JP2024512560A - 皮膚症状の治療のための単離初代真皮線維芽細胞 - Google Patents
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Abstract
対象から得られる皮膚試料由来の初代真皮線維芽細胞を含む細胞を単離するステップと、新鮮単離細胞を対象の皮膚に投与するステップとを含む、対象における皮膚症状を治療する方法を本明細書において提供する。また、初代真皮線維芽細胞を含む新鮮単離細胞調製物及びこの使用を提供する。
Description
本発明は、皮膚科学の分野、特には、皮膚症状、例えば、老化、しわ、瘢痕及び真皮萎縮における線維芽細胞の役割に関する。さらに詳細には、本発明は、真皮線維芽細胞を含む細胞を皮膚から単離するための方法、並びに医学的及び美容的方法におけるこのような単離細胞の使用に関する。
ヒト皮膚は、バリアとして機能する薄い外膜である表皮、並びに皮膚にボリューム及び構造的完全性を与える硬く厚い線維層である真皮からなる。広範な疾患過程により真皮の炎症及び線維化が生じ、結果として瘢痕が生じ得る。瘢痕の最も治療困難な形態のうちの１つは萎縮性瘢痕であり、この場合、真皮のボリュームが減少し、結果として皮膚表面の陥凹が生じる。これは、にきびに特によく見られるが、他の炎症性皮膚疾患、外科手術、外傷又は自傷によっても生じ得る。現在のところ、萎縮性瘢痕のための有効な治療はほとんど存在しない。小型の萎縮性瘢痕は切除する（外科的に除去し縫合する）ことができるが、大型の瘢痕は治療がより困難である。真皮フィラーにより外観の一時的改善をもたらすことが可能である一方、これらは定期的に反復する必要を有する。
自然老化の特性は、真皮の萎縮（菲薄化）であり、これは、線維芽細胞数の減少、細胞外マトリックスの維持における線維芽細胞の機能の変化及び皺皮（しわ）の形成と関連する。このような症状の治療に対する非常に大きな市場が存在する。萎縮性瘢痕、加齢性の真皮萎縮及び皺皮のための真皮フィラーのような現在の治療選択肢がわずかであるため、線維芽細胞療法製剤を開発する試みがなされている。このような製剤の潜在的利点は、真皮フィラーに伴う反復注射を必要としない、皮膚の生体力学的特質、例えば、弾性の改善と関連した真皮萎縮の持続的改善である。また、個人の将来の時点において真皮に再導入するため、非関連の美容外科手術の時点又は皮膚生検中のいずれかにおいて若年時のこの個人から線維芽細胞を回収し、このような細胞を低温で貯蔵することへの可能性が存在する。
現在のところ、ＦＤＡが認可した唯一の皮膚線維芽細胞療法薬は、Laviv（Fibrocell Science Inc社）である。ランダム化対照試験の後、これは、顔皺皮（しわ）の美容的治療のために２０１１年に認可され（Smith, et al., Dermatol. Surg. 2012 Jul;38(7 Pt 2):1234-43）、にきび瘢痕における有効性を示す試験が２０１３年に続いた（Munavalli et al., Dermatol. Surg. 2013 Aug;39(8):1226-36）。この治療は、耳後部からの小皮膚生検の回収を含み、これから線維芽細胞を培養する。３カ月後、このような培養線維芽細胞を３～６週間毎に一連の注射により再導入する。Lavivの成功は商業的に証明されず、結果的に市場から撤退している。このことが、（ｉ）安全かつ一時的に有効な代替物、即ち、真皮フィラーが存在すること、（ii）医師にとって物流的に困難であり、かつ多くの患者に対して魅力的でない、最初の生検採取から細胞注射まで３カ月の長い時間枠、及び（iii）、ＧＭＰ条件下の培養細胞による長期間の高額費用の組合せを象徴している可能性を有する。
Smith, et al., Dermatol. Surg. 2012 Jul;38(7 Pt 2):1234-43
Munavalli et al., Dermatol. Surg. 2013 Aug;39(8):1226-36
したがって、真皮線維芽細胞を使用して皮膚症状を予防又は治療するための新たな方法の必要性が存在する。特には、このような症状を治療するための、例えば、小規模な手術設備において１日で実施可能な、さらに迅速かつ費用効率の高い方法の必要性が存在する。
したがって、一態様では、対象における皮膚症状を予防又は治療する方法であって、対象から得られた皮膚試料由来の初代真皮線維芽細胞を含む細胞を単離するステップと、新鮮単離細胞が対象の皮膚に投与されるステップとを含む、方法を本発明により提供する。
一実施形態では、細胞が、エクスビボでの増殖ステップなしに、対象に投与される。
一実施形態では、細胞が、対象からの皮膚試料の入手及び／又は皮膚試料からの細胞の単離から４８時間、２４時間又は１２時間以内に対象の皮膚に投与される。
一実施形態では、治療する対象の皮膚１ｃｍ２あたり５００，０００、２５０，０００又は１５０，０００未満の細胞が投与される。
一実施形態では、細胞が、カルシウムハイドロキシアパタイト、合成ポリ乳酸ミクロスフェア、ポリ（メチル）メタクリル酸ミクロスフェア、ポリアルキルイミド、フィブリン、ヒアルロン酸及び／又はコラーゲンをさらに含む培地中で、対象に投与される。一実施形態では、細胞が、ヒアルロン酸及び／又はコラーゲン及び／又はフィブリンをさらに含む培地中で、対象に投与される。一実施形態では、細胞が、フィブリンを含むか又はこれから本質的になる水性培地中で、対象に投与される。即ち、細胞調製物は、液体培地（例えば、水溶液）中の細胞（好ましくは、初代真皮線維芽細胞）及びフィブリンから本質的になる。
一実施形態では、好ましくは、細胞が、単離ステップに使用し得る酵素（例えば、下記のもの）の不活性化なしで、細胞を、単離するために使用する消化培地中で、対象に投与される。
一実施形態では、方法は、美容的方法であり、及び／又は皮膚症状は、皮膚の老化、しわ、瘢痕若しくは萎縮である。
一実施形態では、対象の耳介後部、上腕、大腿、腹部若しくは背部から皮膚試料を得、及び／又は対象の顔、頸部、手若しくは他の身体部位上の皮膚に細胞が投与される。
一実施形態では、皮膚試料は、約０．０３～３ｃｍ２、好ましくは、約０．１～２ｃｍ２、より好ましくは、約０．５～１．５ｃｍ２の領域を有する。
一実施形態では、細胞が、次のステップ：（ａ）皮膚試料から表皮を取り出す（例えば、機械的又は酵素的に）ステップ、（ｂ）真皮組織を酵素により消化するステップ、並びに／又は（ｃ）細胞濾過及び／若しくは遠心分離により細胞を分離するステップの１又は２以上を含む方法により、皮膚試料から単離される。
一実施形態では、皮膚試料が、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、ＤＮＡｓｅ及び／又はヒアルロニダーゼから選択される１又は２以上の酵素とともにインキュベートされる。一実施形態では、皮膚試料が、２又は３以上の酵素、好ましくは、２又は３以上のタンパク質分解酵素、好ましくは、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、パパイン、トリプシン、サーモライシン、プロナーゼ、パンクレアチン、エラスターゼ、ＤＮＡｓｅ及び／又はヒアルロニダーゼから選択される２又は３以上の酵素とともにインキュベートされる。
一実施形態では、２又は３以上の酵素のうちの１つは、コラゲナーゼを含むか又はこれからなる。
一実施形態では、新鮮単離細胞における線維芽細胞のパーセンテージは、総細胞数の３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％超を占める。
一実施形態では、対象に投与される新鮮単離細胞は、線維芽細胞からなるか又はこれから本質的になる。
一実施形態では、細胞単離ステップは、ＣＤ２６、ＣＤ３１、ＣＤ３９、ＣＤ３６、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ３２４及びＥｐＣＡＭから選択される１又は２以上の細胞表面マーカー、好ましくは、ＣＤ９０の発現（例えば、陽性又は陰性）に基づいて皮膚試料から真皮線維芽細胞又はこの亜集団を分離するステップをさらに含む。
一実施形態では、細胞単離ステップは、固相上に固定化した真皮線維芽細胞の細胞表面マーカーに対して特異的な１又は２以上のリガンド、好ましくは、磁気ビーズ又はカラムに結合する１又は２以上の抗体を使用して、皮膚試料から真皮線維芽細胞又はこの亜集団を分離するステップをさらに含む。
一実施形態では、新鮮単離細胞は、好ましくは、細胞表面表現型ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＣＤ３２４－ＣＤ９０＋を有する真皮線維芽細胞、例えば、細胞表面表現型ＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６－を有する乳頭状真皮線維芽細胞、及び／又は例えば、細胞表面表現型ＣＤ９０＋ＣＤ３９－若しくはＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６＋を有する網状真皮線維芽細胞を含むか又はこれらからなる。
一実施形態では、新鮮単離細胞は、培養細胞と比較して次の遺伝子：ＡＤＡＭＴＳ９、ＴＣＦ４、ＣＤ３９、Ｃｏｌ１１Ａ１、ＬＥＦ１、Ｃｏｌ６Ａ５の１若しくは２以上の発現の上昇を示し、及び／又は新鮮単離細胞は、培養細胞と比較して次の遺伝子：ＣＤ９０、ＤＣＮ、Ｃｏｌ１ａ２、ＦＮ１、ＬＵＭ、ＰＤＧＦＲＡ、ＣＤ２６、ＡＤＡＭ１２、ＥＬＮ、ＷＮＴ５ａの１若しくは２以上の発現の低下を示す。
一実施形態では、皮膚試料１ｃｍ２あたり少なくとも１００，０００、２５０，０００又は５００，０００の初代真皮線維芽細胞が単離される。
一実施形態では、対象はヒトである。
さらなる態様では、対象における皮膚症状の自家予防又は自家治療における使用のための、対象から得られた初代真皮線維芽細胞を含む新鮮単離細胞調製物を本発明により提供する。
一実施形態では、調製物は、対象を、エクスビボでの増殖ステップなしに治療するために使用される。
一実施形態では、調製物は、対象からの細胞の単離から４８時間、２４時間又は１２時間以内に、対象の皮膚を治療するために使用される。
一実施形態では、調製物は、１，０００，０００、５００，０００、２５０，０００若しくは１５０，０００未満の細胞を含み、及び／又は、１，０００，０００、５００，０００、２５０，０００若しくは１５０，０００未満の細胞が対象に投与される。
一実施形態では、細胞調製物は、１若しくは２以上の真皮フィラーをさらに含み、好ましくは、１又は２以上の真皮フィラーは、コラーゲン、ヒアルロン酸、カルシウムハイドロキシアパタイト、合成ポリ乳酸ミクロスフェア、ポリ（メチル）メタクリル酸ミクロスフェア、ポリアルキルイミド及び／又はフィブリンを含む。一実施形態では、調製物は、ヒアルロン酸及び／又はコラーゲン及び／又はフィブリンをさらに含む。一実施形態では、１又は２以上の真皮フィラーは、ヒアルロン酸、フィブリン及び／又はコラーゲンからなるか又はこれらから本質的になる。
一実施形態では、調製物は、皮膚障害を治療するため又は創傷治癒を促進するために使用される。
一実施形態では、調製物は、対象の皮膚への注射による使用のためのものである。
さらなる態様では、（ａ）皮膚試料から表皮を取り出すステップと、（ｂ）皮膚試料中の真皮組織を１又は２以上の酵素により消化するステップと、（ｃ）消化した試料から細胞を濾過及び／又は遠心分離により分離するステップとを含む、対象から得られた皮膚試料から初代真皮線維芽細胞を含む細胞を単離するための方法であって、皮膚試料１ｃｍ２あたり少なくとも１００，０００、２５０，０００又は５００，０００の初代真皮線維芽細胞が単離される、方法を本発明により提供する。
一実施形態では、ステップ（ｂ）において、皮膚試料が、Ｉ型コラゲナーゼ、ＤＮＡｓｅＩ及び／又はヒアルロニダーゼとともにインキュベートされる。一実施形態では、ステップ（ｂ）において、皮膚試料が、２又は３以上の酵素、好ましくは、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、パパイン、トリプシン、サーモライシン、プロナーゼ、パンクレアチン、エラスターゼ、ＤＮＡｓｅ及び／又はヒアルロニダーゼから選択される２又は３以上の酵素とともにインキュベートされる。一実施形態では、２又は３以上の酵素のうちの少なくとも１つは、コラゲナーゼを含む。
一実施形態では、方法は、ＣＤ２６、ＣＤ３１、ＣＤ３９、ＣＤ３６、ＣＤ４５、ＣＤ９０及びＣＤ３２４から選択される１又は２以上の細胞表面マーカー、好ましくは、ＣＤ９０の発現（例えば、陽性又は陰性）に基づいて、単離細胞から真皮線維芽細胞又はこの亜集団を分離するステップをさらに含む。
さらなる態様では、上に定義の方法により得られたか又は得ることが可能な単離細胞調製物を本発明により提供する。
さらなる態様では、１又は２以上の賦形剤、緩衝液又は希釈剤を含む液体培地中に新鮮単離初代真皮線維芽細胞を含む、医薬単位投与剤形であって、１，０００，０００、５００，０００、２５０，０００又は１５０，０００未満の細胞を含む、医薬単位投与剤形を本発明により提供する。
一実施形態では、単位投与剤形は、皮内注射に適する滅菌溶液又は滅菌懸濁液を含む。
一態様では、本発明は、自家初代真皮線維芽細胞を使用する、対象における皮膚症状を予防又は治療する方法に関する。驚くべきことには、初代真皮線維芽細胞を皮膚試料から得、直接使用して（細胞培養ステップなしに）同対象における皮膚症状を治療することが可能であることが見出された。したがって、インビトロ又はエクスビボでの細胞培養増殖ステップは必要としない。これは、例えば、対象から採取した皮膚生検から得られたドナー細胞をほぼ直後に使用して、対象の身体の異なる部分上の皮膚の患部を治療することが可能であることを意味する。したがって、方法は迅速であり、従来の方法の培養においてドナー細胞集団の増殖に必要とされる長時間の遅延（数週又は数カ月）が回避される。
この方法の理論的根拠は、いくつかの驚くべき知見に基づく。第１に、十分な初代真皮線維芽細胞を小組織生検から直接単離して、同対象における皮膚のかなりの領域を治療することができる。実際、従来検討されたものよりもはるかに少数しか新鮮単離初代真皮線維芽細胞が損傷皮膚の再構成に必要とされないことが見出された。その上、無培養（即ち、新鮮に単離した）真皮線維芽細胞は、皮膚組織の再構成において、培養真皮線維芽細胞よりも有効であることが見出された。まとめると、このような結果により、無培養真皮線維芽細胞を、様々な皮膚症状のための有効な自家細胞療法薬として使用可能であることが初めて実証される。
対象からの皮膚試料の入手
第１のステップでは、皮膚試料は対象から得ることができる。対象は、好ましくは、ヒト対象であり、皮膚症状に罹患し得る。皮膚症状は、典型的には、限局性症状である。即ち、対象の皮膚は、この症状に罹患し得る（が、可視であり、及び／又は美容的に感受性であり得る）領域もあれば、この症状に罹患していない（が、美容的に感受性でない可能性を有する）領域もある。
第１のステップでは、皮膚試料は対象から得ることができる。対象は、好ましくは、ヒト対象であり、皮膚症状に罹患し得る。皮膚症状は、典型的には、限局性症状である。即ち、対象の皮膚は、この症状に罹患し得る（が、可視であり、及び／又は美容的に感受性であり得る）領域もあれば、この症状に罹患していない（が、美容的に感受性でない可能性を有する）領域もある。
典型的には、小皮膚生検は、好ましくは、美容的に感受性でない部位から採取する。皮膚試料部位は、好ましくは、最小限の皮膚付属器、例えば、毛髪及び汗腺を有する。例えば、一部の実施形態では、皮膚試料は、対象の耳介後部、上腕、大腿又は背部から採取する。下背部は、厚い真皮を有し（より多くの線維芽細胞を含む）日光にさらされず、典型的には、下着／水着に覆われていて美容的に感受性でないため、特に適する部位である。
皮膚試料は、標準技術を使用して切除し得る。典型的には、標的部位周囲の皮膚領域は、滅菌し、局所麻酔薬を注射し得る。滅菌したメスを使用し得るか、又は適するサイズのパンチ生検を採取する。
生検試料のサイズは、制限されず、治療する領域のサイズ及び性質、並びに生検試料において利用可能な線維芽細胞数に応じて選択され得る。例えば、毛髪移植手術では、最大１０×１ｃｍの皮膚条片を後部頭皮から回収することがあり、例えば、下背部から同等の量の皮膚を回収し易いことが認められる。しかし、殆どの適用では、わずかに少数の線維芽細胞しか必要とされず、皮膚試料のサイズは、例えば、直径約５～１０ｍｍ、例えば、直径３～８ｍｍ又は４～７ｍｍであり得る。直径およそ５～６ｍｍの皮膚試料は、約１ｃｍ２の皮膚領域に対応する。したがって、皮膚試料は、約０．０３～３ｃｍ２、好ましくは、約０．１～２ｃｍ２、より好ましくは、約０．５～１．５ｃｍ２の領域を含み得る。
また、より厚い真皮によってより高収量の線維芽細胞がもたらされるため、皮膚試料領域は、真皮の厚さに応じて変動し得る。例えば、皮膚試料を、例えば、比較的厚い真皮を有する下背部から採取する場合、試料を、例えば、より薄い真皮を有する顔から採取する場合よりも、狭い皮膚領域しか必要としない場合がある。当業者は、例えば、特定の皮膚領域の公知の真皮厚に基づいて（例えば、Rook's Textbook of Dermatology, Ninth Edition, Ed. C.E.M. Griffiths et al., John Wiley & Sons 2016を参照）、特定の部位から適する皮膚試料領域を容易に選択することができる。
皮膚からの初代真皮線維芽細胞の単離
方法の次のステップでは、細胞を、皮膚試料から単離する。これは、例えば、単離細胞調製物又は単離細胞懸濁液を得るために、例えば、皮膚組織を、この構成する細胞集団に解離させることを意味する。
方法の次のステップでは、細胞を、皮膚試料から単離する。これは、例えば、単離細胞調製物又は単離細胞懸濁液を得るために、例えば、皮膚組織を、この構成する細胞集団に解離させることを意味する。
第１に表皮は、好ましくは、皮膚試料から取り出す。これは、例えば、皮膚試料の１～２ｍｍの上面を、滅菌したメスにより切り取ることにより行い得る。或いは、ディスパーゼのような酵素を使用して表皮を消化し得る。一実施形態では、皮膚試料は、ディスパーゼとともに、例えば、３５～４０℃で３０～１２０分間、好ましくは、３７℃で約１時間インキュベートする。次いで、このインキュベーション後、表皮を真皮から剥離し得る。
解離した細胞は、真皮の酵素消化により皮膚試料から得ることができる。したがって真皮は、例えば、コラゲナーゼ、ＤＮＡｓｅ、トリプシン、パパイン、サーモライシン、プロナーゼ、パンクレアチン、ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）、エラスターゼ及び／又はヒアルロニダーゼから選択される１又は２以上の酵素、好ましくは、２又は３以上の酵素とともにインキュベートする。また真皮は、商標を有する組織解離混合物、例えば、Liberase（商標）ＴＬ、ＤＬ又はＴＭとともにインキュベートする。実施形態では、真皮は、少なくともコラゲナーゼ、好ましくは、コラゲナーゼと、ＤＮＡｓｅ、トリプシン、パパイン、ディスパーゼ、エラスターゼ及び／又はヒアルロニダーゼから選択される１又は２以上のさらなる酵素とともにインキュベートする。より好ましくは、真皮は、少なくともコラゲナーゼ及びパパイン、好ましくは、コラゲナーゼ、パパイン及びトリプシンとともにインキュベートする。好ましくは、真皮は、Ｉ型コラゲナーゼ、ＤＮＡｓｅＩ及び／又はヒアルロニダーゼを含む酵素混合物とともにインキュベートする。酵素の組合せは、真皮のドナー部位及び生検サイズに応じて変動し得る。一部の場合では、酵素混合物は、前調製してもよく、例えば、凍結乾燥酵素調製物から再構成し得る。皮膚試料は、酵素（複数可）とともに、適する期間、例えば、３５～４０℃で３０～２４０分、好ましくは、３７℃で約２時間インキュベートし得る。
次いで、酵素阻害物質（例えば、金属イオンキレート剤、例えば、ＥＤＴＡ）を消化した真皮細胞調製物に加え得る。次いで典型的には、調製物から解離した細胞を例えば、細胞濾過及び／又は遠心分離により分離する。例えば、細胞は、５０～１５０μｍ（例えば、約７０μｍ又は約１００μｍ）の細胞濾過器により濾過し、及び／又は例えば、２００～４００ｇで３～１０分間遠心分離し得る。細胞ペレットは、洗浄し、適する培地、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し得る。
一部の実施形態では、皮膚試料から単離細胞調製物を得るのに適する方法、例えば、Collins et al., Development 138, 5189-5199 (2011)又はWalmsley et al., Journal of Visualized Experiments, January 2016, 107:e53430に記載のものを使用し得る。代替的実施形態では、市販のキット又は試薬、例えば、CellnTec社（Bern、スイス国）又はMiltenyi Biotec社（Whole Skin Dissociation Kit；Bergisch Gladbach、独国）により提供されるものを使用し得る。
しかし、好ましい実施形態では、本明細書に記載の皮膚試料から細胞を単離するための方法を、例えば、実施例１に定義のように使用する。皮膚試料から多数の初代真皮線維芽細胞を単離可能であることは、本明細書に記載の方法の有利な特徴である。好ましくは、皮膚試料１ｃｍ２あたり少なくとも１００，０００、２５０，０００又は５００，０００の初代真皮線維芽細胞が単離される。
皮膚生検から得られた細胞の最大数は、生検回収の安全性、ドナー部位の治癒及び患者の忍容性により制限される。本明細書に記載の方法によれば、有利なアウトカムを達成するのに細胞は殆ど必要としない。これは、治療的に意味のある細胞数が、臨床方法による可能な生成の範囲内にあることを初めて意味する。本明細書に記載の方法では、細胞培養を必要とせずに、未分画の自家線維芽細胞及び線維芽細胞亜集団の両方の迅速な調製が可能となる。
臨床的に意味のある真皮移植のために十分な数の線維芽細胞を生成するのに、細胞培養を必要とするという暗黙の前提が従来存在した。従来の研究では、懸濁液中２０００万の線維芽細胞をヒト試験に使用した（Moon, AMA Facial Plast. Surg. 2019 Jul 1;21(4):312-318.）。本発明の方法を使用すると、細胞収率は典型的には、皮膚１ｃｍ２あたり、例えば、６３，５００～１２７，０００乳頭状線維芽細胞及び２５４，０００～５０８，０００網状線維芽細胞の濃縮画分となることが予想される。この解析は、比較的薄い真皮を有する胸部又は腹部皮膚から単離した線維芽細胞に基づく。線維芽細胞の収率は、より厚い真皮を有するドナー部位、例えば、背部を使用する場合、実質的により高くなることが予想される。したがって、好ましい実施形態では、皮膚試料は、比較的厚い真皮を有する皮膚領域、例えば、１ｃｍ２あたり少なくとも１００，０００、２００，０００又は５００，０００の線維芽細胞が得られる皮膚領域（例えば、背部）から採取する。
初代真皮線維芽細胞を含む細胞調製物
したがって、細胞療法適用のための初代真皮細胞の調製のための方法を本発明により提供する。これは、細胞培養を必要とせずに外来患者用施設において細胞を迅速に（数時間以内に）調製可能である点において、従来の方法とは実質的に異なる。細胞調製物の適用は、萎縮性瘢痕、例えば、にきび瘢痕、皺皮（しわ）、疾患過程及び老化の結果としての真皮の萎縮並びに非外科的美容手術、例えば、非外科的鼻形成術並びに頬骨及び顎の増強とを含むが、これらに制限されない。従来の方法と比較して、これは、細胞の培養を必要とせず、小規模な手術施設において患者が待つ間に実施することができる。
したがって、細胞療法適用のための初代真皮細胞の調製のための方法を本発明により提供する。これは、細胞培養を必要とせずに外来患者用施設において細胞を迅速に（数時間以内に）調製可能である点において、従来の方法とは実質的に異なる。細胞調製物の適用は、萎縮性瘢痕、例えば、にきび瘢痕、皺皮（しわ）、疾患過程及び老化の結果としての真皮の萎縮並びに非外科的美容手術、例えば、非外科的鼻形成術並びに頬骨及び顎の増強とを含むが、これらに制限されない。従来の方法と比較して、これは、細胞の培養を必要とせず、小規模な手術施設において患者が待つ間に実施することができる。
したがって、本発明の方法の実施形態では、初代真皮線維芽細胞を含む細胞（即ち、細胞集団又は調製物）は、皮膚試料から単離し得る。典型的には、細胞調製物は、ヒト皮膚試料に由来する。即ち、細胞調製物は、ヒト皮膚細胞を含む。好ましい実施形態では、細胞調製物は、解離した細胞、即ち、これらの源組織環境から分離し、液体培地中に分散させた細胞を含む。一実施形態では、細胞調製物は、細胞懸濁液、例えば、適する水性緩衝液（例えば、ＰＢＳ）中に分散させた細胞の懸濁液を含む。
典型的には、細胞調製物（例えば、細胞懸濁液）は、初代真皮線維芽細胞、並びに皮膚に由来する他の細胞型（即ち、非線維芽細胞）、例えば、内皮細胞及び／又は白血球（例えば、リンパ球、マクロファージ及び／又は樹状細胞）を含む。一部の実施形態では、真皮線維芽細胞（又はこの亜集団）は、他の皮膚細胞型、例えば、血管内皮細胞及び免疫細胞から分離し得る。或いは、細胞調製物は、さらなる分離ステップなしに対象の皮膚に投与し得る。即ち、投与する細胞調製物は、初代真皮線維芽細胞及び１又は２以上のさらなる皮膚細胞型（例えば、内皮細胞及び／又はリンパ球）を含み得る。
したがって、一実施形態では、細胞調製物は、液体培地（例えば、適する溶液又は緩衝液）中の（解離）初代真皮線維芽細胞を含むか、これから本質的になるか、又はこれからなる。別の実施形態では、細胞調製物は、液体培地（例えば、適する溶液又は緩衝液）中の本明細書に定義の（解離）初代真皮線維芽細胞又はこの亜集団を含むか、これから本質的になるか、又はこれからなる。
好ましい実施形態では、細胞調製物は、高い割合の初代真皮線維芽細胞を含む。別の細胞型（例えば、ケラチノサイト及び／又はメラノサイト）の存在を回避することにより、安全性プロファイルの向上、例えば、非線維芽細胞型の望ましくない作用のリスクの低下がもたらされ得る。したがって、実施形態では、細胞調製物における初代真皮線維芽細胞のパーセンテージは、全細胞数の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％超である。好ましい実施形態では、細胞調製物の細胞は、初代真皮線維芽細胞から本質的になる。即ち、細胞調製物における全細胞数の実質的１００％が、初代真皮線維芽細胞である。実施形態では、細胞調製物における非線維芽細胞型のパーセンテージは、全細胞数の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％未満である。細胞調製物におけるケラチノサイトの存在の割合が高すぎると、適用部位における嚢胞形成のリスクが上昇し得る（Watt (1984) J Cell Biol. 98(1): 16-21）。したがって、実施形態では、細胞調製物におけるケラチノサイトのパーセンテージは、全細胞数の５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％未満である。好ましい実施形態では、細胞調製物は、ケラチノサイトを含まない。細胞調製物におけるメラノサイトの存在により、適用部位における不均等な色素沈着のリスクが上昇し得る（Zokaei et al. 2019. Cultured epidermal melanocyte transplantation in vitiligo: a review article. Iran J Public Health, 48(3): 388-399）。実施形態では、細胞調製物におけるメラノサイトのパーセンテージは、全細胞数の２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％未満である。好ましい実施形態では、細胞調製物は、メラノサイトを含まない。
初代真皮線維芽細胞の分離
本発明の一部の実施形態では、細胞調製物は、初代真皮線維芽細胞又はこの亜集団が濃縮されていてもよく、例えば、解離した初代真皮細胞は、特異的細胞表面マーカーの発現に基づいて亜集団に分離し得る。例えば、真皮細胞は、国際公開第２０１９／１２２９３１号パンフレットに記載の方法を使用して分離し得る。このような方法では、初代真皮細胞は、特定の細胞表面表現型、例えば、特定のマーカーの発現及び／又は他のマーカーの発現の非存在を現す亜集団に選別又は分画する。例えば、ヒト真皮線維芽細胞亜集団は、ＣＤ９０、ＣＤ３９、ＣＤ３６若しくはＣＤ２６を個別に発現する細胞を選択すること、又はＣＤ９０、ＣＤ３９、ＣＤ３６若しくはＣＤ２６の発現を個別に欠くヒト真皮線維芽細胞を選択することにより分離し得る。一部の実施形態では、ヒト線維芽細胞亜集団は、上のマーカーの２又は３以上の発現及び発現の非存在の組合せに基づいて分離し得る。
本発明の一部の実施形態では、細胞調製物は、初代真皮線維芽細胞又はこの亜集団が濃縮されていてもよく、例えば、解離した初代真皮細胞は、特異的細胞表面マーカーの発現に基づいて亜集団に分離し得る。例えば、真皮細胞は、国際公開第２０１９／１２２９３１号パンフレットに記載の方法を使用して分離し得る。このような方法では、初代真皮細胞は、特定の細胞表面表現型、例えば、特定のマーカーの発現及び／又は他のマーカーの発現の非存在を現す亜集団に選別又は分画する。例えば、ヒト真皮線維芽細胞亜集団は、ＣＤ９０、ＣＤ３９、ＣＤ３６若しくはＣＤ２６を個別に発現する細胞を選択すること、又はＣＤ９０、ＣＤ３９、ＣＤ３６若しくはＣＤ２６の発現を個別に欠くヒト真皮線維芽細胞を選択することにより分離し得る。一部の実施形態では、ヒト線維芽細胞亜集団は、上のマーカーの２又は３以上の発現及び発現の非存在の組合せに基づいて分離し得る。
一実施形態では、真皮線維芽細胞は、フローサイトメトリーにより分離する。例えば、フローサイトメトリーを使用して、他の皮膚細胞から真皮線維芽細胞を分離し、及び／又はヒト真皮線維芽細胞を亜集団に分離し得る。蛍光サイトメトリー又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、表面マーカーによる細胞の同定及び単離に特に有用な、特殊化した種類のフローサイトメトリーであり、本発明の一実施形態に使用し得る。
代替的実施形態では、初代真皮線維芽細胞又はこの亜集団は、細胞表面マーカーの発現に基づく細胞分離に適する他の任意の方法により分離し得る。好ましい実施形態では、細胞は、固相、例えば、特異的リガンドに結合する固相を使用して分離する。固相に基づく分離を使用する方法は、「臨床的」手法により、例えば、最小限の専門設備を有する外来患者用診療所において、固相分離を容易かつ迅速に実施し得る点においてＦＡＣＳに好ましい場合がある。対照的に、ＦＡＣＳに基づく方法では、さらなる時間、専門化した設備及び専門知識を必要とする場合があり、したがって、標準的臨床環境における迅速な実施がさらに困難であり得る。
例えば、適する固相分離方法は、磁気ビーズ、カラム及び／又はマイクロ流体技術の使用を含み得る。このような方法では、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ９０又は線維芽細胞亜集団のマーカー）に特異的なリガンド（例えば、抗体）は、固相（例えば、磁気ビーズ）上に固定化してもよく、懸濁液中にヒト真皮線維芽細胞を含む細胞集団をこれに接触させる。次いで、目的のマーカーを発現するヒト真皮線維芽細胞を結合させ、固相上に保持する。マーカーを欠く他の細胞型又はヒト真皮線維芽細胞は、固相に結合せず、したがって、上清を洗い流すことによって所望の亜集団から分離し得る。次いで、所望のヒト線維芽細胞亜集団は、必要に応じて固相から溶出し得る。
一部の実施形態では、負の選択ステップを実施し得る。例えば、調製物中の望まない細胞（例えば、非線維芽細胞）上の細胞表面マーカーに特異的なリガンド（例えば、抗体）を使用し得る。望まない細胞は、例えば、内皮細胞、白血球、ケラチノサイト、メラノサイト又は他の非真皮線維芽細胞型であってもよく、したがって、細胞表面マーカーは、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ３１又はＣＤ３２４であり得る。或いは、望まない細胞は、真皮線維芽細胞の特異的亜集団であってもよく、したがって、細胞表面マーカーは、例えば、ＣＤ２６、ＣＤ３６又はＣＤ３９であり得る。
このような負の選択方法では、望まない細胞は、例えば、細胞表面マーカーに特異的なリガンド（例えば、抗体）を固相上に固定化し、細胞集団を固相と接触させることにより除去し得る。次いで、望まない細胞を固相上に保持し、上清から真皮線維芽細胞（又はこの亜集団）を得る。代替的実施形態では、リガンドに結合した場合、望まない細胞を溶解し得る。例えば、リガンドは、細胞の補体依存性溶解を開始することが可能な抗体であり得る。このような溶解に基づく方法では、例えば、遠心分離又は固相分離ステップを必要とせずに、溶液中の望まない細胞から所望の真皮線維芽細胞を分離する、さらなる利点がもたらされ得る。
したがって、本発明の好ましい実施形態では、初代真皮線維芽細胞を含む細胞集団は、１又は２以上の抗体（例えば、ＦＡＣＳにおける使用に適する蛍光標識抗体、又は固相に結合する抗体、又は望ましくない細胞型の液相溶解を媒介する抗体）と結合させ得る。抗体は、ヒト真皮線維芽細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ９０、ＣＤ３９、ＣＤ３６又はＣＤ２６）に直接結合し得るか、又は細胞表面マーカーに特異的な一次抗体に結合する二次抗体であり得る（例えば、マウスＩｇＧ抗ヒトＣＤ３９、ＣＤ３６又はＣＤ２６一次抗体は、ヒト真皮線維芽細胞に直接結合する場合があり、ラット抗マウスＩｇＧ二次蛍光抗体は、一次抗体に結合し得る）。したがってヒト真皮線維芽細胞は、制限されないが、ＣＤ９０、ＣＤ３９、ＣＤ３６及び／又はＣＤ２６から選択されるマーカーの組合せを含むマーカーの組合せを発現する亜集団に、例えば、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）又はより好ましくは、固相を使用して分離し得る。多色蛍光法（例えば、異なる波長の蛍光標識を有する種々の細胞表面タンパク質に対する抗体を使用する）を使用して、単一ＦＡＣＳステップにおいてマーカーの組合せの発現に基づきヒト真皮線維芽細胞を選択し得る。
真皮細胞集団のさらなる特異的マーカーは、例えば、Reynolds et al., Science 22 Jan 2021; Vol. 371, Issue 6527, eaba6500に記載されている。さらなる実施形態では、細胞調製物は、これに記載のさらなる細胞表面マーカーに基づいて分離し得る。加えて、これに記載の真皮細胞集団のさらなる（例えば、細胞内）マーカーを使用して、例えば、核酸に基づく検出方法（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）を使用する分離細胞集団の同一性及び／又は純度を確認する方法を検証し得る。
初代真皮線維芽細胞
初代真皮線維芽細胞は、特性的細胞表面マーカーの発現に基づいて他の真皮細胞型から識別し得る。例えば、一実施形態では、ＣＤ９０の発現をヒト真皮線維芽細胞のマーカーとして使用し得る。他の実施形態では、ヒト真皮線維芽細胞をｌｉｎ－ＣＤ９０＋細胞又はｌｉｎ－ＣＤ９０－細胞として同定し得る。ｌｉｎ－ＣＤ９０－細胞は、前脂肪細胞、線維芽細胞、周皮細胞及び単球／マクロファージの複合的特性を有する細胞集団として示す。ｌｉｎ細胞表面表現型は、ＣＤ４５、ＣＤ３１及びＣＤ３２４の発現を欠く細胞を指す。ＣＤ４５発現は、免疫細胞を意味することがあり、ＣＤ３１は、内皮細胞上で典型的に発現し、ＣＤ３２４は、ケラチノサイト上で発現し得る。したがって一実施形態では、ヒト真皮線維芽細胞は、例えば、ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＣＤ３２４－ＣＤ９０＋細胞として同定し得る。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）を代替的陰性マーカーとして使用してもよく、例えば、真皮線維芽細胞は、ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＥｐＣＡＭ－ＣＤ９０＋細胞として同定し得る。
初代真皮線維芽細胞は、特性的細胞表面マーカーの発現に基づいて他の真皮細胞型から識別し得る。例えば、一実施形態では、ＣＤ９０の発現をヒト真皮線維芽細胞のマーカーとして使用し得る。他の実施形態では、ヒト真皮線維芽細胞をｌｉｎ－ＣＤ９０＋細胞又はｌｉｎ－ＣＤ９０－細胞として同定し得る。ｌｉｎ－ＣＤ９０－細胞は、前脂肪細胞、線維芽細胞、周皮細胞及び単球／マクロファージの複合的特性を有する細胞集団として示す。ｌｉｎ細胞表面表現型は、ＣＤ４５、ＣＤ３１及びＣＤ３２４の発現を欠く細胞を指す。ＣＤ４５発現は、免疫細胞を意味することがあり、ＣＤ３１は、内皮細胞上で典型的に発現し、ＣＤ３２４は、ケラチノサイト上で発現し得る。したがって一実施形態では、ヒト真皮線維芽細胞は、例えば、ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＣＤ３２４－ＣＤ９０＋細胞として同定し得る。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）を代替的陰性マーカーとして使用してもよく、例えば、真皮線維芽細胞は、ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＥｐＣＡＭ－ＣＤ９０＋細胞として同定し得る。
したがって、本発明の一実施形態では、ヒト真皮線維芽細胞は、第１に、ＣＤ９０＋（例えば、ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＣＤ３２４－ＣＤ９０＋）細胞を選択することにより他のヒト皮膚細胞型から分離し得る。次いで、全ヒト真皮線維芽細胞集団を、国際公開第２０１９／１２２９３１号パンフレットに記載のように、例えば、ＣＤ３９、ＣＤ３６及び／又はＣＤ２６発現に基づいて亜集団に分離し得る。或いは、ヒト真皮線維芽細胞亜集団を、単一ステップにより、例えば、ＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６－（ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＣＤ３２４－ＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６－）細胞、ＣＤ９０＋ＣＤ３９－（ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＣＤ３２４－ＣＤ９０＋ＣＤ３９－）細胞、ＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６－（ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＣＤ３２４－ＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６＋）細胞、ＣＤ９０＋ＣＤ３６＋（ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＣＤ３２４－ＣＤ９０＋ＣＤ３６＋）細胞等を選択することによって他のヒト皮膚細胞型から分離し得る。これらの選択は、例えば、１又は２以上の選択ステップにより、例えば、抗体の特定の組合せを使用して実施し得る。
マーカー
本発明の実施形態では、１又は２以上の細胞表面マーカーの発現を決定し得る。一般に、細胞は、各細胞表面マーカーの発現に対して陽性（＋）又は陰性（－）のいずれかであるものとして決定する。陽性（＋）により、細胞が、少なくとも最低（例えば、検出可能）レベルの細胞表面マーカーを発現することを典型的に意味する。例えば、細胞表面マーカーに特異的な抗体が細胞に、例えば、細胞表面マーカーに特異的な抗体が細胞に、例えば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により検出できる、又は細胞が、細胞表面マーカーに対するリガンド（例えば、抗体）を固定化した固相に結合するような十分な量で結合する場合、細胞は、細胞表面マーカーに対して陽性（＋）であると考えられ得る。同様に、最低（例えば、検出可能）レベル未満のマーカーを発現する場合、細胞は、細胞表面マーカーに対して陰性（－）であると考えられ得る。したがって、細胞集団の細胞表面表現型は、特定のマーカー、例えば、ＣＤ４５－ＣＤ９０＋ＣＤ３９－の発現及び／又は発現の非存在に基づいて指定し得る。
本発明の実施形態では、１又は２以上の細胞表面マーカーの発現を決定し得る。一般に、細胞は、各細胞表面マーカーの発現に対して陽性（＋）又は陰性（－）のいずれかであるものとして決定する。陽性（＋）により、細胞が、少なくとも最低（例えば、検出可能）レベルの細胞表面マーカーを発現することを典型的に意味する。例えば、細胞表面マーカーに特異的な抗体が細胞に、例えば、細胞表面マーカーに特異的な抗体が細胞に、例えば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により検出できる、又は細胞が、細胞表面マーカーに対するリガンド（例えば、抗体）を固定化した固相に結合するような十分な量で結合する場合、細胞は、細胞表面マーカーに対して陽性（＋）であると考えられ得る。同様に、最低（例えば、検出可能）レベル未満のマーカーを発現する場合、細胞は、細胞表面マーカーに対して陰性（－）であると考えられ得る。したがって、細胞集団の細胞表面表現型は、特定のマーカー、例えば、ＣＤ４５－ＣＤ９０＋ＣＤ３９－の発現及び／又は発現の非存在に基づいて指定し得る。
ＣＤ２６
ＣＤ２６は、細胞膜糖タンパク質であり、種々の細胞型の表面上に発現するセリンエキソペプチダーゼである。ＣＤ２６は、ジペプチジルペプチダーゼ４及びアデノシンデアミナーゼ複合タンパク質２としても公知である。ヒトＣＤ２６のアミノ酸配列は、例えば、データベースアクセッション番号Ｐ２７４８７（ＵｎｉＰｒｏｔ）及びＮＰ＿００１９２６（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に開示されている。ＣＤ２６は、フローサイトメトリーにより検出し、ＣＤ２６＋及びＣＤ２６－細胞は、例えば、Kelemen et al., Am J Clin Pathol. 2008 Jan;129(1):146-56に開示のように選別し得る。
ＣＤ２６は、細胞膜糖タンパク質であり、種々の細胞型の表面上に発現するセリンエキソペプチダーゼである。ＣＤ２６は、ジペプチジルペプチダーゼ４及びアデノシンデアミナーゼ複合タンパク質２としても公知である。ヒトＣＤ２６のアミノ酸配列は、例えば、データベースアクセッション番号Ｐ２７４８７（ＵｎｉＰｒｏｔ）及びＮＰ＿００１９２６（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に開示されている。ＣＤ２６は、フローサイトメトリーにより検出し、ＣＤ２６＋及びＣＤ２６－細胞は、例えば、Kelemen et al., Am J Clin Pathol. 2008 Jan;129(1):146-56に開示のように選別し得る。
ＣＤ３６
ＣＤ３６は、クラスＢスカベンジャー受容体ファミリーのメンバーである膜タンパク質である。ＣＤ３６は、血小板糖タンパク質４、脂肪酸トランスロカーゼ、スカベンジャー受容体クラスＢメンバー３（ＳＣＡＲＢ３）、糖タンパク質８８（ＧＰ８８）、糖タンパク質IIIｂ（ＧＰIIIＢ）又は糖タンパク質IV（ＧＰIV）としても公知である。ヒトＣＤ３６のアミノ酸配列は、例えば、データベースアクセッション番号Ｐ１６６７１（ＵｎｉＰｒｏｔ）並びにＮＰ＿００００６３、ＮＰ＿００１００１５４７、ＮＰ＿００１００１５４８、ＮＰ＿００１１２０９１５及びＮＰ＿００１１２０９１６（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に開示されている。ＣＤ３６は、フローサイトメトリーにより検出し、ＣＤ３６＋及びＣＤ３６－細胞は、例えば、Cserti-Gazdewich et al., Cytometry B Clin Cytom. 2009 Mar;76(2):127-34に開示のように選別し得る。
ＣＤ３６は、クラスＢスカベンジャー受容体ファミリーのメンバーである膜タンパク質である。ＣＤ３６は、血小板糖タンパク質４、脂肪酸トランスロカーゼ、スカベンジャー受容体クラスＢメンバー３（ＳＣＡＲＢ３）、糖タンパク質８８（ＧＰ８８）、糖タンパク質IIIｂ（ＧＰIIIＢ）又は糖タンパク質IV（ＧＰIV）としても公知である。ヒトＣＤ３６のアミノ酸配列は、例えば、データベースアクセッション番号Ｐ１６６７１（ＵｎｉＰｒｏｔ）並びにＮＰ＿００００６３、ＮＰ＿００１００１５４７、ＮＰ＿００１００１５４８、ＮＰ＿００１１２０９１５及びＮＰ＿００１１２０９１６（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に開示されている。ＣＤ３６は、フローサイトメトリーにより検出し、ＣＤ３６＋及びＣＤ３６－細胞は、例えば、Cserti-Gazdewich et al., Cytometry B Clin Cytom. 2009 Mar;76(2):127-34に開示のように選別し得る。
ＣＤ３９
ＣＤ３９は、細胞表面に位置するエクトヌクレオチダーゼであり、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１（ＥＮＴＰＤ１）としても公知である。ヒトＣＤ３９のアミノ酸配列は、例えば、データベースアクセッション番号Ｐ４９９６１（ＵｎｉＰｒｏｔ）並びにＮＰ＿００１０９１６４５、ＮＰ＿００１１５７６５０、ＮＰ＿００１１５７６５１、ＮＰ＿００１１５７６５３及びＮＰ＿００１１５７６５４（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に開示されている。ＣＤ３９は、フローサイトメトリーにより検出し、ＣＤ３９＋及びＣＤ３９－細胞は、例えば、Mandapathil et al., Journal of Immunological Methods, Volume 346, Issues 1-2, 31 July 2009, Pages 55-63に開示のように選別し得る。
ＣＤ３９は、細胞表面に位置するエクトヌクレオチダーゼであり、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１（ＥＮＴＰＤ１）としても公知である。ヒトＣＤ３９のアミノ酸配列は、例えば、データベースアクセッション番号Ｐ４９９６１（ＵｎｉＰｒｏｔ）並びにＮＰ＿００１０９１６４５、ＮＰ＿００１１５７６５０、ＮＰ＿００１１５７６５１、ＮＰ＿００１１５７６５３及びＮＰ＿００１１５７６５４（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に開示されている。ＣＤ３９は、フローサイトメトリーにより検出し、ＣＤ３９＋及びＣＤ３９－細胞は、例えば、Mandapathil et al., Journal of Immunological Methods, Volume 346, Issues 1-2, 31 July 2009, Pages 55-63に開示のように選別し得る。
ＣＤ９０
ＣＤ９０は、Ｎ－グリコシル化グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー化保存細胞表面タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるＴｈｙ－１としても公知である。ヒトＣＤ９０のアミノ酸配列は、例えば、データベースアクセッション番号Ｐ０４２１６（ＵｎｉＰｒｏｔ）並びにＮＰ＿００１２９８０８９、ＮＰ＿００１２９８０９１及びＮＰ＿００６２７９（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に開示されている。ＣＤ９０は、フローサイトメトリーにより検出し、ＣＤ９０＋及びＣＤ９０－細胞は、例えば、Nakamura et al., British Journal of Dermatology 154(6):1062-1070 (2006)に開示のように選別し得る。
ＣＤ９０は、Ｎ－グリコシル化グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー化保存細胞表面タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるＴｈｙ－１としても公知である。ヒトＣＤ９０のアミノ酸配列は、例えば、データベースアクセッション番号Ｐ０４２１６（ＵｎｉＰｒｏｔ）並びにＮＰ＿００１２９８０８９、ＮＰ＿００１２９８０９１及びＮＰ＿００６２７９（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に開示されている。ＣＤ９０は、フローサイトメトリーにより検出し、ＣＤ９０＋及びＣＤ９０－細胞は、例えば、Nakamura et al., British Journal of Dermatology 154(6):1062-1070 (2006)に開示のように選別し得る。
ＣＤ４５
ＣＤ４５は、白血球共通抗原（ＬＣＡ）及びタンパク質チロシンホスファターゼＣ型受容体（ＰＴＰＲＣ）としても公知である。ＣＤ４５は、成熟赤血球を除く殆ど全ての造血細胞上に発現する膜糖タンパク質である。ヒトＣＤ４５のアミノ酸配列は、例えば、データベースアクセッション番号Ｐ０８５７５（ＵｎｉＰｒｏｔ）並びにＮＰ＿００１２５４７２７、ＮＰ＿００２８２９及びＮＰ＿００５６３５７８（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に開示されている。ＣＤ４５は、フローサイトメトリーにより検出し、ＣＤ４５＋及びＣＤ４５－細胞は、例えば、Janossy et al., Clinical and Vaccine Immunology 9(5):1085-1094 (2002)に開示のように選別し得る。
ＣＤ４５は、白血球共通抗原（ＬＣＡ）及びタンパク質チロシンホスファターゼＣ型受容体（ＰＴＰＲＣ）としても公知である。ＣＤ４５は、成熟赤血球を除く殆ど全ての造血細胞上に発現する膜糖タンパク質である。ヒトＣＤ４５のアミノ酸配列は、例えば、データベースアクセッション番号Ｐ０８５７５（ＵｎｉＰｒｏｔ）並びにＮＰ＿００１２５４７２７、ＮＰ＿００２８２９及びＮＰ＿００５６３５７８（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に開示されている。ＣＤ４５は、フローサイトメトリーにより検出し、ＣＤ４５＋及びＣＤ４５－細胞は、例えば、Janossy et al., Clinical and Vaccine Immunology 9(5):1085-1094 (2002)に開示のように選別し得る。
ＣＤ３１
ＣＤ３１は、血小板内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ－１）としても公知である細胞表面タンパク質である。ヒトＣＤ３１のアミノ酸配列は、例えば、データベースアクセッション番号Ｐ１６２８４（ＵｎｉＰｒｏｔ）及びＮＰ＿０００４３３（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に開示されている。ＣＤ３１は、フローサイトメトリーにより検出し、ＣＤ３１＋及びＣＤ３１－細胞は、例えば、Khan et al., Cytometry 64B(1):1-8 (2005)及びMock et al., Mucosal Immunology (2014) 7, 1440-1451に開示のように選別し得る。
ＣＤ３１は、血小板内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ－１）としても公知である細胞表面タンパク質である。ヒトＣＤ３１のアミノ酸配列は、例えば、データベースアクセッション番号Ｐ１６２８４（ＵｎｉＰｒｏｔ）及びＮＰ＿０００４３３（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に開示されている。ＣＤ３１は、フローサイトメトリーにより検出し、ＣＤ３１＋及びＣＤ３１－細胞は、例えば、Khan et al., Cytometry 64B(1):1-8 (2005)及びMock et al., Mucosal Immunology (2014) 7, 1440-1451に開示のように選別し得る。
ＣＤ３２４
ＣＤ３２４は、カドヘリン１、Ｅカドヘリン、ＣＤＨ１又はウボモルリンとしても公知である細胞間接着糖タンパク質である。ヒトＣＤ３２４のアミノ酸配列は、例えば、データベースアクセッション番号Ｐ１１２８３０（ＵｎｉＰｒｏｔ）並びにＮＰ＿００１３０４１１３、ＮＰ＿００１３０４１１４及びＮＰ＿００１３０４１１５（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に開示されている。ＣＤ３２４は、フローサイトメトリーにより検出し、ＣＤ３２４＋及びＣＤ３２４－細胞は、例えば、米国特許第９５３４０５８号明細書に開示のように選別し得る。
ＣＤ３２４は、カドヘリン１、Ｅカドヘリン、ＣＤＨ１又はウボモルリンとしても公知である細胞間接着糖タンパク質である。ヒトＣＤ３２４のアミノ酸配列は、例えば、データベースアクセッション番号Ｐ１１２８３０（ＵｎｉＰｒｏｔ）並びにＮＰ＿００１３０４１１３、ＮＰ＿００１３０４１１４及びＮＰ＿００１３０４１１５（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に開示されている。ＣＤ３２４は、フローサイトメトリーにより検出し、ＣＤ３２４＋及びＣＤ３２４－細胞は、例えば、米国特許第９５３４０５８号明細書に開示のように選別し得る。
ＥｐＣＡＭ
上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）は、Ｃａ２＋非依存性同型細胞間接着を媒介する膜貫通糖タンパク質である。ＥｐＣＡＭは、上皮において独占的に発現する。ヒトＥｐＣＡＭのアミノ酸配列は、例えば、データベースアクセッション番号Ｐ１６４２２（ＵｎｉＰｒｏｔ）及びＮＰ＿００２３４５（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に開示されている。
上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）は、Ｃａ２＋非依存性同型細胞間接着を媒介する膜貫通糖タンパク質である。ＥｐＣＡＭは、上皮において独占的に発現する。ヒトＥｐＣＡＭのアミノ酸配列は、例えば、データベースアクセッション番号Ｐ１６４２２（ＵｎｉＰｒｏｔ）及びＮＰ＿００２３４５（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に開示されている。
本明細書において考察するマーカーに対する抗体は公知であり、典型的には、商業的供給源から入手可能であるか、又は公知の技術、例えば、適する抗原による実験動物の免疫化により生成し得る。このようなマーカーへの結合に適する抗体としては、例えば、抗マウスＣＤ２６ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（eBioscience社４５－０２６１－８０）、抗ヒトＣＤ２６ＰＥ－Ｃｙ５（Biolegend社３０２７０８）、抗ヒトＣＤ３１ＰＥ（eBioscience社１２－０３１９－４１）、抗ヒトＣＤ３１ＡＰＣ－Ｃｙ７（Biolegend社３０３１１９）、抗ヒトＣＤ３６ＦＩＴＣ（eBioscience社１１－０３６９－４１）、抗ヒトＣＤ３６ＰＥ（Biolegend社３３６２０６）、抗ヒトＣＤ３９（eBioscience社１４－０３９９－８２）、抗ヒトＣＤ３９ＰＥ（eBioscience社１１１２－０３９９－４１）、抗ヒトＣＤ３９ＡＰＣ（Biolegend社３２８２１０）、抗ヒトＣＤ４５ＡＦ７００（eBioscience社１１１２５６－９４５９－４１）、抗ヒトＣＤ４５ＡＰＣ－Ｃｙ７（Biolegend社３６８５１６）、抗ヒトＣＤ９０ＰＥ（eBioscience社１２－０９０９－４１）、抗ヒトＣＤ９０ＡＰＣ（Biolegend社３２８１１４）及び抗ヒトＣＤ３２４ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Biolegend社３２４１１３が挙げられる。
ヒト真皮線維芽細胞亜集団
本明細書に記載の方法では、ヒト真皮線維芽細胞は、上述のさらなるマーカーのいずれかを含む、本明細書に記載のマーカーの任意の組合せの発現に基づいて亜集団に選別し得る。ヒト真皮線維芽細胞の単離した亜集団は、特定の細胞表面表現型、例えば、ＣＤ４５－ＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６－の発現により特徴づけられ得る。「単離」により、その天然環境から細胞集団を分離すること、例えば、源試料（例えば、ヒト皮膚試料）中のヒト真皮線維芽細胞及び／又は他の真皮細胞の全集団からヒト真皮線維芽細胞の亜集団を分離することを典型的に意味する。
本明細書に記載の方法では、ヒト真皮線維芽細胞は、上述のさらなるマーカーのいずれかを含む、本明細書に記載のマーカーの任意の組合せの発現に基づいて亜集団に選別し得る。ヒト真皮線維芽細胞の単離した亜集団は、特定の細胞表面表現型、例えば、ＣＤ４５－ＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６－の発現により特徴づけられ得る。「単離」により、その天然環境から細胞集団を分離すること、例えば、源試料（例えば、ヒト皮膚試料）中のヒト真皮線維芽細胞及び／又は他の真皮細胞の全集団からヒト真皮線維芽細胞の亜集団を分離することを典型的に意味する。
一実施形態では、単離細胞集団は、細胞表面表現型ＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６－、好ましくは、ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＣＤ３２４－ＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６－の発現により特徴づけられる。一実施形態では、単離細胞集団は、ヒト乳頭状線維芽細胞を含む。
別の実施形態では、単離細胞集団は、細胞表面表現型ＣＤ９０＋ＣＤ３９－、好ましくは、ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＣＤ３２４－ＣＤ９０＋ＣＤ３９－の発現により特徴づけられる。一実施形態では、単離細胞集団は、ヒト真皮網状線維芽細胞を含む。
別の実施形態では、単離細胞集団は、細胞表面表現型ＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６＋、好ましくは、ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＣＤ３２４－ＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６＋の発現により特徴づけられる。一実施形態では、単離細胞集団は、ヒト真皮網状線維芽細胞を含む。
別の実施形態では、単離細胞集団は、細胞表面表現型ＣＤ９０＋ＣＤ３６＋、好ましくは、ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＣＤ３２４－ＣＤ９０＋ＣＤ３６＋の発現により特徴づけられる。一実施形態では、単離細胞集団は、ヒト真皮前脂肪線維芽細胞を含む。
別の実施形態では、単離細胞集団は、ビメンチン＋及びｌｉｎ－ＣＤ９０－であるが、ＣＤ７４（マクロファージ阻害因子受容体）、ＨＬＡ－ＤＲ及び／又はＣＬＤＮ５及びＴＥＫ（ＴＩＥ２）を発現することにより特徴づけられる。典型的には、この亜集団は、前脂肪線維芽細胞及び周皮細胞に寄与する能力を有する細胞を含む。
真皮線維芽細胞を含む新鮮単離細胞調製物
本発明の実施形態では、単離細胞調製物（即ち、初代真皮線維芽細胞又はこの亜集団を含む）を使用して対象を直接治療し、例えば、新鮮単離細胞を使用する。これにより、細胞培養増殖ステップが存在しないこと、即ち、初代真皮線維芽細胞をエクスビボ又はインビトロで増殖させないことを意味する。好ましくは、単離細胞調製物は、単離後に新たに使用し、及び／又は使用前の長期間、エクスビボ若しくはインビトロで維持しない。したがって、対象に投与される細胞は、無培養細胞である。
本発明の実施形態では、単離細胞調製物（即ち、初代真皮線維芽細胞又はこの亜集団を含む）を使用して対象を直接治療し、例えば、新鮮単離細胞を使用する。これにより、細胞培養増殖ステップが存在しないこと、即ち、初代真皮線維芽細胞をエクスビボ又はインビトロで増殖させないことを意味する。好ましくは、単離細胞調製物は、単離後に新たに使用し、及び／又は使用前の長期間、エクスビボ若しくはインビトロで維持しない。したがって、対象に投与される細胞は、無培養細胞である。
一部の実施形態では、皮膚試料を得るステップ及び皮膚試料から細胞を単離するステップは、迅速に、例えば、２４時間未満、１２時間未満、６時間未満、又は４時間未満で実施し得る。したがって、新鮮単離細胞（即ち、初代真皮線維芽細胞を含む）を使用して、皮膚試料からのこの単離から、例えば、単離ステップの初め又は終わりから、例えば、２４時間、１２時間、６時間、４時間又は１時間以内に対象を治療し得る。好ましくは、新鮮単離細胞（即ち、初代真皮線維芽細胞を含む）を使用して、対象からの皮膚試料の入手から４８時間、２４時間、１２時間、６時間又は４時間以内に対象を治療する。
一実施形態では、新鮮単離真皮細胞は、線維芽細胞亜集団に分離せずに使用する。例えば、新鮮単離細胞（例えば、総真皮細胞又は真皮線維芽細胞）は、上記のように、しかし国際公開第２０１９／１２２９３１号パンフレットに記載の線維芽細胞亜集団への分離ステップなしで調製し得る。したがって、投与する細胞は、例えば、エクスビボでの増殖ステップなしで、総（即ち、未分画）真皮細胞又は総（即ち、未分画）真皮線維芽細胞を含むか、これから本質的になるか、又はこれからなり得る。このような方法の利点は、線維芽細胞亜集団へのさらなる分離ステップを回避することが可能であり、したがって方法が、さらに迅速及び／又はより単純となり得ることであり得る。
代替的実施形態では、新鮮単離細胞は、例えば、上記の１又は２以上の正又は負の選択ステップを使用して線維芽細胞亜集団に分離し得る。誤解を避けるために、選択ステップが比較的迅速に（例えば、皮膚試料の入手から４８時間以内に単離細胞が投与されるように）実施可能であるため、単離線維芽細胞亜集団は、新鮮に単離されると、なお考えられる。
新鮮単離真皮細胞のさらなるマーカー
新鮮単離真皮細胞が、培養細胞と比較して皮膚再構成の向上を示すことが加えて同定された。新鮮単離（無培養）真皮線維芽細胞は、培養線維芽細胞と比較して差次的遺伝子発現を示す。したがって、新鮮単離真皮細胞における特異的遺伝子の発現の上方制御及び／又は下方制御は、培養細胞と比較したこれらの特質の向上の根底にあり得る。
新鮮単離真皮細胞が、培養細胞と比較して皮膚再構成の向上を示すことが加えて同定された。新鮮単離（無培養）真皮線維芽細胞は、培養線維芽細胞と比較して差次的遺伝子発現を示す。したがって、新鮮単離真皮細胞における特異的遺伝子の発現の上方制御及び／又は下方制御は、培養細胞と比較したこれらの特質の向上の根底にあり得る。
一部の実施形態では、新鮮単離細胞は、培養細胞と比較して次の遺伝子：ＡＤＡＭＴＳ９、ＴＣＦ４、ＣＤ３９、Ｃｏｌ１１Ａ１、ＬＥＦ１及びＣｏｌ６Ａ５の１又は２以上の発現の上昇を示す。他の実施形態では、新鮮単離細胞は、培養細胞と比較して次の遺伝子：ＣＤ９０、ＤＣＮ、Ｃｏｌ１ａ２、ＦＮ１、ＬＵＭ、ＰＤＧＦＲＡ、ＣＤ２６、ＡＤＡＭ１２、ＥＬＮ及びＷＮＴ５ａの１又は２以上の発現の低下を示す。
ＤＣＮ、ＬＵＭ、ＣＤ９０及びＰＤＧＦＲＡは、汎線維芽細胞マーカーである。ＣＯＬ６Ａ５は、VI型コラーゲンのα５鎖であり、特には、乳頭状真皮線維芽細胞の安定なマーカーを代表する。ＣＤ３９、ＴＣＦ４及びＬＥＦ１は、細胞をインビトロで培養した場合に失われる、乳頭状線維芽細胞のマーカーであり得る。Ｃｏｌ１１Ａ１、Ｅｌｎ、ＦＮ１及びＣｏｌ１ａ２は、網状真皮線維芽細胞において高度に発現する細胞外マトリックスタンパク質（ＥＣＭ）である。ＡＤＡＭＴＳ９及びＡＤＡＭ１２は、ＥＣＭ、例えば、フィブロネクチン原線維形成及びターンオーバーを制御するメタロエンドペプチダーゼタンパク質ファミリーのメンバーである。ＷＮＴ５Ａは、培養中に上方制御される線維芽細胞増殖の制御因子である。ＣＤ２６は、上に考察する線維芽細胞亜集団のマーカーである。
また、Reynolds et al., Science 22 Jan 2021; Vol. 371, Issue 6527, eaba6500に定義される真皮細胞集団のさらなるマーカーを使用し得る。これらのさらなるマーカーは、細胞内だけでなく細胞表面マーカーをも含む場合があり、細胞集団をさらに特性決定するのに使用し得る。例えば、一部の実施形態では、例えば、対象の治療において使用する細胞調製物の適合性を確認する検証ステップとして、得られた細胞調製物を、さらなるマーカーの１又は２以上の発現について解析し得る。一部の実施形態では、細胞調製物におけるさらなるマーカーの発現は、培養細胞調製物における発現と、即ち、エクスビボ又はインビトロでの増殖ステップ後に比較し得る。
さらなるマーカーの解析は、細胞亜集団におけるＲＮＡ及び／又は対応するポリペプチド配列の検出のための適する任意の方法、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、遺伝子発現アレイ、ノーザン／ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ及び免疫細胞化学により実施し得る。さらなるマーカーの一部のＲＴ－ＰＣＲ検出に適するプライマー対の例は、以下の表１に示し、配列番号は括弧内に示す。
当業者は、所望のマーカーの特異的増幅に適する代替的プライマー配列を、公知の方法を使用して容易に同定することができる。その種々の多型バリアントを含む、本明細書に記載のマーカーのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えば、以下の表２に示すように、公的にアクセス可能な配列データベースから入手可能である。
無培養（新鮮に単離した）細胞における上のマーカーの発現は、特定の期間の培養後、例えば、１週間、２週間、１カ月又は３カ月の培養後の類似の細胞（即ち、類似の方法により得られた細胞）における発現レベルと比較し得る。或いは、無培養細胞におけるマーカー発現は、特定数の継代後、例えば、１、２、３、４、５又は６継代後の培養細胞における発現レベルと比較し得る。
医薬調製物及び単位投与剤形
新鮮単離細胞調製物（即ち、初代真皮線維芽細胞を含む）は、対象への投与に適する任意の薬理学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わされ得る。典型的には、細胞集団は、液体培地、例えば、適する滅菌緩衝溶液、例えば、緩衝ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又は滅菌ＰＢＳにより製剤化する。単離ヒト真皮線維芽細胞亜集団を含む医薬製剤は、適する任意の経路、好ましくは、注射、例えば、対象の皮膚への皮内注射による投与のために製剤化し得る。
新鮮単離細胞調製物（即ち、初代真皮線維芽細胞を含む）は、対象への投与に適する任意の薬理学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わされ得る。典型的には、細胞集団は、液体培地、例えば、適する滅菌緩衝溶液、例えば、緩衝ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又は滅菌ＰＢＳにより製剤化する。単離ヒト真皮線維芽細胞亜集団を含む医薬製剤は、適する任意の経路、好ましくは、注射、例えば、対象の皮膚への皮内注射による投与のために製剤化し得る。
当業者は、治療する症状の性質、対象等に応じて細胞集団の適する単位投与量を決定し得る。１００，０００細胞まで低い単位投与量が皮膚の再構成に特に適し得ることが、驚くべきことに本発明により見出された。したがって、細胞調製物の単位投与剤形は、好ましくは、１００万未満、５００，０００未満、２５０，０００未満又は１５０，０００未満の細胞を含む。一部の実施形態では、単回用量は、１０，０００～１００万細胞、好ましくは、２０，０００～５００，０００細胞、より好ましくは、約５０，０００～２００，０００細胞を含み得る。典型的には、このような用量は、溶液０．１～１０ｍｌ、好ましくは、０．１～１ｍｌ、例えば、適する滅菌緩衝溶液約１００μｌにより投与する（例えば、注射により）。
一部の実施形態では、細胞調製物は、１又は２以上の真皮フィラー、例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、カルシウムハイドロキシアパタイト、合成ポリ乳酸ミクロスフェア、ポリ（メチル）メタクリル酸ミクロスフェア、ポリアルキルイミド及び／又はフィブリンをさらに含み得る。好ましくは、真皮フィラーは、ヒアルロン酸、コラーゲン及び／又はフィブリンを含むか又はこれらからなる。より好ましくは、真皮フィラーは、フィブリンからなる。充填剤は、ヒト、動物に由来するか又は合成的に生成し得る。ヒアルロン酸は、真皮フィラーとして普及しており、患者への培養線維芽細胞の送達に安全であると証明されている。コラーゲンは、例えば、ヒト又はウシコラーゲンであり得る。コラーゲンは、例えば、自家（即ち、患者自身の皮膚から抽出したコラーゲン）又はドナーから得られたコラーゲン（例えば、Dermalogen）であり得る。さらなる実施形態では、細胞は、生物学的（例えば、脱細胞化ヒト真皮）又は不活性（例えば、フィブリンゲル、コラーゲンゲル又はヒドロゲル）にかかわらず、無細胞足場と組み合わされ得る。さらなる実施形態では、細胞は、これらを解離させた培地により注射し得る。
対象への投与
本明細書に記載の単離細胞調製物は、種々の美容的及び治療的方法において使用し得る。好ましい実施形態では、新鮮単離細胞は、対象に直接、即ち、エクスビボでの増殖なしで投与される。単離細胞調製物は、皮膚試料を得た対象に、即ち、自家細胞療法において投与する。典型的には、単離細胞調製物は、例えば、皮膚症状に罹患している対象の皮膚領域（即ち、「適用部位」）への皮内注射又はカニューレの使用により投与する。
本明細書に記載の単離細胞調製物は、種々の美容的及び治療的方法において使用し得る。好ましい実施形態では、新鮮単離細胞は、対象に直接、即ち、エクスビボでの増殖なしで投与される。単離細胞調製物は、皮膚試料を得た対象に、即ち、自家細胞療法において投与する。典型的には、単離細胞調製物は、例えば、皮膚症状に罹患している対象の皮膚領域（即ち、「適用部位」）への皮内注射又はカニューレの使用により投与する。
比較的少数の単離細胞が使用されて対象を治療し、皮膚試料からの単離細胞の単離直後に単離細胞が対象に投与されることは、本発明の特性である。したがって、一部の実施形態では、治療する対象の皮膚１ｃｍ２あたり１，０００，０００、５００，０００、２５０，０００又は１５０，０００未満の細胞が投与される。好ましくは、約１０，０００～１，０００，０００細胞／ｃｍ２、より好ましくは、約２０，０００～５００，０００細胞／ｃｍ２、より好ましくは、約５０，０００～１５０，０００細胞／ｃｍ２及び最も好ましくは、約１００，０００細胞／ｃｍ２が対象に投与される。このような実施形態では、皮膚領域は、皮膚症状に罹患しており、及び／又は治療することが望ましい領域、例えば、萎縮性瘢痕の領域又はしわの影響を受ける領域を指す。したがって例えば、２ｃｍ２の領域の萎縮性瘢痕の場合では、およそ２００，０００細胞を投与し得る（例えば、各１００，０００細胞の１又は２回の注射を介して）。
好ましい実施形態では、注射１回あたり１，０００，０００、５００，０００、２５０，０００又は１５０，０００未満の細胞、例えば、１０，０００～１，０００，０００細胞／注射、２０，０００～５００，０００細胞／注射、５０，０００～１５０，０００細胞／注射又は約１００，０００細胞／注射を投与する。最も好ましくは、対象に投与される全細胞数は（例えば、単一ラウンドの治療において）、１，０００，０００未満、５００，０００未満、２５０，０００未満又は１５０，０００未満である。
上に考察するように、従来の研究では、懸濁液中、例えば、２，０００万の線維芽細胞をヒト試験に使用した。本発明の方法によれば、例えば、５００，０００又はこれ未満の線維芽細胞を、例えば、培地、例えば、ヒアルロン酸中に使用し得る。
本明細書に記載の単離ヒト真皮線維芽細胞亜集団は、例えば、ヒト真皮線維芽細胞療法のための既存の臨床試験において実施するような公知の方法を使用して対象に投与し得る。例えば、本明細書に記載の細胞集団は、臨床試験ＮＣＴ０１７４３０５３、ＮＣＴ０１１１５６３４、ＮＣＴ０２４９３８１６及びＮＣＴ００６４２６４２（clinicaltrials.govから入手可能）において記載の方法を使用して対象に投与し得る。また、線維芽細胞に基づく細胞療法を実施するための方法は、例えば、Leavitt T, et al., Scarless wound healing: finding the right cells and signals, Cell Tissue Res. 2016 Sep; 365(3):483-93及びWeiss RA, Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers? Facial Plast Surg Clin North Am. 2013 May;21(2):299-304において総説が記載されている。
皮膚症状の治療的及び美容的治療
単離細胞調製物を使用して種々の症状を予防又は治療し得る。一般には、本明細書において使用する場合、「皮膚症状」の用語は、皮膚障害及び病理の両方、並びに非病理学的皮膚症状を指す。
単離細胞調製物を使用して種々の症状を予防又は治療し得る。一般には、本明細書において使用する場合、「皮膚症状」の用語は、皮膚障害及び病理の両方、並びに非病理学的皮膚症状を指す。
一実施形態では、単離細胞調製物は、皮膚障害を治療するために使用する。例えば、単離細胞調製物を使用して創傷治癒を促進するか、或いはケロイド若しくは非ケロイド瘢痕、強皮症、移植片対宿主病、皮膚潰瘍又は遺伝性障害、例えば、表皮水疱症を治療し得る。
また、単離細胞調製物は、種々の美容的方法において、即ち、非病理学的皮膚症状のための美容的治療として使用し得る。好ましい実施形態では、単離細胞調製物を使用して真皮萎縮を治療する。したがって、細胞調製物は、例えば、ヒト対象における皮膚の老化、しわ若しくは瘢痕（例えば、萎縮性瘢痕）を予防若しくは治療するため、又は非外科的美容手術、例えば、鼻形成術、頬骨の増強若しくは顎の増強若しくは下顎輪郭微調整のために使用し得る。好ましくは、単離細胞調製物は、対象の美容的に感受性の領域、例えば、顔、頸部又は手に投与する。
一実施形態では、単離ヒト真皮線維芽細胞集団を使用して、対象の皮膚における線維症を減少させ得る。例えば、細胞集団を使用して、顔輪郭の変形、例えば、鼻唇溝、眉間の縦溝、額の深いしわ及びにきび瘢痕を修正し得る。一実施形態では、新鮮単離乳頭状真皮線維芽細胞亜集団、例えば、細胞表面表現型ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＣＤ３２４－ＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６－により特徴づけられる単離集団は、このような方法において使用する。
最も困難な瘢痕型のうちの１つは、萎縮性瘢痕である。現在のところ、萎縮性瘢痕に有効な治療は殆ど存在しない。小型の萎縮性瘢痕は、手術（切除及び縫合）によって取り出すことができるが、大型の瘢痕は、より治療が困難である。真皮フィラーにより外観の改善を生じさせることが可能である一方、これらは、定期的に反復する必要を有する。真皮フィラーを上回る本発明の方法の利点は、自己栄養及び複製が可能であり、活性化免疫系によるクリアランスを受けない自家細胞の投与が、治療アウトカムが持続性であることを意味することである。
自家線維芽細胞を導入する従来の試みでは、線維芽細胞の回収の後、３カ月間の長期培養を必要とした（以下参照）。これは、患者にとっては不都合あり、臨床医にとっては物流的に困難であり、その上、このような長期間ＧＭＰ培養施設において細胞を維持する本質的コストのため、非常に高額である。これらのコストは、遺伝子療法適用に対しては経済的に存立可能であり得る一方、瘢痕又は皮膚老化の治療に対しては実現可能であるとは考えにくい。本発明の方法の利点は、培養の必要なしに、患者が待つ間に線維芽細胞を調製可能であり、コスト及び手術の複雑性が劇的に削減されることである。
皮膚症状に対する細胞調製物の作用は、インビトロ及びインビボでの適するモデルにおいて判定し得る。例えば、遊走アッセイ、生検創のインビトロでの外植培養、細胞外マトリックス分泌アッセイ及びインビボでの切除創治癒モデルを、細胞調製物を使用して実施して、これらの作用を判定し得る。
上の治療的及び美容的適用における単離細胞調製物の有効性は、前臨床及び臨床研究において確認し得る。例えば、ケロイド移植動物モデルを含む、ケロイド由来線維芽細胞の活性の解析に基づくケロイド瘢痕の適するモデルは、J. Liu, et al., Human adipose tissue-derived stem cells inhibit the activity of keloid fibroblasts and fibrosis in a keloid model by paracrine signaling, Burns (2017) [Epublication, http://dx.doi.org/10.1016/j.burns.2017.08.017]に記載されている。このようなモデルにおける本発明による単離細胞調製物の作用も判定し得る。一般的ケロイド瘢痕の治療は、Ogawa R. Keloid and Hypertrophic Scars Are the Result of Chronic Inflammation in the Reticular Dermis. Int J Mol Sci. 2017 Mar 10;18(3)に記載されている。したがって、ケロイド瘢痕の治療における単離細胞調製物の作用を判定するのに適する研究は、線維芽細胞注射によるインビトロでのケロイド外植、コラーゲンゲル収縮アッセイ、及び新鮮単離細胞調製物由来の培地で処理したケロイド線維芽細胞の増殖アッセイを含み得る。
キット
また、本明細書に記載の方法を実施するためのキットを本明細書において提供する。このようなキットは、例えば、上記の皮膚試料から真皮線維芽細胞を含む細胞を単離するための装置及び試薬を含み得る。例えば、キットは、次の凍結乾燥した酵素カクテル、消化チャンバー、細胞フィルター、磁気ビーズ、アフィニティカラム及び／又は１若しくは２以上の緩衝液（例えば、ＰＢＳ）の１又は２以上を含み得る。キットは、例えば、消化液、溶出液及び／又は洗浄緩衝液を含み得る。酵素阻害物質溶液（例えば、金属イオンキレート剤、例えば、ＥＤＴＡを含む）も存在し得る。
また、本明細書に記載の方法を実施するためのキットを本明細書において提供する。このようなキットは、例えば、上記の皮膚試料から真皮線維芽細胞を含む細胞を単離するための装置及び試薬を含み得る。例えば、キットは、次の凍結乾燥した酵素カクテル、消化チャンバー、細胞フィルター、磁気ビーズ、アフィニティカラム及び／又は１若しくは２以上の緩衝液（例えば、ＰＢＳ）の１又は２以上を含み得る。キットは、例えば、消化液、溶出液及び／又は洗浄緩衝液を含み得る。酵素阻害物質溶液（例えば、金属イオンキレート剤、例えば、ＥＤＴＡを含む）も存在し得る。
一部の実施形態では、キットは、１又は２以上のマーカーに特異的な試薬を含み得る。適する試薬としては、マーカー（複数可）に特異的に結合するリガンド（例えば、抗体）又はマーカー配列、例えば、マーカーをコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの特異的増幅を方向づけるオリゴヌクレオチドプライマーのような試薬が挙げられる。キットは、検出方法の実施に適するさらなる試薬、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイのための試薬、例えば、二次抗体、緩衝溶液若しくは蛍光標識、又はＲＴ－ＰＣＲの実施のための試薬、例えば、逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）及び適する緩衝液を含み得る。好ましい実施形態では、キットは、固相、例えば、磁気ビーズ又はアフィニティカラムに結合する１又は２以上のマーカーに特異的な試薬（例えば、抗体）、を含む。
好ましい実施形態では、キットは、真皮線維芽細胞マーカー、例えば、ＣＤ９０、ＣＤ３９、ＣＤ３６及び／又はＣＤ２６に特異的な試薬の組合せを含む。例えば、キットは、ＣＤ３９、ＣＤ３６及びＣＤ２６に特異的な抗体又はプライマーを含み得る。キットは、任意で、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ３１及び／又はＣＤ３２４に特異的な試薬（例えば、抗体又はプライマー）をさらに含んでもよい。
さらなる実施形態では、キットは、得られた単離細胞調製物との使用のための１又は２以上のさらなる成分を含み得る。例えば、キットは、注射用医薬組成物、例えば、注射用滅菌（緩衝）液を調製するための１又は２以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体、を含み得る。別の実施形態では、キットは、バイアル及び／又は注射デバイス、例えば、皮内注射に適するシリンジ及び／又はニードルをさらに含み得る。
特異的方法
一実施形態では、方法は、以下に詳述するいくつかのステップを含むか又はこれからなる。
一実施形態では、方法は、以下に詳述するいくつかのステップを含むか又はこれからなる。
１．小皮膚生検、例えば、６ｍｍのパンチ生検を、美容的に感受性でない部位、例えば、耳介後部、上腕、大腿又は背部から得る。
２．コラゲナーゼ酵素の凍結乾燥カクテルを含む使い捨て消化チャンバーに生検を配置し、培地を加えて酵素混合物を再構成し、３７℃の使い捨てインキュベーター内で３時間インキュベートする。このチャンバーは、固定化抗体及び非消化皮膚断片を捕捉するフィルターを含み得る。
３．消化組織は、細胞フィルターを通過させて、懸濁液中に磁気ビーズ（ダイナビーズ）を含むか又はカラムにコンジュゲートさせた第２の使い捨てチャンバー内に入れる。ビーズは、抗体（例えば、線維芽細胞に結合する抗ＣＤ９０）にコンジュゲートさせる。
４．磁石を磁気ビーズに結合するチャンバー／カラムの外側に適用し、細胞を捕獲する。
５．カラムをＰＢＳで洗い流して、全ての消化酵素、非消化ＥＣＭ、及び磁気ビーズにより捕獲されない細胞を取り出す。
６．溶出緩衝液により磁気ビーズから細胞を溶出し、第３のチャンバー内に捕獲する。
７．任意のステップにおいて、磁気ビーズ（例えば、ＣＤ３９、ＣＤ２６）によりさらなる正及び／又は負の選択を実施して、それまでに同定した線維芽細胞亜集団を単離する。
８．別の任意のステップにおいて、細胞をレンチウイルス又は類似のトランスフェクションベクターとともにインキュベートして、遺伝子修飾を引き起こす。
９．線維芽細胞をヒアルロン酸中に再懸濁して、注射後の真皮における効率的な生着を促進する。
１０．再懸濁線維芽細胞を含むヒアルロン酸充填剤を大口径のニードルにより真皮内に注射し、包帯を適用する。
ここで、次の非制限的実施形態を参照して、単なる例として本発明を記載する。
［実施例１］ヒト皮膚試料からの真皮線維芽細胞を含む新鮮単離細胞調製物の単離
皮膚付属器（毛髪、汗腺）が最小限に存在する日光にさらされていない皮膚領域をヨウ素／クロルヘキシジンで消毒し、局所麻酔薬を注射する。４ｍｍのパンチ生検３つを回収する。
皮膚付属器（毛髪、汗腺）が最小限に存在する日光にさらされていない皮膚領域をヨウ素／クロルヘキシジンで消毒し、局所麻酔薬を注射する。４ｍｍのパンチ生検３つを回収する。
振盪水浴内で３７℃のディスパーゼ中１時間のインキュベーション後、１～２ｍｍの皮膚を滅菌したメスで切り取るか又は表皮を剥がすことにより表皮を取り出す。
真皮断片を四分の一に切断し、振盪水浴内の消化培地（２．７５ｍｇ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼ、０．０５％のＤＮＡｓｅＩ；１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼIV－Ｓ（７５０～３０００単位／ｍｇ固形）１００Ｕ／ｍｌのペニシリン；ＤＭＥＭ中１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（高グルコース）、フィルター滅菌）１ｍｌ中３７℃で２時間インキュベートする。酵素阻害物質溶液（５００μｌ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．０４ＭのＥＤＴＡ）を生じた細胞懸濁液に加え、１００μｍの細胞濾過器により濾過し、３００×ｇにより４℃で５分間遠心分離する。
上清を廃棄し、ペレットを１回、ＰＢＳ１．５ｍｌを用いて３００×ｇにより４℃で５分間洗浄する。ペレットをＰＢＳ／食塩水０．２ｍｌ中に再懸濁し、計数する。細胞再懸濁液送達溶液／食塩水の追加により細胞濃縮物を１００μｌあたり１×１０５細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）に希釈する。溶液は、ピペットにより穏やかに混合するか又は非常に低速でボルテックスして細胞の均一な混合を確実とし、１ｍｌのシリンジに入れ、ルアースクリューでキャップをする。プロセスは、皮膚生検採取から単離細胞集団を得るまで計５時間未満を要する。
上記の方法を使用して種々のドナー由来の生検試料いくつかから得られた真皮細胞の収率を以下の表３に示す。
［実施例２］エクスビボで維持した真皮線維芽細胞を含む培養細胞調製物の調製
比較研究のために、上に提示の方法に従って対象からの単離により最初に初代ドナー細胞を得、次いで、エクスビボでの培養により維持した。
比較研究のために、上に提示の方法に従って対象からの単離により最初に初代ドナー細胞を得、次いで、エクスビボでの培養により維持した。
１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、２ｍＭのＬグルタミン及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Gibco社）を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はAmniomaxＣ１００サプリメントを加えたAmniomaxＣ１００培地（Gibco社）によりヒト成人真皮線維芽細胞を培養した。培養フラスコを３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下でインキュベートし、８０％コンフルエントになると３～５日毎に継代した。全ての研究では、１～６継代間の細胞を使用した。初代正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＫ、ｋｍ株）の保存培養物を手術により廃棄された包皮から得、３Ｔ３－Ｊ２支持細胞上で増殖させた。２～５継代間のＮＨＫをＤＥＤ実験に使用した。３Ｔ３－Ｊ２線維芽細胞は、認証されないが、Dr James Rheinwald（Department of Dermatology、Harvard Skin Research Centre、米国）から独自に得た。全ての保存細胞は、マイコプラズマ汚染について日常的に検査し、陰性であった。ＮＨＫは、Ham's F12を１部、ＤＭＥＭを３部、１０－４Ｍのアデニン、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、０．５μｇ ｍｌ－１のヒドロコルチゾン、５μｇ ｍｌ－１のインスリン、１０－１０Ｍのコレラ毒素及び１０ｎｇ ｍｌ－１のＥＧＦを含む完全ＦＡＤ培地により、従来の記載のように有糸分裂的に不活性化した３Ｔ３－Ｊ２細胞上で培養した。
４３歳女性の対象の腹部皮膚から得られ、上の方法による培養によって維持したドナー細胞を得た。
［実施例３］脱表皮化真皮（ＤＥＤ、de-epidermised dermis）器官培養
脱表皮化真皮（ＤＥＤ）を従来の記載のように調製した（Rikimaru et al, Experimental dermatology 6, 214-221 (1997)）。簡潔には、正常な成人のヒト皮膚を１ｃｍ２に分割し、５２℃で２０分間加熱し、ピンセットで表皮を真皮から分離した。１０回の凍結融解サイクルにより真皮の細胞を枯渇させ、６０Ｇｙで１回照射した。線維芽細胞をＤＥＤに播種する前に、組織を６ウェルのハンギングセルカルチャーインサート（Millipore社）内に配置し、ＤＭＥＭで平衡化した。種々の数の細胞（１×１０５細胞又は５×１０５細胞）を含む種々の線維芽細胞調製物（新鮮単離又は培養したもの）を、Ｕ－１００インスリンシリンジ（BD社）を使用して表皮表面から各ＤＥＤに注射した。次いで、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で３７℃のＤＭＥＭに完全に浸したＤＥＤを２４時間インキュベートした。培地は、気液界面によりＦＡＤ培地に交換し、１×１０６のケラチノサイトをＤＥＤの上面に播種した。ＤＥＤは、気液界面によるＦＡＤ培地を用いる培養により３週間維持し、培地は４８時間毎に交換した。試料は、ＯＣＴに包埋した後、薄切した。
脱表皮化真皮（ＤＥＤ）を従来の記載のように調製した（Rikimaru et al, Experimental dermatology 6, 214-221 (1997)）。簡潔には、正常な成人のヒト皮膚を１ｃｍ２に分割し、５２℃で２０分間加熱し、ピンセットで表皮を真皮から分離した。１０回の凍結融解サイクルにより真皮の細胞を枯渇させ、６０Ｇｙで１回照射した。線維芽細胞をＤＥＤに播種する前に、組織を６ウェルのハンギングセルカルチャーインサート（Millipore社）内に配置し、ＤＭＥＭで平衡化した。種々の数の細胞（１×１０５細胞又は５×１０５細胞）を含む種々の線維芽細胞調製物（新鮮単離又は培養したもの）を、Ｕ－１００インスリンシリンジ（BD社）を使用して表皮表面から各ＤＥＤに注射した。次いで、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で３７℃のＤＭＥＭに完全に浸したＤＥＤを２４時間インキュベートした。培地は、気液界面によりＦＡＤ培地に交換し、１×１０６のケラチノサイトをＤＥＤの上面に播種した。ＤＥＤは、気液界面によるＦＡＤ培地を用いる培養により３週間維持し、培地は４８時間毎に交換した。試料は、ＯＣＴに包埋した後、薄切した。
実施例１（新鮮単離線維芽細胞）及び実施例２（培養線維芽細胞）の方法により得られたドナー細胞をＤＥＤモデルにおいて検査した。結果は、図１Ａ及び図１Ｂに示す。結果は、驚くべきことに、新鮮単離線維芽細胞により、培養線維芽細胞よりも良好な表皮再構成が生じたことを示す。さらにより驚くべきことには、より少数の線維芽細胞（新鮮単離細胞１００，０００）により、より多数の線維芽細胞（新鮮単離細胞５００，０００）よりも大幅に厚い表皮が生じた。これは、少数の新鮮単離線維芽細胞を使用して、細胞培養増殖ステップの必要なしに、真皮萎縮により特徴づけられる皮膚症状を治療することができることを実証する。
［実施例４］遺伝子発現の定量的ＲＴ－ＰＣＲ解析
新鮮単離真皮線維芽細胞（実施例１）における遺伝子発現を解析し、培養真皮線維芽細胞（実施例２）と比較した。全ＲＮＡをQiagen RNeasyミニキット（Qiagen社）を使用して単離し、ｃＤＮＡをQuantiTect Reverse Transcriptionキット（Qiagen社）又はSuperscript III First-Strand Synthesis（Thermofisher社）を使用して合成した。さらなるＲＮＡｓｅＨ処理は、反応の終わりに３７℃のＰＣＲブロック内に反応物３０μｌあたりＲＮＡｓｅＨ １μｌを２０分間加えることにより完了させた。
新鮮単離真皮線維芽細胞（実施例１）における遺伝子発現を解析し、培養真皮線維芽細胞（実施例２）と比較した。全ＲＮＡをQiagen RNeasyミニキット（Qiagen社）を使用して単離し、ｃＤＮＡをQuantiTect Reverse Transcriptionキット（Qiagen社）又はSuperscript III First-Strand Synthesis（Thermofisher社）を使用して合成した。さらなるＲＮＡｓｅＨ処理は、反応の終わりに３７℃のＰＣＲブロック内に反応物３０μｌあたりＲＮＡｓｅＨ １μｌを２０分間加えることにより完了させた。
ＲＴ－ｑＰＣＲ反応は、CFX384 Real-Time System（Bio-Rad社）上でSYBR-Green Master Mix（Life Technologies社）用の標準プロトコールを使用し、ｑＰＣＲプライマー（Primer3により設計又は公表）を使用して実施した。値は、ＲＰＬ１３Ａ及びＴＢＰ発現レベルに対して、デルタＣＴ法を使用して正規化した。各反応を完了させ、他に述べない限り少なくとも三つ組の生物学的反復を行った。
結果は、図３及び図４に示す。この結果は、新鮮単離細胞において次の遺伝子：ＡＤＡＭＴＳ９、ＴＣＦ４、ＣＤ３９、Ｃｏｌ１１Ａ１、ＬＥＦ１及びＣｏｌ６Ａ５が、培養細胞と比較して上方制御されることを示した。新鮮単離細胞において次の遺伝子：ＣＤ９０、ＤＣＮ、Ｃｏｌ１ａ２、ＦＮ１、ＬＵＭ、ＰＤＧＦＲＡ、ＣＤ２６、ＡＤＡＭ１２、ＥＬＮ及びＷＮＴ５ａは、培養細胞と比較して下方制御される。
［実施例５］対象における萎縮性瘢痕の治療
実施例１において得られた細胞調製物を使用して、同一対象における萎縮性瘢痕の領域を治療する。投与領域をヨウ素／クロルヘキシジン溶液を使用して消毒する。細胞療法薬を萎縮性瘢痕組織１ｃｍ２あたり１００μｌ（１００，０００細胞を含む）の用量で皮内に注射する。
実施例１において得られた細胞調製物を使用して、同一対象における萎縮性瘢痕の領域を治療する。投与領域をヨウ素／クロルヘキシジン溶液を使用して消毒する。細胞療法薬を萎縮性瘢痕組織１ｃｍ２あたり１００μｌ（１００，０００細胞を含む）の用量で皮内に注射する。
上の明細書に言及する全ての公表文献は、参照により本明細書に組み込む。本発明の記載の方法及び系の種々の変更形態及び変形形態は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に明らかとなる。本発明は、特定の好ましい実施形態と関連させて記載しているが、主張する本発明は、このような特定の実施形態に不当に制限されないことが理解されるはずである。実際、当業者に明らかである、本発明を実行するための記載の方法の種々の変更形態は、次の特許請求の範囲内にあることを意図する。
［実施例５］種々の酵素を使用したヒト真皮の消化効率の比較
実施例１の方法を、種々の酵素の組合せを使用して反復し、真皮の消化の最適混合物を判定した。
実施例１の方法を、種々の酵素の組合せを使用して反復し、真皮の消化の最適混合物を判定した。
皮膚付属器の存在が最小限であるヒト皮膚の日光にさらされていない領域をヨウ素／クロルヘキシジンで消毒し、局所麻酔薬を注射した後、切除した。皮膚試料は、使用するまで凍結した。
解凍後、６ｍｍの生検を採取した。表皮の除去後、ａ）コラゲナーゼ（ＣｏｌＢ、ＣＬＳＡＦＢ（ＡＦＡグレード）３００Ｕ／ｍＬ（Worthington社））、ｂ）コラゲナーゼ及びDNaseＩ（（研究グレード）１ｍｇ／ｍＬ（Roche社））（ＣｏｌＢ＋DNaseＩ）、ｃ）コラゲナーゼ、クロストリパイン及び中性プロテアーゼ（ＮＢ４、Nordmark社）、又はｄ）コラゲナーゼ、クロストリパイン、中性プロテアーゼ及びDNaseＩ（ＮＢ４＋DNaseＩ）のいずれかを追加した消化培地（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン；ＤＭＥＭ中１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（高グルコース）、フィルター滅菌）１ｍＬ中でインタクトな全真皮試料をインキュベートした。ＰＢＳ単独の陰性対照を示す。試料は、振盪水浴内で、それぞれの消化混合物中３７℃で２時間インキュベートした。２時間後、消化混合物を取り出し、酵素阻害物質溶液（５００μｌ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．０４ＭのＥＤＴＡ）を追加したＤＭＥＭを加えた。
消化期間の終わりに、消化した真皮試料をホルマル食塩水中に固定し、パラフィンに包埋して、組織切片を調製した。パラフィン包埋した消化真皮の切片をキシレンで処理して、ワックスを除去し、水中エタノールの段階溶液を使用して再水和した。切片は、Van Gieson溶液（Sigma社）５０ｍＬ、０．０５％のメチレンブルー溶液（Sigma社）５０ｍＬ、グリセリン１０ｍＬ及び炭酸リチウム溶液（飽和水溶液）０．５ｍＬからなるHerovici溶液で２分間染色した。スライドを１％の酢酸で２分間洗浄し、次いで、エタノールの段階溶液の後、キシレンを使用して脱水した。
結果は、図５に示す。紫色に染色した領域は、未消化のＩ型コラーゲンを含む一方、青色の領域は、消化されたコラーゲンを含む。各切片における紫色及び青色染色の割合は、ImageJソフトウェアを使用して決定し、円グラフに示す。
図５に実証するように、単一の酵素（コラゲナーゼＢ）で処理した試料は、２３％の真皮消化を示した（図５Ａ）。しかし、図５は、消化レベルが酵素の数の増加とともに上昇したことを示す。実際、図５Ｂは、２７％の真皮消化が２つの酵素（コラゲナーゼＢ＋DNaseＩ）により達成されたことを示し、これは、コラゲナーゼ単独と比較してわずかな上昇を示す。より驚くべきことには、３つの酵素（ＮＢ４：コラゲナーゼ、クロストリパイン及び中性プロテアーゼ）を使用する場合、消化レベルが３９％に上昇し（図５Ｃ）、これは、４つの酵素（ＮＢ４：コラゲナーゼ、クロストリパイン及びプロテアーゼにプラスしてDNaseＩ）を使用する場合、さらに４３％の消化に上昇した（図５Ｄ）。
したがって、真皮組織試料のさらに効率的な消化が、種々の酵素の組合せにより達成可能であると思われる。
したがって、我々は、消化効率の差が、得られた細胞数と相関するかどうか、及び複数の酵素を使用して得られた細胞が生存可能である（即ち、消化プロセス中に殺傷されない）かどうかを検査した。
これを行うために、新鮮な６ｍｍのヒト顔真皮組織を、表皮を除去し、組織を浸解し、（ｉ）コラゲナーゼＩ（２ｍｇ／ｍＬ）及びパパイン（０．１５％）又は（ii）コラゲナーゼＩ（２ｍｇ／ｍＬ）、パパイン（０．１５％）及びトリプシン（０．２５％）のいずれかをプラスした消化培地中で浸解した組織を３７℃で３時間インキュベートすることにより調製した。酵素阻害物質溶液（５００μｌ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．０４ＭのＥＤＴＡ）を生じた細胞懸濁液に加え、１００μｍの細胞濾過器により濾過し、３００×ｇにより４℃で５分間遠心分離した。
上清を廃棄し、ペレットを１回、ＰＢＳ１．５ｍｌを用いて３００×ｇにより４℃で５分間洗浄した。ペレットは、ＰＢＳ／食塩水０．２ｍｌ中に再懸濁し、トリパンブルーを使用して生／死細胞を計数した。
真皮線維芽細胞の収率及びこれらの生存率を図６に示す。図６に見られるように、消化に使用した酵素数が２つの酵素から３つの酵素に増加した場合、試料から得られた細胞数は実質的に増加した。これは、図５の凍結皮膚組織から得られたデータと一致する。興味深いことには、酵素数の増加は、得られた細胞の生存率に影響せず、細胞の９７％が、２つの酵素を使用する条件において生存可能であり、細胞の９６％が、３つの酵素を使用する条件において生存可能であった。
したがって、我々は、酵素の組合せを使用して、細胞生存率に影響を与えずに、真皮組織から得られた細胞数を増加させ得ることを示す。その上、本発明において使用する酵素の組合せにより、驚くべきことに、他の細胞型と比較して高い割合の線維芽細胞が組織から遊離する。
さらなる態様では、次の付番した項に記載のさらなる実施形態を本発明により提供する。
１．対象における皮膚症状を予防又は治療する方法であって、対象から得られた皮膚試料由来の初代真皮線維芽細胞を含む細胞を単離するステップと、新鮮単離細胞が対象の皮膚に投与されるステップとを含む、方法。
２．細胞が、エクスビボでの増殖ステップなしに、細胞を対象に投与される、項１に記載の方法。
３．細胞が、対象からの皮膚試料の入手及び／又は皮膚試料からの細胞の単離から４８時間、２４時間又は１２時間以内に対象の皮膚に投与される、項１又は２に記載の方法。
４．治療する対象の皮膚１ｃｍ２あたり５００，０００、２５０，０００又は１５０，０００未満の細胞が投与される、項１に記載の方法。
５．細胞が、ヒアルロン酸及び／又はコラーゲンをさらに含む培地中で、対象に投与される、項１～４のいずれかに記載の方法。
６．方法が、美容的方法であり、及び／又は皮膚症状が、皮膚の老化、しわ、瘢痕若しくは萎縮である、項１～５のいずれかに記載の方法。
７．皮膚試料が対象の耳介後部、上腕、大腿若しくは背部から得られ、及び／又は細胞が、対象の顔、頸部若しくは手の皮膚に投与される、項１～６のいずれかに記載の方法。
８．細胞が、次のステップ：（ａ）皮膚試料から表皮を取り出すステップ、（ｂ）真皮組織を酵素により消化するステップ、並びに／又は（ｃ）細胞濾過及び／若しくは遠心分離により細胞を分離するステップ
の１又は２以上を含む方法により皮膚試料から単離される、項１～７のいずれかに記載の方法。
の１又は２以上を含む方法により皮膚試料から単離される、項１～７のいずれかに記載の方法。
９．ディスパーゼ、コラゲナーゼ、ＤＮＡｓｅ及び／又はヒアルロニダーゼから選択される１又は２以上の酵素とともに皮膚試料をインキュベートする、項８に記載の方法。
１０．対象に投与される新鮮単離細胞が、総真皮細胞からなるか又はこれから本質的になる、項１～９のいずれかに記載の方法。
１１．細胞単離ステップが、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ９０及びＣＤ３２４から選択される１又は２以上の細胞表面マーカー、好ましくは、ＣＤ９０の発現に基づいて皮膚試料から真皮線維芽細胞を分離するステップをさらに含む、項１～９のいずれかに記載の方法。
１２．対象に投与される新鮮単離細胞が、好ましくは、細胞表面表現型ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＣＤ３２４－ＣＤ９０＋を有する未分画の真皮線維芽細胞からなるか又はこれから本質的になる、項１～９又は１１のいずれかに記載の方法。
１３．細胞単離ステップが、ＣＤ２６、ＣＤ３９及びＣＤ３６から選択される１又は２以上の細胞表面マーカーの発現に基づいて皮膚試料から真皮線維芽細胞の亜集団を分離するステップをさらに含む、項１～９又は１１のいずれかに記載の方法。
１４．新鮮単離細胞が、（ｉ）好ましくは、細胞表面表現型ＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６－を有する乳頭状真皮線維芽細胞、及び／又は（ii）好ましくは、細胞表面表現型ＣＤ９０＋ＣＤ３９－若しくはＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６＋を有する網状真皮線維芽細胞を含むか又はこれらからなる、項１～９、１１又は１３のいずれかに記載の方法。
１５．細胞単離ステップが、固相上に固定化した真皮線維芽細胞の細胞表面マーカーに対して特異的な１又は２以上のリガンド、好ましくは、磁気ビーズ又はカラムに結合する１又は２以上の抗体を使用して、皮膚試料から真皮線維芽細胞又はこの亜集団を分離するステップをさらに含む、項１～１４のいずれかに記載の方法。
１６．（ｉ）新鮮単離細胞が、培養細胞と比較して次の遺伝子：ＡＤＡＭＴＳ９、ＴＣＦ４、ＣＤ３９、Ｃｏｌ１１Ａ１、ＬＥＦ１、Ｃｏｌ６Ａ５の１若しくは２以上の発現の上昇を示し、及び／又は（ii）新鮮単離細胞が、培養細胞と比較して次の遺伝子：ＣＤ９０、ＤＣＮ、Ｃｏｌ１ａ２、ＦＮ１、ＬＵＭ、ＰＤＧＦＲＡ、ＣＤ２６、ＡＤＡＭ１２、ＥＬＮ、ＷＮＴ５ａの１若しくは２以上の発現の低下を示す、項１～１５のいずれかに記載の方法。
１７．皮膚試料１ｃｍ２あたり少なくとも１００，０００、２５０，０００又は５００，０００の初代真皮線維芽細胞が単離される、項１～１６のいずれかに記載の方法。
１８．対象がヒトである、項１～１７のいずれかに記載の方法。
１９．対象における皮膚症状の自家予防又は自家治療における使用のための、対象から得られた初代真皮線維芽細胞を含む新鮮単離細胞調製物。
２０．対象を、エクスビボでの増殖ステップなしに治療するために使用される、項１９に記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
２１．対象からの細胞の単離から４８時間、２４時間又は１２時間以内に、対象の皮膚を治療するために使用される、項１９又は２０に記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
２２．調製物が５００，０００、２５０，０００若しくは１５０，０００未満の細胞を含み、及び／又は５００，０００、２５０，０００若しくは１５０，０００未満の細胞が対象に投与される、項１９～２１のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
２３．ヒアルロン酸及び／又はコラーゲンをさらに含む、項１９～２２のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
２４．皮膚障害を治療するため又は創傷治癒を促進するために使用される、項１９～２３のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
２５．対象の皮膚への注射による使用のための、項１９～２３のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
２６．（ａ）皮膚試料から表皮を取り出すステップと、
（ｂ）皮膚試料中の真皮組織を１又は２以上の酵素により消化するステップと、
（ｃ）消化した試料から細胞を濾過及び／又は遠心分離により分離するステップと
を含む、対象から得られた皮膚試料から初代真皮線維芽細胞を含む細胞を単離するための方法であって、皮膚試料１ｃｍ２あたり少なくとも１００，０００、２５０，０００又は５００，０００の初代真皮線維芽細胞が単離される、方法。
（ｂ）皮膚試料中の真皮組織を１又は２以上の酵素により消化するステップと、
（ｃ）消化した試料から細胞を濾過及び／又は遠心分離により分離するステップと
を含む、対象から得られた皮膚試料から初代真皮線維芽細胞を含む細胞を単離するための方法であって、皮膚試料１ｃｍ２あたり少なくとも１００，０００、２５０，０００又は５００，０００の初代真皮線維芽細胞が単離される、方法。
２７．ステップ（ｂ）において、Ｉ型コラゲナーゼ、ＤＮＡｓｅＩ及び／又はヒアルロニダーゼIV－Ｓとともに皮膚試料をインキュベートする、項２６に記載の方法。
２８．ＣＤ２６、ＣＤ３１、ＣＤ３９、ＣＤ３６、ＣＤ４５、ＣＤ９０及びＣＤ３２４から選択される１又は２以上の細胞表面マーカー、好ましくは、ＣＤ９０の発現に基づいて、単離細胞から真皮線維芽細胞又はこの亜集団を分離するステップをさらに含む、項２６又は２７に記載の方法。
２９．項２６～２８のいずれかに記載の方法により得られたか又は得ることが可能な単離細胞調製物。
３０．１又は２以上の賦形剤、緩衝液又は希釈剤を含む液体培地中に新鮮単離初代真皮線維芽細胞を含む、医薬単位投与剤形であって、５００，０００、２５０，０００又は１５０，０００未満の細胞を含む、医薬単位投与剤形。
３１．皮内注射に適する滅菌溶液又は懸濁液を含む、項３０に記載の医薬単位投与剤形。
Claims (38)
- 対象における皮膚症状を予防又は治療する方法における使用のための、初代真皮線維芽細胞を含む新鮮単離細胞調製物であって、前記新鮮単離細胞調製物が、前記対象から得られた皮膚試料由来の初代真皮線維芽細胞を含む細胞を単離するステップにより得られ、前記方法が、前記新鮮単離細胞を前記対象の皮膚に投与するステップを含む、前記新鮮単離細胞調製物。
- 細胞が、エクスビボでの増殖ステップなしに、対象に投与される、請求項１に記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 細胞が、対象からの皮膚試料の入手及び／又は皮膚試料からの細胞の単離から４８時間、２４時間又は１２時間以内に前記対象の皮膚に投与される、請求項１又は２に記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 治療する対象の皮膚１ｃｍ２あたり５００，０００、２５０，０００又は１５０，０００未満の細胞が投与される、請求項１に記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 細胞が、カルシウムハイドロキシアパタイト、合成ポリ乳酸ミクロスフェア、ポリ（メチル）メタクリル酸ミクロスフェア、ポリアルキルイミド、フィブリン、ヒアルロン酸及び／又はコラーゲンをさらに含む培地中で、対象に投与される、請求項１～４のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 細胞が、フィブリンを含む培地中で、対象に投与される、請求項１～５のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 方法が、美容的方法であり、及び／又は、皮膚症状が、皮膚の老化、しわ、瘢痕若しくは萎縮である、請求項１～６のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 皮膚試料が、対象の耳介後部、上腕、大腿若しくは背部から得られ、及び／又は、細胞が、対象の顔、頸部若しくは手の皮膚に投与される、請求項１～７のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 皮膚試料が、約０．０３～３ｃｍ２、好ましくは、約０．１～２ｃｍ２、より好ましくは、約０．５～１．５ｃｍ２の領域を有する、請求項１～８のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 細胞が、以下のステップの１又は２以上を含む方法により皮膚試料から単離される、請求項１～９のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
（ａ）前記皮膚試料から表皮を取り出すステップ；
（ｂ）真皮組織を酵素消化するステップ；並びに／又は
（ｃ）細胞濾過及び／若しくは遠心分離により細胞を分離するステップ； - 皮膚試料が、２又は３以上の酵素、好ましくは、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、パパイン、トリプシン、サーモライシン、プロナーゼ、パンクレアチン、エラスターゼ、ＤＮＡｓｅ及び／又はヒアルロニダーゼから選択される２又は３以上の酵素とともにインキュベートされる、請求項１０に記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- ２又は３以上の酵素のうちの１つが、コラゲナーゼを含むか又はこれからなる、請求項１１に記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 新鮮単離細胞における線維芽細胞のパーセンテージが、総細胞数の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％超を占める、請求項１～１２のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 対象に投与される新鮮単離細胞が、初代真皮線維芽細胞からなるか又はこれから本質的になる、請求項１～１３のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 細胞単離ステップが、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ９０及びＣＤ３２４から選択される１又は２以上の細胞表面マーカー、好ましくは、ＣＤ９０の発現に基づいて皮膚試料から真皮線維芽細胞を分離するステップをさらに含む、請求項１～１４のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 対象に投与される新鮮単離細胞が、好ましくは、細胞表面表現型ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＣＤ３２４－ＣＤ９０＋を有する未分画の真皮線維芽細胞からなるか又はこれから本質的になる、請求項１～１５のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 細胞単離ステップが、ＣＤ２６、ＣＤ３９及びＣＤ３６から選択される１又は２以上の細胞表面マーカーの発現に基づいて皮膚試料から真皮線維芽細胞の亜集団を分離するステップをさらに含む、請求項１～１６のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 新鮮単離細胞が、（ｉ）好ましくは、細胞表面表現型ＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６－を有する乳頭状真皮線維芽細胞、及び／又は（ii）好ましくは、細胞表面表現型ＣＤ９０＋ＣＤ３９－若しくはＣＤ９０＋ＣＤ３９＋ＣＤ２６＋を有する網状真皮線維芽細胞を含むか又はこれらからなる、請求項１～１７のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 細胞単離ステップが、固相上に固定化した真皮線維芽細胞の細胞表面マーカーに対して特異的な１又は２以上のリガンド、好ましくは、磁気ビーズ又はカラムに結合する１又は２以上の抗体を使用して、皮膚試料から真皮線維芽細胞又はこの亜集団を分離するステップをさらに含む、請求項１～１８のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- （ｉ）新鮮単離細胞が、培養細胞と比較して次の遺伝子：ＡＤＡＭＴＳ９、ＴＣＦ４、ＣＤ３９、Ｃｏｌ１１Ａ１、ＬＥＦ１、Ｃｏｌ６Ａ５の１若しくは２以上の発現の上昇を示し、及び／又は（ii）新鮮単離細胞が、培養細胞と比較して次の遺伝子：ＣＤ９０、ＤＣＮ、Ｃｏｌ１ａ２、ＦＮ１、ＬＵＭ、ＰＤＧＦＲＡ、ＣＤ２６、ＡＤＡＭ１２、ＥＬＮ、ＷＮＴ５ａの１若しくは２以上の発現の低下を示す、請求項１～１９のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 皮膚試料１ｃｍ２あたり少なくとも１００，０００、２５０，０００又は５００，０００の初代真皮線維芽細胞が単離される、請求項１～２０のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 対象がヒトである、請求項１～２１のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 対象における皮膚症状の自家予防又は自家治療における使用のための、前記対象から得られた初代真皮線維芽細胞を含む新鮮単離細胞調製物。
- 対象を、エクスビボでの増殖ステップなしに治療するために使用される、請求項２３に記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 対象からの細胞の単離から４８時間、２４時間又は１２時間以内に、前記対象の皮膚を治療するために使用される、請求項２３又は２４に記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 調製物が５００，０００、２５０，０００若しくは１５０，０００未満の細胞を含み、及び／又は５００，０００、２５０，０００若しくは１５０，０００未満の細胞が対象に投与される、請求項２３～２５のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- １又は２以上の真皮フィラーをさらに含む、請求項２３～２６のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- １又は２以上の真皮フィラーが、コラーゲン、ヒアルロン酸、カルシウムハイドロキシアパタイト、合成ポリ乳酸ミクロスフェア、ポリ（メチル）メタクリル酸ミクロスフェア、ポリアルキルイミド及び／又はフィブリンを含む、請求項２７に記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- １又は２以上の真皮フィラーが、ヒアルロン酸、フィブリン及び／又はコラーゲンを含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなる、請求項２８に記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 皮膚障害を治療するため又は創傷治癒を促進するために使用される、請求項１～２９のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- 対象の皮膚への注射、好ましくは、皮内注射による使用のための、請求項１～３０のいずれかに記載の使用のための新鮮単離細胞調製物。
- （ａ）皮膚試料から表皮を取り出すステップと、
（ｂ）前記皮膚試料中の真皮組織を１又は２以上の酵素により消化するステップと、
（ｃ）消化した前記試料から細胞を濾過及び／又は遠心分離により分離するステップと
を含む、対象から得られた前記皮膚試料から初代真皮線維芽細胞を含む細胞を単離するための方法であって、前記皮膚試料１ｃｍ２あたり少なくとも１００，０００、２５０，０００又は５００，０００の初代真皮線維芽細胞が単離される、前記方法。 - ステップ（ｂ）において、皮膚試料が、２又は３以上の酵素、好ましくは、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、パパイン、トリプシン、サーモライシン、プロナーゼ、パンクレアチン、エラスターゼ、ＤＮＡｓｅ及び／又はヒアルロニダーゼから選択される２又は３以上の酵素とともにインキュベートされる、請求項３２に記載の方法。
- ２又は３以上の酵素のうちの少なくとも１つが、コラゲナーゼを含む、請求項３３に記載の方法。
- ＣＤ２６、ＣＤ３１、ＣＤ３９、ＣＤ３６、ＣＤ４５、ＣＤ９０及びＣＤ３２４から選択される１又は２以上の細胞表面マーカー、好ましくは、ＣＤ９０の発現に基づいて、単離細胞から真皮線維芽細胞又はこの亜集団を分離するステップをさらに含む、請求項３２～３４のいずれかに記載の方法。
- 請求項３２～３５のいずれかに記載の方法により得られたか又は得ることが可能な単離細胞調製物。
- １若しくは２以上の賦形剤、緩衝液又は希釈剤を含む液体培地中に新鮮単離初代真皮線維芽細胞を含む、医薬単位投与剤形であって、５００，０００、２５０，０００又は１５０，０００未満の細胞を含む、前記医薬単位投与剤形。
- 皮内注射に適する滅菌溶液又は滅菌懸濁液を含む、請求項３７に記載の医薬単位投与剤形。
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