JP7249693B2 - 誘導されたエキソソームを含む皮膚再生及び創傷治癒用組成物 - Google Patents

誘導されたエキソソームを含む皮膚再生及び創傷治癒用組成物 Download PDF

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本発明は、皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソーム、及びその製造方法、並びに、該エキソソームを含む組成物に関する。
人体で最大の組織である皮膚は、刺激を受け入れ、ビタミンＤを合成して体温調節及び免疫監視に関与する様々な機能のほか、基本的に疾病及び水分蒸発に対する保護膜を提供する第１の防衛ラインとしての重要な機能を有する。皮膚の創傷治癒は、止血（ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）、炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、及び再形成（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）の４段階を伴う複雑な段階である。受傷直後数時間以内に引き起こされる第一段階では、血液凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ）及び仮創傷マトリックス（ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｗｏｕｎｄ ｍａｔｒｉｘ）が形成され、第一段階を経て活性化された炎症段階は、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）の募集と単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）の参加及び変性によって、感染体及び壊死組織を除去することになる。増殖段階では、肉芽組織（ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ ｔｉｓｓｕｅ）の形成、血管ネットワークの回復、繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）の表面への移動、再上皮化（ｒｅｅｐｉｔｈｅｌｉｚａｔｉｏｎ）、血管新生（ａｎｇｉｏｎｇｅｎｅｓｉｓ）等が行われ、受傷後２１日～１年後まで続く成熟（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）段階では、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）によって、肉芽組織の形成が止まるような、増殖段階で盛んに行われた過程が徐々に止まり、増殖段階で多量生産されたコラーゲンＩＩＩがさらに強いコラーゲンＩに代替され、筋繊維芽細胞がコラーゲンに多重連結されて、瘢痕の面積を減らすことになる。前記過程の一つでも適宜作用しなければ、創傷は、その治癒が遅延し、または慢性化するが、この場合、特に第１の防衛ラインとしての役割に深刻な問題が生じ、これに対して、治癒は行われても、瘢痕過形成等により、外形的な問題が生じ得る。
皮膚付属器（ｓｋｉｎ ａｐｐｅｎｄａｇｅｓ）は、毛根、皮脂腺、爪、及び汗腺を含む。大きな創傷の治癒経過は、種ごとに異なる。魚類及び両生類等の下等脊椎動物の場合は、魚鱗、分泌腺等の皮膚付属器を含めた皮膚の再生が完全に行われる。これに対して、哺乳類では、胚芽段階を除いては、皮膚再生が完全でなく、皮膚付属器のない瘢痕組織が生成されるが、これは、追加の保護、保温及び刺激と関連した皮膚付属器の機能がうまく行われないようにし、美容及び心理的な面で生活の質を下げてしまうことになる。
生物由来のタンパク質、遺伝子、細胞等を原料とした医薬品であるバイオ医薬品（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）は、合成医薬品のように生体内で作り出される代謝産物がなくて、毒性が低く、疾患の発症機序に選択的に作用して、効果が良く、副作用が少ないという長所を有する。近年では、このような長所が脚光を浴びながら、皮膚再生及び創傷治癒を目的として、バイオ医薬品、特に幹細胞を用いる方法が開発されており、幹細胞自体、その抽出物、または培養液を用いる方法等が開示されている。しかしながら、幹細胞を用いる上記組成物は、幹細胞の分離及び増幅が難しいという効率性及び経済性の問題を共通して有しており、幹細胞治療剤の場合、癌細胞への転移等の危険性があり、幹細胞抽出物の場合、細胞から有効性分を精製することが困難であり、多くの費用と時間を要するという短所があり、幹細胞培養液の場合、有効性分のほか、細胞から分泌した老廃物や、汚染防止のために添加された抗生剤、及び血清等のような、人体への使用時の危険性が検証されなかった物質が含まれているという問題点があった。
エキソソームは、自然に分泌される３０～２００ｎｍの直径のナノ小胞であって、由来細胞から様々な物質を運ぶ重要なナノ媒介として作用することが知られている。エキソソームが、ｍＲＮＡの伝達を介して標的細胞の表現型を変化させ得ることを発見して以来、多くの研究によってエキソソームが細胞分化等に関与することが明らかになった。近年では、エキソソームを治療目的で人体に直接使用できる可能性について、色んな角度から検討されている。特に、エキソソームは、このようなバイオ医薬品の分野において、小さな分子、ペプチド、成長因子、抗体、核酸等の生物学的製剤（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に比べて、様々なタンパク質及び核酸を含有しており、より複雑で長続きする効果を奏することができ、細胞のように大きな医薬品に比べて、転移等の危険がなく、細胞の注入時に生じる小胞体形態への分解が必要ないので、細胞とは異なる時空間的効果を有するという長所がある。近年では、特に多くの症状改善及び治癒効果を有すると知られた幹細胞から得られたエキソソームを、治療組成物として使用する技術が開発されている。特許文献１には、成体幹細胞またはその培養液由来エキソソームを有効性分として含む創傷治療用組成物について開示されている。しかしながら、上記した公開特許の技術を含めて、エキソソームを使用する治療組成物関連技術等は、エキソソームの収率が低いため、殆ど分離及び増幅が難しい幹細胞を使用している。このため、エキソソームを臨床的に使用するためには、幹細胞ではなく、容易に得て増幅・維持が可能な細胞からエキソソームを得るとともに、その収率を高めることができる技術が望まれている。
大韓民国公開特許１０－２０１７－００４４９９９（２０１５．１０．１６）
本発明は、前述した問題を解決するために案出されたものであり、本発明の一実施形態は、細胞に直接的または間接的に超音波刺激を提供する段階と、前記細胞および培地の混合物を一定時間培養する段階と、前記混合物からエキソソームを分離する段階と、を含み、前記直接的に刺激を提供することは、細胞を含む培地に超音波刺激を加えることであり、前記間接的に刺激を提供することは、細胞を含まない培地に超音波刺激を加えた後、前記培地と前記細胞を混合することである、皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームが容易に得られる細胞から短時間かつ高収率で得られる製造方法を提供する。
また、本発明の一実施形態は、前記製造方法で製造され、皮膚再生及び創傷治癒を促進する遺伝子のＲＮＡが増加されたエキソソームを提供する。
また、本発明の一実施形態は、前記エキソソームを含み、安全であり、合成医薬品に比べて、持続力が高い皮膚再生及び創傷治癒用組成物を提供する。
本発明が成し遂げようとする技術的課題は、以上で言及した技術的課題に限定されるものではなく、言及していない他の技術的課題は、以下の記載から、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者に明確に理解される。
前述した技術的課題を達成するための技術的手段として、本発明の一態様による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの製造方法は、細胞に直接的または間接的に超音波刺激を提供する段階と、前記細胞および培地の混合物を一定時間培養する段階と、前記混合物からエキソソームを分離する段階と、を含み、前記直接的に刺激を提供することは、細胞を含む培地に超音波刺激を加えることであり、前記間接的に刺激を提供することは、細胞を含まない培地に超音波刺激を加えた後、前記培地と前記細胞を混合することである。
ここで、前記細胞に直接的または間接的に超音波刺激を提供する過程は、細胞と培地を混合した後、前記混合物に超音波刺激を提供するか、培地に超音波刺激を提供した後、前記培地と細胞を混合するか、細胞に超音波刺激を提供した後、前記細胞と培地を混合するか、細胞に超音波刺激を提供した後、前記細胞と培地を混合し、次いで前記混合物に超音波刺激を提供するか、培地に超音波刺激を提供した後、前記培地と細胞を混合し、次いで前記混合物に超音波刺激を提供するか、細胞と培地にそれぞれ超音波刺激を提供した後、前記細胞及び前記培地を混合するか、細胞と培地にそれぞれ超音波刺激を提供した後、前記細胞及び前記培地を混合し、次いで前記混合物に超音波刺激を提供するかの方式の中から選択されるいずれか一つの方式により行われることを特徴としてもよい。
前記直接的な超音波刺激は、強度が０．１～３Ｗ／ｃｍ２であり、周波数が２０ｋＨｚ～２０ＭＨｚであり、持続時間が０．１秒～２０分であることを特徴とし、前記間接的な超音波刺激は、強度が１～２０Ｗ／ｃｍ２であり、周波数が２０ｋＨｚ～２０ＭＨｚであり、持続時間が０．１秒～２０分であることを特徴としてもよい。
前記細胞は、それぞれ哺乳類由来の幹細胞、前駆細胞、繊維芽細胞、角質細胞、または器官内の組織細胞からなる群から選択されることを特徴としてもよい。
前記培養培地は、上皮幹細胞培地、真皮幹細胞培地、脂肪幹細胞培地、間葉系幹細胞培地、または胚性幹細胞培地のうちのいずれか一つであってもよい。
前記混合物の培養は、１時間～１０日間行われることを特徴としてもよい。
前記エキソソームを分離する段階は、超遠心分離、密度勾配、ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、免疫親和性分離、沈殿、及びマイクロ流体による分離の方法のうちの少なくとも一つを用いることを特徴としてもよい。
前記エキソソームを分離する段階は、前記培養後の混合物を遠心分離して上澄み液を得る段階と、前記上澄み液をフィルタでろ過してろ液を得る段階と、前記ろ液を濃縮する段階と、を含んでいてもよい。
前記エキソソームを分離する段階は、前記上澄み液をフィルタでろ過する前に、４℃以下で、７日～１ヶ月間保管する段階をさらに含んでもよい。
前記分離されたエキソソームは、直径が５０～２００ｎｍであることを特徴としてもよい。
本発明の他の一態様は、前記製造方法で製造されたことを特徴とする、皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームを提供する。
ここで、前記エキソソームは、請求項１に記載の製造方法に入る前の細胞から分泌されたエキソソームに比べて、皮膚再生及び創傷治癒を促進する遺伝子のＲＮＡが増加されており、前記皮膚再生及び創傷治癒を促進する遺伝子は、ＥＧＦＲ、ＦＮ１、ＭＭＰ９、ＭＭＰ２、ＭＡＰＫ１、ＦＧＦ２、ＣＴＧＦ、ＡＫＴ１、ＡＬＢ、ＴＧＦＢ１、ＭＡＰＫ３、ＶＥＧＦＡ、ＦＧＦ７、ＨＧＦ、ＩＬ６、ＥＧＦ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－３１、Ｃｏｌ１α１、ＥＬＮ、ＰＣＮＡ、Ｎ－カドヘリン、及びサイクリン－Ｄ１のうちの少なくともいずれか一つであることを特徴としてもよい。
前記エキソソームは、請求項１に記載の製造方法に入る前の細胞から分泌されたエキソソームに比べて、皮膚への塗布時、皮膚における皮膚再生及び創傷治癒を促進する遺伝子のＲＮＡ発現をさらに増加させ、前記皮膚再生及び創傷治癒を促進する遺伝子は、Ｃｏｌ１α１、Ｃｏｌ３α１、ＥＬＮ、ＰＣＮＡ、Ｎ－カドヘリン、及びサイクリン－Ｄ１のうちの少なくともいずれか一つであってもよい。
本発明のまた他の一態様は、前記皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームを含む組成物を提供する。
ここで、前記組成物は、前記エキソソームが１０６個／ｍｌ以上の濃度で含まれたものであってもよい。
本発明の一実施形態によるエキソソームの製造方法は、分離及び増幅過程が難しい幹細胞及び前駆細胞はもとより、容易に得られる体細胞からも、超音波処理という簡単な過程によって、皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの分泌を多量で誘導することができる。このように誘導されたエキソソームは、その収率が既存の方法に比べて高く、前記エキソソーム内に含まれた各種の因子の量及び数も高い。
本発明の一実施形態によるエキソソーム、及びそれを含む組成物は、皮膚再生及び創傷治癒を誘導する様々な因子を多量で含有する。また、エキソソームは、リン脂質からなる膜構造を有し、毛穴への浸透が容易であり、物質の伝達効率が高いので、本発明の一実施形態によるエキソソームは、皮膚再生及び創傷治癒を効果的に誘導することができ、合成医薬品の使用において現れる副作用がないという長所がある。また、本発明の一実施形態によるエキソソームは、哺乳類では、通常不完全に行われる創傷の治癒をさらに完全に誘導して、瘢痕が残らずまたは小さくなるようにし、創部（創傷部位）の毛根等の皮膚付属器を再生させることもできる。
本発明の効果は、上記の効果に限定されるものではなく、本発明の詳細な説明または特許請求の範囲に記載された発明の構成から推論できる全ての効果を含む。
本発明の実施例１による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの生成データであって、エキソソームマーカーであるＣＤ６３の誘導を示す免疫蛍光染色イメージである。 本発明の実施例１による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの遺伝子発現データであって、ＲＮＡ－ｓｅｑで前記エキソソーム（ｉＥｘｏ）においてのみ１２以上読み取りカウントされた遺伝子の遺伝子オントロジー分析の結果である。 本発明の実施例１による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの遺伝子発現データであって、創傷治癒と関連したＲＮＡ－ｓｅｑの結果データである。 本発明の実施例１による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの遺伝子発現データであって、血管新生、細胞成長、細胞移動、細胞増殖、炎症反応、再生、分泌、組織再生、及び組織リモデリングと関連したＲＮＡ－ｓｅｑの結果データである。 本発明の実施例１による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの遺伝子発現データであって、前記エキソソーム内の皮膚再生及び創傷治癒に関する遺伝子のＲＮＡを分析したｑＲＴ－ＰＣＲデータである。 本発明の実施例１による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果データであって、前記エキソソームを様々な濃度で処理したＨＤＦにおける細胞増殖分析データである。 本発明の実施例１による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果データであって、スクラッチアッセイで測定したＨＤＦにおけるそれぞれのエキソソームの処理濃度別・時間別の移動率データである。 本発明の実施例１による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果データであって、前記エキソソームの処理濃度別のＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）におけるチューブ形成分析データである。 本発明の実施例１による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果データであって、前記エキソソームを処理した細胞内の皮膚再生及び創傷治癒に関する遺伝子のＲＮＡを分析したｑＲＴ－ＰＣＲデータである。 本発明の実施例１による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームによるｉｎ ｖｉｖｏでの効果データであって、前記エキソソームを様々な濃度で処理したマウスにおける経時による創傷治癒の経過イメージである。 本発明の実施例１による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームによるｉｎ ｖｉｖｏでの効果データであって、前記エキソソームを様々な濃度で処理したマウスにおける創部の組織断面のＨ＆Ｅ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ Ｅｏｓｉｎ：ヘマトキシリン・エオジン）染色イメージである。 本発明の実施例１による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームによるｉｎ ｖｉｖｏでの効果データであって、前記エキソソームを様々な濃度で処理したマウスにおける創部の濃度別の細胞増殖マーカー分析データである。 本発明の実施例１による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームによるｉｎ ｖｉｖｏでの効果データであって、前記エキソソームの皮膚浸透分析データである。 本発明の実施例１による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームによるｉｎ ｖｉｖｏでの効果データであって、前記エキソソームを様々な濃度で処理したマウスにおけるエキソソーム処理濃度別の創部におけるＲＴ－ＰＣＲ結果データである。 本発明の実施例１による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームによるｉｎ ｖｉｖｏでの効果データであって、前記エキソソームを処理したマウスにおける受傷後３週間経過してからの創部の皮下血管発達の比較イメージである。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。しかし、本発明は、種々の態様で実現することが可能であり、ここで説明する実施形態により限定されるものではなく、後述する特許請求の範囲により定義されるだけである。
なお、本発明で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明するために使われるものであって、本発明を限定するものではない。単数の表現は、文脈上明らかに異なるものを意味しない限り、複数の表現を含む。本発明の明細書の全般に亘って、ある構成要素を「含む」とは、特に断りのない限り、他の構成要素を除外するものではなく、他の構成要素をさらに含んでいてもよいということを意味する。
本発明の一態様による、皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの製造方法は、細胞に直接的または間接的に超音波刺激を提供する段階と、前記細胞および培地の混合物を一定時間培養する段階と、前記混合物からエキソソームを分離する段階と、を含み、前記直接的に刺激を提供することは、細胞を含む培地に超音波刺激を加えることであり、前記間接的に刺激を提供することは、細胞を含まない培地に超音波刺激を加えた後、前記培地と前記細胞を混合することであることを特徴とする。
ここで、前記細胞に直接的または間接的に超音波刺激を提供する過程は、細胞と培地を混合した後、前記混合物に超音波刺激を提供するか、培地に超音波刺激を提供した後、前記培地と細胞を混合するか、細胞に超音波刺激を提供した後、前記細胞と培地を混合するか、細胞に超音波刺激を提供した後、前記細胞と培地を混合し、次いで前記混合物に超音波刺激を提供するか、培地に超音波刺激を提供した後、前記培地と細胞を混合し、次いで前記混合物に超音波刺激を提供するか、細胞と培地にそれぞれ超音波刺激を提供した後、前記細胞及び前記培地を混合するか、細胞と培地にそれぞれ超音波刺激を提供した後、前記細胞及び前記培地を混合し、次いで前記混合物に超音波刺激を提供するかの方式の中から選択されるいずれか一つの方式により行われることを特徴としてもよい。このような超音波刺激は、前記方式の中から選択される一つ以上の組み合わせにより、細胞に直接的または間接的に１回以上提供されてもよく、回数が増加するほど、エキソソームの皮膚再生及び創傷治癒効果が比例的に高くなる。このように超音波刺激を１回以上提供する場合は、各回の間に細胞が回復できるような時間間隔を設定することが好ましく、前記時間間隔を、好ましくは１日以上、より好ましくは２日以上と設定してもよい。
前記直接的な超音波刺激は、強度が０．１～３Ｗ／ｃｍ２であり、周波数が２０ｋＨｚ～２０ＭＨｚであり、持続時間が０．１秒～２０分であることを特徴とし、前記間接的な超音波刺激は、強度が１～２０Ｗ／ｃｍ２であり、周波数が２０ｋＨｚ～２０ＭＨｚであり、持続時間が０．１秒～２０分であることを特徴としてもよい。好ましくは、前記直接的な超音波刺激は、強度が０．５～２Ｗ／ｃｍ２であり、周波数が２０ｋＨｚ～２ＭＨｚであり、持続時間が０．１秒～１０分であることを特徴とし、前記間接的な超音波刺激は、強度が２～１０Ｗ／ｃｍ２であり、周波数が２０ｋＨｚ～２ＭＨｚであり、持続時間が１秒～１５分であることを特徴としてもよい。
前記細胞は、それぞれ哺乳類由来の生殖細胞を除いた細胞から選択されてもよく、好ましくは、それぞれ哺乳類由来の幹細胞、前駆細胞、繊維芽細胞、角質細胞、または器官内の組織細胞からなる群から選択されることを特徴としてもよく、さらに好ましくは、哺乳類由来の繊維芽細胞または器官内の組織細胞のいずれか一方であってもよい。これは、後述する本発明の一態様による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの製造方法によれば、前記エキソソームは、いずれの細胞を用いても得られるので、得難くて増幅が難しい幹細胞や前駆細胞よりも、繊維芽細胞や器官内の組織細胞等のように、修得、維持及び増幅が容易な細胞がさらに容易くて効率的であるからである。前記細胞は、前記エキソソームの後述する生体への以降の用途に応じて、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）由来、同種（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）由来または異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）由来のいずれかであってもよく、異種由来である場合、哺乳類から得られるものであってもよい。免疫拒絶反応の可能性を低減するために、好ましくは同種由来、より好ましくは自己由来のものを使用してもよい。
前記細胞に超音波刺激を加える段階は、細胞に直接超音波処理を行い、または、細胞が初代培養培地でやっと覆われるほど最小限の量だけ含まれた状態で行われてもよい。このときの初代培養培地は、前記細胞の健康状態を保つために用いられる一般の培地であり、前記細胞の通常の培養に適した培地、例えば、前記細胞が繊維芽細胞であり、抗生剤と血清が含まれたＤＭＥＭ培地であってもよい。
前記培養培地（細胞を含まずに超音波処理される培地)は、上皮幹細胞培地、真皮幹細胞培地、脂肪幹細胞培地、間葉系幹細胞培地、または胚性幹細胞培地のうちから選ばれるものであってもよいが、これに制限されない。例えば、皮膚幹細胞培地、骨髄幹細胞培地、血管内皮前駆細胞培地、血管前駆細胞培地、間葉系前駆細胞培地、上皮幹細胞培地、真皮幹細胞培地、造血幹細胞培地、脂肪幹細胞培地、間葉系幹細胞培地、または、胚性幹細胞培地、及び各種の成体幹細胞培地のうちのいずれか一つであってもよい。これは、本発明の発明者により出願された大韓民国特許出願第１０－２０１８－００６０３１７号の発明によれば、超音波処理された第２細胞培地(第２細胞を培養し、または第２細胞への分化を誘導する培地)及び超音波処理された第１細胞の混合物を培養することにより得られたエキソソームを、他の細胞に処理すると、この細胞を第２細胞によりリプログラミングすることができ、幹細胞、またはその抽出物、培養液等は、全て皮膚再生及び創傷治癒に効果を奏すると知られている。
前記混合物の培養は、１～１０日間行われることを特徴としてもよく、好ましくは１～６日間、最も好ましくは１～２日間行われることを特徴としてもよい。これは、エキソソームが、超音波処理後１日目に最も多く分泌され、経時により、その分泌量が減少するが、このような分泌量の減少からみて、成分が変化する恐れがあるからである。
前記エキソソームを分離する段階は、超遠心分離、密度勾配、ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、免疫親和性分離、沈殿、及びマイクロ流体による分離の方法のうちの少なくとも一つを用いることを特徴としてもよい。
前記エキソソームを分離する段階は、前記培養後の混合物を遠心分離して上澄み液を得る段階と、前記上澄み液をフィルタでろ過してろ液を得る段階と、前記ろ液を濃縮する段階と、を含んでいてもよい。前記遠心分離は、細胞デブリ及び死細胞を除去するために行われ、好ましくは、１０００～５０００ｇで、１０分～６０分間行ってもよい。前記上澄み液をフィルタで濾過する段階は、細胞デブリをさらに除去し、特定のサイズ以下の粒子のみを得るために行われるものであり、ここで使用されるフィルタは、好ましくは、シリンジフィルタであってもよい。前記ろ液を濃縮する段階は、好ましくは、遠心分離フィルタ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ）を用いて行ってもよい。遠心分離フィルタを用いれば、前記ろ液を濃縮するとともに、特定のサイズ以下の粒子を除去することができる。前記エキソソームを分離する段階は、前記上澄み液をフィルタで濾過する前に、４℃以下で７日～３ヶ月間保管する段階をさらに含んでもよい。前記保管は、好ましくは４℃以下で７日以内であり、より好ましくは－２０℃以下で１ヶ月以内であり、最も好ましくは－８０℃以下で３ヶ月以内であってもよい。エキソソームの有効性分は、ｍＲＮＡとタンパク質等であり、これらの成分は、温度が高く、または酵素活性の高い温度に近いほど変性または分解されやすい。
前記分離されたエキソソームは、直径が５０～２００ｎｍであることを特徴とし、好ましくは、直径が１００～１５０ｎｍであることを特徴としてもよい。
本発明の他の一態様による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームは、前記製造方法で製造されたことを特徴とする。
ここで、皮膚再生及び創傷治癒は、抗老化、しわの予防、しわ改善、創傷治癒、瘢痕治癒、及び組織再生のうちの少なくとも一つを含んでもよい。
前記エキソソームは、前記製造方法に入る前の細胞から分泌されたエキソソームに比べて、皮膚再生及び創傷治癒を促進する遺伝子のＲＮＡが増加されており、前記皮膚再生及び創傷治癒を促進する遺伝子は、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：上皮成長因子受容体）、ＦＮ１（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １：フィブロネクチン１）、ＭＭＰ９（Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ９：マトリックスメタロペプチダーゼ９）、ＭＭＰ２（Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ２：マトリックスメタロペプチダーゼ２）、ＭＡＰＫ１（Ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ １：分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ１）、ＦＧＦ２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２：繊維芽細胞成長因子２）、ＣＴＧＦ（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：結合組織成長因子）、ＡＫＴ１（ＡＫＴ Ｓｅｒｉｎｅ／Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ １：ＡＫＴセリン／スレオニンキナーゼ１）、ＡＬＢ（Ａｌｂｕｍｉｎ：アルブミン）、ＴＧＦＢ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ １：トランスフォーミング増殖因子－β１）、ＭＡＰＫ３（Ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ３：分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ３）、ＶＥＧＦＡ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ：血管内皮細胞成長因子Ａ）、ＦＧＦ７（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ７：繊維芽細胞成長因子７）、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：肝細胞増殖因子）、ＩＬ６（インターロイキン６）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：上皮成長因子）、ｍｉＲ－２１０（マイクロＲＮＡ ２１０）、ｍｉＲ－３１（マイクロＲＮＡ ３１）、Ｃｏｌ１α１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ １ ａｌｐｈａ １：コラーゲン１α１）、ＥＬＮ（エラスチン）、ＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ：増殖性細胞核抗原）、Ｎ－カドヘリン、及びサイクリン－Ｄ１のうちの少なくともいずれか一つであることを特徴としてもよい。
前記エキソソームは、前記製造方法に入る前の細胞から分泌されたエキソソームに比べて、皮膚への塗布時、皮膚における皮膚再生及び創傷治癒を促進する遺伝子のＲＮＡ発現をさらに増加させ、前記皮膚再生及び創傷治癒を促進する遺伝子は、Ｃｏｌ１α１、Ｃｏｌ３α１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ３ ａｌｐｈａ １：コラーゲン３α１）、ＥＬＮ、ＰＣＮＡ、Ｎ－カドヘリン、及びサイクリン－Ｄ１のうちの少なくともいずれか一つであってもよい。
本発明の他の一態様は、前記皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームを含む組成物を提供する。
ここで、前記組成物は、前記エキソソームが最小限１０６個／ｍｌ以上含まれたものであり、好ましくは、前記エキソソームが１０６個／ｍｌ～１０１４個／ｍｌの濃度で含まれたものであり、さらに好ましくは、１０１１個／ｍｌ～１０１２個／ｍｌの濃度で含まれたものであってもよい。これは、含まれたエキソソームの濃度が１０６個/ｍｌ未満であり、または１０１４個／ｍｌを超過する場合、皮膚再生及び創傷治癒効果が落ち、特に濃度が高くなり過ぎると、経済性も落ちるからである。
前記組成物には、前記皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソーム以外にも、薬剤学的に許容される担体、及び／または有効成分の吸収や再生及び治癒反応をさらに増進させるその他の添加剤等が、様々に添加され得ることは自明な事項であるので、これについての具体的な説明を省略する。
以下、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように、本発明の実施例について詳細に説明する。しかしながら、本発明は、種々の態様で実現することが可能であり、後述する実施例により限定されるものではない。
本発明の全ての実施例及び実験例上の全ての細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行われた。
実施例１．皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの製造
皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームを得るために、１×１０６個のヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）にＵｌｔｒａＲｅｐｒｏ １００１（ステムオンインコーポレーテッド（ＳＴＥＭＯＮ Ｉｎｃ．）、大韓民国・ソウル市）を用いて、２０ＫＨｚ、１．０Ｗ／ｃｍ２の超音波刺激を５秒間直接加えた。２×１０５個のＵＨＤＦを、３５－ｍｍペトリ皿で、超音波処理された(２０ＫＨｚ、５．０Ｗ／ｃｍ２、１０分)胚性幹細胞培養培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１５％ ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、０．１％ ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、０．１％ペニシリン／ストラプトマイシン、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール、１０００ｕｎｉｔ／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ））と共に１日間培養した。このように超音波処理したＨＤＦ（ＵＨＤＦ）を培養した培養培地からエキソソームを、次のように分離した。培養培地を３，０００×ｇで２０分間遠心分離することで細胞デブリ及び死細胞を除去した後、上澄み液を０．２２－ｍｍのフィルタ（Ｍｉｎｉｓａｒｔ（登録商標） Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ、ザルトリウス社、ドイツ・ゲッティンゲン）に通過させた。通過した培地をＡｍｉｃｏｎ（登録商標） Ｕｌｔｒａ－１５ １００，０００ｋＤａ ｄｅｖｉｃｅ（ミリポア社、アメリカ合衆国・マサチューセッツ州・ビレリカ）に入れ、１４，０００×ｇで２０分間遠心分離することで、エキソソーム（ｉＥｘｏ）を濃縮した。
実験例１．皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの分析実験
実施例１における皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの製造方法により培養した細胞（ＵＨＤＦ）を、エキソソームマーカーのＣＤ６３に対する免疫蛍光染色により分析した結果(このとき、対照染色は、核染色剤であるＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ：４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）により行う)、対照群に比べて、ＣＤ６３の信号強度がはるかに高く、多量のエキソソームが生成していることが確認された（図１）。製造されたエキソソームのＲＮＡ－Ｓｅｑの結果、実施例１により製造されたエキソソーム（ｉＥｘｏ）では、超音波刺激を与えずに培養された細胞から分離されたエキソソーム（ｉＥｘｏ）に比べて、特に創傷治癒、血管新生、細胞成長、細胞移動、細胞増殖、炎症反応、再生、分泌、組織再生、及び組織リモデリング等と関連した遺伝子発現が高く現れたが（図２～４）、代表として、ＥＧＦＲ、ＦＮ１、ＭＭＰ９、ＭＭＰ２、ＭＡＰＫ１、ＦＧＦ２、ＣＴＧＦ、ＡＫＴ１、ＡＬＢ、ＴＧＦＢ１、ＭＡＰＫ３、ＶＥＧＦＡ、ＦＧＦ７、ＨＧＦ、ＩＬ６、ＥＧＦ等のタンパク質コード遺伝子と、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－３１等のマイクロＲＮＡが含まれた（図３）。
また、前記細胞の培養液から分離したエキソソーム（ｉＥｘｏ）からＲＮＡを抽出して、ｑＲＴ－ＰＣＲにより分析した結果、組織再生及び創傷治癒に係る細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）と関連した遺伝子であるＣｏｌ１α１、Ｃｏｌ１α３、及びＥＬＮ、細胞増殖と関連した遺伝子であるＰＣＮＡ、Ｎ－カドヘリン、及びサイクリン－Ｄ１等の発現が、対照群から分離したエキソソーム（ｉＥｘｏ）に比べて高くなったことが確認された（図５）。
実験例２．皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの処理による細胞表現型の分析実験
実施例１における皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの製造方法により製造されたエキソソームを培地に加えてＨＤＦを培養し、これに対してエキソソームの濃度による効果を確認した。まず、細胞増殖効果を関連マーカーであるｋｉ６７に対する免疫蛍光染色によって分析した結果、実験群は、対照群に比べて前記マーカーの発現がより高く、特に５×１０１１個／ｍｌ及び１０×１０１１個／ｍｌの濃度のエキソソームで処理したとき、より優れた効果が示されることが分かり、細胞数がより多く増加することが確認された（図６）。次に、前記ＨＤＦをプレートに満杯に培養した後、２０μｌのエローチップ（ｙｅｌｌｏｗ ｔｉｐ）で線を引いて細胞間の距離を離隔してからエキソソームを処理して培養する創傷治癒アッセイ（ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ａｓｓａｙ）を行った。その結果、エキソソーム処理群において、空きスペースが比較的迅速に埋められることが示されており（図７）、実験群の細胞移動率が高いことを確認できた。
次に、実施例１により製造されたエキソソームの濃度に応じた組織の再生プロセスにおける血管形成の効率を分析するために、内皮細胞であるＨＵＶＥＣに異なる濃度のエキソソームを処理し、１０時間後に管（チューブ）の形成を確認した。その結果、エキソソーム処理群は、対照群に比べて管を良好に形成することが目視でも確認され（図８ａ）、管の長さ及び分岐点の数も高く示されており（図８ｂ～ｃ）、特に、５×１０１１個／ｍｌ及び１０×１０１１個／ｍｌの濃度で処理した群では、さらなる効果があることが示された。
最後に、エキソソームを処理した細胞内の組織再生及び創傷治癒に関する遺伝子であるＣｏｌ１α１、Ｃｏｌ３α１、ＥＬＮ、ＰＣＮＡ、Ｎ－カドヘリン、及びサイクリン－Ｄ１の発現をｑＲＴ－ＰＣＲで分析した。その結果、実験群の場合、対照群に比べて創傷治癒に関する遺伝子の発現が高く現れた（図９）。
実験例３．皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの処理のｉｎ ｖｉｖｏでの効果分析
実施例１における皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの製造方法により製造されたエキソソーム（ｉＥｘｏ）の効果を ｉｎ ｖｉｖｏで確認するために、６週齢のＣ５７マウスの皮膚にパンチで６ｍｍの創傷を発生させ、ｉＥｘｏをそれぞれ０、５、１０、２０×１０１１個／ｍｌの濃度にＰＢＳで希釈し、創部に週２回塗布した。
その結果、１週間後、エキソソームを処理したマウスの場合、外部に露出した創傷（ｏｐｅｎｉｎｇ）のサイズが、エキソソームを処理していないマウスに比べて、有意に縮小されたことがわかった（図１０；これについて、エキソソームを処理したマウスの場合、２週間で創傷が完全に閉じ、その上に毛が伸びて、処理群間の比較写真が撮れなかった）。また、１週間及び２週間後、それぞれ創部組織の断面をＨ＆Ｅ染色で確認した結果、エキソソームを処理していないマウスの創傷の大きさに比べて、エキソソームを処理したマウスの創傷の大きさが小さいことから、皮膚の再生、創傷の治癒が迅速に行われたことが確認できた。特に、創部に１０及び２０×１０１１個／ｍｌの濃度のエキソソームを処理した場合、皮膚組織が２週間で完全に回復して、皮膚組織を構成する表皮と真皮層、脂肪層、筋肉層が明確に区別できるように再生され、真皮層と脂肪層に、創部と周辺部位間に差がないように、皮膚付属器である毛包が形成され、特に、１０及び２０×１０１１個／ｍｌの濃度のエキソソームを処理した場合、２週間で瘢痕も消えたことが示された（図１１）。さらに、免疫蛍光染色により、創傷回復部位の組織断面に細胞増殖マーカーであるＫｉ６７を確認した結果、エキソソームを処理していない群に比べて、処理群において、Ｋｉ６７が広範囲に観察され（図１２）、損傷部位に細胞増殖が盛んに行われていることが分かった。ｉＥｘｏをＶｙｂｒａｎｔＴＭＤｉＤ細胞標識溶液（Ｃｅｌｌ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて染色して創部に処理し、２週間後、ｉＥｘｏを処理した部位を蛍光顕微鏡で分析した結果、ｉＥｘｏが創部全体に浸透し、このような効果的な浸透により前記のような再生及び治癒効果が奏されることが確認できる（図１３）。
次に、エキソソームを処理した創部において、組織再生及び創傷治癒に関する遺伝子であるＣｏｌ１α１、Ｃｏｌ１α３、ＥＬＮ、Ｎ－カドヘリン、及びサイクリン－Ｄ１の発現をｑＲＴ－ＰＣＲで分析し、その結果、ｉＥｘｏを処理した実験群の場合、対照群に比べて、前記遺伝子のうちの少なくとも一つの遺伝子の発現が概ね高かった（図１４）。このとき、濃度の違いによって最も増加する遺伝子が異なり、濃度と発現の増減の相関関係を確認することは困難であった。
最後に、創傷治癒が完了した３週間目に、創部の皮下血管発達の程度を確認した。その結果、ｉＥｘｏを処理した組織の血管がさらに多く発達したことが示された（図１５）。
まとめると、実施例１により製造されたエキソソームは、細胞の増殖と移動、及び血管の発達等を促進することで、組織の創傷治癒及び再生能力を向上させることができる。また、前記エキソソームの効果は、ｉｎ ｖｉｖｏでも示され、皮膚の再生、創傷治癒の速度を高める一方で、瘢痕がさらに小さくなりまたはなく、皮膚付属器も再生できるさらに完全な皮膚再生及び創傷治癒を誘導することができる。
比較例１．エキソソームに対する対照群（ｎＥｘｏ）
超音波刺激を与えなかったＨＤＦ（ＮＨＤＦ）を、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ－Ｉ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ギブコ社）、６Ｕ／ｍＬヘパリン（シグマアルドリッチ社）及び２００μＭアスコルビン酸（シグマアルドリッチ社）が含まれた繊維芽細胞培地（１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）及び１％ペニシリン／ストラプトマイシン（ギブコ社）が含まれたＤＭＥＭ（ギブコ社）で培養した。前記ＮＨＤＦを培養した培養培地からエキソソーム（ｎＥｘｏ）を分離するときは、実施例１におけるエキソソームの分離方法と同じ過程を経た。
比較例２．エキソソームにより誘導された細胞の対照群
１×１０５個のＨＤＦを、３５－ｍｍペトリ皿に播種して１日間培養した後、培地を比較例１により得られたエキソソームを含む培地に変えて５日間培養した。このとき、エキソソームを含む培地は、胚性幹細胞培養培地を使用し、培養培地は、２日毎に取り替えた。
比較例３．エキソソームにより皮膚再生及び創傷治癒が誘導されたマウスの対照群
ｉＥｘｏ希釈溶媒であるＰＢＳを、パンチで６ｍｍの創傷を発生させたマウスに、週２回塗布した。
前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者は、本願の技術的思想や必須特徴を変更することなく他の具体的な形態に容易に変形可能であることが理解できるであろう。よって、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的ではないことを理解しなければならない。例えば、単一型に説明されている各構成要素は分散して実施されてもよく、同様に、分散して説明されている構成要素も結合された形態で実施されてもよい。
本発明の範囲は、後述する特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び範囲、並びにその均等概念から導出される全ての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
本発明による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソーム及びそれを含む組成物は、皮膚再生及び創傷治癒を誘導する様々な因子、特に皮膚再生及び創傷治癒を促進する遺伝子の発現産物を多量で含み、リン脂質からなる膜構造を有し、頭皮への浸透が容易であり、物質の伝達効率が高いので、皮膚再生及び創傷治癒を効果的に誘導することができ、合成医薬品の使用において現れる副作用がなく、効果がさらに持続的であるので、皮膚を含む組織の損傷時、再生及び治癒を誘導することができる薬物として用いられ得る。
また、本発明による皮膚再生及び創傷治癒効果を有するエキソソームの製造方法は、前述した効果を有する様々な因子を、超音波刺激を細胞に処理する容易な過程により、高濃度の有効性分を含むエキソソームとして高収率で得ることができる。

Claims (8)

  1. 細胞に直接的に超音波刺激を提供する段階と、
    前記細胞と、超音波刺激を提供された培地との混合物を培養する段階と、
    前記混合物からエキソソームを分離する段階と、
    を含み、
    前記直接的に刺激を提供することは、細胞を含む培地に超音波刺激を加えることであり、前記超音波刺激を提供された培地とは、細胞を含まない培地に超音波刺激を加えることであり、
    前記細胞は、ヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）であり、
    前記混合物から分離されたエキソソームは超音波刺激を受けてない細胞から分泌されたエキソソームに比べて、皮膚再生及び創傷治癒を促進する遺伝子のＲＮＡが増加されており、前記皮膚再生及び創傷治癒を促進する遺伝子は、ＦＮ１、ＭＭＰ９、ＭＭＰ２、ＭＡＰＫ１、ＡＫＴ１、ＡＬＢ、ＭＡＰＫ３、ＩＬ６、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－３１、Ｃｏｌ１α１、ＥＬＮ、ＰＣＮＡ、Ｎ－カドヘリン、及びサイクリン－Ｄ１のうちの少なくともいずれか一つであり、
    前記混合物から分離されたエキソソームは超音波刺激を受けてない細胞から分泌されたエキソソームに比べて、皮膚への塗布時、皮膚における皮膚再生及び創傷治癒を促進する遺伝子のＲＮＡ発現をさらに増加させ、前記皮膚再生及び創傷治癒を促進する遺伝子は、Ｃｏｌ１α１、Ｃｏｌ３α１、ＥＬＮ、ＰＣＮＡ、Ｎ－カドヘリン、及びサイクリン－Ｄ１のうちの少なくともいずれか一つであり、
    前記混合物から分離されたエキソソームを含有する
    ことを特徴とする皮膚再生及び創傷治癒用組成物の製造方法。
  2. 前記直接的な超音波刺激は、強度が０．１～３Ｗ／ｃｍ２であり、周波数が２０ｋＨｚ～２０ＭＨｚであり、持続時間が０．１秒～２０分であることを特徴とし、
    前記培地に提供される超音波刺激は、強度が１～２０Ｗ／ｃｍ２であり、周波数が２０ｋＨｚ～２０ＭＨｚであり、持続時間が０．１秒～２０分である
    請求項１に記載の皮膚再生及び創傷治癒用組成物の製造方法。
  3. 前記培地は、上皮幹細胞培地、真皮幹細胞培地、脂肪幹細胞培地、間葉系幹細胞培地、または胚性幹細胞培地のうちのいずれか一つである
    請求項１に記載の皮膚再生及び創傷治癒用組成物の製造方法。
  4. 前記混合物の培養は、１時間～１０日間行われる
    請求項１に記載の皮膚再生及び創傷治癒用組成物の製造方法。
  5. 前記エキソソームを分離する段階は、
    超遠心分離、密度勾配、ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、免疫親和性分離、沈殿、及びマイクロ流体による分離の方法のうちの少なくとも一つを用いる
    請求項１に記載の皮膚再生及び創傷治癒用組成物の製造方法。
  6. 前記エキソソームを分離する段階は、
    前記培養する段階後の混合物を遠心分離して上澄み液を得る段階と、
    前記上澄み液をフィルタでろ過してろ液を得る段階と、
    前記ろ液を濃縮する段階と、を含む
    請求項１に記載の皮膚再生及び創傷治癒用組成物の製造方法。
  7. 前記エキソソームを分離する段階は、
    前記上澄み液をフィルタでろ過する前に、４℃以下で、７日～１ヶ月間保管する段階をさらに含む
    請求項６に記載の皮膚再生及び創傷治癒用組成物の製造方法。
  8. 前記分離されたエキソソームは、直径が５０～２００ｎｍである
    請求項１に記載の皮膚再生及び創傷治癒用組成物の製造方法。
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