CN104894060B - 诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法及其应用。具体地，本发明涉及采用组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂、糖原合成酶激酶(GSK‑3)抑制剂和转化生长因子β(TGF‑β)信号通路抑制剂的组合，在正常生理低氧环境下诱导成纤维细胞、上皮细胞等体细胞来诱导形成具有良好多能性以及传代稳定性的神经干细胞。本发明方法无需引入外源性基因，且制备时间远远短于现有技术，有望开发成为治疗神经系统疾病(尤其是神经系统退行性病变)的治疗方法或药物，因此具有良好的临床应用前景。

Description

诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术和神经发育领域，具体地，本发明涉及一种诱导体细胞转转分化为神经干细胞的方法及其应用。
背景技术
终末分化细胞被认为是一类具有特定功能和表型，并丧失进一步发育潜能的细胞。但是，早期研究发现终末分化细胞的细胞核可被用于克隆动物，此外，体外细胞融合也可以导致细胞谱系的重编程，以上结果表明发育过程中的表观遗传学修饰是可逆的。近期大量研究发现，通过特异转录因子组合不但可以诱导体细胞通过重编程去分化为多潜能干细胞，也可以直接转分化为其他谱系的特定体细胞，从而为病人的个性化治疗提供新的细胞来源。
神经干细胞是一类能够自我增殖、更新和分化为不同神经类细胞的细胞，具有巨大的研究和临床应用价值。目前，从脑组织提取神经干细胞和从胚胎干细胞和诱导性多能干细胞分化为神经干细胞的方法已经成熟，此外，不同因子组合诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法也日渐完善；但是现有的转分化方法涉及到外源基因的介入，具有很大的临床安全隐患。
因此，本领域迫切需要开发不需要外源基因介入的诱导体细胞转分化为神经干细胞将为神经干细胞的方法。
发明内容
本发明提供了一种在低氧(尤其是正常生理低氧)环境下诱导体细胞转分化为神经干细胞将为神经干细胞。
本发明第一方面，提供了一种小分子化合物组合，所述的小分子化合物包括以下组分：
(a)组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂；
(b)糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂；
(c)转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂；和
(d)任选的药学上可接受的载体。
本发明第二方面，提供了一种小分子化合物组合，所述的小分子化合物由以下组分构成：
(a)组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂；
(b)糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂；
(c)转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂。
本发明第三方面，提供了第一或第二方面所述的组合物的用途，用于在低氧环境下诱导体细胞转分化为神经干细胞。
在另一优选例中，所述的低氧环境包括正常生理低氧环境。
在另一优选例中，所述的低氧环境为氧浓度3-8％的环境，较佳地，为4-6％。
在另一优选例中，所述的体细胞包括成纤维细胞、上皮细胞。
在另一优选例中，所述的体细胞来源于哺乳动物，较佳地为人、啮齿动物(小鼠、大鼠)。
在另一优选例中，所述的成纤维细胞包括小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠尾尖成纤维细胞、人皮肤成纤维细胞。
在另一优选例中，所述的上皮细胞分离自人尿液。
本发明第四方面，提供了一种体外诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法，在低氧环境以及本发明第一或第二方面所述的小分子化合物组合存在的培养条件下，培养体细胞。
在另一优选例中，所述的培养条件还包括神经干细胞培养基。
在另一优选例中，所述的神经干细胞培养基含有表皮生长因子EGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、肝素、或其组合。
在另一优选例中，所述的培养为至少培养4代，较佳地，至少5-8代，更佳地，至少10-15代。
在另一优选例中，所述的小分子化合物组合中HDACs抑制剂包括丙戊酸钠(VPA)、丁酸钠(NaB)、或曲古抑菌素A(TSA)；和/或
所述的GSK-3抑制剂包括CHIR99021、氯化锂(LiCl)、或碳酸锂(Li2CO3)；和/或
所述的TGF-β信号通路抑制剂包括Repsox、SB431542、或曲尼司特(Tranilast)。
在另一优选例中，所述小分子化合物组合中各组分的最低有效浓度如下所示：
HDACs抑制剂：VPA：0.2-1mM，较佳地0.3-0.8mM，更佳地，0.4-0.6mM；NaB0.2-1mM，较佳地0.3-0.8mM，更佳地，0.4-0.6mM；TSA5-20nM，8-15nM，更佳地，10-12nM；
GSK-3抑制剂：CHIR990211-5μM，较佳地2-4μM；LiCl0.5-3μM，较佳地1-2μM；Li2CO30.05-1mM，较佳地，0.1-0.8mM，更佳地，0.2-0.5mM；
TGF-β抑制剂信号通路：Repsox0.2-3μM，较佳地，0.5-2μM；SB4315420.2-3μM，较佳地0.5-2μM；Tranilast10-50μM，较佳地，20-40μM。
本发明第五方面，提供了一种神经干细胞，所述的神经干细胞是由本发明第四方面所述的方法制备的。
在另一优选例中，所述的神经干细胞具有以下一个或多个特征：
(i)神经干细胞特异性基因高表达；
(ii)神经干细胞多能性基因高表达；
(iii)神经干细胞具有分化多潜能性。
在另一优选例中，所述的神经干细胞特异性基因包括Nestin、Sox2、Blbp、Pax6和Ascl1。
在另一优选例中，所述的神经干细胞多能性基因包括Nestin、Sox2、Blbp和Pax6。
在另一优选例中，用于制备预防或治疗神经系统疾病的药物组合物。
在另一优选例中，所述的神经系统疾病包括神经退行性病变、由于基因突变引起的神经系统疾病，以及因脑外伤或脑溢血等导致的神经系统病变。
在另一优选例中，所述的神经系统疾病包括阿尔兹海默病、帕金森症、或亨廷顿舞蹈症。
本发明第六方面，提供了一种组合物，所述的组合物包括：本发明第五方面所述的神经干细胞。
在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物、食品组合物、保健品组合物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1、VCRP在正常生理低氧条件下诱导小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）形成致密细胞克隆。图1A显示了VCRP处理15天后，不同氧浓度（21%、3%和5%）条件下MEFs的形态学变化。20,0000细胞种植于6孔板并在21%氧浓度下培养24小时后更换为包含有小分子化合物组合VCRP（0.5mM VPA、3μM CHIR99021、1μM Repsox和2μM Parnate）的KSR培养液，每5天更换一次培养液直至20天；处理至第10天，仅正常生理低氧条件下的药物处理组开始出现致密细胞克隆。右图为细胞克隆数目统计。图1B显示了正常生理低氧条件下VCR处理组的致密细胞克隆的碱性磷酸酶（AP）表达量显著增高。每20,0000细胞中约有40个克隆，其中3/4的克隆表达碱性磷酸酶。标尺为200μm；所有数据采用mean±SEM；代表性图片来自于至少三次的独立实验。
图2、筛选VCRP组合中的必要化合物。图2A显示了正常生理低氧条件下，不同化合物组合诱导MEFs产生的克隆数目。图2B显示了正常生理低氧条件下，VCR（0.5mM VPA、3μMCHIR99021和1μM Repsox）基础之上添加其他化合物（1μM OAC1（O）,7.5μM Luteolin（L）,300ng/mL poly I:C(I)）诱导细胞产生的克隆数目（第15天）。图2C显示了MEFs在不同氧浓度（21%和5%）下经VCR处理10天后的Sox2表达量检测。图2D显示了正常生理低氧条件下，不同化合物及其组合处理细胞10天后的Sox2表达量检测。所有数据采用mean±SEM；代表性图片来自于至少三次的独立实验。
图3、化合物组合VCR在生理正常生理低氧条件下诱导小鼠胚胎成纤维细胞到神经干细胞。图3A显示了化合物组合VCR在生理正常生理低氧条件下诱导碱性磷酸酶AP阳性的致密克隆。小鼠胚胎成纤维细胞在21%(正常氧压)或5%(正常生理低氧)O2培养条件下，用化合物组合VCR(0.5mM VPA、3μMCHIR99021和1μM Repsox)处理。克隆是在VCR处理15天后计数的。柱形图代表起始的20万细胞诱导产生的克隆数目。图3B显示了定量链式聚合酶反应检测多能性相关基因的相对表达水平。所有的样品都归一化到第0天，第0天的值为1。图3C显示了VCR诱导产生神经干细胞状的细胞群。VCR处理的小鼠胚胎成纤维细胞经消化后在神经胚胎干细胞培养基中培养(小鼠胚胎成纤维细胞和第1、5和13代)。图3D显示了定量链式聚合酶反应检测神经干细胞特异基因的相对表达水平。所有的样品都归一化到小鼠胚胎成纤维细胞的表达水平，小鼠胚胎成纤维细胞的表达水平值为1。图3E显示了免疫荧光染色Nestin、Pax6和Sox2。细胞核用DAPI染色。Nestin/Pax6和Nestin/Sox2双阳性的细胞在右边的通道展示。图片标尺为50μm。图3F显示了从小鼠胚胎成纤维细胞诱导神经干细胞的实验策略流程图。数据是平均值±标准误，且至少进行三次重复实验，***P<0.001,**P<0.01。
图4、诱导MEFs转分化为神经干细胞（ciNPCs）。图4A显示了第1代ciNPCs的形态，Nestin、Sox2和Pax6的表达量检测。VCR处理的MEFs在包含有生长因子的神经培养液中继续培养7-10天，可观察到类似神经干细胞形态出现。通过免疫荧光染色检测了神经干细胞标记蛋白Nestin、Sox2和Pax6等的表达，并对阳性细胞进行统计。这类细胞经过进一步悬浮培养可形成Sox2和Nestin阳性的神经球。图4B显示了原代神经球经过更长代数的悬浮培养可以富集Nestin、Sox2和Pax6等阳性细胞的比例。标尺为200μm；所有数据采用mean±SEM；代表性图片来自于至少三次的独立实验。
图5、纯化合物诱导的神经干细胞比例统计。图5A显示了第13代ciNPCs的免疫荧光染色（Nestin和Sox2）。图5B显示了图5A中Nestin和Sox2阳性细胞数目统计。图5C显示了第13代ciNPCs的免疫荧光染色（Nestin和Pax6）。图5D显示了图5C中Nestin和Pax6阳性细胞数目统计。代表性图片来自于至少三次的独立实验。
图6、化合物诱导的神经干细胞的增殖和自我更新。图6A显示了第13代的化合物诱导的神经干细胞Ki67和Nestin免疫荧光染色代表性图片。图6B显示了悬浮培养的第13代的化合物诱导的神经干细胞和第5代的对照神经干细胞的神经球。图6C显示了贴壁单层培养的第23代化合物诱导的神经干细胞的Nestin、Pax6和Sox2的免疫荧光染色。图6D显示了第23代化合物诱导的神经干细胞形成的神经球Nestin、Pax6和Sox2的免疫荧光染色。细胞核用DAPI染色。图片标尺为50μm。
图7、化合物诱导的神经干细胞的基因组转录谱分析。图7A显示了聚类和热图分析芯片数据。比较来自小鼠胚胎成纤维细胞核第5及13代的化合物诱导的神经干细胞。在热图中，红色表示相对于小鼠胚胎成纤维细胞增加表达而绿色表示减少表达。图7B显示了配对散点图分析251个通过“neuro”搜索来的芯片数据库基因。红色点表达上调表达，绿色表示下调表达，而灰色表示无明显变化。图7C显示了韦恩图展示相对于小鼠胚胎成纤维细胞高表达（≥10-fold,P<0.05）的基因中，第5代的和第13代的化合物诱导的神经干细胞和对照干细胞的重叠情况。图7D显示了基因本土分析（GO分析）774个图7C中的共用基因。P值代表EASE打分。
图8、起始细胞MEFs、对照组神经干细胞（NPCs）、第5代和第31代ciNPC的全基因组表达谱分析。图8A显示了与MEFs比较，NPCs、ciNPC第5代和第31代中表达上调基因的基因本位分析（GO）。图8B显示了部分神经类基因、多潜能相关基因和成纤维细胞特异表达基因的热图。图8C显示了从MEFs到第5代和第31代ciNPC，表达量逐渐下调的基因（233条）的功能注释。图8D显示了与MEFs比较，NPCs、第5代和第31代ciNPC中表达下调基因的基因本位分析（GO）。图8E显示了脑组织特定区域表达基因的热图。P值代表EASE值；红色代表高表达，绿色代表低表达。
图9、起始MEFs中不包含有神经干细胞（NPCs）。图9A显示了神经干细胞标记蛋白的免疫荧光染色。原代MEFs培养至第3代后分别培养于包含有10%血清的DMEM或神经干细胞培养液（NEM）中7天用于后期检测。数据表明起始MEFs中不包含有Sox2、Pax6或Nestin阳性的神经干细胞，小鼠脑组织分离得到的原代神经干细胞作为阳性对照。图9B显示了qRT-PCR进一步分析在神经干细胞中特异性高表达基因的表达量。标尺为200μm；所有数据采用mean±SEM；代表性图片来自于至少三次的独立实验。
图10、与HDACs、TGF-β、GSK-3和正常生理低氧相关信号通路基因的分析。图10A显示了与HDACs相关联的196个基因的聚类分析及热图。图10B显示了与TGF-β相关联的74个基因的聚类分析及热图。图10C显示了与GSK-3相关联的114个基因的聚类分析及热图。图10D显示了与正常生理低氧相关联的71个基因的聚类分析及热图。
图11、ciNPCs体外分化的多潜能性。图11A显示了第5代ciNPCs在包含有生长因子的神经基础培养液中分化7天，可检测到GFAP阳性的胶质细胞和Tuj1阳性的非成熟神经元（左图）和MAP2阳性的成熟神经元（右图）。图11B显示了第13代ciNPCs分化得到的成熟神经元。第13代ciNPCs于神经元分化特异培养液中培养4周后，可检测到GAD67阳性和Synapsin阳性细胞。DAPI标记细胞核；标尺为50μm（左图），右图为图12B中Synapsin/Tuj1免疫荧光染色图放大8倍。
图12、化合物诱导的神经干细胞的体外和体内分化的多能性。图12A显示了星形胶质细胞标记基因GFAP，神经元标记基因Tuj1和Map2，少突胶质细胞标记基因Olig2和Mbp在第13代化合物诱导的神经干细胞在分化培养基中培养后的表达。图12B显示了第13代化合物诱导的神经干细胞在神经元分化培养基中培养4周后，免疫荧光染色NeuN、Glutamate和Synapsin。细胞核用DAPI染色。图片标尺为50μm。三次重复实验的代表性图片被展示。图12C显示了电流钳记录化合物诱导的神经干细胞分化的神经元的代表性的动作电位。图12D显示了化合物诱导的神经干细胞分化的神经元的代表性的自发突触后电流。图12E显示了电压钳记录化合物诱导的神经干细胞分化的神经元的代表性的Na+电流。图12F显示了GFP标记的化合物诱导的神经干细胞移植一个月后，检测少突胶质细胞标记基因Olig2，星形胶质细胞标记基因GFAP和神经元标记基因NeuN。GFP标记的化合物诱导的神经干细胞移植E13.5胚胎一个月后，切片小鼠脑袋并免疫荧光染色，箭头指示分别表达Olig2、GFAP或NeuN的GFP阳性细胞。细胞核用DAPI染色。图片图12A和图12B标尺为50μm。图片图12F标尺为15μm.24个小鼠胚胎用GFP标记的化合物诱导的神经干细胞移植。
图13、GFP标记的ciNPCs鉴定。图13A显示了第17代ciNPC被表达GFP的慢病毒感染后仍旧具有形成神经球能力。图13B显示了GFP-ciNPCs表达神经干细胞标记蛋白Nestin和Sox2。图13C显示了GFP-ciNPCs仍具有分化为GFAP阳性胶质细胞、Tuj1阳性神经元和Olig2阳性少突状胶质细胞的多潜能性。箭头指示为表达Tuj1或Olig2的GFP阳性细胞。标尺为50μm。
图14、体内移植表达GFP的ciNPCs。图14A显示了E13.5天小鼠胚胎脑组织接种GFP-ciNPCs1周后，GFP阳性细胞的体内分布。图14B显示了GFP-ciNPCs在体内移植1周后仍旧表达Ki67。图14C显示了GFP-ciNPCs在体内移植1周后分化为Olig2阳性或GFAP阳性细胞。图14D显示了GFP-ciNPCs在体内移植1个月后分化为Mbp阳性少突状胶质细胞或Tuj1阳性神经元。图14E显示了GFP-ciNPCs在体内移植1个月后未检测到Ki67表达。标尺为50μm；代表性图片来自于至少10只移植后小鼠的脑组织。
图15、正常生理低氧条件下，化合物组合NLS或TLT诱导MEFs转分化为神经干细胞（ciNPCs）。图15A显示了NLS诱导获得的第5代ciNPCs的贴壁形态、神经球和针对Sox2、Pax6以及Nestin的免疫荧光染色。图15B显示了TLT诱导获得的第5代ciNPCs的贴壁形态、神经球和针对Sox2、Pax6以及Nestin的免疫荧光染色。标尺为200μm；代表性图片来自于至少三次的独立实验。
图16、其它化合物组合诱导神经干细胞。图16A显示了定量链式聚合酶反应分析NLS(0.5mM NaB,1mM LiCl和1μM SB431542)（左图）或TLT(10nMTSA,0.3mM Li2CO3和30μMTranilast)在5%O2条件下处理的小鼠成纤维细胞的Sox2表达水平。所有的样品都归一化到第0天的DMSO组，它的值为1。图16B显示了NLS或TLT处理获得的神经干细胞的形态图和Nestin,Sox2及Pax6免疫荧光染色。细胞核用DAPI染色。图片标尺为50μm。图16C显示了定量链式聚合酶反应分析神经干细胞特异基因的表达水平。所有的样品都归一化到MEF组，它的值为1。数据是平均值±标准误。
图17、从小鼠尾尖成纤维细胞和人的尿液来源的上皮细胞(简称尿细胞)诱导产生神经干细胞并定性。图17A显示了定量链式聚合酶反应分析VCR在正常生理低氧条件下处理小鼠尾尖成纤维细胞后多能性相关基因的表达水平。所有的样品都归一化到d0组，它的值为1。图17B显示了小鼠尾尖成纤维细胞和第1代从小鼠尾尖成纤维细胞产生的神经干细胞的形态图。图17C显示了第13代从小鼠尾尖成纤维细胞产生的神经干细胞的形态图和Nestin,Sox2及Pax6免疫荧光染色。图17D显示了定量链式聚合酶反应分析第16代从小鼠尾尖成纤维细胞产生的神经干细胞的神经干细胞特异基因的表达水平。所有的样品都归一化到TTF组，它的值为1。图17E显示了星形胶质细胞标记基因GFAP，神经元标记基因Tuj1和Map2，少突胶质细胞标记基因Olig2和Mbp在小鼠尾尖成纤维细胞衍生的第13代化合物诱导的神经干细胞在分化培养基中培养后的表达。图17F显示了人的尿细胞在正常生理低氧处理VCR前后的相差图片。图17G显示了定量链式聚合酶反应分析VCR在正常生理低氧条件下处理人尿细胞后多能性相关基因的表达水平。所有的样品都归一化到d0组，它的值为1。图17H显示了第5代从人尿细胞产生的神经干细胞和对照人的诱导神经干细胞的贴壁单层培养和悬浮培养的形态图。人的诱导神经干细胞从特定的转录因子诱导而来。图17I显示了定量链式聚合酶反应分析神经干细胞特异基因的表达水平。所有的样品都归一化到hUCs组，它的值为1。图17J显示了星形胶质细胞标记基因GFAP，神经元标记基因Tuj1和Map2在人的尿细胞衍生的第5代化合物诱导的神经干细胞在分化培养基中培养后的表达。细胞核用DAPI染色。图片标尺为50μm。数据是平均值±标准误。
三次重复实验的代表性图片被展示。
图18、正常生理低氧条件下，VCR诱导小鼠尾尖成纤维细胞转分化为神经干细胞（第5代）。Nestin、Sox2和Pax6的免疫荧光染色（左图）及对应的统计图（右图）。标尺为50μm；代表性图片来自于至少三次的独立实验。
图19、正常生理低氧条件下，VCR诱导人尿液中的细胞转分化为神经干细胞。图19A显示了第11代和第22代的人尿液中的细胞来源ciNPCs的免疫荧光染色（Nestin和Sox2）。图19B显示了人尿液中的细胞来源ciNPCs与阳性对照iNPCs的生长曲线。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的化合物筛选，首次意外地发现了特定小分子化合物的组合能够诱导体细胞转分化为神经干细胞。实验表明，将组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂、糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂、转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂这三类化合物联合应用于体细胞(如成纤维细胞)时，能够使体细胞进入重编程并转分化为与神经干细胞外形、性能特征(如良好的多能分化性)极其相似的，并具有稳定传代功能的神经干细胞，从而摆脱了只有引入外源基因才能够诱导体细胞分化为神经干细胞的方法。在此基础上，完成了本发明。
组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂
组蛋白去乙酰化酶是一类蛋白酶,对染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用。在细胞核内，组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化过程处于动态平衡，并由组蛋白乙酰化转移酶和组蛋白去乙酰化酶共同调控。组蛋白去乙酰化酶抑制剂则可通过提高染色质特定区域组蛋白乙酰化程度来改变染色质结构，从而调控细胞凋亡及分化相关蛋白的表达和稳定性；按结构类型,组蛋白去乙酰化酶抑制剂大致可以分为:异羟肟酸类化合物（如曲古抑菌素A等）、环状四肽类化合物（如Trapoxin等）、脂肪酸盐类化合物（如丙戊酸钠、丁酸钠等）、苯甲酰胺类化合物（如MS275等）和亲电酮类化合物（如三氟甲基酮等）等。
糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂
糖原合成酶激酶是一个多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,不仅参与肝糖代谢过程,而且还参与Wnt和Hedgehog信号通路,通过磷酸化多种底物蛋白来调节细胞的生理过程。糖原合成酶激酶抑制剂作为目前备受关注的小分子抑制剂,对治疗神经退化性疾病、癌症、Ⅱ型糖尿病具有潜在的疗效；可分为ATP竞争性抑制剂和ATP竞争性抑制剂，前者包括Paullones、靛玉红类（Indirubin）、马来酰胺类（Maleimides）、嘧啶类（Pyrimidines）、吡啶类（Pyridines）和吡嗪（Aloisines）等；后者包括Li离子和TDZD衍生物。
转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂
TGF-β属于一类促进细胞生长和转化的细胞因子超家族，目前共发现5种亚型，其胞浆内信号传导通路主要包括膜受体丝氨酸/苏氨酸激酶系统和Smad蛋白信号传递系统。TGF-β抑制剂研究主要包括抑制TGF-β及其受体的表达（如曲尼司特等），阻断TGF-β和受体的结合（如SB-431542、LY2157299等），干扰受体激酶信号传递（如SIS3等）。
小分子化合物组合
如本文所用，术语“小分子化合物组合”指的是含有以下组分的组合：(a)组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂；(b)糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂；(c)转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂。此外，所述的小分子化合物组合还可以含有药学上可接受的载体，在这样的情况下，所述的小分子化合物组合即为具有诱导体细胞转分化为神经干细胞活性的药物组合物。
其中，所述的HDACs抑制剂包括VPA(丙戊酸钠)、NaB(丁酸钠)、或TSA(曲古抑菌素A)；
所述的GSK-3抑制剂包括CHIR99021、LiCl(氯化锂)、或Li2CO3(碳酸锂)；
所述的TGF-β抑制剂信号通路包括Repsox、SB431542、或Tranilast(曲尼司特)。
可用于本发明小分子组合物的各组分之间的比例没有任何限制。通常，各组分应当满足其最低的有效浓度。在一优选例中，所述小分子化合物组合中各组分的最低有效浓度如下所示：
HDACs抑制剂：VPA：0.2-1mM，较佳地0.3-0.8mM，更佳地，0.4-0.6mM；NaB0.2-1mM，较佳地0.3-0.8mM，更佳地，0.4-0.6mM；TSA5-20nM，8-15nM，更佳地，10-12nM；
GSK-3抑制剂：CHIR990211-5μM，较佳地2-4μM；LiCl0.5-3μM，较佳地1-2μM；Li2CO30.05-1mM，较佳地，0.1-0.8mM，更佳地，0.2-0.5mM；
TGF-β抑制剂信号通路：Repsox0.2-3μM，较佳地，0.5-2μM；SB4315420.2-3μM，较佳地0.5-2μM；Tranilast10-50μM，较佳地，20-40μM。
在本发明中，验证了VCR(VPA、CHIR99021、Repsox)、NLS（NaB、LiCl和SB431542)和TLT（TSA、Li2CO3和Tranilast）的组合具有良好的诱导体细胞分化神经干细胞的活性。当然，本领域技术人员也可以根据本发明的启示，对以上三类抑制剂进行任意的组合，开发新的具有诱导体细胞转分化神经干细胞活性小分子化合物组合。
神经干细胞
神经干细胞(Neural Stem Cells，NSCs或Neural progenitor Cells，NPCs)具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。在脑脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。
如本文所用，术语“ciNPCs”、“化合物诱导的神经干细胞”可互换使用，指的是体细胞经本发明小分子化合物组合(药物组合物)诱导后，产生的神经干细胞。
如本文所用，术语“NSCs”、“NPCs”、“神经干细胞”可互换使用，指的是来自哺乳动物(如人或小鼠)的不同部位的神经干细胞，在本文中，通常用于ciNPC的对照。
神经干细胞特异性基因
如本文所用，术语“神经干细胞特异性基因”指的是较非神经干细胞而言，在神经干细胞中高表达的基因(或其蛋白)。通常，所述的神经干细胞特异性基因包括Sox2、Nestin、Pax6、Ascl1和Blbp等。
如本文所用，术语“神经干细胞多能性基因高表达”指的是较非神经干细胞而言，在神经干细胞中高表达的，并与神经干细胞多能分化性能相关的基因(或其蛋白)。通常，所述的神经干细胞多能性基因包括Sox2、Nestin、Pax6、Ascl1和Blbp等。
低氧环境
如本文所用，术语“低氧环境”指的是模拟体内细胞环境的体外或体内，通常，所述的低氧环境指的是正常生理低氧环境，例如氧浓度(或氧压)界于3%-8%之间的环境，较佳地，所述的正常生理低氧环境指的是氧浓度为4%-6%的环境，更佳地，为5%。
本发明实验证明，3%-5%(尤其是5%)的环境是获得神经干细胞效果最佳的环境，且对比于正常氧浓度(约21%)的环境而言，低氧(尤其是正常生理低氧环境)对体细胞转分化为神经干细胞是必须的。
诱导方法
本发明诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法通常指的是体外的诱导方法，当然也可以根据体外诱导实验进行进一步的体内诱导，这可以根据本领域常规技术或方法进行研究获得。
通常，可在本发明小分子化合物组合存在的条件下，培养体细胞。
此外，还可以采用本领域常规的神经干细胞或神经细胞培养基对所述的体细胞进行进一步的培养。优选的，所述的神经干细胞或神经细胞培养基中可以含有表皮生长因子EGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、肝素、或其组合。
药物组合物
本发明提供了一种包括本发明所述神经干细胞的组合物。
优选地，所述的组合物为药物组合物、食品组合物、保健品组合物等。
本发明的药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量活性成分：本发明所述的神经干细胞。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的载体”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明还提供了所述药物组合物的用途，用于预防或治疗神经系统疾病。
本发明有益效果
本发明方法能够在不引入外源性基因的情况下，成功利用特定信号通路的抑制剂的组合，诱导多种体细胞转分化为神经干细胞，且所制备的干细胞外形与神经干细胞极其相似并具有良好的多能分化性能
此外，目前现有的获得病人特异的iNPCs细胞的方法包括通过转一组转录因子诱导转分化或者通过人成纤维细胞来源的iPSCs分化为iNPC获得。根据现有的方法，从获得iPSCs到得到iNPCs将耗费至少3个月的时间。而按照本发明诱导方法，能够在更短的时间能获得相近数量的ciNPCs。
因此，本发明为研究病人特异的神经细胞及相关细胞治疗提供了一个更好的备选策略。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用方法
细胞培养
原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）分离于E13.5天的小鼠胚胎，如文献所述。简单来说，剪除头部，四肢，内脏组织，生殖腺和脊柱；将剩余的部分剪成小块，再用胰酶消化。分离获得的MEFs传至第3代，然后即可用于其他实验。小鼠尾尖成纤维细胞（TTFs）分离于新生3天的C57BL/6小鼠。简单来说，尾部的前1/5部分切成小块并且培养6天。从尾尖小块迁移出来的传至第3代，然后就可以用于其他实验。小鼠的MEFs和TTFs在DMEM（LifeTechnologies,C11965），37℃，5%CO2中培养，其中添加了10%FBS（PAA Laboratories,A15-101），1mM GlutaMAX（Life Technologies,35050-061）和0.1mM非必须氨基酸（NEAA,Millipore,TMS-001-C）。小鼠神经干细胞取自E12.5天的小鼠胚胎，在神经细胞扩大培养液（NEM）中培养，添加30ng/ml heprin，20ng/ml EGF和20ng/ml bFGF。人尿细胞(分离自人尿液的上皮细胞)收集和培养在REGM（Lonza,CC-4127）培液中。
ciNPCs的诱导
对于MEFs和TTFs的神经干细胞诱导，起始细胞在DMEM中培养24小时后换成KSR培液，其中包含knockout DMEM（Life Technologies,10829-018）15%去除血清替代物，1%NEAA（Life Technologies,35050），1%Glutamax（Life Technologies,35050-061），1%丙酮酸钠（Life Technologies,11360），0.1mMβ巯基乙醇（Life Technologies,21985-023）和1000U/ml的白血病抑制因子（LIF）（Chemicon,ESG1107）。细胞培养在37℃，5%O2（hypoxia）和5%CO2条件下。含有化合物的培液每五天换一次。对于人细胞的ciNPCs诱导，尿细胞铺在Matrigel包被的6孔板培养在RGEM培养液。2天后，培液换成mTeSR（Stem Cell Technologies,05850/05896）并包含化合物组合并且在37℃，5%O2（hypoxia），5%CO2条件下培养。培液每5天换一次。当小鼠成纤维细胞或人尿细胞培养过程中形成紧密的细胞克隆，包含克隆的细胞混液在添加了生长因子的NEM中进一步培养。ciNPCs在多轮神经球悬浮培养过程中进一步富集。
ciNPCs的体外分化
小鼠成纤维细胞来源的ciNPCs培养在神经细胞扩大培养液中，其中添加EGF（20ng/ml）和bFGF（20ng/ml）。对于通用的神经分化方法，20000ciNPCs铺到PDL/Laminin包被的24孔板上，在不含EGF和bFGF的N2B27（DMEM:F12,1%N2,2%B27）培液中培养。稳定的星形胶质细胞生成诱导是在无生长因子的N2B27中添加BMP4（50ng/ml;R&D Biosystems）和1%FBS。神经元分化则是将ciNPCs铺在PDL/Laminin包被的盖玻片上，在神经分化培养基（Neural basal medium,2%B27,1%N2,10ng/ml BDNF,10ng/ml GDNF,10ng/ml IGF-1,1μMcAMP,200μM Ascorbic acid）中培养。神经元分子标记基因表达和电生理分析分别在特定的时间点进行检测。而少突胶质细胞的分化，则是将20000细胞铺在PDL/Laminin包被的盖玻片上，在包含bFGF（10ng/mL;Invitrogen）和PDGF-AA（10ng/mL;Peprotech）的N2B27培养中培养7天，然后加入T3（100ng/mL;20Sigma-Aldrich）后分化5天。
对于hUC来源的ciNPC的神经元分化，神经球用accutase（Life Technologies）消化以后，10000细胞铺至Poly-L-ornithine/laminin包被的玻片上。第二天，培养液中撤去EGF和bFGF，加入神经营养因子，其中包括BDNF，GDNF，IGF（均为10ng/mL）和100mM cAMP，200ng/mL的ascorbic acid。神经元分化培液两天换一次，2周以后，检测神经元分子标记的表达，约50天以后，检测星形胶质细胞分子标记的表达。
碱性磷酸酶分析
染色之前，细胞用4%多聚甲醛固定2分钟。碱性磷酸酶（AP）染色参照生产商的操作步骤用碱性磷酸酶试剂盒（Sigma-Aldrich,85L3R）进行染色。图像获得采用ZeissObserver Z1。
免疫荧光染色
培养于玻片上的细胞先用4%PFA溶液固定10分钟，然后在包含或不包含0.5%TritonX-100的封闭缓冲液（1%bovine serum albumin in PBS）中室温（RT）封闭30分钟。随后，样品孵育一抗4℃过夜，而后和适合的荧光二抗室温孵育1小时。细胞核用DAPI进行染色。图片分别用荧光显微镜（Olympus IX71）和Leica Sp-8共聚焦显微镜拍照。采用的特异性一抗包括Nestin（1:1000,Millipore,MAB5326），Sox2（1:200,R&D,AF2018），Pax6（1:500,Covance,RPB-278P），Ki67（1:500,Abcam,ab15580），GFAP（1:1000,Dako,Z0334），Tuj（1:500,Covance,MMS435P），MAP2（1:250,Millipore,AB5622），MBP（1:250,Covance,SMI94），Oligo2（1:400,Santa Cruz,sc-19969），NeuN（1:200,Millipore,MAB377），GAD67（1:200,Millipore,MAB5406），Synapsin（1:200,Millipore,AB1543），Glutamate（1:200,Millipore,MAB5304）。
神经球的染色，神经球悬液先转移至15ml管，使神经球自然沉降。然后将神经球于4%PFA中室温固定15分钟，于4℃5ml30%蔗糖中孵育过夜直到稳定。神经球沉淀转移至cryostat chuck上的组织冻存液中（Leica,020108926）。10μm厚度的神经球切片准备并包埋在箔中，保存于-80℃待分析。
小鼠大脑切片制备如前所述。简单来说，用4%PFA PBS心脏灌流小鼠大脑。冷冻于30%蔗糖后，小鼠大脑以20μm厚冰切并做免疫荧光染色分析。
基因芯片分析
全基因组表达分析由Shanghai OE Biotech.Co.,Ltd公司根据安捷伦科技基于单色芯片分析的操作方法进行。简单来说，RNA样品根据生产商说明书用TRIzol（Sigma-Aldrich,T9424）进行抽提，并且RNA完整性用Agilent2100bioanalyzer进行分析。每个样品的200ng总RNA通过单色快速标记扩增试剂盒（Agilent,5190-2305）进行标记反应。标记扩增好的RNA用RNeasy mini试剂盒（Qiagen,74104）进行纯化。用于8X60array的cDNA芯片来自安捷伦科技，并且采用安捷伦基因表达杂交试剂盒（catalog number:G4852A）。于65℃杂交17小时并清洗后，芯片用安捷伦芯片扫描仪（Agilent Technologies,USA）进行扫描。图像提取软件（version10.7.1.1,Agilent Technologies）用于分析芯片图像来获得原始数据。GeneSpring软件用于完成对原始数据的基础分析。首先，采用分位数算法对原始数据进行归一化。差异表达的基因通过倍数变化并设置10的阈值来进行鉴别。随后Gene Ontology（GO）分析和KEGG分析应用于确定这些差异表达mRNAs的作用。来自entrenz-gene数据库的39430个基因的55821个探针被检测。
定量实时PCR
细胞总RNA根据生产商说明书（Sigma-Aldrich,T9424）用Trizol试剂进行抽提。抽提的RNA采用随机六聚体引物和M-MLV反转录酶（Promega）反转为cDNA。cDNA样品与2XPCRmix（Qiagen）和Eva Green（Biotium）混合后置于MX3000P Stratagene PCR仪进行实时定量PCR分析。相对表达量通过与内参（HPRT）比较进行归一化处理。PCR所用引物的序列如下：
电生理分析
对ciNPC分化获得的neurons进行全细胞膜片钳记录。采用Multiclamp700Bamplifier（Molecular Devices）进行记录。包含神经元的玻片始终保持在常温且有新鲜的人工脑脊液（ACSF）中。ACSF包含126mM NaCl，3mM KCl，1.25mM KH2PO41.3mM MgSO4，3.2mMCaCl2，26mM NaHCO3和10mM的葡萄糖，用95%O2和5%CO2吹出气泡。信号在10kHz with a2kHzlow-pass过滤器中进行采样.全细胞电容被全补偿。Ra>50M或信号波动>20%的信号被排除。细胞内液包含93mM K-gluconate，16mM KCl，2mM MgCl2，10mM HEPES4mM ATP-Mg，0.3mMGTP-Na2，10mM creatine phosphate,0.5%Alexa Fluor568hydrazide（Invitrogen）（pH7.25,290/300mOsm），0.4%neurobiotin（Invitrogen）。膜电位稳定在约-70mV,采用2pA增量的反复电流的输入来激发动作电位。采用-70至+70mV的电位差来激活钠离子内向电流和钾离子外向电流。数据均用pClamp（Clampfit）进行分析。
体内移植
体内移植按照文献进行操作。简单来说，E13.5天孕期的孕鼠C57BL/6的子宫角培养在无菌的环境中。包含约20个GFP-ciNPC神经球的PBS通过斜角校准的玻璃微管注入到胚胎脑室，其中神经球的直径不得超过80μm。此后，子宫角被替代，腹膜腔用10mL温热PBS进行灌洗，PBS含有抗生素，然后缝合伤口。1周或1月之后，小鼠在冰上麻醉或者戊巴比妥钠麻醉，脑片制备如前所述并可用于后续分析。
动物饲养
所有小鼠可以随时获得给予的食物和水。所有实验都遵守动物关爱与利用国家研究机构健康指南进行操作并由中科院上海生命科学研究院生物研究伦理委员会批准。
数据分析
所有定量数据按照期望标准误来进行统计分析。除非有其他说明，统计显著性差异均由单向方差分析完成，并以P值的形式具体在文章和图片叙述中阐述。
实施例1正常生理低氧条件下筛选诱导体细胞产生神经干细胞的化合物组合
1.1筛选VPCR组合在正常生理低氧情况下培养体细胞形成的克隆情况
通过大量组合物筛选，基本确定采用化合物组合VPCR（VPA、CHIR99021、Repsox和Parnate）在3%或者5%O2条件下处理小鼠成纤维细胞10天左右就可以出现致密的克隆，而在21%O2条件下则无致密克隆生成（图1A）。20万个起始细胞可以出现大约40个致密的克隆。中间态克隆的诱导效率在5%O2条件下相对于3%O2条件略高，因此，在后续的诱导实验中采取5%O2的培养条件。
1.2对1.1中的细胞克隆进行AP染色
对这些中间态克隆进行碱性磷酸酶AP染色发现，约有3/4的致密克隆高表达碱性磷酸酶AP（图1B、图3A），而在正常氧压条件下VPCR处理的小鼠成纤维细胞中既未发现致密克隆也未发现AP阳性的细胞。
1.3对1.1中的VPCR的组分进行进一步筛选
检查VPA、CHIR99021、Repsox和Parnate都是诱导获得致密克隆的必要成分。为此，采用VPCR中的任三种化合物的组合处理小鼠成纤维细胞，检查能否获得致密的克隆形成。
结果如图2所示，Parnate对于致密克隆的形成是可有可无的，而另外三个化合物则是必需的成分，不用这三个化合物中的任一个则大大地减少诱导形成的致密克隆的数目（图2A）。在5%O2条件下用VCR（VCR、CHIR99021和Repsox）处理获得的致密克隆中有90%是AP阳性的。进一步实验表明，再添加一些促重编程化合物31-33到VCR组合中也无进一步的提升效果（图2B）。
结论：VCR化合物组合中的任一组分(即VPA、CHIR99021、Repsox)对体细胞在正常生理低氧条件下转分化为神经干细胞是必须的。
实施例2VCR处理细胞克隆的特性检测
2.1Sox2在不同氧压下的表达
在正常氧压条件下或用其它缺失Repsox、CHIR99021或者VPA的化合物组合则不能有效的诱导Sox2表达（图2C和2D）
2.2不同神经干细胞相关基因在细胞克隆中的表达
如图3B所示，在正常生理低氧条件下用VCR处理小鼠成纤维细胞，发现Sox2的表达在第5天明显提高，在第10天达到顶峰,在第15天略有回落；而Oct4和Nanog的表达则只是在第10天略有提高表达。
结论：小分子化合物组合VCR在5%O2正常生理低氧条件下有利于小鼠胚胎成纤维细胞转分化到中间态的致密克隆。
实施例3VCR处理细胞克隆的神经干细胞分化
3.1培养克隆的形态观察
在正常生理低氧条件下，将VCR组合处理10天左右的细胞进行消化重新铺种并在含肝素heparin，表皮生长因子EGF，碱性成纤维细胞生长因子bFGF的神经干细胞培养基条件下培养，大约7-10天后，培养的细胞中出现神经干细胞状的双极性形态（图3C）。
3.2神经干细胞特异性基因检测
神经干细胞标记基因Nestin、Sox2和Pax6可以用免疫荧光染色方法检测到（图4A）。进一步地，逆转录聚合酶链式反应检测到神经干细胞特异基因包括Sox2、Pax6、Blbp、Ascl1和Brn2的表达水平也是增强的（图3D，ciNPCp1）。
结论：神经干细胞状的细胞出现在培养体系中。当这些细胞悬浮培养时形成了漂浮的细胞簇，细胞簇免疫荧光染色显示是Sox2和Nestin阳性的，具有神经球的性质（图4A）。收集这些漂浮的细胞簇并把它们命名为化合物诱导的神经干细胞/神经球（ciNPC）代数1（p1）。
实施例4化合物诱导的神经干细胞（ciNPC）的增殖和自我更新特性鉴定
4.1悬浮培养神经球细胞并测定其是否具有神经干细胞的基本性质(增殖和自我更新)
培养4代(p5)后，大约50%的化合物诱导的神经干细胞免疫荧光染色是Sox2阳性的，60%多的细胞室Pax6阳性的，大约40%的细胞是Nestin阳性的，而有30%的细胞是Nestin/Pax6或者Nestin/Sox2双阳性的（图4B）。
13代(p13)的化合物诱导的神经干细胞贴壁单层培养时展示了类似于小鼠胚胎神经干细胞的双极形态（图3C，ciNPC p5）。定量链式聚合酶酶反应检测不同代数的化合物诱导的神经干细胞中Sox2、Pax6、Blbp、Ascl1和Brn2的表达水平，发现悬浮培养可以很好地富集原始诱导的混合细胞中的神经干细胞（图3D，ciNPC p13）。
在细胞代数13代时，超过96%的化合物诱导的神经干细胞呈Nestin、Sox2或Pax6单阳性，大约有93%的化合物诱导的神经干细胞呈Nestin/Sox2或Nestin/Pax6双阳性（图3E，图5）,提示已经形成较纯的神经干细胞群体（图3F）。并且不仅仅这些13代的化合物诱导的神经干细胞呈增殖标记物Ki67阳性（图6A）,而且当这些神经球在低密度铺种时展示出类似于小鼠脑袋衍生的神经干细胞第5代的大小和数量（图6B）。其中，Nestin、Sox2或Pax6单阳性代表具有类似神经干细胞的细胞的生成；Nestin/Sox2或Nestin/Pax6双阳性代表神经干细胞的生成。
以上结果表明，这些化合物诱导的神经干细胞具有小鼠脑袋衍生的神经干细胞类似的增殖和自我更新能力。
4.2神经球形成能力的传代稳定性测定
对这些化合物诱导的神经干细胞的增殖能力进行进一步的检测，发现这类神经干细胞的神经干细胞标记基因表达水平和悬浮培养时的神经球形成能力直至25代仍没有改变（图6C和6D）。
结论：在正常生理低氧条件下VCR处理小鼠胚胎成纤维细胞可以获得较纯的可以扩增的神经干细胞。
实施例5化合物诱导的神经干细胞的转录谱研究
采用小鼠胚胎衍生的神经干细胞（对照NPCs）、小鼠胚胎成纤维细胞和第5代及13代的化合物诱导的神经干细胞抽提mRNA并运用芯片对这些细胞进行全基因组表达类型分析。
5.1化合物诱导的神经干细胞与小鼠神经干细胞的相似性
全基因组聚类和热图分析（图7A）和散点图分析（图8B）揭示化合物诱导的神经干细胞和小鼠胚胎成纤维细胞具有很大的不同，但是化合物诱导的神经干细胞和小鼠脑袋衍生的神经干细胞具有很大的相似性。不同代数的化合物诱导的神经干细胞和对照的神经干细胞共有774个核心靶基因（图7C），通过基因本体分析（GO分析）发现这些基因主要与神经发生和细胞形态等过程相关（图7D和图8A）。
神经干细胞特异基因比如Sox2、Pax6、Ncan、Tox3,、Hes5、Gpm6a、Nes,、Bmi1、Zbtb16、Rfx4、Gpm6a和Slc1a3在化合物诱导的神经干细胞中表达明显上调，并具有和小鼠胚胎神经干细胞相当的表达水平；然而多能性相关基因Pof5f1和Nanog的表达并未上调,说明诱导获得的神经干细胞并不具有多能干细胞的特性。（图8B）。
5.2化合物诱导的神经干细胞与小鼠成纤维细胞的区别
生物学过程比如骨架系统的表达谱是化合物诱导的神经干细胞相对于小鼠成纤维细胞最明显下调表达的基因（图8C和8D）。其中，424个基因比如Col3a1、DKK3、Thy1、Snail1和其它成纤维特异的基因的表达水平从第5代至第13代逐渐下调。这些发现表明化合物诱导的神经干细胞保存部分的成纤维细胞的表观遗传记忆，可以排除起始的小鼠胚胎成纤维细胞中可能的神经干细胞污染。另一方面，小鼠成纤维细胞直接在DMEM或神经干细胞培养基中培养并没有检测到Nestin、Sox2或者Pax6的表达（图9）。
5.3芯片数据中不同脑区特异的基因表达（图8E）
化合物诱导的神经干细胞和小鼠脑袋衍生的神经干细胞都具有较高的腹侧脑区特异的基因如Oligo2和Nkx2.2的表达水平，而没有检测到背侧脑区特异的基因如Pax3和Pax7的表达。
同时，实验还发现前脑特异基因Emx2、Foxg1和Nr2e1以及中脑特异基因Gbx2和En1的高表达，但是，并没有后脑特异基因如Hoxa7和Hoxb7的高表达。
综上，本发明所获得的化合物诱导的神经干细胞具有腹侧的前中脑区的特性，但不是很好地具有其它脑区的性质。
5.4芯片中ciNPCs和NPCs的组蛋白去乙酰化酶(HDACs)、糖原合成酶激酶3β（GSK-3）、转化生长因子β（TGF-β）和正常生理低氧信号传导通路的表达类型研究
化合物诱导的神经干细胞和对照神经干细胞中在这些信号传导通路具有相似的表达类型，并有小鼠胚胎成纤维细胞具有很大的区别（图10）。
这些数据揭示激活这几条信号传导通路对于成功的转分化小鼠胚胎成纤维细胞到神经干细胞是必需的。
结论：从基因表达谱来看，本发明化合物诱导的神经干细胞与小鼠神经干细胞具有很大的相似性，但与小鼠成纤维细胞则区别很大。此外，本发明化合物诱导的神经干细胞还具有腹侧的前中脑区的特征，且组蛋白去乙酰化酶(HDACs)、糖原合成酶激酶3β（GSK-3）、转化生长因子β（TGF-β）和正常生理低氧信号的传导通路在体细胞转化为神经干细胞的过程中是必须的。
实施例6化合物诱导的神经干细胞的多能性鉴定
6.1体外分化实验检测化合物诱导的神经干细胞的分化能力
6.11实验发现，第5代或13代的化合物诱导的神经干细胞在添加了BMP4和1%FBS并且撤掉生长因子的N2B27培养基中培养7天后，约有90%的细胞具有星形胶质细胞的形态并且免疫荧光染色是GFAP阳性的。
而在添加了B27、N2、BDNF、GDNF、IGF、cAMP和Ascorbic acid的神经基础培养基中培养7天则有80%的细胞具有神经元的形态且是Tuj1阳性的，在培养10-14天后则是具有成熟神经元的形态和Map2/Tuj1双阳性的（图11A和图12A）。Map2或Tuj1在GFAP阳性的细胞中不表达，这代表分化的细胞具有功能特异性。
当采用更细致的诱导分化条件时发现第13代的化合物诱导的神经干细胞在含bFGF,PDGF-AA和T3的培养基中培养12天后，可以观察到Olig2/Mbp双阳性的细胞并且具有少突胶质细胞的形态（图12A，分化效率为25%左右）。进一步地，分化四周后可以发现成熟神经元如NeuN、Synapsin和GAD67的表达（图11B和图12B）。
6.12进而用全细胞膜片钳实验检测化合物诱导的神经干细胞的成熟度和功能
实验发现，化合物诱导的神经干细胞分化的神经元可以产生重复记录的动作电位（图12C）和自发突触后电流（图12D）。此外，Na+电流也可以在这些分化得到的神经元中记录到（图12E）。
6.2体内分化实验检测化合物诱导的神经干细胞的分化能力
将化合物诱导的神经干细胞移植到胚鼠体内，并用慢病毒GFP标记第17代的化合物诱导的神经干细胞。
实验显示GFP标记的化合物诱导的神经干细胞仍具有神经干细胞相关的性质，包括增殖能力、神经球形成能力、神经干细胞特异基因表达和体外分化能力都没有改变（图13）。
GFP标记的化合物诱导的神经干细胞被注射到E13.5的胚胎中，免疫荧光染色显示移植1周后GFP标记的化合物诱导的神经干细胞可以在小鼠不同脑区存活（图14A）。此外，这种GFP标记的化合物诱导的神经干细胞能够被Ki67、Olig2或GFAP标记，但是不能被Tuj1标记（图14B和图14C）,这代表诱导获得的神经干细胞在体内更易分化成胶质细胞和少突状胶质细胞。
移植1个月后，仍可以发现GFP标记的化合物诱导的神经干细胞分化得到的Olig2+或Mbp+的少突胶质细胞,GFAP+的星形胶质细胞和NeuN+或Tuj1+的成熟神经元（图12F，图14D）。但是并没有发现Ki67阳性的GFP标记的细胞（图14E），也没有在移植的脑区发现肿瘤形成。
结论：化合物诱导的神经元细胞能够在体外分化到主要的神经谱系，包括星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞。
而移植的化合物诱导的神经干细胞可以在体内分化为不同的神经谱系，且不会在移植的脑区形成肿瘤，因此化合物诱导的神经干细胞具有潜在的临床应用前景。
实施例7其它化合物组合诱导神经干细胞
VPA、CHIR99021和Repsox分别是组蛋白去乙酰化酶(HDACs)、糖原合成酶激酶3β（GSK-3）、转化生长因子β（TGF-β）信号通路的抑制剂。因此本发明还检测了是否这些信号传导通路的其它抑制剂组合也可以诱导神经干细胞的产生，比如是否NaB或者TSA可以取代VPA，LiCl或者Li2CO3可以取代CHIR99021,SB431542或者Tranilast可以取代Repsox，其中，各组抑制剂的化学结构式如表1所示：
表1
方法同VCR诱导的实验方案，结果发现，在同样的实验条件下，化合物组合NLS（NaB、LiCl和SB431542)和TLT（TSA、Li2CO3和Tranilast）能够在5%O2条件下处理小鼠胚胎成纤维细胞可以获得致密克隆和激活Sox2表达。并且这些中间态的克隆进一步地悬浮培养后可以产生Nestin+/Pax6+或Nestin+/Sox2+的神经干细胞（图15）。
这些纯化的化合物诱导的神经干细胞在传代13代后可以具有经典的神经干细胞的形态和神经球形成能力（图16B）。
免疫荧光染色发现这两中化合物组合诱导获得的神经干细胞高表达神经干细胞基因Nesting、Sox2和Pax6。逆转录聚合酶链式反应同样确认了这些神经干细胞标记基因的高表达（图16C）。
结论：NLS和TLT化合物组合可以在正常生理低氧培养条件下具有和VCR化合物组合同样的诱导产生神经干细胞的效果，进一步地支持芯片分析得到的结论，即激活一系列的信号传导通路可以协调地促进小鼠胚胎成纤维细胞到神经干细胞的转分化。
实施例8小鼠尾尖成纤维细胞和人尿细胞诱导ciNPCs
8.1采用相同的方法以及化合物组合VCR，处理新生小鼠尾尖成纤维细胞（TTFs）。
结果如图17A所示，在正常生理低氧条件VCR处理10天时，Sox2的表达上调。在加了heparin，EGF和bFGF的神经细胞扩大培养液里进一步培养7到10天，VCR处理后的TTFs与VCR处理后的MEF一样，具有相同的形态变化（图17B）。在传代过程中，能逐步获得均质的ciNPCs（图18）。
TTFs来源的第16代的ciNPC具有典型的神经干细胞的形态和神经球形成能力(图17C)。免疫荧光染色和实时定量PCR分析都能够检测到神经干细胞分子标记基因Nestin，Sox2，Pax6和Blbp的表达（图17D）。
此外，TTFs来源的ciNPCs在特定分化条件下还能够诱导出GFAP阳性的星形胶质细胞，Tuj1/MAP2双阳性的神经元以及Olig2/MBP双阳性的少突胶质细胞（图17E）。
因此，VPA，CHIR99021，Repsox和正常生理低氧的结合能够直接使不同来源的小鼠成纤维细胞转化为ciNPCs。
8.2采用药物组合VCR来诱导hUCs为ciNPCs。5%O2，VCR处理20天后，在hUC培养中类似于VCR处理MEF所获得的紧密细胞克隆开始出现（图17F）。第15天的时候Sox2的表达上调（图17G）。
在神经细胞扩大培养液里培养5代以上，这些VCR诱导的中间态细胞开始展现出与对照组iNPCs相同的形态（如前所述，通过在hUCs中导入基因诱导获得）（图17H）。
通过检测qRT-PCR（图17I）和免疫荧光染色（图19A），这些hUCs来源的ciNPCs表达神经干细胞特异的基因，包括Sox2、Nestin、Sox1和Pax6。更重要的是hUCs来源的ciNPCs具有与对照iNPCs相近的增殖能力（图19B），并且它能在神经分化培养基里分化为Tuj1/MAP2双阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞（图17J）。
以上结果表明人尿细胞在药物组合VCR处理后，可以诱导成为神经干细胞。
讨论：
首先，本发明的研究首次表明，在非外源基因介导的条件下，利用纯化合物组合完全可以诱导体细胞发生重编程并直接转分化为神经干干细胞。
本发明诱导策略主要包括两个方面：一、在正常生理低氧条件下，化合物组合诱导细胞进入重编程阶段，二、诱导获得的中间态细胞在谱系特异的诱导条件下进行转分化。鉴于其他谱系细胞，例如：心肌细胞、血管内皮细胞等，也可以通过转因子方法诱导获得，或者通过干细胞体外分化法获得，因此，应用本发明的诱导策略可以获得纯化何物法诱导的其他谱系特定细胞。
其次，本发明发现在正常生理低氧条件下，不同的HDACs抑制剂、GSK-3激酶抑制剂和TGF-β信号通路抑制剂组合均可以诱导终末分化的体细胞进入重编程状态，并且该重编程状态伴随Sox2基因的表达激活。因此，上述三个信号通路很有可能通过调节Sox2相关基因的表达从而促进细胞重编程。此外，cDNA芯片数据也表明上述三个信号通路相关基因的变化在化合物诱导获得神经干细胞与对照神经干细胞中非常类似，且显著区别于起始成纤维细胞。综上，小分子化合物调节的HDACs、GSK-3和TGF-β信号通路对于诱导成纤维细胞转分化为神经干细胞是至关重要的，但是具体的分子机制还有待深入研究。
第三，本发明发现正常生理低氧条件对于纯化何物诱导细胞进入重编程状态是必须的，但是正常生理低氧模拟化合物，如氯化钴等，并不能取代正常生理低氧条件诱导细胞发生重编程。尽管标准的哺乳动物细胞体外培养的氧气浓度度为21%，但是体内组织的实际氧气浓度为1%到5%，而且正常生理条件下，干细胞的微环境也是正常生理低氧条件，因此进一步检测体外诱导细胞发生重编程的小分子化合物组合在体内是否也能促进转分化具有重要的意义。
最后，利用的化合物组合也可以诱导人尿液中的细胞直接转分化为神经干细胞，本发明为获得病人的特异性神经干细胞提供了全新的、便捷的、安全的可行性方法，为进一步治疗神经类疾病，如阿尔茨海默病和帕金森症等提供了新的治疗途径。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (16)

1.一种小分子组合物的用途，其特征在于，用于非治疗性地在不引入外源性基因且低氧环境下诱导体细胞转分化为神经干细胞，其中所述小分子组合物由以下组分构成
(a)组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂；
(b)糖原合成酶激酶-3(GSK-3)抑制剂；
(c)转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂；和
(d)任选的药学上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的低氧环境为氧浓度3-8％的环境。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的体细胞包括成纤维细胞、上皮细胞。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的成纤维细胞包括小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠尾尖成纤维细胞、人皮肤成纤维细胞。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的上皮细胞分离自人尿液。
6.一种体外诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法，其特征在于，在低氧环境以及权利要求1或2所述的小分子化合物组合存在的培养条件下，不引入外源基因，培养体细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的小分子化合物组合中，HDACs抑制剂包括丙戊酸(VPA)、丁酸钠(NaB)、或曲古抑菌素A(TSA)；和/或
所述的GSK-3抑制剂包括CHIR99021、氯化锂(LiCl)、或碳酸锂(Li2CO3)；和/或
所述的TGF-β信号通路抑制剂包括Repsox、SB431542、或曲尼司特(Tranilast)。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述小分子化合物组合中各组分的最低有效浓度如下所示：
HDACs抑制剂：VPA：0.2-1mM；NaB 0.2-1mM；TSA 5-20nM；
GSK-3抑制剂：CHIR99021 1-5μM；LiCl 0.5-3μM；Li2CO3 0.05-1mM；
TGF-β抑制剂信号通路：Repsox 0.2-3μM；SB431542 0.2-3μM；Tranilast 10-50μM。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的培养为至少培养4代。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的培养条件还包括采用神经干细胞培养基。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的神经干细胞培养基含有表皮生长因子EGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、肝素或其组合。
12.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的低氧环境为氧浓度为4-6％。
13.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述小分子化合物组合中各组分的最低有效浓度如下所示：
HDACs抑制剂：VPA：0.3-0.8mM；NaB:0.3-0.8mM；TSA:8-15nM；
GSK-3抑制剂：CHIR99021:2-4μM；LiCl:1-2μM；Li2CO3:0.1-0.8mM；
TGF-β抑制剂信号通路：Repsox:0.5-2μM；SB431542:0.5-2μM；Tranilast 20-40μM。
14.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述小分子化合物组合中各组分的最低有效浓度如下所示：
HDACs抑制剂：VPA：0.4-0.6mM；NaB:0.4-0.6mM；TSA:10-12nM；
GSK-3抑制剂：CHIR99021:2-4μM；LiCl:1-2μM；Li2CO3:0.2-0.5mM；
TGF-β抑制剂信号通路：Repsox:0.5-2μM；SB431542:0.5-2μM；Tranilast 20-40μM。
15.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的培养为至少培养5-8代。
16.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的培养为至少培养10-15代。
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