNase-free ddH2O 0.17μL)。反应程序37℃20分钟；85℃5分钟；4℃放置。
5.体外转录及RNase A特异性酶切反应
RNase A特异性酶切反应分为T切与C切两种，本实验中使用单独的T切反应。体外转录与酶切反应同时进行，总体积7μL反应体系包含SAP处理后PCR产物2μL，RNase-free ddH2O 3.15μL，5x T7PolymeraseBuffer 0.89μL，T Cleavage Mix(来自试剂盒)0.24μL，100mM DTT，0.22μL，T7RNA&DNAPolymerase 0.44μL，RNase A 0.06μL。反应程序为37℃3小时，4℃放置。
6.树脂纯化
每个样品中加水20μL稀释，震荡混匀，加入6mg Clean Resin树脂纯化10分钟，3200g离心5分钟。
7.芯片点样及质谱检测
使用MassARRAY Nanodispenser RS 1000点样仪(SEQUENOM)将纯化后产物点至384孔SpectroCHIP(SEQUENOM)芯片上，将点制好的芯片放入MassARAYCompact System(SEQUENOM)进行检测。SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time offlight)基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术，检测数据通过EpiTYPER软件(SEQUENOM)分析并输出结果。
见结果部分中涉及的图8。
实施例5.RT-PCR检测
iPS细胞全RNA用TRIzol提取(Invitrogen)，按照相关操作手册用“EasyScript Reverse Transcriptase”(TransGen Biotech)进行RNA反转录。PCR用2×EasyTaq SuperMix(TransGen Biotech)体系完成。引物见下表。
| Endo-sox2S | TAG AGC TAG ACT CCG GGC GAT GA | SEQ ID NO：5 |
| Endo-sox2A | TTG CCTTAAACAAGA CCA CGAAA | SEQ ID NO：6 |
| Endo-klf4S | GCG AAC TCA CAC AGG CGA GAAACC | SEQ ID NO：7 |
| Endo-klf4A | TCG CTTCCTCTTCCTCCGACACA | SEQ ID NO：8 |
| Endo-cmycS | TGA CCTAAC TCG AGG AGG AGC TGG AAT C | SEQ ID NO：9 |
| Endo-cmycA | AAG TTT GAG GCA GTTAAAATTATG GCT GAA GC | SEQ ID NO：10 |
| Endo-oct4S | ATGAAAGCCCTGCAGAAGGAGCTAGAAC | SEQ ID NO：11 |
| Endo-oct4A | TCTCTAGCCCAAGCTGATTGGCGATGTG | SEQ ID NO：12 |
| Endo-NanogS | CAGGAGTTTGAGGGTAGCTC | SEQ ID NO：13 |
| Endo-NanogA | CGGTTCATCATGGTACAGTC | SEQ ID NO：14 |
| utf1-S | GGATGTCCC GGTGAC TAC GTC TG | SEQ ID NO：15 |
| utf1-A | GGC GGA TCT GGT TAT CGAAGG GT | SEQ ID NO：16 |
| rex1-S | ACGAGTGGC AGTTTC TTC TTGGGA | SEQ ID NO：17 |
| rex1-A | TAT GAC TCA CTT CCA GGG GGC ACT | SEQ ID NO：18 |
| fbx15-S | CAA CAG CCT CAG TCC TGT CA | SEQ ID NO：19 |
| fbx15-A | TCT GTC GCA GCC AAT CAT AG | SEQ ID NO：20 |
| dax1-S | TGC TGC GGT CCA GGC CAT CAA GAG | SEQ ID NO：21 |
| dax1-A | GGG CAC TGT TCA GTT CAG CGG ATC | SEQ ID NO：22 |
| eras-S | ACT GCC CCT CAT CAG ACT GCT ACT | SEQ ID NO：23 |
| eras-A | CAC TGC CTT GTA CTC GGG TAG CTG | SEQ ID NO：24 |
| cripto-S | ATG GAC GCA ACT GTG AAC ATG ATG TTC GCA | SEQ ID NO：25 |
| cripto-A | CTT TGA GGT CCT GGT CCA TCA CGT GAC CAT | SEQ ID NO：26 |
| gapdh-S | CCC ACT AAC ATC AAA TGG GG | SEQ ID NO：27 |
| gapdh-A | CCT TCC ACA ATG CCA AAG TT | SEQ ID NO：28 |
分别用来扩增oct4，sox2，nanog，klf4，myc，rex1，fbx15，dax1，e-ras，crypto，Gapdah等多潜能性相关基因，证实所得到的细胞是iPS细胞，表达胚胎干细胞特异的标志性基因。见结果部分中涉及的图7。
实施例6.体外分化和畸胎瘤
EB分化：iPS细胞用悬浮培养皿(Coming)培养，培养基为15％胎牛血清，1mM L-glutamine，1％non-essential amino acids和0.1mMb-mercaptoethanol(均购自Invitrogen)以形成胚胎小体。七天后，悬浮的胚胎小体转入0.1％明胶(Sigma)铺被的细胞培养皿中继续培养，诱导细胞继续分化。
畸胎瘤生成：将105iPS细胞移植到NOD-SCID小鼠(n＝5)皮下，四周后切片HE检测畸胎瘤的组成。见结果部分中涉及的图10。
实施例7.DNA芯片分析
MEF、iPS细胞及鼠胚胎干细胞中的所有mRNA用Cy5标记，并按照操作手册要求同mouse Oligo Microarray(Phalanx Mouse Whole GenomeOneArrayTM，Phalanx Biotech)杂交(每个三份平行)。每一个样品的中值采用分级群聚。见结果部分中涉及的图9。
实施例8.基因组PCR检测
1)嵌合鼠实验和嵌合鼠各组织器官的基因组PCR检测
8-10个iPS细胞显微注射到小鼠的(维通达)8细胞胚胎中，培养一天后，胚胎移植到2.5dpcICR假孕小鼠子宫角内并在体内发育形成嵌合鼠。EasyPure Genomic DNA Extraction Kit(Transgen)提取嵌合鼠不同组织的基因组DNA。PCR检测体系为30sec 94℃，30sec 63℃，30sec 72℃共33个循环。引物(参考RIKEN，BRC)为EGFPUS23：TTCAGGGTCAGCTTGCCGTA(SEQ ID NO：29)和OCGOFU35：CTAGGTGAGCCGTCTTTTCA(SEQ ID NO：30)，扩增pOct4-GFP片段。见结果部分中涉及的图13。
2)iPS细胞的基因组PCR检测引物包括：PCR检测体系为30sec 94℃，30sec 58℃，30sec 72℃共30个循环。
| oct4-Tg-S | GAA GGA TGT GGT CCG AGT | SEQ ID NO：31 |
| oct4-Tg-A(pLL-Tg-A) | GCA GCG TATCCA CATAGC GT | SEQ ID NO：32 |
| sox2-Tg-S | CAT GGG TTC GGT GGT CAA | SEQ ID NO：33 |
| sox2-Tg-A(pLL-Tg-A) | GCA GCG TAT CCA CATAGC GT | SEQ ID NO：34 |
| cmyc-Tg-S | TAC ATC CTG TCC GTC CAA GC | SEQ ID NO：35 |
| cmyc-Tg-A(pLL-Tg-A) | GCA GCG TAT CCA CATAGC GT | SEQ ID NO：36 |
| klf4-Tg-S | ACC ACT GTG ACT GGG ACG | SEQ ID NO：37 |
| Klf4-Tg-A(pLL-Tg-A) | GCA GCG TAT CCA CAT AGC GT | SEQ ID NO：38 |
见结果部分中涉及的图6。
结果部分：
我们首先发现，当OG转基因小鼠胚胎13.5天的成纤维细胞(OG-MEF)通过慢病毒载体同时转入Oct4，Sox2和Klf4三个外源基因后，在VPA(0.5mM)和CHIR99021(3μM)的作用下，iPS克隆产生的数量会比不用这两种小分子处理产生的iPS克隆数提高约30倍(图1A，对照为不加本发明的小分子)：在感染后12天，平均1×104MEF细胞能够产生大约30个iPS克隆。
随后，因为报道显示TGF-beta信号通路抑制剂之一，小分子616452能够替代sox2，实现oct4和klf4双因子诱导MEF重编程，产生iPS细胞；我们也在体系中应用了该小分子，并发现当VPA(0.5mM)，CHIR(3μM)和616452(2μM)(简称为VC6)联合处理OG-MEF细胞，能够有效地提高oct4/klf4双因子重编程的效率(图1B，对照为不加本发明的小分子)：平均在15天内，5×104MEF细胞能够产生大约5-20个iPS克隆。但是，我们发现在VC6小分子组合联合处理MEF细胞的情况下，即使体外长期培养超过40天，仅依靠oct4单因子的作用也不能实现细胞重编程。
因此，我们进一步探索其他小分子能够帮助在单因子oct4的基础上实现MEF细胞的重编程。我们发现H3K4组蛋白甲基化酶抑制剂tranylcypromine(2μM)能够显著提高MEF细胞在三因子(oct4/klf4/sox2)基础上重编程的效率(图1C，VPA为0.5mM，对照为不加本发明的小分子)。
如果在VC6分子组合上加入tranylcypromine(2μM)，我们发现这一新的小分子组合(VC6T)能够成功诱导MEF在单基因oct4的作用下实现重编程(图2，图3)：平均5×104MEF细胞能够产生大约2-15个iPS克隆。并且，在对照实验中如果未经VCT6组合诱导或未转入oct4外源基因，MEF细胞均不能重编程产生iPS克隆。同时，我们发现在VC6T组合和单oct4因子的作用下，不同品系的转基因小鼠ICR×OG，129×OG以及C57×OG的MEF细胞均能够重编程产生iPS克隆(结果同图3)。
VC6T和单oct4诱导产生的iPS克隆能够在体外长期传代，同时经检测，除了oct4还表达胚胎干细胞的关键基因如碱性磷酸酶(图4)，nanog，Sox2，Nanog，Utf1，Rex1以及SSEA1等(图5)。基因组PCR鉴定可以确认这些iPS细胞系中只有Oct4一个基因的基因组整合(图6)。RT-PCR检测显示出这些iPS细胞系和胚胎干细胞系一样表达一些多潜能性的标志基因，而诱导iPS细胞系的体细胞则不表达(图7)。
此外，DNA甲基化分析证明这类iPS细胞的oct4和nanog启动子去甲基化程度以及和鼠胚胎干细胞相类似(图8)。基因芯片分析结果亦表明单oct4因子和VC6T诱导产生的iPS细胞其基因表达谱和四因子诱导的iPS细胞和鼠胚胎干细胞相似(图9)。此外，oct4因子和VC6T诱导产生的iPS细胞具有向外、中、内三个胚层细胞多向分化的潜能，并且移植到免疫缺陷小鼠体内能够产生畸胎瘤(图10，在畸胎瘤的切片图中可以看到肠道上皮，黑素细胞，肌肉细胞，类神经管等组织细胞类型)。
将oct4因子和VC6T诱导产生的iPS细胞和八细胞胚胎融合并移植入小鼠囊胚内，那么这群iPSC来源的细胞能够在小鼠体内继续发育，生成嵌合鼠(图11)。并且，在17天的胚胎中能够观察到GFP阳性的细胞(图12，上图phase为生殖嵴形态图，下图GFP为绿色荧光视野)，证明iPSC来源的细胞能够发育为生殖细胞。
分离嵌合鼠的组织器官进行基因组PCR检测可发现，嵌合鼠的各个组织器官中均可检测出供体细胞特异的pOct4-GFP基因片段(图13，显示嵌合鼠各个器官中检测到pOct4-GFP的基因组片段)，表明含有pOct4-GFP基因组片段的iPS细胞整合到了嵌合鼠的各个组织器官中，具有较高的嵌合能力。从而证实iPS细胞具有和胚胎干细胞类似的多潜能的分化能力。
因此，从整体而言，oct4因子和VC6T诱导产生的iPS细胞具有和鼠胚胎干细胞相似的特性，即具有维持自我更新的能力以及分化的全能性。
我们利用上述方法，还尝试了在成体小鼠的成纤维细胞(维通达)中诱导iPS细胞。尽管成体小鼠成纤维细胞诱导iPS细胞的效率低于MEF(胚胎成纤维细胞)。但我们仍然成功得到了来自于成体小鼠成纤维细胞的iPS细胞克隆(图17A)，经过实施例中描述的AP染色(图17B)，免疫荧光(图17B)，基因组PCR(图17C)等鉴定分析为只插入了外源Oct4基因的iPS细胞克隆。
经过小分子浓度的依次调试，我们也发现VC6T四个小分子的组合在一定浓度范围内均可诱导iPS细胞克隆(图16)。
此外，我们还尝试用更少的小分子来进行单oct4的iPS细胞的诱导。我们首先发现，3个小分子(VC6)就可以足够诱导iPS细胞(表1，图15)。我们还发现，最少2个小分子(CHIR99021和616452)就足够在单个oct4存在的情况下诱导iPS细胞(表1，形态同图15和18)。在有bFGF(Peprotech，10ng/mL)提高效率的情况下，更能稳定的得到只用了两个小分子(CHIR99021和616452)的iPS细胞克隆(表1，形态同图15和18)。表1不同小分子组合在只转导Oct4的情况下诱导iPS细胞的数量
a.
| VCT6 | CT6 | VC6 | C6 | VT6 | VCT | |
| 不加bFGF | 1/2/1 | 3/2/0 | 0/2/0 | 0/0/0 | 0/0/0 | 0/0/0 |
| 加bFGF | 8/6/8 | 58/30/36 | 8/2/1 | 9/18/10 | 0/1/1 | 0/0/0 |
b.
| VCT6 | VC6 | C6 | 6 | Null | |
| 不加bFGF | 2/2/3 | 2/3/0 | 0/3/0 | 0/0/0 | 0/0/0 |
| 加bFGF | 4/2/3 | 33/2/3 | 1/0/0 | 0/0/0 | 0/0/0 |
c.
| VCT6 | VC6 | C6 | 6 | Null | |
| 不加bFGF | 1/1/1 | 0/0/1 | 0/0/0 | 0/0/0 | 0/0/0 |
| 加bFGF | 2/1/2 | 0/2/1 | 1/1/1 | 0/0/0 | 0/0/0 |
d.
注：a，b，c，d分别为四次独立实验。表格中的数字表示每4×104诱导得到的GFP+的iPS细胞克隆数(典型的克隆形态见图15和18)。用斜杠隔开的3个数字表示同批实验的三个平行处理的细胞样品。Null表示不加小分子的情况。表格中的最后一行是在bFGF存在的情况下得到的iPS细胞克隆数量。
我们还尝试使用和所述4个小分子作用靶点相同的其它抑制剂的作用。我们发现用另一种HDAC抑制剂butyrate替代VPA，用另一种H3K4去甲基化抑制剂phenelzine替代Tranylcypromine，另一种TGF-beta抑制剂SB431542替代616452，另一种GSK3-beta抑制蛋白wnt3a替代CHIR99021，均可成功诱导单Oct4基因的iPS细胞(表1.d，形态同图15和18)。得到的iPS细胞克隆表达GFP荧光(来自其中整合的pOct4-GFP的报告体系)(图18a，图18b分别为用Wnt3a替代CHIR99021、以及用butyrate替代VPA得到的iPS细胞克隆)
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Claims (14)
1.Oct4联合由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合或Oct4联合由GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，或Oct4联合由HDAC抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合用于诱导多潜能干细胞产生的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述HDAC抑制剂是VPA，butyrate或TSA；所述GSK3-beta抑制剂是CHIR99021，BIO或Gene ID：22416的wnt3a编码的Wnt3a蛋白；所述TGF-beta抑制剂是616452或SB431542；所述H3K4去甲基化抑制剂是tranylcypromine或phenelzine，其中VPA，CHIR99021，616452，tranylcypromine，TSA，SB431542，BIO和phenelzine的结构式如下：
3.权利要求2的用途，其中butyrate是丁酸钠，结构式如下：
phenelzine是phenelzine磺酸盐，结构式如下：
4.一种制备诱导多潜能干细胞的方法，包括向分化的细胞中提供诱导因子，所述诱导因子是Oct4和由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合或Oct4和由GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，或Oct4和由HDAC抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合。
5.权利要求4的方法，其中所述HDAC抑制剂是VPA，butyrate或TSA；所述GSK3-beta抑制剂是CHIR99021，BIO或Gene ID：22416的wnt3a编码的Wnt3a蛋白；所述TGF-beta抑制剂是616452或SB431542；所述H3K4去甲基化抑制剂是tranycylpromine或phenelzine，其中VPA，CHIR99021，616452，tranycylpromine，TSA，SB431542，BIO和phenelzine的结构式如权利要求2中所示。
6.权利要求4的方法，还使用碱性成纤维细胞生长因子。
7.权利要求4的方法，其中所述分化的细胞是皮肤细胞，肝细胞，胃细胞，角质细胞或血液细胞。
8.权利要求4的方法，其中所述分化的细胞来源于哺乳动物。
9.权利要求8的方法，其中所述哺乳动物是人、鼠或灵长类动物。
10.权利要求4的方法，其中Oct4是DNA，mRNA或蛋白形式。
11.一种制备诱导多潜能干细胞的试剂盒，包括向分化的细胞中提供的诱导因子，所述诱导因子包括Oct4和由HDAC抑制剂，GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合或包括Oct4和由GSK3-beta抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合，或包括Oct4和由HDAC抑制剂，TGF-beta抑制剂和H3K4去甲基化抑制剂组成的组合。
12.权利要求11的试剂盒，还包含碱性成纤维细胞生长因子。
13.权利要求11-12中任一项的试剂盒，其中所述HDAC抑制剂是VPA，butyrate或TSA；所述GSK3-beta抑制剂是CHIR99021，BIO或GeneID：22416的wnt3a编码的Wnt3a蛋白；所述TGF-beta抑制剂是616452或SB431542；所述H3K4去甲基化抑制剂是tranycylpromine或phenelzine，其中VPA，CHIR99021，616452，tranycylpromine，TSA，SB431542，BIO和phenelzine的结构式如权利要求2中所示。
14.权利要求11的试剂盒，其中Oct4是DNA，mRNA或蛋白形式。
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