CN111073881A - 用于毛发再生的含有诱导的外泌体的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有毛发再生效果的外泌体的制备方法，包括：向细胞直接/间接提供超声波刺激的步骤；以规定时间培养上述细胞及培养基的混合物的步骤；以及从上述混合物分离外泌体的步骤，其中，直接提供刺激是指向含有细胞的培养基施加超声波刺激，间接提供刺激是指向未含有细胞的培养基施加超声波刺激之后，混合上述培养基和上述细胞。这种外泌体的制备方法可以轻易地获取具有毛发再生效果的大量的外泌体，其所含有的各种因子的含量及数量也多。上述外泌体及含有其的组合物可诱导毛发再生的多种因子，且外泌体具有基于磷脂的膜结构，容易渗透头皮，由此递送物质的效率高，故能有效地诱导毛发再生，没有使用合成药品时出现的副作用。

Description

用于毛发再生的含有诱导的外泌体的组合物
技术领域
本发明涉及一种具有毛发再生效果的外泌体、其制备方法以及含有上述外泌体的组合物。
背景技术
毛发具有一定的毛发周期(hair cycle)，即毛发经过受到毛乳头(dermalpapilla)的刺激的毛母细胞(keratinocyte)活跃地分裂及增殖，从而使毛发生长的生长期(anagen)、对于毛球(hair bulb)的血液供应被阻断，且毛乳头从毛囊分离的退行期(catagen)、以及停止细胞增殖而毛发不生长的休止期(telogen)之后，再次回到生长期或者走向毛发从头皮脱落的脱落期(exogen)。人的毛发具有分别独立的生长周期，一部分处于脱落期，另一部分处于生长期，从而整体上保持相同程度的毛发数。然而，当这种均衡倾向于脱落期，在正常应当有毛发的部位出现毛发脱落的状态称为秃头症(alopecia)。
秃头症对当事人带来严重的精神上的痛苦，最近，随着出现症状的年龄段降低，秃头症越来越受到关注。脱发有多种原因，大体上有男性激素的变性、自体免疫、内分泌疾病、分娩、闭经、老化等的内部因素及缺乏营养、药物、压力、头皮污染、头皮干燥、毛囊虫等的外部因素。
为了改善这种脱发现象，正在开发多种脱发改善制剂或生发诱导制剂。目前，公认的美国食品和药物管理局(FDA)批准的药物中除了米诺地尔(Minoxidil)制剂和非那雄胺(Finasteride)之外，没有验证的治疗剂，由于上述两种合成药品需要持续服用才能见效，因此存在由长期服用而带来的副作用、费用及不便的问题。并且，虽然其中非那雄胺具有防止脱发的效果，但是长期处于休止期状态的毛发的生长效果不太明显，且作为激素制剂而存在各种副作用。
生物体来源的蛋白质、基因、细胞等作为原料的药品(生物药品(biologics))与合成药品不同，不会在体内产生代谢产物，由此毒性较低，并且选择性地作用于疾患的病因，从而效果好，副作用较少。最近，随着这种优点受到关注，正在开发用于治疗脱发的生物药品，尤其是利用干细胞来治疗脱发的方法。韩国授权专利10-1425653(2014.08.05)公开了通过混合脂肪组织来源的成体干细胞及头皮组织来源的毛囊细胞而制成的用于治疗脱发的细胞治疗剂，韩国授权专利10-1781526(2017.09.19)公开了含有干细胞提取物的脱发治疗剂，韩国授权专利10-1836029(2018.03.08)公开了含有通过利用TGF-β进行刺激来进行培养的干细胞培养液的用于防止脱发及促进生发的组合物。但是，就利用干细胞的上述组合物而言，共同具有效率性及经济性差的问题(该问题由苛刻的细胞的分离及扩增而导致)。并且，对于干细胞治疗剂而言，存在转移为癌症等风险，而就干细胞提取物而言，从细胞中提纯活性成分并不容易，存在需付出较多的费用和时间的缺点，且对于干细胞培养液而言，除了活性成分之外，还含有从细胞中分泌的排泄物或为了防止污染而添加的抗生素及血清等(这些为未验证用于人体时的风险的物质)。
众所周知，外泌体是自然分泌的30至200nm直径的纳米囊泡，并且，可作为从来源的细胞搬运多种物质的重要的纳米介质而发挥作用。发现外泌体可以通过递送mRNA来改变目标细胞的表型之后，多项研究表明外泌体参与细胞分化。最近，人们以多种方式寻求将外泌体以治疗目的而直接用于人体的可能性。尤其，在这种生物药品领域中，相比于小分子、肽、生长因子、抗体、核酸等的生物制药(biopharmaceuticals)，外泌体在含有多种蛋白质及核酸，从而可以产生更复杂又持久的效果。并且，相比于如细胞一样大的药品，外泌体不存在转移等的风险，且由于不需要在注入细胞时发生的内质网形态的分解，因此具有与细胞不同的时空效应。最近，正在开发将从具有改善及治愈多种症状的效果的干细胞中得到的外泌体作为治疗组合物来使用的技术。韩国公开专利10-2017-0044999(2015.10.16.)公开了包含成体干细胞或其培养液来源的外泌体作为活性成分的用于防止脱发或治疗的组合物。但是，包括上述公开专利的使用外泌体的治疗组合物的相关技术而言，难以生产大量的外泌体，并且大部分使用分离及扩增苛刻的干细胞。因此，为了在临床上使用外泌体，需要一种新型技术，该技术可从容易获得、扩增和保持的细胞(非干细胞)中得到外泌体的同时，还能提高外泌体的收率。
发明内容
发明所要解决的问题
本发明为了解决上述问题而提出，提供一种如下的外泌体的制备方法，该制备方法包括：向细胞直接/间接提供超声波刺激的步骤；以规定时间培养上述细胞及培养基的混合物的步骤；以及从上述混合物分离外泌体的步骤，其中，直接提供刺激是指向含有细胞的培养基施加超声波刺激，间接提供刺激是指向未含有细胞的培养基施加超声波刺激之后，混合上述培养基和上述细胞，因此可以在短时间内从可轻易获得的细胞中以高收率得到具有毛发再生效果的外泌体。
并且，本发明的一实施例提供通过上述制备方法制备、且能促进毛发再生的基因的RNA增加的外泌体。
并且，本发明的一实施例提供含有上述外泌体、且可持久发挥毛发再生效果的安全的组合物。
本发明所要解决的技术问题不限于前述技术问题，本领域技术人员可以根据以下的记载而明确地了解到未提及的其它技术问题。
用于解决问题的方案
作为用于解决上述技术问题的技术方案，根据本发明一方面的具有毛发再生效果的外泌体的制备方法包括：向细胞直接/间接提供超声波刺激的步骤；以规定时间培养上述细胞及培养基的混合物的步骤；以及从上述混合物中分离外泌体的步骤，其中，直接提供刺激是指向含有细胞的培养基施加超声波刺激，间接提供刺激是指向不含有细胞的培养基施加超声波刺激之后，混合上述培养基和上述细胞。
其中，上述向细胞直接/间接提供超声波刺激的步骤通过选自以下方式中的任一种方式来执行：在混合细胞和培养基之后，向上述混合物提供超声波刺激，或者在向培养基提供超声波刺激之后，混合上述培养基和细胞，或者在向细胞提供超声波刺激之后，混合上述细胞和培养基，或者在向细胞提供超声波刺激之后，混合上述细胞和培养基，然后向上述混合物提供超声波刺激，或者在向培养基提供超声波刺激之后，混合上述培养基和细胞，然后向上述混合物提供超声波刺激，或者在分别向细胞和培养基提供超声波刺激之后，混合上述细胞及上述培养基，或者在分别向细胞和培养基提供超声波刺激之后，混合上述细胞及上述培养基，然后向上述混合物提供超声波刺激。
就直接的上述超声波刺激而言，强度为0.1至3W/cm2，频率为20kHz至20MHz，持续时间为0.1秒至20分，就间接的上述超声波刺激而言，强度为1至20W/cm2，频率为20kHz至20MHz，持续时间为0.1秒至20分。
上述细胞选自由各种哺乳类来源的干细胞、祖细胞(progenitor cell)、成纤维细胞、角质细胞或者器官内的组织细胞构成的组。
上述培养基可以是胚胎干细胞培养基、毛乳头细胞培养基或者毛囊干细胞培养基中的任一种。
上述混合物的培养进行1小时至10天。
上述分离外泌体的步骤中，利用超离心分离、密度梯度、过滤、尺寸排除色谱法，免疫亲和分离、沉淀、基于微流体的分离方法中的一种以上。
上述分离外泌体的步骤可以包括：通过对培养后的上述混合物进行离心分离来获取上清液的步骤；利用过滤器来过滤上述上清液，由此获取过滤液的步骤；对上述过滤液进行浓缩的步骤。
上述分离外泌体的步骤还可以包括：利用过滤器过滤上述上清液之前，在4℃以下的条件下保管3个月以内的时间的步骤。
所分离的上述外泌体的直径为50至200nm。
根据本发明的另一方面，提供通过上述制备方法制备的、具有毛发再生效果的外泌体。
其中，上述外泌体与未通过上述制备方法的细胞所分泌的外泌体相比，促进毛发再生的基因的RNA增加，上述促进毛发再生的基因是β-Catenin、Shh、KRT25、Lef1、VCAN、Ptc1、Tcf3、Mitf、Tyr、Tyrp1、Gli1及Dct中的任一种以上。
上述外泌体与未通过上述制备方法的细胞所分泌的外泌体相比，涂布在皮肤时，进一步增加在皮肤促进毛发再生的基因的RNA表达，且进一步减少抑制毛发再生的基因的RNA表达，上述促进毛发再生的基因是Shh、β-Catenin、KRT25、VCAN、Gli1、Lef1、Ptc1、Tyrp1、Tyr、Mitf及Dct中的任一种以上，上述抑制毛发再生的基因是Sfrp4及DKK中的任一种以上。
本发明的再一方面，提供含有具有上述毛发再生效果的外泌体的组合物。
其中，上述组合物可以含有106个/ml以上浓度的上述外泌体。
上述解决技术问题的技术手段仅仅是示例性的，而不能理解为限定本发明的意图。除了上述示例性的实施例之外，在附图及发明的详细的说明中还可以存在额外的实施例。
发明效果
根据本发明的一实施例的外泌体的制备方法可以通过如超声波处理的简单的过程，不仅能从分离及扩增过程较苛刻的干细胞及祖细胞诱导具有毛发再生效果的大量的外泌体，而且还可以从可容易获得的体细胞中诱导具有毛发再生效果的大量的外泌体。对于以这种方式诱导的外泌体而言，其收率比现有的方法高，上述外泌体内所含有的各种因子的含量及数量也更多。
根据本发明的一实施例的外泌体及含有其的组合物中可以大量含有可诱导毛发再生的多种因子，尤其是促进毛发再生的基因的RNA。并且，外泌体具有基于磷脂的膜结构，容易渗透毛孔，故递送物质的效率高，因此可以有效地诱导毛发再生，没有使用合成药品时出现的副作用，且效果更持久。
本发明的效果并不限于上述效果，而应当被理解为包括可通过记载的本发明的详细的说明或者记载于权利要求书的发明的结构来推测的所有效果。
附图说明
图1为根据本发明实施例1的具有毛发再生效果的外泌体的生成数据，其是利用纳米颗粒分析仪(Nanosight)及电子显微镜来分析外泌体的形态的图(a-b)及根据实施例1而制备的外泌体及对照组(HDF-exo)的粒子尺寸及浓度的图(c-d)。
图2为根据本发明实施例1的具有毛发再生效果的外泌体的生成数据，其是示出外泌体标记物CD63的诱导、以及CD63与对毛发再生起到重要作用的蛋白质Shh的共存的免疫荧光染色图。
图3为分析根据本发明实施例1的具有毛发再生效果的外泌体内的毛发再生相关mRNA的转录组测序(RNA-seq)数据。
图4为分析根据本发明实施例1的具有毛发再生效果的外泌体内的毛发再生相关mRNA的RT-qPCR数据。
图5为基于根据本发明实施例1的具有毛发再生效果的外泌体的C57小鼠皮肤的毛发再生数据，其是根据上述外泌体的处理浓度及处理后的时间的毛发生成图。
图6为基于根据本发明实施例1的具有毛发再生效果的外泌体的裸鼠皮肤的毛发再生数据，其是根据上述外泌体的处理浓度及处理后的时间的毛发生成图。
图7为基于根据本发明实施例1的具有毛发再生效果的外泌体的C57小鼠及裸鼠皮肤中的组织变化数据，其是皮肤组织的H&E染色图。
图8为基于根据本发明实施例1的具有毛发再生效果的外泌体的C57小鼠及裸鼠皮肤中的组织变化数据，其是皮下及整个皮肤组织中的毛囊数数据。
图9为基于根据本发明实施例1的具有毛发再生效果的外泌体的C57小鼠皮肤中的体内(in vivo)基因表达变化数据，其是在皮肤涂布利用亲脂性标记物Did标记的外泌体后示出其分布情况的荧光染色图及与根据上述外泌体处理的毛囊再生基因的表达变化相关的蛋白质免疫荧光染色图。
图10为基于根据本发明实施例1的具有毛发再生效果的外泌体的C57小鼠皮肤中的体内基因表达变化数据，其是与根据上述外泌体处理的毛囊再生基因的表达变化相关的mRNA的qRT-PCR数据。
图11为基于根据本发明实施例1的具有毛发再生效果的外泌体的裸鼠皮肤中的体内基因表达变化数据，其是在皮肤涂布利用亲脂性标记物Did标记的外泌体后示出其分布情况的荧光染色图及与根据上述外泌体处理的毛囊再生基因的表达变化相关的蛋白质免疫荧光染色图。
图12为基于根据本发明实施例1的具有毛发再生效果的外泌体的裸鼠皮肤中的体内基因表达变化数据，其是与根据上述外泌体处理的毛囊再生基因的表达变化相关的mRNA的qRT-PCR数据。
具体实施方式
以下，更详细地说明本发明。但是本发明能够以各种不同的方式来实现，且不限于在此说明的实施例，只能根据前述的权利要求书定义本发明。
并且，在本申请中使用的术语仅仅是为了说明特定的实施例而使用的，并不是限定本发明的意图。单数的表述方式只要在文脉上没有明确指出不同意思就包括多数的表述含义。在本发明的整个说明书中“含有”某个结构要素是指在没有特别相反的记载的情况下，并不是排除其他构成要素，而是还能够进一步含有其他结构要素。
根据本发明一实施例的具有毛发再生效果的外泌体的制备方法包括：向细胞直接/间接提供超声波刺激的步骤；以规定时间培养上述细胞及培养基的混合物的步骤；以及从上述混合物中分离外泌体的步骤，其中，直接提供刺激是指向含有细胞的培养基施加超声波刺激，间接提供刺激是指向不含有细胞的培养基施加超声波刺激之后，混合上述培养基和上述细胞。
其中，向细胞直接/间接提供超声波刺激的上述步骤通过选自以下方式中的任一种方式来执行：在混合细胞和培养基之后，向上述混合物提供超声波刺激，或者在向培养基提供超声波刺激之后，混合上述培养基和细胞，或者在向细胞提供超声波刺激之后，混合上述细胞和培养基，或者在向细胞提供超声波刺激之后，混合上述细胞和培养基，然后向上述混合物提供超声波刺激，或者在向培养基提供超声波刺激之后，混合上述培养基和细胞，然后向上述混合物提供超声波刺激，或者在分别向细胞和培养基提供超声波刺激之后，混合上述细胞及上述培养基，或者在分别向细胞和培养基提供超声波刺激之后，混合上述细胞及上述培养基，然后向上述混合物提供超声波刺激。如上所述的超声波刺激可以是对细胞通过直接/间接的方法执行一次以上，或以上述方式中选择一种以上的组合来进行，随着次数的增加，外泌体的毛发再生效果可以成比例的增加。如此，在提供一次以上的超声波刺激时，优选在每次的超声波刺激之间留有时间间隔，以能使细胞能恢复。上述时间间隔为一日以上，更优选为两日以上。
对于直接的上述超声波刺激而言，强度为0.1至3W/cm2，频率为20kHz至20MHz，持续时间为0.1秒至20分钟，对于间接的上述超声波刺激而言，强度为1至20W/cm2，频率为20kHz至20MHz，持续时间为0.1秒至20分钟。更优选地，对于直接的上述超声波刺激而言，强度为0.5至2W/cm2，频率为20kHz至2MHz，持续时间为0.1秒至10分钟，对于间接的上述超声波刺激而言，强度为2至10W/cm2，频率为20kHz至2MHz，持续时间为1秒至15分钟。
上述细胞可以选自各种哺乳类来源的除生殖细胞以外的各种细胞，优选地，上述细胞选自由各种哺乳类来源的干细胞、祖细胞、成纤维细胞、角质细胞或者器官内的组织细胞构成的组，更优选地，上述细胞可以是哺乳类来源的成纤维细胞或者器官内的组织细胞中的任一种。这是因为，根据后述的本发明一实施例的具有毛发再生效果的外泌体的制备方法，即使使用任何细胞，也能够获取上述外泌体，因此与难以获得且扩增条件苛刻的干细胞或祖细胞相比，更容易获取、保持及扩增的细胞(如成纤维细胞或器官内的组织细胞等)可更加容易、且有效地获取外泌体。根据上述外泌体对于后述的生物体的后续用途，上述细胞可以是自体来源(autologous)的细胞、同种来源(allogeneic)的细胞或者异种来源(heterologous)的细胞中的任一种，就异种来源的细胞而言，可以是从哺乳类中获取的。为了减少免疫排斥的可能性，优选使用同种来源的细胞，最优选使用自体来源的细胞。
向细胞施加超声波刺激的上述步骤中，可直接对细胞进行超声波处理，或者在仅含有最小量(即在细胞能被初始培养基勉强覆盖的程度)的情况下进行超声波处理。此时，初始培养基作为将上述细胞保持为健康状态时使用的普通培养基，可以是适合于上述细胞的普通培养的培养基，例如，上述细胞是成纤维细胞，初始培养基为含有抗生素和血清的DMEM培养基。
上述培养基(在无细胞的情况下超声波处理的培养基)可以选自胚胎干细胞培养基、毛乳头细胞培养基及毛囊干细胞培养基，但是并不限于此。例如，上述培养基可以是胚胎干细胞培养基、间充质干细胞培养基、神经干细胞培养基、脂肪干细胞培养基、造血干细胞培养基、毛乳头细胞培养基及毛囊干细胞培养基中的任一种。根据本发明的发明人申请的韩国专利第10-2018-0060317号，通过对超声波处理的第二细胞培养基(可培养第二细胞或可诱导分化为第二细胞的培养基)及超声波处理的第一细胞的混合物进行培养而获得的外泌体来处理其他细胞，则可以将该细胞重编程为第二细胞，干细胞或者其提取物、培养液等均呈现治疗脱发的效果。
上述混合物的培养进行1至10日，优选地，进行1至6日，最优选地，进行1至2日。这是因为外泌体在超声波处理后的第一天分泌最多，随着时间的流逝，其分泌量减少，从这种分泌量减少的情况来看，成分也有可能发生变化。
分离外泌体的上述步骤中，可利用超离心分离、密度梯度分离、过滤、尺寸排除色谱法、免疫亲和分离、沉淀、基于微流体的分离方法中的一个以上。
分离外泌体的上述步骤可以包括：通过对培养后的上述混合物进行离心分离来获取上清液的步骤；利用过滤器过滤上述上清液，由此获取过滤液的步骤；以及对上述过滤液进行浓缩的步骤。上述离心分离是为去除细胞碎片及死细胞而进行，优选地，以1000至5000g进行10分钟至60分钟。利用过滤器过滤上清液的步骤是为了进一步去除细胞碎片，且仅获取特定尺寸以下的粒子而执行，优选地，在此使用的过滤器可以是注射器式过滤器(syringe filter)。优选地，对上述过滤液进行浓缩的步骤中，可以利用离心式过滤器(centrifugal filter)来进行浓缩。如果利用离心式过滤器，则可以对上述过滤液进行浓缩的同时，去除特定尺寸的粒子。分离外泌体的上述步骤还可以包括：利用过滤器过滤上述上清液之前，在4℃以下的条件下进行3个月以内时间的保管的步骤。对于上述保管而言，优选地，在4℃以下的条件下保管7天以内的时间，更优选地，可以在-20℃以下的条件下保管1个月以内的时间，最优选地，可以在-80℃以下的条件下保管3个月以内的时间。外泌体的活性成分为mRNA和蛋白质等，在温度高或接近能使酶活性高的温度时，这些成分更容易发生变性或分解。
所分离的上述外泌体的直径为50至200nm，优选地，直径为100至150nm。
根据本发明的另一面的具有毛发再生效果的外泌体，通过上述制备方法来实现制备。
其中，上述外泌体与未通过权利要求1的制备方法的细胞所分泌的外泌体相比，促进毛发再生的基因的RNA增加，上述促进毛发再生的基因是β-连环蛋白(Beta-Catenin)、音猬因子(Sonic Hedgehog，Shh)、角蛋白25(Keratin 25，KRT25)、淋巴样增强结合因子1(Lymphoid Enhancer Binding Factor 1，Lef1)、多能蛋白聚糖(Versican，VCAN)、Ptc1(Patched 1)，转录因子3(Trascription Factor 3，TCF3)、小眼畸形相关转录因子(Microphthalmia Associated Transcription Factor，MITF)、酪氨酸酶(Tyrosinase，Tyr)、酪氨酸酶相关蛋白1(Tyrosinase Related Protein 1，Tyrp1)、GLI家族锌指蛋白1(GLI family zinc finter 1，Gli1)及多巴色素异构酶(Dopachrome Tautomerase，Dct)中的任一种以上。
上述外泌体与未通过上述制备方法的细胞所分泌外泌体相比，涂布在皮肤时，进一步增加在皮肤中能促进毛发再生的基因的RNA表达，且进一步减少抑制毛发再生的基因的RNA表达，上述促进毛发再生的基因是Shh(Sonic Hedgehog)、β-Catenin(Beta-Catenin)、KRT25(Keratin 25)、VCAN(Versican)、Gli1(GLI family zinc finer 1)、Lef1(Lymphoid Enhancer Binding Factor 1)、Ptc1(Patched 1)、Tyrp1(Tyrosinase RelatedProtein 1)、Tyr(Tyrosinase)、MITF(Microphthalmia Associated TranscriptionFactor)及Dct(Dopachrome Tautomerase)中的任一种以上，上述抑制毛发再生的基因是分泌型卷曲相关蛋白4(Secreted Frizzled Related Protein 4，Sfrp4)及DKK(Dickkopf)中的任一种以上。
根据本发明另一方面，提供含有具有上述毛发再生效果的外泌体的组合物。
其中，上述组合物可以最少含有106个/ml浓度的上述外泌体，更优选地，含有1012个/ml浓度的上述外泌体。这是因为，当含有的外泌体的浓度小于106个/ml或大于1012个/ml时，毛发再生效果可能会降低，特别是在浓度过高时，经济性也会降低。
向上述组合物除了添加上述外泌体之外，显而易见地，还能够以多种方式添加作为药用载体、其他添加剂(可通过提高向上述处理部位的渗透率来进一步增强毛发再生效果的添加剂)等，因此将省略对其的具体说明。
以下，对本发明的实施例进行详细地说明，以便本领域技术人员能够容易实施。然而本发明能够以各种不同的方式来实现，且不限于在此说明的实施例。
本发明的所有实施例及实验例中的所有细胞培养是在37℃、5％的CO2条件下进行。
实施例1.具有毛发再生效果的外泌体的制备及利用其的毛发再生的诱导
为了获取具有毛发再生效果的外泌体，利用UltraRepro 1001(STEMON公司，首尔，韩国)直接向1×106个的人真皮成纤维细胞(HDF)施加20KHz，1.0W/cm2的超声波刺激5秒。在35-mm培养皿中，将2×105个的UHDF与超声波处理(20KHz，5.0W/cm2，10分)的毛乳头细胞培养基(Dermal Papilla cell medium，PromoCell)一起培养一天。从培养上述UHDF的培养基中分离外泌体的方式如下：以3000×g方式对培养基进行离心分离20分钟，从而去除细胞碎片及死细胞之后，用0.22-mm过滤器(
Figure BDA0002223992440000111
Syringe Filter，赛多利斯(Sartorius)，戈丁根(Goettingen)，德国)过滤上清液。将过滤的培养基放入
Figure BDA0002223992440000112
Ultra-15离心式过滤器(100000kDa)((Millipore，Billerica，MA，美国)以14000×g进行离心分离20分钟，从而对外泌体(iExo)进行浓缩。
实验例1.具有毛发再生效果的外泌体分析实验
对根据实施例1的具有毛发再生效果的外泌体的制备方法而培养出的UHDF通过基于CD63外泌体标记物的免疫荧光染色进行分析的结果(此时，对照染色为核染剂4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI))，正生成大量的外泌体(图2的a)，上述标记物和对毛发再生起到重要作用的标记物Shh(Sonic hedgehog)的免疫荧光染色结果，可以确认Shh在分泌的外泌体中表达(图2的b)。利用纳米颗粒分析仪(Nanosight)及透射电子显微镜(transmissionelectron microscopy，TEM)来分析根据实施例1的具有毛发再生效果的外泌体的制备方法获取的外泌体的形态的结果，观察到正常形态的外泌体(图1的a-b)。根据实施例1制备的外泌体大体具有50nm至250nm的直径(图1的c)，并且与未通过上述制备方法的相同数量的细胞所分泌的外泌体相比，其数量多四倍以上(图1的d)。对于上述外泌体的RNA-Seq分析结果，相比于对照组，与毛发再生相关的毛发组织生成、毛发再生、黑色素形成、Jak-Stat信号转导系统及Wnt信号转导系统的mRNA及微RNA(microRNA)大大增加(图3，其中“重编程因子的外泌体”是指“Repsome”)。利用实时定量荧光PCR(Real-time PCR)分析上述外泌体的mRNA的结果，可以得知，相比于对照组，β-Catenin、Shh、KRT25、Lef1、Versican、Ptc1、TCF3、Mitf、Tyr、Gli1及Tyrp1增加(图4的a-b)，上述结果可以根据对于上述外泌体及对照组的RNA-seq的读取数(read count)分析来确认(图4的c)。综上所述，可以确认能成功通过实施例1的外泌体的制备方法来从HDF诱导出具有毛发再生功能的外泌体。
实验例2.根据具有毛发再生效果的外泌体的毛发再生实验
将根据实施例1的具有毛发再生效果的外泌体的制备方法而获取的外泌体稀释在D-PBS培养液，并且分别以1×109、1×1010、1×1011个/ml浓度在去除背侧(dorsal side)的毛发的C57小鼠及裸鼠的皮肤涂布外泌体，涂布方式为一周一次，一周及两周后分别确认其效果的结果，可以确认C57小鼠的多数毛发比对照组中的毛发长(图5)，就裸鼠而言，可以确认未进行外泌体处理的组中无法用肉眼观察毛发，相反，对于进行外泌体处理的组而言，从第一周开始长出多数毛发(图6)，利用上述外泌体处理两周的小鼠组与对照组相比，毛发长三倍(未列出数据(data not shown))。上述内容能证明上述外泌体具有毛发再生效果，同时，从可通过一周一次的涂抹而在正常无法生长出毛发的裸鼠中诱导毛发再生的事实来看，上述外泌体可以具有比以一日两次的方式进行涂布才能发挥效果的FDA批准的药物更长的持久性。
H&E染色结果，在外泌体处理的皮肤观察到染成深紫色的多个部分(表示毛囊)(图7)，可确认在整个皮肤层，尤其在皮下组织(subcutis)中毛囊数量远多于对照组(图8)，由此可以在组织水平确认毛发的生成。利用脂质标记物DiD对上述外泌体进行染色后，涂布在裸鼠及C57小鼠的表皮，根据其结果，可以确认外泌体渗透至毛孔内(分别图9的a及图11的a，对照染色为核染色剂DAPI)。并且，通过组织免疫荧光染色可确认外泌体处理组与对照组相比，与毛囊细胞再生相关的蛋白质B-Catenin、Shh及Ki67的表达增加(分别图9的b及图11的b)，并且，通过对于皮肤组织的qRT-PCR可确认生发促进因子Shh、β-Catenin、KRT25、VCAN、Gli1、Lef1、Ptc1、Tyrp1、Tyr、Mitf、Dct的mRNA表达增加，生发抑制因子Sfrp4及DKK的mRNA表达减少(分别图10及图12)。综上所述，可以确认根据实施例1而制备的外泌体在体外(in vitro)及体内(in vivo)呈现出卓越的毛发再生效果。
比较例1.对于具有毛发再生效果的外泌体的对照组
在成纤维细胞培养基(含有10％胎牛血清(fetal bovine serum)(Gibco)及1％青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)(Gibco)的DMEM(Gibco))培养未进行超声波刺激的HDF(NHDF)。当从培养上述NHDF的培养基分离外泌体，即对照组的外泌体(HDF-Exo)时，通过与实施例1的外泌体分离方法相同的过程来进行。
比较例2.相对于具有毛发再生效果的外泌体处理小鼠的对照组
在没有外泌体的情况下，将D-PBS培养液(其为用于稀释外泌体的溶剂)涂布在去除背侧(dorsal side)的毛发的C57小鼠及裸鼠的皮肤。
前述的本发明的说明用于示例，本领域技术人员能够理解在不变更本发明的技术思想或必要特征的前提下，可变形为其他具体形态。因此，应当被理解为以上描述的实施例在所有方面都是示例性的，而不是限定性的。例如，以单一的方式说明的各个结构要素也可以由分散的形态实施，同理，以分散的方式说明的结构要素也可以由结合的形态实施。
本发明的范围由前述的权利要求书而体现，从权利要求书的含义、范围以及等效概念导出的所有变更或者变形的形态应包括在本发明的范围内。

Claims (15)

1.一种具有毛发再生效果的外泌体的制备方法，其特征在于，包括：
向细胞直接/间接提供超声波刺激的步骤；
以规定时间培养所述细胞及培养基的混合物的步骤；以及
从所述混合物分离外泌体的步骤，
其中，直接提供刺激是指向含有细胞的培养基施加超声波刺激，间接提供刺激是指向未含有细胞的培养基施加超声波刺激之后，混合所述培养基和所述细胞。
2.根据权利要求1所述的具有毛发再生效果的外泌体的制备方法，其特征在于，
所述向细胞直接/间接提供超声波刺激的步骤通过选自以下方式中的任一种方式来执行：
在混合细胞和培养基之后，向所述混合物提供超声波刺激；或者
在向培养基提供超声波刺激之后，混合所述培养基和细胞；或者
在向细胞提供超声波刺激之后，混合所述细胞和培养基；或者
在向细胞提供超声波刺激之后，混合所述细胞和培养基，然后向所述混合物提供超声波刺激；或者
在向培养基提供超声波刺激之后，混合所述培养基和细胞，然后向所述混合物提供超声波刺激；或者
在分别向细胞和培养基提供超声波刺激之后，混合所述细胞及所述培养基；或者
在分别向细胞和培养基提供超声波刺激之后，混合所述细胞及所述培养基，然后向所述混合物提供超声波刺激。
3.根据权利要求1所述的具有毛发再生效果的外泌体的制备方法，其特征在于，
直接的所述超声波刺激的强度为0.1至3W/cm2，频率为20kHz至20MHz，持续时间为0.1秒至20分，
间接的所述超声波刺激的强度为1至20W/cm2，频率为20kHz至20MHz，持续时间为0.1秒至20分。
4.根据权利要求1所述的具有毛发再生效果的外泌体的制备方法，其特征在于，
所述细胞选自由各种哺乳类来源的干细胞、祖细胞、成纤维细胞、角质细胞或者器官内的组织细胞构成的组。
5.根据权利要求1所述的具有毛发再生效果的外泌体的制备方法，其特征在于，
所述培养基是胚胎干细胞培养基、毛乳头细胞培养基或者毛囊干细胞培养基中的任一种。
6.根据权利要求1所述的具有毛发再生效果的外泌体的制备方法，其特征在于，
所述混合物的培养进行1小时至10天。
7.根据权利要求1所述的具有毛发再生效果的外泌体的制备方法，其特征在于，
所述分离外泌体的步骤中，利用超离心、密度梯度、过滤、尺寸排除色谱法、免疫亲和分离、沉淀、基于微流体的分离方法中的一个以上。
8.根据权利要求1所述的具有毛发再生效果的外泌体的制备方法，其特征在于，
所述分离外泌体的步骤包括：
通过对培养后的所述混合物进行离心分离来获取上清液的步骤；
利用过滤器过滤所述上清液，由此获取过滤液的步骤；以及
对所述过滤液进行浓缩的步骤。
9.根据权利要求1所述的具有毛发再生效果的外泌体的制备方法，其特征在于，
所述分离外泌体的步骤还包括：
利用过滤器过滤所述上清液之前，在4℃以下的条件下保管3个月以内的时间的步骤。
10.根据权利要求1所述的具有毛发再生效果的外泌体的制备方法，其特征在于，
所分离的所述外泌体的直径为50至200nm。
11.一种具有毛发再生效果的外泌体，其特征在于，
所述外泌体根据权利要求1所述的制备方法制备。
12.根据权利要求11所述的具有毛发再生效果的外泌体，其特征在于，
所述外泌体与未通过权利要求1的制备方法制备的细胞所分泌的外泌体相比，促进毛发再生的基因的RNA增加，
所述促进毛发再生的基因是β-连环蛋白、音猬因子、角蛋白25、淋巴样增强结合因子1、多能蛋白聚糖、Ptc1、转录因子3、小眼畸形相关转录因子、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1、GLI家族锌指蛋白1及多巴色素异构酶中的任一种以上。
13.根据权利要求11所述的具有毛发再生效果的外泌体，其特征在于，
所述外泌体与未通过权利要求1的制备方法的细胞所分泌的外泌体相比，涂布在皮肤时，进一步增加在皮肤中促进毛发再生的基因的RNA表达，且进一步减少抑制毛发再生的基因的RNA表达，
所述促进毛发再生的基因是音猬因子、β-连环蛋白、角蛋白25、多能蛋白聚糖、GLI家族锌指蛋白1、淋巴样增强结合因子1、Ptc1、酪氨酸酶相关蛋白1、酪氨酸酶、小眼畸形相关转录因子及多巴色素异构酶中的任一种以上，
所述抑制毛发再生的基因是分泌型卷曲相关蛋白4及DKK中的任一种以上。
14.一种含有具有毛发再生效果的外泌体的组合物，其特征在于，
所述具有毛发再生效果的外泌体是根据权利要求11所述的具有毛发再生效果的外泌体。
15.根据权利要求14所述的含有具有毛发再生效果的外泌体的组合物，其特征在于，
所述组合物含有106个/ml以上浓度的所述外泌体。
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