CN111909901B - 一种个性化诱导性神经干细胞外泌体的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种个性化诱导性神经干细胞外泌体的制备方法及应用。该制备方法包括取皮肤成纤维细胞，利用液体培养基对其进行传代配培养，再使用体细胞重编程技术诱导皮肤成纤维细胞成为个性化诱导性神经干细胞；收集该诱导性神经干细胞分泌的大量外泌体。本发明制备的个性化诱导性神经干细胞外泌体具有良好的皮肤穿透性，可以直接渗透到达到真皮层后改善局部再生微环境。因此，应用其制备的皮肤抗衰老产品对正常皮肤有天然保持皮肤湿润、美白、抗皱纹和抗色素沉淀的作用，对老化及紫外线损伤后的皮肤具有促进生长，复原组织完整性的作用，对外伤后的皮肤具有抗疤痕形成的作用，且不刺激皮肤，具有高度安全性。

Description

一种个性化诱导性神经干细胞外泌体的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种个性化诱导性神经干细胞外泌体的制备方法及应用。
背景技术
皮肤衰老常常由内源性的细胞老化及外源性的因素，比如过度日晒及氧化应激引起[1]，其临床表现包括皱纹增多、表面粗糙、弹性消失等。研究表明，皮肤衰老的病理基础是皮下结缔组织细胞外间质的改变[2～3]。皮肤成纤维细胞 (fibroblast)是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞的主要功能是分泌细胞外间质构成的多种蛋白，包括基质蛋白、胶原蛋白和弹性纤维蛋白。这些蛋白对维持结缔组织结构的完整性至关重要，在皮肤组织中，成纤维细胞分泌的蛋白决定了皮肤的物理特性。因此，成纤维细胞对皮肤的正常生理功能及病理损伤中具有重要作用。成纤维细胞在老年化或UV损伤后会表现出不同程度的功能缺陷，主要表现为减少胶原纤维和基质成分的制造从而阻碍了局部组织细胞再生和细胞间基质的自然修复。因此，功能性修复皮肤成纤维细胞是治疗皮肤衰老的一个关键步骤。
皮肤成纤维细胞处于表皮下方的真皮层，其生理功能依赖于所处的组织微环境。衰老及UV损伤后的微环境总体来说不利于皮肤成纤维细胞发挥修复功能，但研究证明干细胞主导的微环境改变对皮肤成纤维细胞的功能性修复至关重要[4]。干细胞调控微环境改变包括外泌体(exosome)的分泌。外泌体是一种最近新观察到的由活细胞分泌的纳米级别膜状小体，和微囊泡及凋亡小体同属细胞外囊泡家族。外泌体的生物学功能已经有广泛报道，已知的功能主要集中在细胞间通讯领域[5～6]。外泌体直径约40至150纳米，主要由多泡小体(multivesicular bodies，MVB)经胞吐作用产生。因为外泌体反应来源细胞的特异性信息，它们常常有组织特异性，对局部组织的作用明显。外泌体具有天然的细胞亲和性，是良好的药物载体。神经干细胞提供的微环境是人体里最富有修复功能的微环境之一。本专利申请人具有丰富诱导性神经干细胞制造经验[7～8]，申请人最新的研究证明诱导性神经干细胞分泌的大量外泌体提供良好的再生微环境[9～10]。目前的衰老及UV损伤研究大多聚焦于正常皮肤成纤维细胞或间充质细胞。基于神经干细胞的微环境改变是一种全新的衰老及UV损伤治疗策略，该策略的应用将对损伤的皮肤成纤维细胞起修复作用，具有极大临床价值，但未有相关报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种个性化诱导性神经干细胞外泌体的制备方法及应用，该外泌体具有良好的皮肤穿透性，可以直接渗透到达到真皮层后改善局部再生微环境，可应用于制备皮肤抗衰老产品。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种个性化诱导性神经干细胞外泌体的制备方法，该方法包括如下步骤：
步骤一，反转录病毒的制备和包装：将人源SOX2、FOXG1和Brn2的基因片段经克隆转入pMXs反转录病毒载体，然后和包装载体共转染Plat-E细胞，收集表达人源SOX2、FOXG1和Brn2的反转录病毒；
步骤二，成纤维细胞细胞重组成诱导性神经干细胞：使用上述表达人源 SOX2、FOXG1和Brn2的反转录病毒对皮肤成纤维细胞进行感染过夜，培养获得成功诱导的个性化诱导性神经干细胞(iPNCs)；
步骤三，个性化诱导性神经干细胞外泌体的抽提：采用梯度超速离心的方法抽提该个性化诱导性神经干细胞外泌体。
进一步地，步骤一中转染后的Plat-E细胞的上清经0.45μm孔径过滤器过滤而获得该表达人源SOX2、FOXG1和Brn2的反转录病毒。
进一步地，步骤二中的皮肤成纤维细胞为培养传代2-6代的细胞。
进一步地，皮肤成纤维细胞培养所用的培养基为DMEM培养基，并含有10％ FBS、5％非必需氨基酸、100U/ml青霉素和100g/ml链霉素。
进一步地，在步骤二中，感染时所采用的培养基含有10μg/ml的聚凝胺。
进一步地，该制备方法还包括个性化诱导性神经干细胞的鉴定。
进一步地，步骤三个性化诱导性神经干细胞外泌体的抽提具体为：首先将个性化诱导性神经干细胞的上清用300g的速度离心以去除游离细胞；接着，去除沉淀，取上清用3000g的速度离心去除细胞碎片；最后，去除游离细胞和碎片后的上清用100000g高速离心来收集外泌体；离心后，弃掉上清，取沉淀由过滤后的PBS冲洗并再次100000g高速离心以得到该个性化诱导性神经干细胞外泌体。
本发明的第二方面是提供上述制备方法制备的个性化诱导性神经干细胞外泌体。
本发明的第三方面是提供上述个性化诱导性神经干细胞外泌体在制备皮肤抗衰老产品中的应用。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明制备的个性化诱导性神经干细胞外泌体具有良好的皮肤穿透性，可以直接渗透到达到真皮层后改善局部再生微环境。因此，应用其制备的皮肤抗衰老产品对正常皮肤有天然保持皮肤湿润、美白、抗皱纹和抗色素沉淀的作用，对老化及紫外线损伤后的皮肤具有促进生长，复原组织完整性的作用，对外伤后的皮肤具有抗疤痕形成的作用，且不刺激皮肤，具有高度安全性。
附图说明
图1为本发明一实施例中诱导性神经干细胞经免疫荧光染色鉴定的结果图；其中，图1A-D分别为SOX2、Nestin、Ki67和SSEA1染色结果；
图2为本发明一实施例中诱导性神经干细胞经体外分化培养后的功能鉴定结果图；其中，经免疫荧光染色可观察到特异的Tuj1阳性神经元(图2A)，GFAP 阳性星型胶质细胞(图2B)，O4阳性少突胶质细胞(图2C)，以及特异的神经元亚型，包括VGluT1阳性兴奋性神经元(图2D)阳性，GABA阳性抑制性神经元(图2E)，和ChAT阳性神经元(图2F)；细胞核被同时以DAPI染色标记；
图3为本发明一实施例中诱导性神经干细胞外泌体的鉴定结果图；其中，图 3A-B为诱导性神经干细胞外泌体电镜下形态图；图3C为诱导性神经干细胞外泌体(Exosome)蛋白经免疫印迹检测的结果；
图4为本发明一实施例中诱导性神经干细胞外泌体促进皮肤成纤维细胞增殖的结果示意图；其中，图4A和图4B分别为成纤维细胞经UV照射后经诱导性神经干细胞外泌体和PBS处理的结果；图4C为图4A和图4B的柱状统计结果；
图5为本发明一实施例中通过划痕实验验证诱导性神经干细胞外泌体提高皮肤成纤维细胞迁移的结果图；其中，成纤维细胞经划痕后，0h时划痕明显(图 5A，B)；24h后，成纤维细胞自然迁移入划痕区(图5C)；24h后，经诱导性神经干细胞外泌体处理后，成纤维细胞迁移入划痕区增多(图5D，E)；
图6为本发明一实施例中诱导性神经干细胞外泌体减少UV诱导皮肤成纤维细胞凋亡的结果图；图6A为对照组，图6B为经紫外照射组，图6C为经紫外照射并由外泌体处理组；
图7为本发明一实施例中诱导性神经干细胞外泌体可被皮肤成纤维细胞吸收的示意图；
图8为本发明一实施例中诱导性神经干细胞外泌体对成纤维细胞的基因表达的影响结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种个性化诱导性神经干细胞外泌体的制备方法及应用，该制备方法具体是取服务对象的皮肤成纤维细胞，利用液体培养基对其进行传代配培养，再使用体细胞重编程技术诱导皮肤成纤维细胞成为个性化诱导性神经干细胞，该诱导性神经干细胞分泌大量外泌体，收集该外泌体。该外泌体制成的产品具有良好的皮肤穿透性，可以直接渗透到达到真皮层后改善局部再生微环境。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。以下实施例中所用试剂和原料均可按文献方法及试剂说明书方法制备。下列实施方式未注明具体条件的实验方法，通常按照工具书(著，美国，Molecular Cell Biology,by Harvey Lodish,Arnold Berk, et al.Apr 1,2016)。
实施例1
本实施例提供个性化诱导性神经干细胞的制备方法及其鉴定过程，包括如下步骤：
一，皮肤成纤维细胞的获得
皮肤成纤维细胞的获得已经被现有技术公开[9]。皮肤组织由局麻下手术取得。细胞培养基包括：DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)、10％FBS、5％非必需氨基酸、100U/ml青霉素、100g/ml链霉素。皮肤成纤维细胞取传代2代～ 6代细胞进行后续操作。
二，反转录病毒制备和包装
人源SOX2，FOXG1，和Brn2的基因片段经克隆转入pMXs反转录病毒载体(CellBiolabs)。病毒包装由反转录病毒载体质粒转染入Plat-E细胞(购置上海吉玛公司并按公司推荐转染方法转染)。转染后的Plat-E上清经0.45μm孔径过滤器过滤而获得表达人源SOX2、FOXG1和Brn2的反转录病毒。
三，成纤维细胞细胞重组成诱导性神经干细胞
将2代～6代成纤维细胞细胞于转染前一天接种到6孔板中，放置于37℃， 5％二氧化碳温箱孵育，转染时细胞密度50-70％。其次，使用表达人源SOX2、 FOXG1和Brn2的反转录病毒于含有聚凝胺polybrene(10μg/ml)的培养基对成纤维细胞细胞进行感染过夜。反转录病毒两轮感染后，细胞维持于培养基中观察 30天以获取成功诱导的个性化诱导性神经干细胞神经球。
四，检测个性化诱导性神经干细胞
荧光显微镜下，个性化诱导性神经干细胞神经球形态清晰可见如图1所示。免疫荧光染色显示培养体系中所有细胞均为SOX2(图1A，神经干细胞标记)、 Nestin(图1B，神经干细胞标记)、Ki67(图1C，增殖细胞标记)以及SSEA1 (图1D，干细胞标记)阳性，提示这些细胞为增殖中的个性化诱导性神经干细胞(图1)。个性化诱导性神经干细胞将按图2中所示的定向分化的方法确认神经干细胞的身份，由图2可知，诱导性神经干细胞是具有多分化能功能的神经干细胞。
实施例2
本实施例提供个性化诱导性神经干细胞外泌体抽提及鉴定方法，具体的步骤和结果如下：
一，个性化诱导性神经干细胞外泌体的抽提
个性化诱导性神经干细胞外泌体抽提将采用梯度超速离心的方法：首先将实施例1中获得的诱导性神经干细胞的上清用300g的速度离心以去除游离细胞；接着，去除细胞的上清将用3000g的速度离心去除细胞碎片；最后，去除游离细胞和碎片的上清将用100000g高速离心收集外泌体。离心后，外泌体由过滤后的 PBS冲洗并再次100000g高速离心以得到个性化诱导性神经干细胞来源的外泌体。该外泌体可长期保存于-80℃冰箱，并仍然保持生物活性。
二，个性化诱导性神经干细胞外泌体的鉴定
首先，外泌体的的数量和大小我们采用扫描电镜及Nanoparticle TrackingAnalysis(NTA,Nanosight)检测。本申请人团队具有多年类似的外泌体分析的经验，且大部分外泌体分析的相关技术已发表[9,11～14]。透射电镜下，诱导性神经干细胞外泌体大部呈现为直径100μm膜状小体(图3A)。扫描电镜下，诱导性神经干细胞外泌体经由胞吐至细胞外间隙，具有典型的“杯状”结构(图3B)。其次，对梯度超速离心获得的外泌体进行内含的蛋白质和核酸的确认，使用免疫印迹及免疫电镜的方法检测外泌体内含的蛋白(图3C)，检测结果可知，该外泌体的标记物flotillin-1和Alix均表达。
验证实施例
本实施例研究个性化诱导性神经干细胞外泌体对成纤维细胞的增殖、存活、迁移以及基因表达的影响。
一，个性化诱导性神经干细胞外泌体对成纤维细胞的增殖能力的影响
将成纤维细胞铺于96孔板中，待细胞密度在70％时，一组细胞加入加入个性化诱导性神经干细胞外泌体，一组细胞等体积的PBS。48h后，细胞增殖由CCK8细胞增殖毒性试剂盒(翊圣生物)检测，结果如图4所示。由图4可知，经个性化诱导性神经干细胞外泌体处理后，成纤维细胞的活性比单独UV照射的 PBS对照组明显增加，提示个性化诱导性神经干细胞外泌体对成纤维细胞的抗 UV毒性能力有促进作用。
二，个性化诱导性神经干细胞外泌体对成纤维细胞的迁移能力的影响
将成纤维细胞铺于12孔板中，待细胞密度为90％时，进行细胞划痕。使用 PBS洗净划下的细胞，剩余细胞加入无血清培养基。一组细胞加入TGFB细胞因子同时加入个性化诱导性神经干细胞外泌体，一组细胞加入TGFB细胞因子同时加入PBS对照。每个处理组分别于划痕后0h和24h在显微镜下相同位置拍照。每个实验组成纤维细胞迁移能力以划痕区覆盖比例按百分比计算。由图5可知，间充质干细胞外泌体处理24h后，成纤维细胞迁移入划痕区增多，提示间充质干细胞外泌体促进成纤维细胞迁移；48小时后，成纤维细胞迁移入划痕区增多。
三，个性化诱导性神经干细胞外泌体对UV诱导成纤维细胞的凋亡的影响
将成纤维细胞铺于24孔板中，待细胞密度在70％时，细胞均接受UV照射诱导凋亡。一组细胞加入个性化诱导性神经干细胞外泌体，一组细胞加入TGFB 细胞因子同时加入PBS对照。24h后，通过TUNEL检测法检测细胞凋亡，结果如图6所示。由图6可知，成纤维细胞经UV照射后，TUNEL阳性凋亡细胞(图 6B)明显比未经UV照射的细胞(图6A)增多；经诱导性神经干细胞外泌体处理后，凋亡的细胞数目回复到正常水平。因此，个性化诱导性神经干细胞外泌体处理显著减少UV诱导的细胞凋亡。
四，个性化诱导性神经干细胞外泌体对成纤维细胞的基因表达的影响。
将成纤维细胞铺于24孔板中，待细胞密度在70％时，一组细胞加入个性化诱导性神经干细胞外泌体并接受24h紫外照射，一组细胞加入等量PBS对照并接受24h紫外照射，另一组细胞加入等量PBS而无紫外照射。24h后，细胞基因表达由前述real time RT PCR检测，结果如图8所示。此外，将诱导性神经干细胞外泌体经Dil红色荧光标记后，加入成纤维细胞，洗净残余Dil红色荧光后拍摄，结果如图7所示。由图7可知，成纤维细胞内仍然可见明显红色荧光，提示诱导性神经干细胞外泌体可被皮肤成纤维细胞吸收。该结果旨在通过实验证明外泌体可被皮肤成纤维细胞吸收，并非应用于实施例，特此说明。由图8可知，个性化诱导性神经干细胞外泌体处理显著增加存活基因表达，减少抑制细胞增殖的基因表达，提示个性化诱导性神经干细胞外泌体影响成纤维细胞的基因表达。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
参考文献
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Claims (7)

1.一种个性化诱导性神经干细胞外泌体在制备皮肤抗衰老产品中的应用，其特征在于，所述个性化诱导性神经干细胞外泌体的制备方法包括如下步骤：
步骤一，反转录病毒的制备和包装：将人源SOX2、FOXG1和Brn2的基因片段经克隆转入pMXs反转录病毒载体，然后和包装载体共转染Plat-E细胞，收集表达人源SOX2、FOXG1和Brn2的反转录病毒；
步骤二，成纤维细胞细胞重组成诱导性神经干细胞：使用所述表达人源SOX2、FOXG1和Brn2的反转录病毒对皮肤成纤维细胞进行感染过夜，培养获得成功诱导的所述个性化诱导性神经干细胞；
步骤三，采用梯度超速离心的方法抽提所述个性化诱导性神经干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤一中转染后的所述Plat-E细胞的上清经0.45μm孔径过滤器过滤而获得所述表达人源SOX2、FOXG1和Brn2的反转录病毒。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤二中的所述皮肤成纤维细胞为培养传代2-6代的细胞。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述皮肤成纤维细胞培养所用的培养基为DMEM培养基，并含有10％FBS、5％非必需氨基酸、100U/ml青霉素和100g/ml链霉素。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在步骤二中，感染时所采用的培养基含有10μg/ml的聚凝胺。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，还包括个性化诱导性神经干细胞的鉴定。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤三具体为：首先将所述个性化诱导性神经干细胞的上清用300g的速度离心以去除游离细胞；接着，去除沉淀，取上清用3000g的速度离心去除细胞碎片；然后，将去除游离细胞和碎片后的上清用100000g高速离心来收集外泌体；离心后，弃掉上清，取沉淀由过滤后的PBS冲洗并再次100000g高速离心以得到所述个性化诱导性神经干细胞外泌体。
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Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing,tripotent neural precursor cells;Ernesto Lujan et al.;PNAS *
Induced neural progenitor cells abundantly secrete extracellular vesicles and promote the proliferation of neural progenitors via extracellular signal–regulated kinase pathways;Yizhao Ma et al.;Neurobiol Dis.;第2节 材料与方法部分，摘要 *

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