CN116410918A - 一种皮肤类器官外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种皮肤类器官外泌体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种皮肤类器官外泌体及其制备方法和应用。本发明方法取全层皮肤组织消化解离出具有干性的细胞后培养为皮肤类器官，再使用物理‑生理联用刺激所述皮肤类器官分泌出外泌体。本发明得到的外泌体在针对自然衰老皮肤修复和紫外诱导的光老化皮肤修复中具有显著的效果。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种皮肤类器官外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
生命的进展过程中，皮肤的物理变化是体现机体老化的首要观察结果。长久以来，人们致力于通过各种抗衰老方法来改善皮肤的质量。通常认为，皮肤的老化是由外在因素(环境方面包括紫外线照射、空气污染、吸烟或营养缺乏)和内在因素(例如细胞老化和荷尔蒙变化)共同决定的，这些因素都会导致皮肤功能和再生潜力的丧失。特别是，内在皮肤老化是一个随年龄增加而不可避免的加剧的过程，其主要因素包括活性氧（ROS）的形成(加速皮肤老化，水分流失)、端粒磨损加速或基质金属蛋白酶(MMP)表达增加(结构完整性丧失，拉伸强度和弹性下降)，这些因素都会导致皮肤形态发生变化。此外，炎症性皮肤疾病和难愈合伤口，也是一直困扰人们的皮肤缺陷问题。
对于上述皮肤衰老或缺陷问题，目前采用的改善策略包括使用化学、生物或物理手段的局部非侵入性和侵入性策略。非侵入性策略主要以化妆品、化学换肤和光疗的方式出现。从功效方面看，以抗氧化剂和细胞调节剂为主的化妆品可用于增强皮肤对ROS引起的氧化应激保护。激光治疗策略能够产生胶原蛋白和弹性蛋白、重塑真皮以及减少色素和红斑等，但并不是每个人的皮肤都适用，相当多的人会产生强烈的副作用。在侵入性策略中，微针疗法用于将药物跳过皮肤屏障直接输送到真皮层中，与非侵入性策略相比，具有更直接的效果，但持续时间较短，而且会一定程度造成皮肤受损，甚至会引起皮肤炎症。此外，2000年初兴起的干细胞疗法也曾广泛应用于皮肤治疗。然而，干细胞治疗的安全性和有效性一直存在争议，一些研究表明干细胞本身并不参与治疗过程且注入缺陷部位的干细胞显示出低细胞活力。因此，目前的主流皮肤抗衰策略或多或少都会存在一些安全性和有效性的问题，并不适用于每一个人。因此，开发个体化的皮肤质量改善策略是未来皮肤护理的一大趋势。
外泌体是细胞分泌的直径30~150nm的双层磷脂囊泡，其携带包括脂质、蛋白质和核酸在内的多种生物分子。外泌体可以由大多数类型的细胞分泌，但不同细胞分泌的外泌体中携带的生物分子成分有所不同，且不同的细胞分泌的外泌体的量也是不同的。最近的研究表明外泌体在改善皮肤缺陷（如老化、特应性皮炎和伤口）和修复屏障敏感中具有一定的功效。与干细胞治疗相比，外泌体治疗不是直接用异体细胞来取代自体细胞从而发挥治疗效果，仅是提高和促进原本细胞的功能的和自我修复能力，主要优势是接受者的排斥风险最小。因此使用外泌体可以避免由于细胞成分引起的生物学上的一些风险以及伦理问题。
目前在皮肤护理领域展开研究的外泌体主要是来自人类多能诱导干细胞（IPSC）、骨髓间充质干细胞（MSC）和人真皮成纤维细胞（HDF），其都是单一细胞类型分泌的外泌体，由于不同细胞分泌的外泌体中携带的生物分子成分有所不同，因此并没有真正实现精准化、个体化皮肤护理。此外，外泌体的浓度和量也会对皮肤护理的效果产生很大的差异。由于皮肤是由多种类细胞组成的高度复杂的器官，因此单一细胞类型产生的外泌体成分相较完整皮肤分泌的具有很大的差异，而人体的真正皮肤组织目前还不能在体外长期培养以分泌外泌体，这会涉及到伦理学方面的问题。
综上所述，有必要提出一种新的外泌体制备策略，用于缓解现有技术中存在的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种皮肤类器官外泌体及其制备方法和应用，具体技术方案如下。
一种皮肤类器官外泌体的制备方法，取全层皮肤组织消化解离出具有干性的细胞后培养为皮肤类器官，再使用物理-生理联用刺激所述皮肤类器官分泌出外泌体，具体步骤包括如下：
步骤1：取全层皮肤组织，将其分离为真皮层和表皮层；
步骤2：将步骤1分离出的真皮层和表皮层进一步消化得到具有干性的细胞，所述具有干性的细胞包括真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞；
步骤3：将步骤2得到的真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞按照9:1~1:1的比例（包括9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1）混合，加入含有血小板裂解物的类器官培养基，然后再用Matrigel基质胶（简称为Matrigel）或BME基底膜提取物（简称为BME）重悬并接种于细胞孔板中，待胶滴凝结后再加入所述含有血小板裂解物的类器官培养基培养出皮肤类器官；
步骤4：将步骤3培养出的皮肤类器官培养至可传代水平，随后解离为30-50μm 尺寸大小以增大皮肤类器官的表面积，再加入所述含有血小板裂解物的类器官培养基并接种于新的细胞孔板中；
步骤5：对步骤4中增大了表面积的皮肤类器官进行1-3轮的物理-生理联用刺激，以促进外泌体分泌，所述物理-生理联用刺激为采用物理手段和生理手段联合刺激外泌体分泌，所述物理手段包括机械刺激和动态培养，所述生理手段为饥饿刺激，每轮的所述物理-生理联用刺激操作依次为饥饿刺激2天、机械刺激2天和动态培养3天；
步骤6：收集步骤5中经过1-3轮物理-生理联用刺激操作后的培养上清液，用差速离心结合超高速离心的方式收集所述上清液中的外泌体。
优选的，所述血小板裂解物可以购买商用的，也可以采用供者自体的。所述血小板裂解物的主要用途是提高皮肤类器官生成的效率。
进一步，所述饥饿刺激为将皮肤类器官置于无糖基础培养基上培养，所述无糖基础培养基包括无糖DMEM培养基、无糖DMEM/F12培养基或SILAC Advanced DMEM/F-12 Flex培养基。
进一步，所述机械刺激为将皮肤类器官置于15-40kpa/300mmHg的压力环境下培养；所述动态培养为将皮肤类器官置于动态摇床上以30-50rpm摇动培养。
进一步，所述含有血小板裂解物的类器官培养基包括Advanced DMEM/F12培养基、5%-10% hpL（血小板裂解物）、0.1% BSA（牛血清白蛋白）、1% N2（N2补充剂）、1% B27（B27蛋白）、10Mm HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）、1% GlutaMAX（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）、1% P/S（青霉素/链霉素）、1mM N-Acetyl-L-cysteine（N-乙酰-L-半胱氨酸）、1uM A83-01（TGF-βI型受体抑制剂）、10uM Forskolin（毛喉素）、50ng/mL EGF（表皮生长因子）、100ng/mL FGF-10（成纤维细胞生长因子10）、100ng/mL Noggin（BMP骨形态发生蛋白的内源性抑制剂）、250ng/mLR-Spondin 1（经典Wnt信号通路的激活因子）或100ng/mL Wnt3a（Wnt3a重组蛋白）。
进一步，所述步骤2中将表皮层剪切成细小块状，加到0.25%的胰酶溶液中孵育至细胞完全解离，收获单细胞悬液并用上皮培养基CntPrime（上皮增殖培养基）重悬后接种于胶原蛋白包被的培养板上得到所述表皮角质形成细胞；将真皮层剪成细小块状，用I型胶原酶和0.25%胰酶消化，并孵育于α-MEM培养基（含核糖核酸和脱氧核糖核酸）中得到所述真皮成纤维细胞。
进一步，所述步骤4中可传代水平的皮肤类器官大小为大于150μm。
进一步，所述步骤5中对皮肤类器官进行一共3轮的物理-生理联用刺激。
进一步，所述步骤6中的差速离心的操作依次为300g离心10min、2000g离心10min、10000g离心30min。
上述制备方法得到的皮肤类器官外泌体，所述皮肤类器官外泌体的浓度为1X1010~5X1010/mL。
上述皮肤类器官外泌体在制备皮肤抗衰老制剂中的应用。
上述皮肤类器官外泌体在制备皮肤光老化损伤修复制剂中的应用。
有益技术效果
本发明采用取全层皮肤组织消化解离出具有干性的细胞后，培养出与原代皮肤组织结构接近的皮肤类器官，再使用调控皮肤类器官表面积大小结合物理-生理联用刺激的方式最终使培养出的皮肤类器官在较短的时间内分泌出活性高、浓度较大的皮肤类器官外泌体。
本发明首先采用以真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞为基础细胞系培养出与原代皮肤组织结构接近的皮肤类器官。在皮肤解离出的细胞中，实际上具有多种类型的干性细胞，包括不限于表皮干细胞、真皮干细胞、毛囊干细胞、造血干细胞或内皮祖细胞等。然而本发明仅选用了真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞，在特定的混合比例下培养出了与原代皮肤组织结构接近的皮肤类器官。
本发明其次采用了调控皮肤类器官表面积大小结合物理-生理联用刺激的方式最终使培养出的皮肤类器官在较短的时间内分泌出活性高、浓度较大的外泌体。特别是本发明创新性的提出物理-生理联用刺激的手段，实验证明该联用刺激手段相较于任何单一刺激手段在相同时间内分泌出的外泌体成倍数增长。
本发明最后实验证实，制备得到的特定类型（真皮成纤维-表皮角质形成细胞皮肤类器官）和浓度（1X1010~5X1010/mL）的外泌体在针对自然衰老皮肤修复和紫外诱导的光老化皮肤修复中具有显著的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明构建的皮肤类器官图片（a、b、c、d代表不同视野下的显微镜图）；
图2为原皮肤组织和本发明构建的皮肤类器官的免疫组化图（a为原皮肤组织H&E免疫组化图，b为本发明制备的皮肤类器官H&E免疫组化图，c为原皮肤组织CK14免疫组化图，d为本发明制备的皮肤类器官CK14免疫组化图）；
图3为本发明构建的皮肤类器官的免疫荧光染色图（a为DAPI， b的CK14，c为α-SMA，d为Merge）；
图4为紫外诱导的光老化类器官模型经外泌体S0-EV处理后的SA-β-gal染色结果图（a为对照，b为经SO-EV处理，c为年轻皮肤类器官模型）；
图5为紫外诱导的光老化类器官模型经外泌体SO-EV处理后的衰老相关基因的表达水平的变化以及类器官增殖能力的检测图（a为经SO-EV处理后的光老化类器官的细胞衰老相关基因的表达水平的变化，b为类器官增殖能力的检测）；
图6为用三种外泌体分别处理自然衰老类器官模型并进行SA-β-gal染色图（a为对照，b为经HF-EV处理，c为经SO2-EV处理，d为经SO-EV处理）；
图7为自然衰老类器官模型修复实验图（a为经不同外泌体处理后的自然衰老类器官模型中衰老相关基因的表达水平的变化图，b为经不同外泌体处理后的自然衰老类器官模型中类器官增殖能力的检测图）；
图8为不同参数调节验证实验图（a为同一种皮肤类器官经不同手段刺激分泌外泌体结果图，b为不同类器官经过相同手段刺激分泌外泌体结果图，c为同一种皮肤类器官的不同尺寸经过相同手段刺激分泌外泌体结果图）。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本文中“和/或”包括任何和所有一个或多个列出的相关项的组合。
本文中“多个”意指两个或两个以上，即其包含两个、三个、四个、五个等。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5%，更典型的是所述值的+/-4%，更典型的是所述值的+/-3 %，更典型的是所述值的+/-2 %，甚至更典型的是所述值的+/-1 %，甚至更典型的是所述值的+/-0.5%。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1〜6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
本发明所述的“具有干性的细胞”是指皮肤组织中具有分化潜能的细胞。
本发明所述的物理-生理联用刺激”是指用物理手段和生理手段联合作用刺激皮肤类器官分泌外泌体。所述物理手段包括以施加外部压力为主导的机械刺激和以摇动培养为主导的动态培养刺激；所述生理手段主要是指对培养的皮肤类器官切断糖原供给以达到饥饿处理目的的技术手段。
本发明所述的“无糖基础培养基”是指不含糖类成分，特别是不含葡萄糖成分的类器官培养基。
实施例1
本实施例提供一种皮肤类器官的制备方法。
步骤一：皮肤组织的处理。取长宽为几毫米左右的全层皮肤组织，分离成真皮层和表皮层。将取到的全层皮肤组织用75%的酒精反复喷淋，用含有1%-5%双抗的DPBS清洗。再用分散酶将真皮层与表皮层分开，或者置于0.25%胰酶溶液4℃过夜孵育分离真皮层与表皮层。
步骤二：真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞的分离与扩增。将表皮层剪切成细小块状，并加入0.25%的胰酶溶液中孵育，并用移液管反复吹打至细胞完全解离。用70μm的细胞过滤器过滤悬液，收获单细胞悬液。此时的单细胞悬液中含有多种细胞成分，包括多种具有干性的细胞，例如表皮干细胞、真皮干细胞、毛囊干细胞、造血干细胞或内皮祖细胞等。用上皮培养基CntPrime重悬，接种于胶原蛋白包被的培养板上，得到表皮角质形成细胞。真皮层剪切至小块，用I型胶原酶消化40-60min，再用0.25%胰酶消化10min孵育于α-MEM培养基(含有10% hPL，0.04% 肝素，1% P/S)中，得到真皮成纤维细胞。
步骤三：含有血小板裂解物的皮肤类器官培养基的配制。所述培养基中含有Advanced DMEM/F12（其中含有葡萄糖成分），补充0.1%BSA，1%N2，1%B27，10Mm HEPES,1%GlutaMAX,1%P/S，1mM N-Acetyl-L-cysteine，1uM A83-01，10uM Forskolin，50ng/mL EGF,100ng/mL FGF-10,100ng/mL Noggin，250ng/mL R-Spondin 1,100ng/mL Wnt3a和5%-10%hpL。
步骤四：皮肤类器官的构建：将得到的真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞按照9:1~1:1的比例（包括9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1）混合混合，并用适当体积的含有血小板裂解物的皮肤类器官培养基重悬接种于96孔U型板(每1uL含有100-1000个混合细胞，每孔100uL)，4℃预冷后置于培养箱培养2-3天，收集细胞并用Matrigel或BME重悬，并接种于48孔板内，待胶滴凝结后再加入皮肤类器官培养基。
本实施例构建的皮肤类器官图片见图1，图1a、图1b、图1c和图1d分别代表不同视野下的显微镜图。图中可以看到本实施例所构建的类器官有多种形态的结构，表明其具有多种细胞类型。
实施例2
本实施例对实施例1构建的皮肤类器官进行鉴定。
步骤一：收集构建成功的皮肤类器官，对所述皮肤类器官和来源的皮肤组织分别进行免疫组化和免疫荧光染色。
步骤二：染色使用的标记物可选地包括PCK，CK14，CK1，α-SMA，α6-整合素，DAPI或Versican。
实验结果见图2、图3。图2a为原皮肤组织H&E免疫组化图，图2b为本发明制备的皮肤类器官H&E免疫组化图，图2c为原皮肤组织CK14免疫组化图，图2d为本发明制备的皮肤类器官CK14免疫组化图。从图2免疫组化对比图可以看出本发明制备的皮肤类器官与原代皮肤组织具有相似的特征。从图3免疫荧光染色图可以看出皮肤类器官中的各细胞种类，其中图3a的DAPI是细胞核染料，用于标记细胞核，图3b的CK14为表皮角质形成细胞的标志物，图3c的α-SMA为真皮成纤维细胞的标注物，图3d的Merge代表融合。
实施例3
本实施例对实施例1构建的皮肤类器官进行外泌体分泌刺激。
步骤一：配制饥饿处理培养基，其中包含无糖基础培养基和各种细胞因子或小分子。所述无糖基础培养基可选地包括Gibco™ DMEM，无糖型(赛默飞，货号：11966025)、DMEM/F12无糖（普诺赛，货号PM150331）或Gibco™ SILAC Advanced DMEM/F-12 Flex 培养基（赛默飞，货号A2494301）。所述细胞因子或小分子可选地包括0.1% BSA，1% N2，1% B27，10Mm HEPES,1% GlutaMAX,1 %P/S，1mM N-Acetyl-L-cysteine，1uM A83-01，10uMForskolin，50ng/mL EGF, 100ng/mL FGF-10,100ng/mL Noggin.250ng/mL R-Spondin 1,100ng/mL Wnt3a和5%-10% hpL。
步骤二：增大皮肤类器官表面积。培养皮肤类器官至可传代水平(大于150μm)，将皮肤类器官解离至30-50μm尺寸大小(降低类器官尺寸可以使类器官分泌增加，因为增大了总体表面积)，并接种于孔板内，加入含有血小板裂解物的皮肤类器官培养基。
步骤三：物理-生理联用刺激。
1）饥饿刺激：传代后2天，将培养基更换为饥饿处理培养基，于培养箱孵育2天后收集培养上清。
2）机械刺激：将培养基更换为含有血小板裂解物的皮肤类器官培养基，将孔板置于细胞仿生压力系统进行静态压力培养，气压为15-40kpa/300mmHg，2天后终止压力培养并收集培养上清。
3）动态培养：收集机械刺激后的培养上清，继续加入含有血小板裂解物的皮肤类器官培养基，并置于轨道摇床上(30-50rpm)进行摇动培养3天。
上述操作的1）-3）为1轮完整的物理-生理联用刺激，以促进皮肤类器官分泌外泌体，一共进行3轮的物理-生理联用刺激。可以理解的是，当第1轮的第3）步动态培养3天后，收集培养上清，再继续进行第2轮的第1）步饥饿刺激。
步骤四：外泌体的分离和收集。
收集经过3轮的物理-生理联用刺激后的培养上清，先通过差速离心（300g离心10分钟，2000g离心10分钟，10000g离心30分钟）进行分离。收集经过差速离心后的上清，再进行两轮的超高速离心。其中，第一轮100000g超速离心70分钟。用磷酸盐缓冲盐水（PBS，Sigma-Aldrich）洗涤沉淀后，进行第二轮100000g超速离心70分钟。将最终离心沉淀重悬于200μL PBS中。为了去除蛋白质并进一步浓缩外泌体，将PBS中的离心沉淀进一步离心并通过15mL超滤离心管(100kDa，MilliporeSigma, Burlington,MA, USA)。将外泌体浓缩至1X1010~5X1010/mL并储存在-80℃备用，标记为SO-EV。
实施例4
本实施例对实施例3刺激分泌得到的外泌体进行功效验证。
步骤一:衰老皮肤类器官、年轻皮肤类器官和光老化皮肤类器官的构建。具体的讲，将取自自然衰老部位的皮肤按照实施例1皮肤类器官构建方法培养成衰老皮肤类器官，标记为SO-O；将取自年轻部位的皮肤培养为的年轻皮肤类器官标记为SO-Y；将年轻皮肤类器官进一步用紫外辐照处理，得到紫外诱导损伤的光老化类器官模型，标记为SO-UO。
步骤二：用实施例3刺激得到的外泌体（SO-EV）处理上述光老化皮肤类器官模型，并检测细胞衰老相关标志物的变化(SA-β-gal染色)，相关基因的表达水平的变化(p16INK4A,p21CIP1A)和对类器官增殖的影响。
实验结果见图4和图5。图4为经外泌体S0-EV处理后的SA-β-gal染色结果，图4a为对照，图4b为经SO-EV处理，图4c为年轻皮肤类器官模型。图中可以看出，经外泌体S0-EV处理后，SO-UO的着色明显减少，说明由紫外辐射引起的细胞老化得到了明显改善。SO-EV处理组的着色水平与年轻皮肤类器官SO-Y相比几乎无明显差异。图5a为经SO-EV处理后的光老化类器官的细胞衰老相关基因的表达水平的变化，图5b为类器官增殖能力的检测（用ATP检测的发光值，值越高代表活性越好），可以看出，SO-EV使SO-UO模型的细胞衰老相关标志物p16INK4A和p21CIP1A表达水平显著下调，类器官的增殖能力显著增强。“未处理”代表未用SO-EV处理的SO-UO模型组。
实施例5
对比试验例1：提供一种真皮成纤维细胞外泌体的制备。
1）将实施例1中真皮层小块孵育于α-MEM培养基中。接种于Transwell培养小室上，5天后收集成纤维细胞，并用DMEM/F-12+1%FBS培养基培养。
2）将扩增的成纤维细胞，接种至T-175超低吸附培养瓶中。
3）待细胞汇合度达到80%后，用PBS清洗细胞3次。
4）向T-175培养瓶中加入20mL无血清的DMEM/F-12待真皮成纤维细胞逐渐形成3D细胞球，培养至第5天时收集培养上清。
5）收集的培养上清，先通过差速离心（300g离心10分钟，2000g离心10分钟，10000g离心30分钟）进行分离。收集经过差速离心后的上清，进行第一轮100000g超速离心70分钟。用磷酸盐缓冲盐水（PBS，Sigma-Aldrich）洗涤沉淀后，进行第二轮 100000g 超速离心70分钟。将最终沉淀重悬于 200 μL PBS 中。为了去除蛋白质并浓缩培养基中的外泌体，将培养基离心并通过15mL超滤离心管(100kDa，MilliporeSigma, Burlington, MA, USA)。将外泌体浓缩并储存在-80℃备用，标记为HF-EV。
对比试验例2：提供另一种皮肤类器官外泌体的制备方法。
1）安乐死小鼠，用75%乙醇反复喷淋小鼠尸体。
2）将小鼠放置吸水纸上，用剪刀取下颈段皮肤。
3）在预冷的PBS中反复漂洗皮肤组织，并用镊子去除皮肤组织上明显的血污。
4）用剪刀剪碎皮肤组织。
5）用15ml Trypsin在50ml BD管中重悬皮肤组织，加入10ul DNaseI，于37℃水浴锅中消化1小时，期间每10分钟取出上下颠倒。
6）用等体积的DMEM+10%FBS中和Trypsin。
7）将第6）步中的组织悬液通过70μm的滤网。
8）1500rpm 离心10分钟。
9）去掉上清液，收集沉淀后用5ml ACK于冰上重悬细胞，静置3分钟。
10）1500rpm离心5分钟。
11）去掉上清液，收集沉淀后加120ul Matrigel于冰上重悬细胞，种在48孔板中，每孔30ul。
12）于37℃孵箱中凝固15分钟。
13）48孔板中，每孔加入DMEM/F12培养基及细胞因子或化合物进行类器官培养，所述细胞因子或化合物包括B27、EGF、R-spondin 1、FGF10、Y-27632、Glutamax、Gastrin、N-acetylcysteine、Noggin、A83-01、Nicotinamide、WNT3a和N2中的一种或多种。并在培养基周围加上PBS，防止蒸干。
14）每天观察和记录，培养基变黄再更换新的培养基或者传代，培养出皮肤类器官，收集培养的皮肤类器官上清。
15）收集培养上清，先通过差速离心（300g离心10分钟，2000g离心10分钟，10000g离心30分钟）进行分离。收集经过差速离心后的上清，进行第一轮100000g超速离心70分钟。用磷酸盐缓冲盐水（PBS，Sigma-Aldrich）洗涤沉淀后，进行第二轮 100000g 超速离心70分钟。将最终沉淀重悬于 200 μL PBS 中。为了去除蛋白质并浓缩培养基中的外泌体，将培养基离心并通过15mL超滤离心管(100kDa，MilliporeSigma, Burlington, MA, USA)。将外泌体浓缩并储存在-80℃备用，标记为SO2-EV。
对比分析外泌体SO-EV,SO2-EV,HY-EV的衰老修复作用。
用三种外泌体分别处理自然衰老类器官模型SO-O，并进行SA-β-gal染色，p16INK4A,p21CIP1A的表达水平分析，以及类器官的增殖分析。实验结果见图6、图7。
图6为SA-β-gal染色结果，图6a为对照，图6b为经HF-EV处理，图6c为经SO2-EV处理，图6d为经SO-EV处理。图中可以看出SO-EV处理后的类器官着色最少，其次是SO2-EV处理的类器官着色较少，但SO-EV的整体衰老修复效果显著优于其他两种外泌体。
图7a为细胞衰老相关基因的表达情况对比分析，结果表明SO-EV可以使两种基因显著下调，且显著优于其他两种外泌体，“未处理”代表未用任何外泌体处理的SO-O模型组；图7b为类器官的增殖曲线，三种外泌体均能促进类器官的增殖，SO-EV处理的类器官增殖能力显著优于另外两组。
实施例6
本实施例提供不同方法刺激分泌的外泌体对比。
对比本发明使用物理-生理联用刺激方法和逐一单独使用方案中提到的类器官尺寸控制、饥饿刺激、机械刺激、动态培养对各种实验组进行处理并制备相应的外泌体。
图8a示出了用不同的手段刺激本发明的皮肤类器官分泌分泌外泌体。图中可以看出，当分别采用饥饿刺激7天、机械刺激7天和动态培养7天时，其外泌体的分泌量显著低于本发明的物理-生理联用刺激（饥饿刺激2天-机械刺激2天-动态培养-3天）。其中对照为不采用任何方法刺激外泌体分泌的皮肤类器官。
图8b示出了用本发明的物理-生理联用刺激分别处理本发明制备得到的皮肤类器官、对比试验例1的成纤维3D细胞球、对比试验例2的皮肤类器官，可以看出，在相同的促类器官分泌手段下，本发明制备的类器官的外泌体分泌量显著高于其他两组。
图8c示出了不同尺寸的皮肤类器官铺板，用同样的方法刺激外泌体分泌。其中对照组的类器官尺寸为50-100μm，控制类器官尺寸组为30-50μm。可以看出，将皮肤类器官解离至30-50μm尺寸大小后，由于增大了类器官总体表面积，因此可以在相同手段下刺激类器官分泌出更多的外泌体。
图8a-8c的纵坐标代表外泌体分泌量的倍数变化。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
Claims (10)
1.一种皮肤类器官外泌体的制备方法，其特征在于，取全层皮肤组织消化解离出具有干性的细胞后培养为皮肤类器官，再使用物理-生理联用刺激所述皮肤类器官分泌出外泌体，具体步骤包括如下：
步骤1：取全层皮肤组织，将其分离为真皮层和表皮层；
步骤2：将步骤1分离出的真皮层和表皮层进一步消化得到具有干性的细胞，所述具有干性的细胞包括真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞；
步骤3：将步骤2得到的真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞按照9:1~1:1的比例混合，加入含有血小板裂解物的类器官培养基，然后再用Matrigel基质胶或BME基底膜提取物重悬并接种于细胞孔板中，待胶滴凝结后再加入所述含有血小板裂解物的类器官培养基培养出皮肤类器官；
步骤4：将步骤3培养出的皮肤类器官培养至可传代水平，随后解离为30-50μm尺寸大小以增大皮肤类器官的表面积，再加入所述含有血小板裂解物的类器官培养基并接种于新的细胞孔板中；
步骤5：对步骤4中增大了表面积的的皮肤类器官进行1-3轮的物理-生理联用刺激，以促进外泌体分泌，所述物理-生理联用刺激为采用物理手段和生理手段联合刺激外泌体分泌，所述物理手段包括机械刺激和动态培养，所述生理手段为饥饿刺激，每轮的所述物理-生理联用刺激操作依次为饥饿刺激2天、机械刺激2天和动态培养3天；
步骤6：收集步骤5中经过1-3轮物理-生理联用刺激操作后的培养上清液，用差速离心结合超高速离心的方式收集所述上清液中的外泌体。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述饥饿刺激为将皮肤类器官置于无糖基础培养基上培养，所述无糖基础培养基包括无糖DMEN培养基、无糖DMEM/F12培养基或SILAC Advanced DMEM/F-12 Flex培养基。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述机械刺激为将皮肤类器官置于15-40kpa/300mmHg的压力环境下培养；所述动态培养为将皮肤类器官置于动态摇床上以30-50rpm摇动培养。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含有血小板裂解物的类器官培养基包括Advanced DMEM/F12、5%-10% hpL、0.1% BSA、1% N2、1% B27、10Mm HEPES、1%GlutaMAX、1% P/S、1mM N-Acetyl-L-cysteine、1uM A83-01、10uM Forskolin、50ng/mLEGF、100ng/mL FGF-10、100ng/mL Noggin、250ng/mL R-Spondin 1或100ng/mL Wnt3a。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中将表皮层剪切成细小块状，加到0.25%的胰酶溶液中孵育至细胞完全解离，收获单细胞悬液并用上皮培养基CntPrime重悬后接种于胶原蛋白包被的培养板上得到所述表皮角质形成细胞；将真皮层剪成细小块状，用I型胶原酶和0.25%胰酶消化，并孵育于α-MEM培养基中得到所述真皮成纤维细胞。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中可传代水平的皮肤类器官大小为大于150μm。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5中对皮肤类器官进行一共3轮的物理-生理联用刺激。
8.权利要求1-7任一项所述的制备方法得到的皮肤类器官外泌体，其特征在于，所述皮肤类器官外泌体的浓度为1X1010~5X1010/mL。
9.权利要求8所述的皮肤类器官外泌体在制备皮肤抗衰老制剂中的应用。
10.权利要求8所述的皮肤类器官外泌体在制备皮肤光老化损伤修复制剂中的应用。
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