CN115478048A - 培养脂肪间充质干细胞制备外泌体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及培养脂肪间充质干细胞制备外泌体。一方面，本发明涉及使用脂肪间充质干细胞分离提取的外泌体，其具有50～200nm的平均粒径，膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％，膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％；该外泌体是使用IL‑1β处理脂肪间充质干细胞然后在低氧分压的环境中对细胞进行培养，接着通过对培养液进行差速离心制备得到的。本发明还提供上该外泌体的制备方法，其医疗用途。本发明外泌体具有优良的生物调控性能和生物学活性。

Description

培养脂肪间充质干细胞制备外泌体

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种培养间充质干细胞获取外泌体的方法。具体涉及一种采用炎性因子及低氧环境下诱导培养间充质干细胞分泌外泌体并提取的方法，该方法获取的外泌体在可显著的提高细胞的抗炎活性。本发明的间充质干细胞是从脂肪分离和传代培养获得的。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于中胚层的一类非造血系统多能干细胞，现已证实MSCs除具有自我更新自我复制和多向分化潜能外，还具有很强的抗炎和抑制多种免疫细胞的能力，并能够诱导外周免疫耐受。研究表明MSCs通过分泌多种免疫调节因子，如IFN-γ、PGE2等(可参见：Polchert D,Sobinsky J,Douglas G,Kidd M,Moadsiri A,Reina E,et al.IFN-gamma activation of mesenchymal stem cells fortreatment and prevention of graft versus host disease.European journal ofimmunology.2008；38(6):1745-55.以及Spaggiari GM,Abdelrazik H,Becchetti F,Moretta L.MSCs inhibit monocyte-derived DC maturation and function byselectively interfering with the generation of immature DCs:central role ofMSC-derived prostaglandin E2.Blood.2009；113(26):6576-83.)，从而抑制免疫细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞、抗原呈递细胞等)的功能(可参见：Corcione A,Benvenuto F,Ferretti E,Giunti D,Cappiello V,Cazzanti F,et al.Human mesenchymal stem cellsmodulate B-cell functions.Blood.2006；107(1):367-72.以及Di Nicola M,CarloStella C,Magni M,Milanesi M,Longoni PD,Matteucci P,et al.Human bonemarrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellularor nonspecific mitogenic stimuli.Blood.2002；99(10):3838-43.)。

间充质干细胞的免疫原性低。基于MSCs的细胞治疗已成功应用于心血管系统疾病，骨、软骨缺损，糖尿病等疾病的治疗。MSCs通过旁分泌和自分泌释放多种细胞因子和生长因子，这些分泌的生物活性因子能够抑制纤维化和凋亡，增强血管生成，参与组织修复再生。

间充质干细胞来源丰富，可取自脐带、胎盘、骨髓、脐血、脂肪、羊膜等组织。

外泌体(exosome)是一种由细胞分泌的直径约30～200nm、密度范围在1.13～1.19g/ml之间的膜性微囊泡。外泌体可携带多种与源细胞相似的蛋白质、mRNA、miRNA，参与免疫调节、细胞通讯、细胞迁移、血管新生等过程(可参见：Yanez-Mo M,Siljander PR,Andreu Z,Zavec AB,Borras FE,Buzas EI,et al.Biological properties ofextracellular vesicles and their physiological functions.Journal ofextracellular vesicles.2015；4:27066.)。Lai等发现MSCs来源的外泌体可减少心肌缺血再灌注损伤，并且证实外泌体的miRNA可以促进血管新生，因此外泌体可能成为治疗心血管疾病的一个新方向(可参见：Lai RC,Arslan F,Lee MM,Sze NS,Choo A,Chen TS,etal.Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusioninjury.Stem cell research.2010；4(3):214-22.)。Xin等发现MSCs来源的外泌体通过转移miR-133b到神经细胞，可促进神经轴突的生长(可参见：Xin H,Li Y,Buller B,Katakowski M,Zhang Y,Wang X,et al.Exosome mediated transfer of miR-133b frommultipotent mesenchymal stromal cells to neural cells contributes to neuriteoutgrowth.Stem cells.2012；30(7):1556-64.)。Filipazzi等发现肿瘤细胞来源的外泌体可通过NK细胞激活型受体NKG2D(naturalkiller group 2,member D)抑制T细胞和NK细胞的细胞毒性，从而影响宿主的免疫系统(可参见：Filipazzi P,Burdek M,Villa A,Rivoltini L,Huber V.Recent advances on the role of tumor exosomes inimmunosuppression and disease progression.Seminars in cancer biology.2012；22(4):342-9)。

外泌体(exosome)这种由活细胞分泌的膜泡，最早于1983年被发现。随着研究深入，发现其具有执行蛋白、核酸的运输，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件，参与细胞间的通讯等功能，而不断受到重视。外泌体携带蛋白质包括源细胞非特异性和源细胞特异性两类蛋白分子。前者可能与外泌体的生物发生和生物学作用有关，主要包括：细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白；另一类是特殊蛋白质，这类蛋白质只存在于某种特殊的细胞分泌的外泌体，而这些特定细胞源的外泌体与其生物学功能有着密切联系，例如：分子来源的外泌体上含有MHCII类分子。因此，不同细胞源的外泌体所携带的信号分子不一样，发挥的功能也不尽相同。例如：肿瘤细胞分泌的外泌体能够介导血管再生肿瘤细胞增殖及免疫逃逸，而树突状细胞源性外泌体则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。已有的研究发现，外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA，并且外泌体能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，故外泌体有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。

外泌体作为一种纳米级的脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。外泌体天然存在于体液中、包括血液、唾液、尿液、母乳等。外泌体是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡。包括肿瘤在内的几乎所有的细胞，都可以产生并释放外泌体。外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，最后又可以被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质。宿主细胞抑或是肿瘤细胞分泌的外泌体都参与了细胞的生长、增值，代谢和调控等作用。免疫细胞和肿瘤细胞之间也可以通过外泌体进行信息交换，这种通讯方式在调节肿瘤免疫中发挥了双重作用：外泌体即可以通过抑制免疫细胞(DCs、NK细胞、CD4+、CD8+T细胞等)引发抗肿瘤反应，又可以诱导免疫抑制或调节细胞群(MDSCs、Tregs、Bregs)的免疫抑制。

目前研究发现，间充质干细胞的外泌体携带有多种有效的细胞因子、蛋白和小分子核酸物质，可有效介导细胞增殖、凋亡和功能调节作用。研究发现，外泌体中含有血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板增殖因子、肿瘤坏死因子和肿瘤生长因子等，具有抑制细胞凋亡、细胞的纤维化程度，促进血管发生有丝分裂和介导免疫反应等功能。实验证明，在使用间充质干细胞所分泌的外泌体携带的胰岛素样生长因子和血管内皮细胞生长因子是治疗急性肾损伤的关键主导因子。在免疫学方面，间充质干细胞分泌的外泌体脂膜表面表达有多种膜蛋白，如：凝血因子、肿瘤坏死因子、MHC I/II分子以及CCR5趋化因子受体等，这些脂膜表面蛋白对抵抗炎症具有重要的作用。

目前进行外泌体提取的方法和途径也多种多样，现有的外泌体提取方法主要采用超速离心法或昂贵的试剂盒过柱子法，然而超速离心法所获取的外泌体质量不均一、不能保证外泌体所获取量、逐级离心时间冗长，有时甚至离心时间或者离心速度原因而最终无法分离得到，浪费时间及成本。而试剂盒过柱子法通常只能适用于较小量的外泌体获取，并且成本昂贵。

现有技术已有一些关于外泌体的分离提取方法的报道。例如，CN106282107A(中国专利申请号201610779165.2)公开了一种从人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，CN105708861A(中国专利申请号201610149852.6)公开了骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗强直性脊柱炎的药物中的应用，CN105267240A(中国专利申请号201410781765.3)公开了间充质干细胞来源的外泌体的用途，CN104382827A(中国专利申请号201410705462.3)公开了人羊膜间充质干细胞外泌体的用途，CN103767985A(中国专利申请号201210402915.6)公开了人源血液或间充质干细胞分泌外泌体的制备与应用。然而，现有技术中，采用各种来源的间充质干细胞培养上清液来提取外泌体，这些方法均存在产量偏低、工艺复杂等的不足。

人们已经从脂肪组织分离出一类具有多向分化潜能的干细胞，并在体外培养特殊体系中成功地分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞与肌细胞等，这种可分化的干细胞被认可为脂肪来源的间充质细胞，即脂肪干细胞或脂肪间充质干细胞(adipose-derived stemcells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，脂肪干细胞具有分化多胚层全能性特征，其中包括中胚层，内胚层和外胚层分化细胞的能力，能分泌许多潜在的有利的生长因子和细胞活素以细胞为基础的促进创面愈合的治疗方法快速发展。脂肪源性干细胞是一群多功能间充质干细胞，可以分化为其他的细胞系在脂肪组织的非脂肪(间质)碎片中存在大量的脂肪源性细胞，且易于分离获取。

作为各种组织缺损的辅助治疗方法，脂肪源性干细胞被推荐应用。在创面愈合过程中，血管再生是一个重要的步骤新生血管的形成是支持肉芽组织形成和角化细胞存活扩增愈合创伤的的必要条件。因此认为，脂肪源性干细胞是通过快速促血管再生从而促进创面的愈合。另外，脂肪源性干细胞还显示出通过细胞分化以及分泌促进胶原合成和真皮成纤维细胞迁移的长因子来促进创面的愈合。

人们已将脂肪源性干细胞与细胞外基质支架成分联合应用于动物的皮肤软组织创面，发现脂肪源性干细胞以促进支架的血管化能力。有研究结果显示，脂肪源性细胞对创面愈合的促进作用与脂肪源性干细胞促进上皮化和肉芽组织的形成有关，并且脂肪源性干细胞有潜在的表皮细胞分化能力研究结果还提示脂肪源性干细胞的远位分化能力是多功能脂肪干细胞对创面的微环境的一个反应。脂肪源性干细胞对局部血管的重塑包括直接分化为血管内皮细胞和分泌血管生长因子，后两者则有益于血管的再生。即是说，脂肪源性干细胞通过细胞分化和血管再生促进创面的愈合。另外，人们将脂肪源性干细胞与血小板源性生长因子，即一种众所周知的参与正常创面愈合过程的因子，联合用于创面的治疗。研究结果显示二者的联合应用有协同作用，即可能通过提高生长因子的水平而促进了创面的愈合。

理论上讲，细胞疗法前景广阔，因为多功能干细胞或祖细胞通过对创面缺失组织的再生和持续提供许多有利因子而促进创面的愈合。尽管如此，关于脂肪源性干细胞对创面愈合的机制的研究仍有待于进一步探索。脂肪源性干细胞对局部血管的重塑包括直接分化为血管内皮细胞和分泌生血管生长因子，后两者则有益于血管的再生。

脂肪间充质干细胞的应用前景已通过在各疾病动物模型上的应用得以验证，其用来干预治疗糖尿病、肝脏损伤修复、膀肌重建、2型糖尿病阳疹、心肌梗死、脑梗、认知功能障碍、中风、椎间盘修复、胶质母细胞瘤治疗、骨缺损、创伤后血管新生、风湿性关节炎、唇愕裂、心力衰竭、结肠炎、尿失禁等。有研究者将脂肪间充质干细胞转变为心肌细胞，既重新编程了成熟的干细胞，又能改善心脏病的治疗。也有人将脂肪间充质干细胞与纤维蛋白胶复合后注射到心肌梗塞大鼠的左心室壁上，ADSCs在临床组织工程治疗心肌梗塞上会有很大的前景。脂肪间充质干细胞作为种子细胞放于网状支架中，成功地修复了狗的颅骨损伤，为临床治疗颅骨损伤。还有研究应用心脏病人腹部脂肪的脂肪间充质干细胞注射进他们的心脏以后，减少了心脏的损伤、同时也增加了血流，干细胞注射进心脏以后经过6个月，病人心脏接受带氧血液的能力提高，心脏左心室送出的血液也增加了3.5倍，SPELT显像证明接受脂肪间充质干细胞注射的病人心泵的能力增加了5.7％，核磁扫描也显示患者的平均心肌疤痕面积由原来的31.6％下降到15.4％，这一研究成果发布在2010年美国心脏协会科学年会上。脂肪间充质干细胞在组织修复过程中可以调节周围组织中的生长激素和细胞因子等防治细胞凋亡，有试验证明脂肪间充质干细胞可以分泌各种皮肤生长因子如纤维细胞生长因子(Basic fibroblastgrowth factor,bFGF)等来促进成纤维细胞繁殖，并具有抗光老化、抗氧化、抗皱、抗紫外辐射等作用。有研究用脂肪间充质干细胞来治疗病人复杂性肛屡已经进入到II期临床实验。还有用人的脂肪间充质干细胞移植入名乳房萎缩、大小不一或需要隆胸的患者乳房中，左右乳房大小均衡对称，乳房X光检测，被修复的乳房自然柔软完全无钙化，无囊肿现象，无明显的注射疤痕。最近的临床研究显示，肌内注射脂肪间充质干细胞对糖尿病足和闭塞性动脉硬化症也有一定的疗效。在注射脂肪间充质干细胞的6个月后，从临床上看，患者的静息疼痛得到了缓解，无痛行走的距离明显延长，而且并未发现任何并发症。有试验显示脂肪间充质干细胞诱导成胰岛样细胞回输糖尿病患者，术后随访23个月，发现患者的外源性胰岛素用量下降，患者的平均体重增加了而且患者无不适或副反应。

有学者研究发现脂肪组织参与创伤修复，当脂肪细胞受到创伤刺激后，基因表达发生应激性分泌TNF-a、IL-1、IL-6、细胞间粘附因子、趋化因子，急性反映蛋白，受体等炎症基质的基因表达都会增加，这些因子调控都是我们了解脂肪细胞参与修复的内在治疗机制，这种调节体系是值得我们思考的精密调控。获得的科研成果是丰富创伤修复的理论基础。临床应用伤及真皮下组织脂肪层的深度皮损创伤，脂肪回输治疗均可以达到加速创面修复的理想治疗效果，国外研究学者也应用脂肪细胞，胶原蛋白与弹性蛋白应用组织工程技术制备含有脂肪细胞的人工皮肤，临床应用发现可减少全层皮肤缺损的组织修复造成的创面收缩，这一现象提示我们脂肪组织中存在具有修复作用的因子与细胞。

脂肪间充质干细胞对细胞外基质的黏附强快速特性，体外筛选培养的人脂肪来源的间充质干细胞得以在国内外方法特异性发展。而干细胞生物学性能，可以做到增进功能、避免潜在有害基因及对干细胞控制分化时间与控制不同分化方向等，在基础科研、临床治疗、干细胞治疗研究方向、皮肤再生损伤修复、高拟组织工程皮肤的构建方面等均有历史时期不可取代的指导意义。

脂肪间充质干细胞(ADSCs)作为来源于脂肪的间充质干细胞，取材方便，其提取效率比骨髓间充质干细胞高40倍，并且体外培养条件下增殖速度更快；具有多向分化能力，可以向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞，甚至神经细胞分化。目前临床Ⅰ期和Ⅱ期实验都证明，ADSCs在心脏、直肠、乳腺等多种器官损伤修复中的应用是安全、有效的，而且已有研究证实ADSCs具有促进皮肤再生修复的作用。

ADSCs在多个方面呈现出其固有的优势。ADSCs属于单核细胞家族，是成体干细胞中的一种。它来自处理过的脂肪组织，培养时在细胞培养皿中以贴壁、粘附方式生长，并具有多样分化的能力，不只分化为脂肪细胞，还可以分化为肌细胞、软骨细胞、神经细胞、血管内皮细胞、骨细胞等，因此它们也在组织工程中被广泛地应用。例如，ADSCs可通过自我复制分化为脂肪细胞，在组织再生中发挥作用；ADSCs可以分化成血管内皮细胞或周围细胞；ADSCs在缺氧或其他条件下，可以分泌血管生长因子；当ADSCs和脂肪细胞一起移植的时候，它能够分化成内皮细胞，阻止纤维化和脂肪坏死的发生，提高脂肪成活率；根据最近的许多具体研究结果表明，ADSCs能表达多种细胞因子VEGF、IGF、TGF-β1、bFGF、EGF等，还通过表达VEGF、IGF-1等血管生长因子，来阻止凋亡的发生，维持脂肪细胞的成活率。

现有技术公开了诸多有关脂肪间充质干细胞的培养方法。例如，CN106479970A(201611050980.1)公开了一种大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法；CN104762260A(201510197879.8)涉及一种脂肪间充质干细胞的制备方法；CN104974984A(申请号201510173453.9)公开了一种脂肪组织来源的间充质干细胞的扩增培养方法；CN106520686A(申请号201610887111.8)提供了一种脂肪间充质干细胞的培养方法；CN101984049A(申请号201010580537.1)公开了一种从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法；CN102329783A(申请号201110310461.5)公开了一种从外科吸脂手术中的膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法。

此外，本申请的发明人团队在中国专利ZL2020113812050中亦提供了一种有效的无血清培养基分离培养原代脂肪间充质干细胞的方法。

然而，本领域仍然期待有新的方法来分离提取外泌体，特别是以简单易得和高产量的方式通过间充质干细胞分泌提取外泌体。此外，本领域还期待提供一种治疗炎性疾病的方法例如通过使用外泌体治疗炎性疾病的方法。尤其是，本领域特别期待提供一种通过人脂肪间充质干细胞培养分离的外泌体治疗炎性疾病的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的方法来分离提取外泌体，特别是这种方法能够以简单易得和高产量的方式通过间充质干细胞分泌提取外泌体。已经出人意料的发现通过本发明方法能够有益的实现上述目的。本发明基于此发现而得以完成。

本发明涉及的间充质干细胞是脂肪来源的。

为此，本发明第一方面提供了一种使用脂肪间充质干细胞分离提取的外泌体，其具有50～200nm的平均粒径，例如其具有75～150nm的平均粒径。

根据本发明第一方面的外泌体，其表达了膜蛋白CD9和膜蛋白CD81。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％，例如大于75％。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％，例如大于85％。

根据本发明第一方面的外泌体，所述脂肪间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(a)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脂肪样本；

(b)使脂肪样本离心，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，再次离心，移取脂肪组织，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；

(c)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(d)取步骤(c)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO₂培养箱中培养；所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并加入：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖；

(e)培养3d后培养基全换液一次，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞；

(f)使原代脂肪间充质干细胞以步骤(d)至步骤(e)的方式纯化培养和传代，得P1代细胞；以此类推，依次得到P2～P8代间充质干细胞。

上述制备脂肪间充质干细胞的过程中，步骤(b)中，两次离心均以100xg离心5min的条件进行操作；和/或，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；和/或，步骤(c)中，离心以100xg离心5min的条件进行操作；和/或，步骤(d)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1～5×10⁴/cm²接种至T75瓶；和/或，步骤(d)中，CO₂培养箱中培养的条件为：5％ CO₂，37℃，饱和湿度；和/或，步骤(e)中每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min；和/或，步骤(e)中以100xg离心10min；和/或，步骤(e)中每瓶加入10ml的D-hanks液稀释。

上述制备脂肪间充质干细胞的过程中，所述D-Hanks液的配方组成如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml。

上述制备脂肪间充质干细胞的过程中，所述DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL。

根据本发明第一方面的外泌体，其是使用脂肪间充质干细胞通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)将间充质干细胞接种至培养瓶中，添加MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度8～12ng/mL，继续培养；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培养基，再置于37℃、2％ O₂、5％CO₂培养箱中培养42～56小时；

(4)吸取细胞上清液置离心管中，进行如下离心处理：

以250～350g、4℃离心8～12分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以1500～2500g、4℃离心18～25分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以8000～12000g、4℃离心25～35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中；

以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清液，加无菌PBS使外泌体重悬，得到呈悬液形式的外泌体。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(1)中，间充质干细胞是P2～P8代的细胞，例如是P3～P7代的细胞。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(1)中，所述培养瓶中以(0.5～5)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞，例如以(0.5～2)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞。在一个实施方案中，步骤(1)使用T75培养瓶，每瓶接种(2～10)×10^5个细胞例如6×10^5个细胞，添加培养基10～20ml。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(1)中，培养20～30小时例如培养24小时使细胞贴壁。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(1)中，添加IL-1β后继续培养20～30小时例如培养24小时。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(3)中，在37℃、2％ O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(4)中，首先以250g、4℃离心12分钟，接着以2500g、4℃离心18分钟，接着以8000g、4℃离心35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以120000g、4℃离心75分钟。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(4)中，首先以350g、4℃离心8分钟，接着以1500g、4℃离心25分钟，接着以12000g、4℃离心25分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以80000g、4℃离心120分钟。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(4)中，首先以300g、4℃离心10分钟，接着以2000g、4℃离心20分钟，接着以10000g、4℃离心30分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以100000g、4℃离心90分钟。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(5)中，以100000g、4℃离心90分钟，或者以80000g、4℃离心120分钟，或者以120000g、4℃离心75分钟。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(5)中，所得的外泌体悬液置-80℃保存。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(5)中，以步骤(1)之1.2×10^6个细胞获得的外泌体用0.5～5ml无菌PBS重悬，例如用0.5～2ml无菌PBS重悬，例如用1ml无菌PBS重悬。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(1)中，在添加IL-1β的同时还向培养液中添加酒石酸钠、赖氨酸，二者的浓度分别为0.1～0.2mg/mL例如0.125～0.175mg/mL、2.0～2.5mg/mL，例如二者的浓度分别为0.15mg/mL、2.2mg/mL。

进一步的，本发明第二方面提供了一种使用脂肪间充质干细胞分离提取外泌体的方法，该方法包括如下步骤：

(1)将间充质干细胞接种至培养瓶中，添加MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度8～12ng/mL，继续培养；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培养基，再置于37℃、2％ O₂、5％CO₂培养箱中培养42～56小时；

(4)吸取细胞上清液置离心管中，进行如下离心处理：

以250～350g、4℃离心8～12分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以1500～2500g、4℃离心18～25分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以8000～12000g、4℃离心25～35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中；

以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清液，加无菌PBS使外泌体重悬，得到呈悬液形式的外泌体。

根据本发明第二方面的方法，步骤(1)中，间充质干细胞是P2～P8代的细胞，例如是P3～P7代的细胞。

根据本发明第二方面的方法，步骤(1)中，所述培养瓶中以(0.5～5)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞，例如以(0.5～2)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞。在一个实施方案中，步骤(1)使用T75培养瓶，每瓶接种(2～10)×10^5个细胞例如6×10^5个细胞，添加培养基10～20ml。

根据本发明第二方面的方法，步骤(1)中，培养20～30小时例如培养24小时使细胞贴壁。

根据本发明第二方面的方法，步骤(1)中，添加IL-1β后继续培养20～30小时例如培养24小时。

根据本发明第二方面的方法，步骤(3)中，在37℃、2％ O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

根据本发明第二方面的方法，步骤(4)中，首先以250g、4℃离心12分钟，接着以2500g、4℃离心18分钟，接着以8000g、4℃离心35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以120000g、4℃离心75分钟。

根据本发明第二方面的方法，步骤(4)中，首先以350g、4℃离心8分钟，接着以1500g、4℃离心25分钟，接着以12000g、4℃离心25分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以80000g、4℃离心120分钟。

根据本发明第二方面的方法，步骤(4)中，首先以300g、4℃离心10分钟，接着以2000g、4℃离心20分钟，接着以10000g、4℃离心30分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以100000g、4℃离心90分钟。

根据本发明第二方面的方法，步骤(5)中，以100000g、4℃离心90分钟，或者以80000g、4℃离心120分钟，或者以120000g、4℃离心75分钟。

根据本发明第二方面的方法，步骤(5)中，所得的外泌体悬液置-80℃保存。

根据本发明第二方面的方法，步骤(5)中，以步骤(1)之1.2×10^6个细胞获得的外泌体用0.5～5ml无菌PBS重悬，例如用0.5～2ml无菌PBS重悬，例如用1ml无菌PBS重悬。

根据本发明第二方面的方法，步骤(1)中，在添加IL-1β的同时还向培养液中添加酒石酸钠、赖氨酸，二者的浓度分别为0.1～0.2mg/mL例如0.125～0.175mg/mL、2.0～2.5mg/mL，例如二者的浓度分别为0.15mg/mL、2.2mg/mL。

根据本发明第二方面的方法，所得外泌体的平均粒径为50～200nm，例如平均粒径为75～150nm。

根据本发明第二方面的方法，所得外泌体表达了膜蛋白CD9和膜蛋白CD81。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％，例如大于75％。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％，例如大于85％。

根据本发明第二方面的方法，所述脂肪间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(a)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脂肪样本；

(b)使脂肪样本离心，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，再次离心，移取脂肪组织，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；

(c)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(d)取步骤(c)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO₂培养箱中培养；所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并加入：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖；

(e)培养3d后培养基全换液一次，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞；

(f)使原代脂肪间充质干细胞以步骤(d)至步骤(e)的方式纯化培养和传代，得P1代细胞；以此类推，依次得到P2～P8代间充质干细胞。

上述制备脂肪间充质干细胞的过程中，步骤(b)中，两次离心均以100xg离心5min的条件进行操作；和/或，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；和/或，步骤(c)中，离心以100xg离心5min的条件进行操作；和/或，步骤(d)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1～5×10⁴/cm²接种至T75瓶；和/或，步骤(d)中，CO₂培养箱中培养的条件为：5％ CO₂，37℃，饱和湿度；和/或，步骤(e)中每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min；和/或，步骤(e)中以100xg离心10min；和/或，步骤(e)中每瓶加入10ml的D-hanks液稀释。

上述制备脂肪间充质干细胞的过程中，所述D-Hanks液的配方组成如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml。

上述制备脂肪间充质干细胞的过程中，所述DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL。

进一步的，本发明第三方面提供了脂肪间充质干细胞分离提取的外泌体在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途，所述外泌体，其具有50～200nm的平均粒径，例如其具有75～150nm的平均粒径。

根据本发明第三方面的用途，所述外泌体表达了膜蛋白CD9和膜蛋白CD81。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％，例如大于75％。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％，例如大于85％。

根据本发明第三方面的用途，所述外泌体是使用脂肪间充质干细胞通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)将间充质干细胞接种至培养瓶中，添加MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度8～12ng/mL，继续培养；所述脂肪间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(a)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脂肪样本；

(b)使脂肪样本离心，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，再次离心，移取脂肪组织，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；

(c)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(d)取步骤(c)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO₂培养箱中培养；所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并加入：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖；

(e)培养3d后培养基全换液一次，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞；

(f)使原代脂肪间充质干细胞以步骤(d)至步骤(e)的方式纯化培养和传代，得P1代细胞；以此类推，依次得到P2～P8代间充质干细胞；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培养基，再置于37℃、2％ O₂、5％CO₂培养箱中培养42～56小时；

(4)吸取细胞上清液置离心管中，进行如下离心处理：

以250～350g、4℃离心8～12分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以1500～2500g、4℃离心18～25分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以8000～12000g、4℃离心25～35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中；

以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清液，加无菌PBS使外泌体重悬，得到呈悬液形式的外泌体。

上述制备脂肪间充质干细胞的过程中，步骤(b)中，两次离心均以100xg离心5min的条件进行操作；和/或，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；和/或，步骤(c)中，离心以100xg离心5min的条件进行操作；和/或，步骤(d)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1～5×10⁴/cm²接种至T75瓶；和/或，步骤(d)中，CO₂培养箱中培养的条件为：5％ CO₂，37℃，饱和湿度；和/或，步骤(e)中每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min；和/或，步骤(e)中以100xg离心10min；和/或，步骤(e)中每瓶加入10ml的D-hanks液稀释。

上述制备脂肪间充质干细胞的过程中，所述D-Hanks液的配方组成如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml。

上述制备脂肪间充质干细胞的过程中，所述DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL。

根据本发明第三方面的用途，以上制备脂肪间充质干细胞的方法中，所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。

根据本发明第三方面的用途，以上制备羊膜间充质干细胞的方法中，所述混合酶消化液中包含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶。

根据本发明第三方面的用途，以上制备羊膜间充质干细胞的方法步骤(e)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。

根据本发明第三方面的用途，步骤(1)中，间充质干细胞是P2～P8代的细胞，例如是P3～P7代的细胞。

根据本发明第三方面的用途，步骤(1)中，所述培养瓶中以(0.5～5)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞，例如以(0.5～2)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞。在一个实施方案中，步骤(1)使用T75培养瓶，每瓶接种(2～10)×10^5个细胞例如6×10^5个细胞，添加培养基10～20ml。

根据本发明第三方面的用途，步骤(1)中，培养20～30小时例如培养24小时使细胞贴壁。

根据本发明第三方面的用途，步骤(1)中，添加IL-1β后继续培养20～30小时例如培养24小时。

根据本发明第三方面的用途，步骤(3)中，在37℃、2％ O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

根据本发明第三方面的用途，步骤(4)中，首先以250g、4℃离心12分钟，接着以2500g、4℃离心18分钟，接着以8000g、4℃离心35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以120000g、4℃离心75分钟。

根据本发明第三方面的用途，步骤(4)中，首先以350g、4℃离心8分钟，接着以1500g、4℃离心25分钟，接着以12000g、4℃离心25分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以80000g、4℃离心120分钟。

根据本发明第三方面的用途，步骤(4)中，首先以300g、4℃离心10分钟，接着以2000g、4℃离心20分钟，接着以10000g、4℃离心30分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以100000g、4℃离心90分钟。

根据本发明第三方面的用途，步骤(5)中，以100000g、4℃离心90分钟，或者以80000g、4℃离心120分钟，或者以120000g、4℃离心75分钟。

根据本发明第三方面的用途，步骤(5)中，所得的外泌体悬液置-80℃保存。

根据本发明第三方面的用途，步骤(5)中，以步骤(1)之1.2×10^6个细胞获得的外泌体用0.5～5ml无菌PBS重悬，例如用0.5～2ml无菌PBS重悬，例如用1ml无菌PBS重悬。

根据本发明第三方面的用途，步骤(1)中，在添加IL-1β的同时还向培养液中添加酒石酸钠、赖氨酸，二者的浓度分别为0.1～0.2mg/mL例如0.125～0.175mg/mL、2.0～2.5mg/mL，例如二者的浓度分别为0.15mg/mL、2.2mg/mL。

进一步的，本发明第四方面提供了使用外泌体调控外周血单个核细胞(PBMC)分泌TNF-α水平的方法，该方法包括使所述外周血单个核细胞暴露于所述外泌体的操作；其中，所述外泌体，其具有50～200nm的平均粒径，例如其具有75～150nm的平均粒径，并且所述外泌体表达了膜蛋白CD9和膜蛋白CD81。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％，例如大于75％。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％，例如大于85％。

根据本发明第四方面的方法，所述外泌体是使用脂肪间充质干细胞通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)将间充质干细胞接种至培养瓶中，添加MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度8～12ng/mL，继续培养；所述脂肪间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(a)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脂肪样本；

(b)使脂肪样本离心，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，再次离心，移取脂肪组织，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；

(c)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(d)取步骤(c)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO₂培养箱中培养；所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并加入：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖；

(e)培养3d后培养基全换液一次，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞；

(f)使原代脂肪间充质干细胞以步骤(d)至步骤(e)的方式纯化培养和传代，得P1代细胞；以此类推，依次得到P2～P8代间充质干细胞；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培养基，再置于37℃、2％ O₂、5％CO₂培养箱中培养42～56小时；

(4)吸取细胞上清液置离心管中，进行如下离心处理：

以250～350g、4℃离心8～12分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以1500～2500g、4℃离心18～25分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以8000～12000g、4℃离心25～35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中；

以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清液，加无菌PBS使外泌体重悬，得到呈悬液形式的外泌体。

根据本发明第四方面的方法，以上制备羊膜间充质干细胞的方法中，所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。

根据本发明第四方面的方法，以上制备羊膜间充质干细胞的方法中，所述混合酶消化液中包含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶。

根据本发明第四方面的方法，以上制备羊膜间充质干细胞的方法步骤(e)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。

根据本发明第四方面的方法，步骤(1)中，间充质干细胞是P2～P8代的细胞，例如是P3～P7代的细胞。

根据本发明第四方面的方法，步骤(1)中，所述培养瓶中以(0.5～5)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞，例如以(0.5～2)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞。在一个实施方案中，步骤(1)使用T75培养瓶，每瓶接种(2～10)×10^5个细胞例如6×10^5个细胞，添加培养基10～20ml。

根据本发明第四方面的方法，步骤(1)中，培养20～30小时例如培养24小时使细胞贴壁。

根据本发明第四方面的方法，步骤(1)中，添加IL-1β后继续培养20～30小时例如培养24小时。

根据本发明第四方面的方法，步骤(3)中，在37℃、2％ O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

根据本发明第四方面的方法，步骤(4)中，首先以250g、4℃离心12分钟，接着以2500g、4℃离心18分钟，接着以8000g、4℃离心35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以120000g、4℃离心75分钟。

根据本发明第四方面的方法，步骤(4)中，首先以350g、4℃离心8分钟，接着以1500g、4℃离心25分钟，接着以12000g、4℃离心25分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以80000g、4℃离心120分钟。

根据本发明第四方面的方法，步骤(4)中，首先以300g、4℃离心10分钟，接着以2000g、4℃离心20分钟，接着以10000g、4℃离心30分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以100000g、4℃离心90分钟。

根据本发明第四方面的方法，步骤(5)中，以100000g、4℃离心90分钟，或者以80000g、4℃离心120分钟，或者以120000g、4℃离心75分钟。

根据本发明第四方面的方法，步骤(5)中，所得的外泌体悬液置-80℃保存。

根据本发明第四方面的方法，步骤(5)中，以步骤(1)之1.2×10^6个细胞获得的外泌体用0.5～5ml无菌PBS重悬，例如用0.5～2ml无菌PBS重悬，例如用1ml无菌PBS重悬。

根据本发明第四方面的方法，步骤(1)中，在添加IL-1β的同时还向培养液中添加酒石酸钠、赖氨酸，二者的浓度分别为0.1～0.2mg/mL例如0.125～0.175mg/mL、2.0～2.5mg/mL，例如二者的浓度分别为0.15mg/mL、2.2mg/mL。

在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

尽管MSC来源的外泌体具有促进血管生成、促进细胞增殖、生长、迁移等诸多优势，但是目前绝大多数采用常规方法培养的MSC来源的外泌体在介导炎症调控方面的作用却并不明显。基于此，本发明设计了一种低氧分压联合炎症因子刺激方式诱导MSC培养并分离纯化其分泌的外泌体，在体外显示出良好的炎症调控作用，为外泌体治疗炎症性疾病提供了新的方案。

附图说明

图1显示了实施例2所得脂肪间充质干细胞外泌体电镜图。

图2显示了实施例3所得脂肪间充质干细胞外泌体电镜图。

图3显示了实施例3外泌体的粒度分布散点图。

图4显示了实施例3外泌体的粒度分布曲线。

图5显示了实施例3所得外泌体膜蛋白CD9表达量。

图6显示了实施例3所得外泌体膜蛋白CD81表达量。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。

如无另外说明，本发明使用的一些试剂试药是本领域常规的或者可以容易从市售途径购得的。例如无血清培养基(Gibco)购自ThermoFisher Scientific；人血小板裂解物购自Precicion BioMedicals公司；磷酸盐缓冲液(pH6.8，PBS)制法为：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，121℃灭菌15min，即得；组织清洗液(PRS-TCR-1)购自普瑞昇。本文所述MSC完全培养基是含2％人血小板裂解物的无血清培养基。

实施例1：脂肪间充质干细胞原代及传代培养

通过脂肪获得原代和传代的间充质干细胞的方法已在诸多文献报道，本发明制备外泌体所用的间充质干细胞可以使用这些文献方法获得，并且虽然本发明技术的关键核心并不在于，示例性的，本发明仍然愿意在此描述一种制备间充质干细胞的方法。

本实施例参考本申请发明团队的中国专利号ZL2020113812050(实施例1a)中所记载的方法来制备脂肪间充质干细胞，所用的材料及来源亦均参考该专利文献，该文献的全部内容并入本文作为参考。

(a)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脂肪(样本M)；

(b)100xg离心5min，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，100xg离心5min，移取脂肪组织，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；

(c)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(d)取细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％ CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(e)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)；

(f)使P0代细胞以步骤(d)至步骤(e)的方式纯化培养和传代，得P1代细胞；以此类推，依次得到P2～P8代间充质干细胞。

本实施例1试验中用到的D-Hanks液其配方组成和制法如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。

本实施例1试验中用到的原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖。

本实施例1试验中用到的DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。

如ZL2020113812050所述，上述方法所得人脂肪间充质干细胞的细胞形态、细胞表型、分化潜能等方面呈现优良性能，例如具有优良的诱导分化成骨、成软骨、成脂等性能。

实施例2：使用IL-1β处理间充质干细胞并用差速离心法分离纯化外泌体

(1)将实施例1所得间充质干细胞(P5代)按照6×10^5个细胞接种至T75培养瓶中，每瓶添加15mL的MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养(24小时)使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度10ng/mL，继续培养24小时；[本领域技术人员理解，可以改用其它规格的培养瓶例如T25、T75瓶，根据培养面积不同可以改变细胞接种数量和/或培养基添加量，例如在MSC培养时以上述浓度并添加约15ml培养基是本领域的常规操作]

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗3次，然后向每瓶中添加MSC完全培养基15mL，再置于37℃、2％O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

[上述2％ O₂、5％ CO₂培养箱中的气氛是指氮气平衡的气氛，而前述5％ CO₂培养箱中的气氛是指21％氧和余量氮气平衡的气氛，此类表述方式的含义是本领域技术人员一般都公认的含义]

(4)吸取细胞上清液(30ml，来自2个培养瓶中的上清液量)置(50ml)离心管中，进行如下离心处理：

以300g、4℃离心10分钟(去除死细胞及较大的细胞碎片)，吸取上清液至另一(50ml)离心管中；

以2000g、4℃离心20分钟(进一步去除细胞碎片等杂质)，吸取上清液至另一(高速)离心管中；

以10000g、4℃离心30分钟(进一步去除较小的细胞碎片及杂质)，上清液用0.22μm滤膜(PES滤膜，millipore)过滤后置于另一(超速)离心管中；

以100000g、4℃离心90分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加20ml无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以100000g、4℃离心90分钟，弃上清液，加1mL无菌PBS使外泌体重悬，得到外泌体悬液1ml，其可置于-80℃保存和/或分装用于性能测定。

上述步骤中所用不同离心力要求的离心管和离心机均购自Beckman Coulter。

实施例2a：使用IL-1β处理间充质干细胞并用差速离心法分离纯化外泌体

(1)将实施例1所得间充质干细胞(P3代)按照6×10^5个细胞接种至T75培养瓶中，每瓶添加17mL的MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养(20小时)使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度8ng/mL，继续培养24小时；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗3次，然后向每瓶中添加MSC完全培养基15mL，再置于37℃、2％O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

(4)吸取细胞上清液(30ml，来自2个培养瓶中的上清液量)置(50ml)离心管中，进行如下离心处理：

以250g、4℃离心12分钟(去除死细胞及较大的细胞碎片)，吸取上清液至另一(50ml)离心管中；

以2500g、4℃离心18分钟(进一步去除细胞碎片等杂质)，吸取上清液至另一(高速)离心管中；

以8000g、4℃离心35分钟(进一步去除较小的细胞碎片及杂质)，上清液用0.22μm滤膜(PES滤膜，millipore)过滤后置于另一(超速)离心管中；

以120000g、4℃离心75分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加15ml无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000g、4℃离心120分钟，弃上清液，加1mL无菌PBS使外泌体重悬，得到外泌体悬液1ml，其可置于-80℃保存和/或分装用于性能测定。

实施例2b：使用IL-1β处理间充质干细胞并用差速离心法分离纯化外泌体

(1)将实施例1所得间充质干细胞(P7代)按照6×10^5个细胞接种至T75培养瓶中，每瓶添加13mL的MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养(30小时)使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度12ng/mL，继续培养24小时；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗3次，然后向每瓶中添加MSC完全培养基15mL，再置于37℃、2％O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

(4)吸取细胞上清液(30ml，来自2个培养瓶中的上清液量)置(50ml)离心管中，进行如下离心处理：

以350g、4℃离心8分钟(去除死细胞及较大的细胞碎片)，吸取上清液至另一(50ml)离心管中；

以1500g、4℃离心25分钟(进一步去除细胞碎片等杂质)，吸取上清液至另一(高速)离心管中；

以12000g、4℃离心25分钟(进一步去除较小的细胞碎片及杂质)，上清液用0.22μm滤膜(PES滤膜，millipore)过滤后置于另一(超速)离心管中；

以80000g、4℃离心120分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加25ml无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以120000g、4℃离心75分钟，弃上清液，加1mL无菌PBS使外泌体重悬，得到外泌体悬液1ml，其可置于-80℃保存和/或分装用于性能测定。

实施例3：使用IL-1β处理间充质干细胞并用差速离心法分离纯化外泌体

(1)将实施例1所得间充质干细胞(P5代)按照6×10^5个细胞接种至T75培养瓶中，每瓶添加15mL的MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养(24小时)使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β、酒石酸钠、赖氨酸分别至浓度10ng/mL、0.15mg/mL、2.2mg/mL，继续培养24小时；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗3次，然后向每瓶中添加MSC完全培养基15mL，再置于37℃、2％O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

[上述2％ O₂、5％ CO₂培养箱中的气氛是指氮气平衡的气氛，而前述5％ CO₂培养箱中的气氛是指21％氧和余量氮气平衡的气氛，此类表述方式的含义是本领域技术人员一般都公认的含义]

(4)吸取细胞上清液(30ml，来自2个培养瓶中的上清液量)置(50ml)离心管中，进行如下离心处理：

以300g、4℃离心10分钟(去除死细胞及较大的细胞碎片)，吸取上清液至另一(50ml)离心管中；

以2000g、4℃离心20分钟(进一步去除细胞碎片等杂质)，吸取上清液至另一(高速)离心管中；

以10000g、4℃离心30分钟(进一步去除较小的细胞碎片及杂质)，上清液用0.22μm滤膜(PES滤膜，millipore)过滤后置于另一(超速)离心管中；

以100000g、4℃离心90分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加20ml无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以100000g、4℃离心90分钟，弃上清液，加1mL无菌PBS使外泌体重悬，得到外泌体悬液1ml，其可置于-80℃保存和/或分装用于性能测定。

实施例3a：使用IL-1β处理间充质干细胞并用差速离心法分离纯化外泌体

(1)将实施例1所得间充质干细胞(P3代)按照6×10^5个细胞接种至T75培养瓶中，每瓶添加17mL的MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养(20小时)使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β、酒石酸钠、盐酸赖氨酸分别至浓度8ng/mL、0.175mg/mL、2mg/mL，继续培养24小时；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗3次，然后向每瓶中添加MSC完全培养基15mL，再置于37℃、2％O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

(4)吸取细胞上清液(30ml，来自2个培养瓶中的上清液量)置(50ml)离心管中，进行如下离心处理：

以250g、4℃离心12分钟(去除死细胞及较大的细胞碎片)，吸取上清液至另一(50ml)离心管中；

以2500g、4℃离心18分钟(进一步去除细胞碎片等杂质)，吸取上清液至另一(高速)离心管中；

以8000g、4℃离心35分钟(进一步去除较小的细胞碎片及杂质)，上清液用0.22μm滤膜(PES滤膜，millipore)过滤后置于另一(超速)离心管中；

以120000g、4℃离心75分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加15ml无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000g、4℃离心120分钟，弃上清液，加1mL无菌PBS使外泌体重悬，得到外泌体悬液1ml，其可置于-80℃保存和/或分装用于性能测定。

实施例3b：使用IL-1β处理间充质干细胞并用差速离心法分离纯化外泌体

(1)将实施例1所得间充质干细胞(P7代)按照6×10^5个细胞接种至T75培养瓶中，每瓶添加13mL的MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养(30小时)使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β、酒石酸钠、盐酸赖氨酸分别至浓度12ng/mL、0.125mg/mL、2.5mg/mL，继续培养24小时；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗3次，然后向每瓶中添加MSC完全培养基15mL，再置于37℃、2％O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

(4)吸取细胞上清液(30ml，来自2个培养瓶中的上清液量)置(50ml)离心管中，进行如下离心处理：

以350g、4℃离心8分钟(去除死细胞及较大的细胞碎片)，吸取上清液至另一(50ml)离心管中；

以1500g、4℃离心25分钟(进一步去除细胞碎片等杂质)，吸取上清液至另一(高速)离心管中；

以12000g、4℃离心25分钟(进一步去除较小的细胞碎片及杂质)，上清液用0.22μm滤膜(PES滤膜，millipore)过滤后置于另一(超速)离心管中；

以80000g、4℃离心120分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加25ml无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以120000g、4℃离心75分钟，弃上清液，加1mL无菌PBS使外泌体重悬，得到外泌体悬液1ml，其可置于-80℃保存和/或分装用于性能测定。

实施例3c：分别参照实施例3、实施例3a和实施例3b，不同的仅是步骤(1)不添加酒石酸钠，得到三批外泌体，可分别记为实施例3c1、实施例3c2、实施例3c3。

实施例3d：分别参照实施例3、实施例3a和实施例3b，不同的仅是步骤(1)不添加盐酸赖氨酸，得到三批外泌体，可分别记为实施例3d1、实施例3d2、实施例3d3。

实施例4：外泌体颗粒的透射电镜观察

1、取分离纯化后的外泌体沉淀50μl，向其中加入等体积的2.5％戊二醛，置于4℃冰箱中固定1hr；

2、将固定后的外泌体悬液20μl，滴加到铜网的正面，静止20min；

3、用吸水滤纸小心的吸去多余的溶液；然后用超纯水清洗铜网5次，每次30秒中，用滤纸吸干；

4、向铜网正面滴加1滴2％醋酸双氧铀染色液，染色1min，然后用滤纸延铜网边缘吸干多余的染液；

5、将铜网放置在室温空气中自然干燥，待晾干后上机进行观察，同时计算并统计外泌体的粒径和分布。

使用以上方法对本发明各实施例所得外泌体(悬液)进行检测。计算由1.2×10^6个细胞(2个培养瓶)得到的各实施例外泌体数量，结果为：实施例2、实施例2a和实施例2b的外泌体颗粒数分别为9.4×10^9粒、8.7×10^9粒和11.4×10^9粒，实施例3、实施例3a和实施例3b的外泌体颗粒数分别为124.3×10^9粒、133.2×10^9粒和109.8×10^9粒，实施例3c1、实施例3c2和实施例3c3的外泌体颗粒数分别为12.2×10^9粒、9.7×10^9粒和10.3×10^9粒，实施例3d1、实施例3d2和实施例3d3的外泌体颗粒数分别为9.2×10^9粒、9.8×10^9粒和11.6×10^9粒。以实施例2的外泌体为例，初始的MSC细胞量为1.2×10^6细胞，得到的外泌体体积为1ml，测得其中外泌体浓度为9.4×10^9粒/mL，相当于由1.2×10^6细胞得到9.4×10^9粒外泌体。以上“9.4×10^9粒外泌体”表示9.4乘以10的9次方外泌体，其它类似表述有类似含义。

图1和图2分别显示了实施例2和实施例3所得脂肪间充质干细胞外泌体电镜图。经测定，上述实施例2、实施例2a和实施例2b，实施例3、实施例3a和实施例3b，实施例3c、实施例3d所得全部的外泌体的平均粒径均在102～144nm范围内，例如实施例3外泌体的峰值粒径113.7±4.4nm，平均粒径131.7±1.6nm。图3显示了实施例3外泌体的粒度分布散点图，图4显示了实施例3外泌体的粒度分布曲线。

实施例5：流式细胞仪检测外泌体颗粒表面蛋白表达

1、将Thermofisher CD63磁珠(货号10606D)成分颠倒混匀10min；吸取20μl磁珠悬液至1.5mL圆底EP管中；

2、向EP管中添加200μl磁珠清洗液，用枪头充分混匀；

3、将EP放置在磁力架上1min；然后吸弃上清液；

4、取提取后的血浆外泌体悬液50μl，添加50μl清洗液至终体积为100μl，充分混匀；

5、将外泌体-清洗液混合液置于旋转混匀器上，设定转速为10rpm，置于2～8℃旋转孵育过夜；

6、隔天将样本进行3～5秒快速离心收集沉淀；

7、向样本中添加300μl清洗液，用枪头充分混匀30秒；

8、将样本置于磁力架上约1min，吸弃上清液；

9、向样本中添加400μl清洗液，用枪头充分混匀30秒；

10、将样本置于磁力架上约1min，吸弃上清液，用300μl清洗液重悬；

11、各取100μl样本，向样本中分别添加CD9-PE、CD81-FITC流式抗体，置于4℃避光孵育30min，

12、将孵育后的样本置于磁力架上约1min，吸弃上清液，添加300μl清洗液洗涤；

13、重复步骤12一次后，用300μl PB重悬选样本后上机检测。

图5显示了实施例3所得外泌体膜蛋白CD9表达量，图6显示了实施例3所得外泌体膜蛋白CD81表达量，CD9的阳性表达率为78.3％，CD81的阳性表达率为95.4％。其它实例所得外泌体的膜蛋白CD9和CD81表达量与图5和图6无明显差异。

实施例6：外泌体蛋白含量检测

本实施例使用PierceTM蛋白定量试剂盒(货号：23225，Thermo Scientific)进行测试。

1、取5mg/mL的BCA(2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠)标准品10μl，用PBS稀释至终浓度为0.5mg/mL，作为BCA标准品溶液，将该标准品溶液按0、2、4、6、8、12、16、20μL加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足至20μL；

2、将外泌体样品作适当稀释，加20μL到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量样品时误差偏大，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品浓度点落在标准线1/2后。

3、各孔加入200μL的BCA工作液，37℃放置15-30分钟。用酶标仪测定A562nm的OD值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

标准曲线为y＝0.9999x-0.0488，其中x是OD值，y是单位为mg/ml的外泌体蛋白浓度。

使用以上方法对本发明各实施例所得外泌体(悬液)进行检测。计算由1.2×10^6个细胞得到的各实施例外泌体蛋白含量，结果为：实施例2、实施例2a和实施例2b的蛋白含量分别为66.4μg、56.2μg和71.7μg，实施例3、实施例3a和实施例3b的蛋白含量分别为276.8μg、303.7μg和297.4μg，实施例3c和实施例3d的6个外泌体样本的蛋白含量在61～74μg范围内。

实施例7：Elisa检测外泌体对PBMC细胞分泌TNF-α水平的免疫调控实验

肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)是一种促炎细胞因子，参与正常炎症反应和免疫反应，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，并在体内以跨膜型(tmTNF)和分泌型(sTNF)两种形式发挥作用，tmTNF以膜蛋白的形式分布于分泌TNF-α的细胞上，经过TACE(TNF-α-converting enzyme)酶活化切割后产生sTNF。TNFα受体分为2种(TNFRⅠ和TNFRⅡ)，存在于多种细胞表面，TNFα与TNFR的结合通常会引起细胞凋亡、炎症和肿瘤的发生等。

本发明方法中的间充质干细胞分泌的外泌体可以抑制淋巴细胞释放TNF-α，本实验中间充质干细胞提取纯化的外泌体和PBMC按照一定的比例共培养，然后采用ELISA的方法检测细胞上清中的TNF-α表达水平，通过分析TNF-α表达水平的变化检测外泌体对淋巴细胞释放TNF-α的抑制能力。

1、采用Ficoll法从健康成人外周血中分离单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)，用免疫细胞无血清培养基(Miltenyi，含2.5％血清替代物)重悬PBMC，将PBMC的密度调整成4×10^5/ml，然后向每ml PBMC悬液中加入50μl CD3/CD28磁珠(Thermofisher)；混匀PBMC和磁珠后，将0.5ml PBMC加入到24孔板的孔中，并向该孔内添加50μl含有1×10^7个外泌体的悬液。设置试验组孔(已用磁珠激活且添加外泌体的PBMC)、对照组孔(已用磁珠激活且不添加外泌体的PBMC)、阴性组孔(未用磁珠激活的PBMC)、空白组孔(只含有免疫细胞无血清培养基)；

2、共培养5天后，收集共培养基的上清；然后用2000rpm的速度离心5分钟；收集上清液；

3、将检测TNF-α的ELISA试剂盒(R&D Systems)和试剂从冰箱取出，室温下放置(使用前平衡至室温)，取下微孔板条放在微孔板条支架里面，将剩余的微孔板条放回箔纸袋里面，封口，并放回冰箱；

4、取出一支TNF-α标准品，加入0.95ml去离子水，用吸头轻轻吹打几下，使PGE2溶解，制备成浓度是10000pg/ml的标准品原液；将溶解后的PGE2标准品放在室温下分钟，每4-5分钟用手晃动TNF-α标准品2-3次；然后取7个1.5ml EP管，用Calibrator Diluent RD6-12将TNF-α标准品稀释成不同的浓度梯度：1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml和15.6pg/ml；

5、释样本：对于每个检测样本，取待检测样本适量用Calibrator Diluent RD6-12稀释至外泌体蛋白浓度5μg/ml；

6、加样并孵育：分别将50μl的Assay Diluent RD1F加到微孔板的每个孔里面；将50μl培养基加到微孔板里面，重复3个孔，作为对照组；将50μl不同浓度的标准品溶液加到微孔板里面，分别重复3个孔；将50μl稀释后的样本加到微孔板里面，分别重复3个孔；小心盖上微孔板贴膜，使用450rpm的转速在室温下震荡2个小时；

7、小心撕去贴膜，倒掉微孔板里面的液体，将微孔板倒扣在吸水纸上拍打几次；向每个孔里面加入300μl 1×Wash Buffer，然后倒掉1×Wash Buffer，将微孔板倒扣在吸水纸上拍打几次；重复3次；

8、向每个孔里面加入200μl TNF-αConjugate，小心盖上一个新的贴膜，在室温下孵育2小时；

9、小心撕去贴膜，倒掉微孔板里面的液体，将微孔板倒扣在吸水纸上拍打几次；向每个孔里面加入300μl 1×Wash Buffer，然后倒掉1×Wash Buffer，将微孔板倒扣在吸水纸上拍打几次；重复3次；

10、向每个孔里面加入200μl Substrate Solution，在室温避光的条件下放置30分钟；再向每个孔里面加入50μl Stop Solution；

11、读取OD值：把微孔板放入酶标仪(Thermofisher，Multiscan)中，然后设置酶标仪程序,在波长为450nm处检测吸光度，并进行数据分析；

12、结果减去培养基空白组的OD值的平均值后利用Origin软件，以标准曲线各点的理论浓度为X轴，以吸光值为Y轴，两边同时进行对数转换，四参数法进行拟合，绘制标准曲线，输入样本的吸光值，计算出样本的TNF-α浓度值。

使用上述方法测定外泌体抑制PBMC分泌TNF-α水平，结果：

阴性组TNF-α水平为802.2pg/ml，

对照组TNF-α水平为5203.7pg/ml，

实施例2、实施例2a、实施例2b试验组的TNF-α水平为1044～1307pg/ml例如实施例2试验组的TNF-α水平为1143.2pg/ml，

实施例3、实施例3a、实施例3b试验组的TNF-α水平为1103～1367pg/ml例如实施例3试验组的TNF-α水平为1241.4pg/ml，

实施例3c和实施例3d试验组的TNF-α水平在1173～1407pg/ml范围内。

实施例8：RT-PCR分析外泌体对PBMC的TNF-α基因表达水平的抑制作用

1、PBMC总RNA的提取：将实施例7，步骤2中共培养5天后的各组(实验组、对照组、阴性组)PBMC细胞1ml从24孔板中吸出，置于1.5ml的EP管中，300g，离心5分钟后吸弃上清液，沉淀加入1ml的Trizol试剂(Life公司)，室温放置5分钟，充分裂解；

2、将EP管放入高速离心机，4℃，12000rpm，离心5分钟后，弃沉淀；

3、加入200μl氯仿，振荡混匀后室温放置15分钟；

4、将EP管放入高速离心机，12000rpm，离心15分钟；

5、吸取上层水相至另一离心管中；添加0.5ml异丙醇溶液，混匀，室温放置10分钟；

6、将EP管放入高速离心机，4℃，12000rpm，离心10分钟后，弃上清，RNA沉淀于管底；

7、添加1mL的75％乙醇溶液，温和震荡离心管悬浮沉淀；

8、将EP管放入高速离心机，4℃，8000rpm，离心5分钟后，弃上清液；室温晾干5～10分钟，用20μl无菌去离子水重悬RNA；

9、用nanodrop仪器检测RNA浓度；

10、反转录cDNA：按照Bestar qPCR kit试剂盒(货号：DBI-2220)操作说明书进行RNA反转录为cDNA；

11、qPCR检测TNF-α基因表达水平：按照Bestar qPCR(SyberGreen)kit(货号：DBI-2043)试剂盒操作说明书进行实时荧光定量PCR检测TNF-α基因表达水平。

实时荧光定量PCR检测TNF-α基因表达水平以相对mRNA水平(倍)表征，阴性组的相对mRNA水平为1，计算其余各组的相对mRNA水平，结果：

对照组的相对mRNA水平为114.6倍，

实施例2、实施例2a、实施例2b试验组的相对mRNA水平为55～67倍例如实施例2试验组的相对mRNA水平为63.1倍，

实施例3、实施例3a、实施例3b试验组的相对mRNA水平为61～70倍例如实施例3试验组的相对mRNA水平为68.4倍，

实施例3c和实施例3d试验组的相对mRNA水平为64～72倍。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (10)

1.使用脂肪间充质干细胞分离提取的外泌体，其具有50～200nm的平均粒径，膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％，膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％；该外泌体是使用脂肪间充质干细胞通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)将脂肪间充质干细胞接种至培养瓶中，添加MSC完全培养基，置37℃、5％CO₂培养箱中培养使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度8～12ng/mL，继续培养；脂肪间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(a)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脂肪样本；

(b)使脂肪样本离心，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，再次离心，移取脂肪组织，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；

(c)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(d)取步骤(c)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO₂培养箱中培养；所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并加入：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖；

(e)培养3d后培养基全换液一次，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞；

(f)使原代脂肪间充质干细胞以步骤(d)至步骤(e)的方式纯化培养和传代，得P1代细胞；以此类推，依次得到P2～P8代间充质干细胞；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培养基，再置于37℃、2％O₂、5％CO₂培养箱中培养42～56小时；

(4)吸取细胞上清液置离心管中，进行如下离心处理：

以250～350g、4℃离心8～12分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以1500～2500g、4℃离心18～25分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以8000～12000g、4℃离心25～35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中；

以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清液，加无菌PBS使外泌体重悬，得到呈悬液形式的外泌体。

2.根据权利要求1的外泌体，其中，

步骤(b)中，两次离心均以100xg离心5min的条件进行操作；和/或，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；

步骤(c)中，离心以100xg离心5min的条件进行操作；

步骤(d)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1～5×10⁴/cm²接种至T75瓶；和/或，步骤(d)中，CO₂培养箱中培养的条件为：5％CO₂，37℃，饱和湿度；和/或，

步骤(e)中每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min；和/或，步骤(e)中以100xg离心10min；和/或，步骤(e)中每瓶加入10ml的D-hanks液稀释。

3.根据权利要求1的外泌体，其中，

所述D-Hanks液的配方组成如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml；和/或，

所述DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL。

4.根据权利要求1的外泌体，其中，

步骤(1)中，间充质干细胞是P2～P8代的细胞，例如是P3～P7代的细胞；

步骤(1)中，所述培养瓶中以(0.5～5)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞，例如以(0.5～2)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞；

步骤(1)使用T75培养瓶，每瓶接种(2～10)×10^5个细胞例如6×10^5个细胞，添加培养基10～20ml；

步骤(1)中，培养20～30小时例如培养24小时使细胞贴壁；

步骤(1)中，添加IL-1β后继续培养20～30小时例如培养24小时；

步骤(3)中，在37℃、2％O₂、5％CO₂培养箱中培养48小时；

步骤(4)中，首先以250g、4℃离心12分钟，接着以2500g、4℃离心18分钟，接着以8000g、4℃离心35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以120000g、4℃离心75分钟；

步骤(4)中，首先以350g、4℃离心8分钟，接着以1500g、4℃离心25分钟，接着以12000g、4℃离心25分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以80000g、4℃离心120分钟；

步骤(4)中，首先以300g、4℃离心10分钟，接着以2000g、4℃离心20分钟，接着以10000g、4℃离心30分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以100000g、4℃离心90分钟；

步骤(5)中，以100000g、4℃离心90分钟，或者以80000g、4℃离心120分钟，或者以120000g、4℃离心75分钟；

步骤(5)中，所得的外泌体悬液置-80℃保存；和/或，

步骤(5)中，以步骤(1)之1.2×10^6个细胞获得的外泌体用0.5～5ml无菌PBS重悬，例如用0.5～2ml无菌PBS重悬，例如用1ml无菌PBS重悬。

5.根据权利要求1的外泌体，其中，步骤(1)中，在添加IL-1β的同时还向培养液中添加酒石酸钠、赖氨酸，二者的浓度分别为0.1～0.2mg/mL例如0.125～0.175mg/mL、2.0～2.5mg/mL，例如二者的浓度分别为0.15mg/mL、2.2mg/mL。

6.使用脂肪间充质干细胞分离提取外泌体的方法，该方法包括如下步骤：

(1)将间充质干细胞接种至培养瓶中，添加MSC完全培养基，置37℃、5％CO₂培养箱中培养使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度8～12ng/mL，继续培养；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培养基，再置于37℃、2％O₂、5％CO₂培养箱中培养42～56小时；

(4)吸取细胞上清液置离心管中，进行如下离心处理：

以250～350g、4℃离心8～12分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以1500～2500g、4℃离心18～25分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以8000～12000g、4℃离心25～35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中；

以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清液，加无菌PBS使外泌体重悬，得到呈悬液形式的外泌体，

其中，所述脂肪间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(a)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脂肪样本；

(b)使脂肪样本离心，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，再次离心，移取脂肪组织，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；

(c)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(d)取步骤(c)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO₂培养箱中培养；所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并加入：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖；

(e)培养3d后培养基全换液一次，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞；

(f)使原代脂肪间充质干细胞以步骤(d)至步骤(e)的方式纯化培养和传代，得P1代细胞；以此类推，依次得到P2～P8代间充质干细胞。

7.根据权利要求6的方法，步骤(1)中，间充质干细胞是P2～P8代的细胞，例如是P3～P7代的细胞。

8.根据权利要求6的方法，其如权利要求1～5任一项所述。

9.脂肪间充质干细胞分离提取的外泌体在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途，所述外泌体如权利要求1～5任一项所述。

10.使用外泌体调控外周血单个核细胞(PBMC)分泌TNF-α水平的方法，该方法包括使所述外周血单个核细胞暴露于所述外泌体的操作；所述外泌体如权利要求1～5任一项所述。

Images