CN112522193B - 无血清培养基在分离和传代脂肪间充质干细胞中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及无血清培养基在分离和传代脂肪间充质干细胞中的用途。具体涉及分离和传代培养脂肪间充质干细胞的方法，其包括(a)分离培养原代脂肪间充质干细胞和(b)传代培养脂肪间充质干细胞两个阶段，(b)阶段是将原代间充质干细胞接种，补充传代完全培养基培养，用D‑hanks液清洗，加重组胰酶溶液消化，得到P1代间充质干细胞；接着将P1代间充质干细胞接种参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞，继续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。本发明使用无血清培养基分离培养和传代培养脂肪间充质干细胞的方法呈现优异的技术效果，例如细胞收率高、细胞活率高。

Description

无血清培养基在分离和传代脂肪间充质干细胞中的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种从脂肪中分离和传代脂肪间充质干细胞的方法。本发明还涉及上述脂肪间充质干细胞培养中所用的培养基及相关试液，还涉及无血清培养基在分离和传代脂肪间充质干细胞中的用途。使用本发明方法分离培养和传代培养所述脂肪间充质干细胞时，能够呈现本发明所述优异技术效果。特别是，本发明涉及使用无血清的培养基从脂肪中分离传代培养间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(Caplan AI.Mesenchymal stem cells.JOrthop Res.1991,9:641-650.Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells.Science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。

干细胞是人体细胞的祖先，我们体内的所有细胞均来自于干细胞。当体内的细胞衰老死亡或者损伤变性时，干细胞就会生长和转变出可以替代它们的细胞。作为种子细胞，临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。人间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4～7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病(GVHD)、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。

间充质干细胞的分离培养以及传代培养工艺是关系到干细胞作为治疗药物使用安全性的关键步骤。培养工艺中尤其是培养基的成分是主要的影响参数。在已有的文献记载的方法中，对间充质干细胞进行分离培养和传代培养时，所用的培养基多需要添加血清，例如胎牛血清，特别是通常需要添加10％胎牛血清，例如通常采用MSC完全培养基(其为包含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基)对间充质干细胞进行分离和培养传代。

然而，一方面，胎牛血清的成本相当高，这对于间充质干细胞的培养是不利的；另一方面，胎牛血清作为一种动物来源的外源性物质，其存在于干细胞中会对细胞的临床使用的安全性产生潜在风险。因此，无血清的分离和传代培养间充质干细胞是有意义的。

此外，人们已经从脂肪组织分离出一类具有多向分化潜能的干细胞，并在体外培养特殊体系中成功地分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞与肌细胞等，这种可分化的干细胞被认可为脂肪来源的间充质细胞，即脂肪干细胞或脂肪间充质干细胞(adipose-derivedstem cells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，脂肪干细胞具有分化多胚层全能性特征，其中包括中胚层，内胚层和外胚层分化细胞的能力，能分泌许多潜在的有利的生长因子和细胞活素以细胞为基础的促进创面愈合的治疗方法快速发展。脂肪源性干细胞是一群多功能间充质干细胞，可以分化为其他的细胞系在脂肪组织的非脂肪(间质)碎片中存在大量的脂肪源性细胞，且易于分离获取。

作为各种组织缺损的辅助治疗方法，脂肪源性干细胞被推荐应用。在创面愈合过程中，血管再生是一个重要的步骤新生血管的形成是支持肉芽组织形成和角化细胞存活扩增愈合创伤的的必要条件。因此认为，脂肪源性干细胞是通过快速促血管再生从而促进创面的愈合。另外，脂肪源性干细胞还显示出通过细胞分化以及分泌促进胶原合成和真皮成纤维细胞迁移的长因子来促进创面的愈合。

人们已将脂肪源性干细胞与细胞外基质支架成分联合应用于动物的皮肤软组织创面，发现脂肪源性干细胞以促进支架的血管化能力。有研究结果显示，脂肪源性细胞对创面愈合的促进作用与脂肪源性干细胞促进上皮化和肉芽组织的形成有关，并且脂肪源性干细胞有潜在的表皮细胞分化能力研究结果还提示脂肪源性干细胞的远位分化能力是多功能脂肪干细胞对创面的微环境的一个反应。脂肪源性干细胞对局部血管的重塑包括直接分化为血管内皮细胞和分泌血管生长因子，后两者则有益于血管的再生。即是说，脂肪源性干细胞通过细胞分化和血管再生促进创面的愈合。另外，人们将脂肪源性干细胞与血小板源性生长因子，即一种众所周知的参与正常创面愈合过程的因子，联合用于创面的治疗。研究结果显示二者的联合应用有协同作用，即可能通过提高生长因子的水平而促进了创面的愈合。

理论上讲，细胞疗法前景广阔，因为多功能干细胞或祖细胞通过对创面缺失组织的再生和持续提供许多有利因子而促进创面的愈合。尽管如此，关于脂肪源性干细胞对创面愈合的机制的研究仍有待于进一步探索。脂肪源性干细胞对局部血管的重塑包括直接分化为血管内皮细胞和分泌生血管生长因子，后两者则有益于血管的再生。

脂肪间充质干细胞的应用前景已通过在各疾病动物模型上的应用得以验证，其用来干预治疗糖尿病、肝脏损伤修复、膀肌重建、2型糖尿病阳疹、心肌梗死、脑梗、认知功能障碍、中风、椎间盘修复、胶质母细胞瘤治疗、骨缺损、创伤后血管新生、风湿性关节炎、唇愕裂、心力衰竭、结肠炎、尿失禁等。有研究者将脂肪间充质干细胞转变为心肌细胞，既重新编程了成熟的干细胞，又能改善心脏病的治疗。也有人将脂肪间充质干细胞与纤维蛋白胶复合后注射到心肌梗塞大鼠的左心室壁上，ADSCs在临床组织工程治疗心肌梗塞上会有很大的前景。脂肪间充质干细胞作为种子细胞放于网状支架中，成功地修复了狗的颅骨损伤，为临床治疗颅骨损伤。还有研究应用心脏病人腹部脂肪的脂肪间充质干细胞注射进他们的心脏以后，减少了心脏的损伤、同时也增加了血流，干细胞注射进心脏以后经过6个月，病人心脏接受带氧血液的能力提高，心脏左心室送出的血液也增加了3.5倍，SPELT显像证明接受脂肪间充质干细胞注射的病人心泵的能力增加了5.7％，核磁扫描也显示患者的平均心肌疤痕面积由原来的31.6％下降到15.4％，这一研究成果发布在2010年美国心脏协会科学年会上。脂肪间充质干细胞在组织修复过程中可以调节周围组织中的生长激素和细胞因子等防治细胞凋亡，有试验证明脂肪间充质干细胞可以分泌各种皮肤生长因子如纤维细胞生长因子(Basic fibroblastgrowth factor,bFGF)等来促进成纤维细胞繁殖，并具有抗光老化、抗氧化、抗皱、抗紫外辐射等作用。有研究用脂肪间充质干细胞来治疗病人复杂性肛屡已经进入到II期临床实验。还有用人的脂肪间充质干细胞移植入名乳房萎缩、大小不一或需要隆胸的患者乳房中，左右乳房大小均衡对称，乳房X光检测，被修复的乳房自然柔软完全无钙化，无囊肿现象，无明显的注射疤痕。最近的临床研究显示，肌内注射脂肪间充质干细胞对糖尿病足和闭塞性动脉硬化症也有一定的疗效。在注射脂肪间充质干细胞的6个月后，从临床上看，患者的静息疼痛得到了缓解，无痛行走的距离明显延长，而且并未发现任何并发症。有试验显示脂肪间充质干细胞诱导成胰岛样细胞回输糖尿病患者，术后随访23个月，发现患者的外源性胰岛素用量下降，患者的平均体重增加了而且患者无不适或副反应。

有学者研究发现脂肪组织参与创伤修复，当脂肪细胞受到创伤刺激后，基因表达发生应激性分泌TNF-a、IL-1、IL-6、细胞间粘附因子、趋化因子，急性反映蛋白，受体等炎症基质的基因表达都会增加，这些因子调控都是我们了解脂肪细胞参与修复的内在治疗机制，这种调节体系是值得我们思考的精密调控。获得的科研成果是丰富创伤修复的理论基础。临床应用伤及真皮下组织脂肪层的深度皮损创伤，脂肪回输治疗均可以达到加速创面修复的理想治疗效果，国外研究学者也应用脂肪细胞，胶原蛋白与弹性蛋白应用组织工程技术制备含有脂肪细胞的人工皮肤，临床应用发现可减少全层皮肤缺损的组织修复造成的创面收缩，这一现象提示我们脂肪组织中存在具有修复作用的因子与细胞。

脂肪间充质干细胞对细胞外基质的黏附强快速特性，体外筛选培养的人脂肪来源的间充质干细胞得以在国内外方法特异性发展。而干细胞生物学性能，可以做到增进功能、避免潜在有害基因及对干细胞控制分化时间与控制不同分化方向等，在基础科研、临床治疗、干细胞治疗研究方向、皮肤再生损伤修复、高拟组织工程皮肤的构建方面等均有历史时期不可取代的指导意义。

脂肪间充质干细胞(ADSCs)作为来源于脂肪的间充质干细胞，取材方便，其提取效率比骨髓间充质干细胞高40倍，并且体外培养条件下增殖速度更快；具有多向分化能力，可以向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞，甚至神经细胞分化。目前临床Ⅰ期和Ⅱ期实验都证明，ADSCs在心脏、直肠、乳腺等多种器官损伤修复中的应用是安全、有效的，而且已有研究证实ADSCs具有促进皮肤再生修复的作用。

ADSCs在多个方面呈现出其固有的优势。ADSCs属于单核细胞家族，是成体干细胞中的一种。它来自处理过的脂肪组织，培养时在细胞培养皿中以贴壁、粘附方式生长，并具有多样分化的能力，不只分化为脂肪细胞，还可以分化为肌细胞、软骨细胞、神经细胞、血管内皮细胞、骨细胞等，因此它们也在组织工程中被广泛地应用。例如，ADSCs可通过自我复制分化为脂肪细胞，在组织再生中发挥作用；ADSCs可以分化成血管内皮细胞或周围细胞；ADSCs在缺氧或其他条件下，可以分泌血管生长因子；当ADSCs和脂肪细胞一起移植的时候，它能够分化成内皮细胞，阻止纤维化和脂肪坏死的发生，提高脂肪成活率；根据最近的许多具体研究结果表明，ADSCs能表达多种细胞因子VEGF、IGF、TGF-β1、bFGF、EGF等，还通过表达VEGF、IGF-1等血管生长因子，来阻止凋亡的发生，维持脂肪细胞的成活率。

现有技术公开了诸多有关脂肪间充质干细胞的培养方法。例如，CN106479970A(201611050980.1)公开了一种大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法。本发明所述大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法向玻璃培养瓶中加入脂肪间充质干细胞培养基，在湿度95％、5％CO2的培养箱中于35℃温育平衡30分钟；调整脂肪间充质干细胞培养基的温度到35℃，pH7.05，加入预处理的微载体和脂肪间充质干细胞，5RPM～20RPM搅拌2h；升温至37℃于15RPM-40RPM、5％CO2条件下培养96h，期间补加脂肪间充质干细胞培养基。与现有方法相比，据信该发明大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法增殖后获得细胞更多，细胞活力和增殖能力强，且能很好保持脂肪间充质干细胞的形态和良好的干细胞特性。

CN104762260A(201510197879.8)涉及一种脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：获得脂肪，预处理、酶解、离心，收集沉淀，获得脂肪间充质干细胞；步骤2：培养所述脂肪间充质干细胞，当所述脂肪间充质干细胞生长至80％融合时，弃培养液，加PBS清洗，再加EDTA～胰酶溶液消化，终止消化、离心，传代培养。据信该发明具有以下优势：1、培养得到的干细胞纯度高；2、回收脂肪间充质干细胞培养过程中分泌出的各类因子，可以显著促进表皮细胞的增殖，表明能加快表皮细胞的新生和更替，达到显著的抗衰老效果。

CN104974984A(申请号201510173453.9)公开了一种脂肪组织来源的间充质干细胞的扩增培养方法，包括如下步骤：将分离的脂肪组织来源的间充质干细胞用脂肪干细胞培养基进行重悬处理，得到含间充质干细胞的重悬液；将所述重悬液接种至干细胞培养器中进行扩增培养；扩增培养24小时后更换所述脂肪干细胞培养基，之后每两天更换所述脂肪干细胞培养基一次，待生长融合至80～90％时，用胰酶消化处理后进行传代培养；其中，所述脂肪干细胞培养基含有0.1～10v/v％胎牛血清、1～10v/v％庆大霉素和80～98.9v/v％高糖DMEM培养基；所述干细胞培养器为用纤维粘连蛋白包被处理的干细胞培养器。据信该发明脂肪组织来源的间充质干细胞的扩增培养方法采用纤维粘连蛋白包被脂肪间充质干细胞生长依附的固相支持物，利用低浓度胎牛血清和高浓度庆大霉素的协同增效筛选培养，使得脂肪组织来源的间充质干细胞在两周时间内能扩增400-500倍，且纯度高，能定向诱导分化为脂肪组织。

CN106520686A(申请号201610887111.8)提供了一种脂肪间充质干细胞的培养方法。本发明脂肪间充质干细胞培养方法包括如下培养步骤：将获取的原代脂肪间充质干细胞接种至干细胞培养基中进行培养处理，其中，所述干细胞培养基中含有干细胞因子和白介素3因子，且所述干细胞因子与白介素3因子的含量比为(5-20μmol/L):(5-20ug/ml)。本发明培养方法能够提高脂肪间充质干细胞的扩增能力，并获得较高的迁移能力。

CN101984049A(申请号201010580537.1)公开了一种从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)脂肪组织的获得：脂肪组织为专业的医院或者美容院通过肿胀法吸脂手术获得的废弃物，在无菌条件下，4-20℃储存小于48小时；(2)初步去除红细胞：脂肪抽取物静止放置待分层后，小心移除下层液体，用D-Hanks液洗涤多次至洗出液清亮；(3)消化脂肪抽取物：加入以D-Hanks液配制的一型胶原酶至0.01-2g/100ml，37℃下20-400转/min震荡消化15-120分钟；(4)脂肪干细胞的获得：将消化后产物在4℃、离心力450g条件下离心5min，脂肪干细胞培养基重悬，以100μm孔径滤膜过滤去除杂质最终获得脂肪干细胞；(5)再次去除红细胞，利用反复洗涤和红细胞裂解的方式再次去除红细胞；(6)脂肪干细胞计数、活性检测和培养：取100μl分离的细胞以细胞计数板进行细胞计数；同时取出100μl细胞通过苔盼蓝染色的方法进行活细胞计数，根据两个计数的结果按照3*10⁴/cm²的密度接种于T-75培养瓶中，37℃、CO2浓度5％、湿度100％条件下进行培养。据信该发明方法能够利用小量的脂肪组织获得大量的状态良好、保持很好的多向分化能力的脂肪干细胞，并且操作方法简单易行、可重复性强。然而该文献方法中在对细胞进行裂解时同时针对间充质干细胞，这对于干细胞的存活是不利的。

CN106222134A(申请号201610605996.8)公开的高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法中，在对脂肪进行分离时，仅吸取离心后中间层的脂肪粒部分，而未获取离心底部的细胞沉淀。

CN102329783A(申请号201110310461.5)公开了一种从外科吸脂手术中的膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法，由以下步骤组成：(1)膨胀液的收集抽脂前向所要抽取部位灌注过量低渗膨胀液，然后将抽脂过程中获取的脂肪与膨胀液置于室温下放置10min，待脂肪与膨胀液完全分离后，用移液枪吸取黄色脂肪下面部分的红色液体，即为含有脂肪干细胞的膨胀液；(2)膨胀液的处理将收集到的膨胀液分装入50ml离心管，放入离心机以1500rpm离心5min；离心吸取弃掉离心管上面部分的液体，收集沉淀，每管用PBS液悬浮，加入红细胞裂解液室温静置5分钟，以1200rpm离心3min，弃上清液；(3)细胞的洗涤加入5mlDMEM(不含血清)将沉淀吹散，细胞滤器过滤，过滤以后的液体以1200rpm离心3min，沉淀即为要获取的脂肪间充质干细胞，再加入DMEM(不含血清)重复以上的操作洗涤3次；(4)细胞培养：将获取细胞接种至75cm2细胞培养瓶内，接种，加入间充质干细胞培养基，37℃，5％CO2培养。然而该CN102329783A只是针对膨胀液部分中的干细胞进行分离，而不是针对掺杂有膨胀液的脂肪液进行干细胞的分离。

尽管现有技术公开了一些诸如上述的有关脂肪间充质干细胞的培养方法，然而这些方法多需要使用包含较浓度胎牛血清的培养基。

本领域仍然期待提供一种新的方法来分离培养甚至传代培养间充质干细胞，尤其是提供一种无胎牛血清的新方法进行间充质干细胞分离培养甚至传代培养。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的方法来制备脂肪间充质干细胞，特别是提供一种适用于从脂肪中分离获取脂肪间充质干细胞的方法，以及将所得干细胞进行传代的方法，并且期待这种方法能够呈现出细胞收率高和/或细胞活率高等特性和/或其它优异性能。本发明已经出人意料的发现使用本发明方法能够获得如本发明所述一个或多个方面的技术效果。本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了分离培养原代脂肪间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脂肪样本；

(2)使脂肪样本离心，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，再次离心，移取脂肪组织，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；

(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO₂培养箱中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，两次离心均以100xg离心5min的条件进行操作。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，离心以100xg离心5min的条件进行操作。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1～5×10⁴/cm²接种至T75瓶，例如是指按照细胞量2×10⁴/cm²接种至T75瓶。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，CO₂培养箱中培养的条件为：5％CO₂，37℃，饱和湿度。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，以100xg离心10min。

根据本发明第一方面的方法，其中所述D-Hanks液的配方组成如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml。例如，其配制方法如下：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。

根据本发明第一方面的方法，其中所述原代完全培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF。

根据本发明第一方面的方法，其中所述原代完全培养基改用原代增补培养基代替。根据本发明第一方面的方法，其中所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖。

根据本发明第一方面的方法，其中所述DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。

根据本发明第一方面的方法，其中还包括对分离培养获得的原代脂肪间充质干细胞进行检测。例如检测细胞形态和/或免疫表型鉴定。在一个实施方案中，所述免疫表型鉴定是指对CD73、CD90、CD105和CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34进行检测。本发明所得原代脂肪间充质干细胞的CD73、CD90、CD105均呈阳性(均大于98％)，CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34均呈阴性(均小于2％)。

进一步的，本发明第二方面提供了分离和传代培养脂肪间充质干细胞的方法，其包括(a)分离培养原代脂肪间充质干细胞和(b)传代培养脂肪间充质干细胞两个阶段，其中

(a)分离培养原代脂肪间充质干细胞的阶段包括如下步骤：

(a1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脂肪样本；

(a2)使脂肪样本离心，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，再次离心，移取脂肪组织，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；

(a3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(a4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO₂培养箱中培养；

(a5)培养3d后培养基全换液一次，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)；

(b)传代培养脂肪间充质干细胞的阶段包括如下步骤：

(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；

(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a2)中，两次离心均以100xg离心5min的条件进行操作。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a2)中，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a3)中，离心以100xg离心5min的条件进行操作。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a4)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1～5×10⁴/cm²接种至T75瓶，例如是指按照细胞量2×10⁴/cm²接种至T75瓶。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a4)中，CO₂培养箱中培养的条件为：5％CO₂，37℃，饱和湿度。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a5)中，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a5)中，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a5)中，以100xg离心10min。

根据本发明第二方面的方法，其中所述D-Hanks液的配方组成如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml。例如，其配制方法如下：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。

根据本发明第二方面的方法，其中所述原代完全培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF。

根据本发明第二方面的方法，其中所述原代完全培养基改用原代增补培养基代替。根据本发明第二方面的方法，其中所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖。

根据本发明第二方面的方法，其中所述DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。

根据本发明第二方面的方法，其中还包括对分离培养获得的原代脂肪间充质干细胞进行检测。例如检测细胞形态和/或免疫表型鉴定。在一个实施方案中，所述免疫表型鉴定是指对CD73、CD90、CD105和CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34进行检测。本发明所得原代脂肪间充质干细胞的CD73、CD90、CD105均呈阳性(均大于98％)，CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34均呈阴性(均小于2％)。

在本发明上下文中，提及的传代完全培养基，其是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：2.5％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、15ng/ml的bFGF、0.04％硫代甘油、1％果糖。

进一步的，本发明第三方面提供了一种原代完全培养基，其是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF。

根据本发明第三方面的原代完全培养基，其是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖。包含硫代甘油和果糖的原代完全培养基亦可称为原代增补培养基。

根据本发明第三方面的原代完全培养基，其用于分离培养原代脂肪间充质干细胞。

根据本发明第三方面的原代完全培养基，其用于分离培养原代脂肪间充质干细胞的方法包括如下步骤：

(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脂肪样本；

(2)使脂肪样本离心，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，再次离心，移取脂肪组织，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；

(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO₂培养箱中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

进一步的，本发明第四方面提供了一种用于脂肪间充质干细胞传代培养的传代完全培养基，其是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：2.5％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、15ng/ml的bFGF、0.04％硫代甘油、1％果糖。

根据本发明第四方面的传代完全培养基，其用于分离培养和传代培养脂肪间充质干细胞的方法包括(a)分离培养原代脂肪间充质干细胞和(b)传代培养脂肪间充质干细胞两个阶段，其中

(a)分离培养原代脂肪间充质干细胞的阶段包括如下步骤：

(a1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脂肪样本；

(a2)使脂肪样本离心，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，再次离心，移取脂肪组织，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；

(a3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(a4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO₂培养箱中培养；

(a5)培养3d后培养基全换液一次，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)；

(b)传代培养脂肪间充质干细胞的阶段包括如下步骤：

(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；

(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。

根据本发明第五方面无血清培养基在分离脂肪间充质干细胞中的用途，所述无血清培养基(其亦可称为原代增补培养基)是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖。

根据本发明第六方面无血清培养基在传代脂肪间充质干细胞中的用途，所述无血清培养基(其亦可称为传代完全培养基)是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：2.5％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、15ng/ml的bFGF、0.04％硫代甘油、1％果糖。

在本发明中，表示细胞数量时，“10^6”表示10的6次方；在本发明中，表示培养面积时，“cm^2”表示平方厘米；其它涉及“^”符号的情形，均具有类似含义；此符号的含义在本领域中亦是公知的。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，所述脂肪是从人体任何部位获取的脂肪。

在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

在本发明中，术语“脂肪间充质干细胞”是指来源于脂肪的间充质干细胞。因此在本发明中，特别是涉及本发明的语境中，术语“脂肪间充质干细胞”可以与“脂肪干细胞”、“干细胞”、“间充质干细胞”互换使用，除非另有明确指明。

在本发明中，术语“PBS缓冲液”或者“PBS”是指磷酸盐缓冲液。本领域技术人员熟知在本发明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它们的一般性质例如pH值或pH范围，并且这些PBS缓冲液通常是可以通过商业途径获得的预配液(或预配粉)，例如用于本发明领域的PBS通常是pH7.4(±0.1)的商品化缓冲液，例如HyClone品牌的PBS缓冲液；本领域经典的应用时的PBS缓冲液组成中包括137mM氯化钠、2.7nM氯化钾和10mM磷酸根，在本发明中如未另外特别说明，所用PBS使用时的组成均为该组成。

本发明方法分离培养脂肪间充质干细胞，所得脂肪间充质干细胞具有非常高的活率且具有非常高的收率。本发明方法呈现如本文描述的一个或多个方面的优异技术效果。

附图说明

图1：原代间充质干细胞的显微镜下细胞形态(100×)。

图2：原代细胞定向分化潜能，A)成脂对照，B)成脂诱导；C)成骨对照，D)成骨诱导；E)成软骨对照，F)成软骨诱导。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。

在本发明中，如未特别说明，试验中用到的DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。

在本发明中，试验中用到的血小板裂解物可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自Sigma-Aldrich的PLTGold Human Platelet Lysate，其货号为SCM151。

在本发明中，试验中用到的Ⅱ型胶原酶可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自Gibco。

在本发明中，试验中用到的bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自Sigma-Aldrich，其货号为GF003。

在本发明中，试验中用到的EGF(表皮生长因子)可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自Gibco，其货号为PHG0311L。

在本发明中，试验中用到的重组胰岛素可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自Solarbio，其货号为I8830。

在本发明中，试验中用到的重组胰酶溶液可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自兰博康斯公司的2000u/ml浓度的重组胰酶溶液，货号RT2S01。

在本发明中，如未特别说明，试验中用到的D-Hanks液其配方组成和制法如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。

在本发明中，如未特别说明，试验中用到的原代完全培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF。

在本发明中，如未特别说明，试验中用到的原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖。

在本发明的具体实验中，对所制得的某代次干细胞取样，用sysmex血球计数仪进行有核细胞即MSC细胞计数，通过台盼兰染色检测细胞活率，并取样用于微生物检测。

实施例1：分离培养原代脂肪间充质干细胞

(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脂肪(样本A)；

(2)100xg离心5min，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，100xg离心5min，移取脂肪组织，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；

(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

上述步骤(1)～(5)在步骤(4)中以2×10⁴/cm²量接种至T75瓶后，每瓶获得有核细胞数量(重复执行5次的均值)为1.13×10^6(n＝5)(本文中，此数据可称为细胞收获量)，且细胞活率91.3％(n＝5)。

实施例1a：分离培养原代脂肪间充质干细胞

步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例1；

(4)取实施例1之步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。本实施例1a上述步骤(1)～(5)在步骤(4)中以2×10⁴/cm²量接种至T75瓶后，每瓶获得有核细胞数量(重复执行5次的均值)为5.45×10^6(n＝5)(本文中，此数据可称为细胞收获量)，且细胞活率92.7％(n＝5)。

实施例1b：照实施例1a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脂肪间充质干细胞。本实施例1b的原代脂肪间充质干细胞的细胞收获量为1.26×10^6(n＝5)、细胞活率93.3％(n＝5)。

实施例1c：照实施例1a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脂肪间充质干细胞。本实施例1b的原代脂肪间充质干细胞的细胞收获量为0.87×10^6(n＝5)、细胞活率90.4％(n＝5)。

在本文中，实施例1a、实施例1b、实施例1c亦可以称为实施例1的附属实例，而实施例1可称为主实例，它们相互之间可称为实例族。

与实施例1相比，实施例1a、实施例1b、实施例1c细胞活率基本相同，均在90～94％范围内；但是，实施例1a细胞收获量是实施例1的大约4.82倍，实施例1b细胞收获量是实施例1的大约1.12倍，实施例1c细胞收获量是实施例1的大约0.77倍；这些出人意料的发现表明，在原代完全培养基中额外添加少量价格低廉的硫代甘油和果糖，不但可以获得细胞活率基本相当的原代干细胞，更令人鼓舞的是细胞收获量显著增加达4倍之多，在生产成本基本不变的情况下细胞收获量显著增加。但是，当仅仅添加硫代甘油或者仅仅添加果糖时虽然细胞活率未见改变，细胞收获量却并未增加，甚至在仅额外添加硫代甘油时细胞收获量还有明显的降低。

在细胞活率方面，本文主实例实施例2～8以及它们各自的附属a、b、c实例亦呈现与上述实施例1及其附属实例(实施例1a、实施例1b、实施例1c)基本相同的结果，细胞活率均在90～95％范围内，例如实施例2和实施例2a、实施例2b、实施例2c四者所得原代间充质干细胞的细胞活率分别为93.3％、92.4％、94.1％、90.7％。

在细胞收获量方面，本文主实例实施例2～8以及它们各自的附属a、b、c实例亦呈现与上述实施例1及其附属实例(实施例1a、实施例1b、实施例1c)基本相同的趋势甚至结果，主实例实施例2～8的细胞收获量均在(0.93～1.27)×10^6范围内，a组附属实例的细胞收获量均是其各自主实例的4.16～5.23倍，b组附属实例的细胞收获量均是其各自主实例的0.96～1.24倍，c组附属实例的细胞收获量均是其各自主实例的0.69～0.88倍；例如实施例2、实施例2a、实施例2b、实施例2c的细胞收获量(n＝5)分别为1.18×10^6、5.14×10^6(4.36倍)、1.23×10^6(1.04倍)、0.93×10^6(0.79倍)。

对本文主实例实施例1～8以及它们各自的附属a、b、c实例所得原代脂肪间充质干细胞进行检测，细胞形态均正常，免疫表型鉴定显示各原代脂肪间充质干细胞的CD73、CD90、CD105均呈阳性(均大于98％，例如实施例1所得干细胞CD73均大于98.7％)，CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34均呈阴性(均小于2％，例如实施例1所得干细胞CD19均小于0.35％)。

实施例2：分离培养原代脂肪间充质干细胞

(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脂肪(样本B)；

(2)100xg离心5min，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，100xg离心5min，移取脂肪组织，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；

(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

实施例2a：分离培养原代脂肪间充质干细胞

步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例2；

(4)取实施例2之步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

实施例2b：照实施例2a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脂肪间充质干细胞。

实施例2c：照实施例2a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脂肪间充质干细胞。

实施例3：分离培养原代脂肪间充质干细胞

(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脂肪(样本C)；

(2)100xg离心5min，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，100xg离心5min，移取脂肪组织，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；

(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

实施例3a：分离培养原代脂肪间充质干细胞

步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例3；

(4)取实施例3之步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

实施例3b：照实施例3a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脂肪间充质干细胞。

实施例3c：照实施例3a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脂肪间充质干细胞。

实施例4：分离培养原代脂肪间充质干细胞

(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脂肪(样本D)；

(2)100xg离心5min，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，100xg离心5min，移取脂肪组织，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；

(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

实施例4a：分离培养原代脂肪间充质干细胞

步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例4；

(4)取实施例4之步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

实施例4b：照实施例4a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脂肪间充质干细胞。

实施例4c：照实施例4a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脂肪间充质干细胞。

实施例5：分离培养原代脂肪间充质干细胞

(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脂肪(样本E)；

(2)100xg离心5min，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，100xg离心5min，移取脂肪组织，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；

(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

实施例5a：分离培养原代脂肪间充质干细胞

步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例5；

(4)取实施例5之步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

实施例5b：照实施例5a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脂肪间充质干细胞。

实施例5c：照实施例5a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脂肪间充质干细胞。

实施例6：分离培养原代脂肪间充质干细胞

(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脂肪(样本F)；

(2)100xg离心5min，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，100xg离心5min，移取脂肪组织，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；

(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

实施例6a：分离培养原代脂肪间充质干细胞

步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例6；

(4)取实施例6之步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

实施例6b：照实施例6a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脂肪间充质干细胞。

实施例6c：照实施例6a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脂肪间充质干细胞。

实施例7：分离培养原代脂肪间充质干细胞

(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脂肪(样本G)；

(2)100xg离心5min，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，100xg离心5min，移取脂肪组织，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；

(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

实施例7a：分离培养原代脂肪间充质干细胞

步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例7；

(4)取实施例7之步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

实施例7b：照实施例7a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脂肪间充质干细胞。

实施例7c：照实施例7a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脂肪间充质干细胞。

实施例8：分离培养原代脂肪间充质干细胞

(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的脂肪(样本H)；

(2)100xg离心5min，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，100xg离心5min，移取脂肪组织，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；

(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

实施例8a：分离培养原代脂肪间充质干细胞

步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例8；

(4)取实施例8之步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×10⁴/cm²接种至T75瓶；置CO₂培养箱(5％CO₂，37℃，饱和湿度)中培养；

(5)培养3d后培养基全换液一次，至(5d左右)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)。

实施例8b：照实施例8a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代脂肪间充质干细胞。

实施例8c：照实施例8a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代脂肪间充质干细胞。

以下实施例11～18所用的传代完全培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：2.5％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、15ng/ml的bFGF、0.04％硫代甘油、1％果糖。

实施例11：脂肪间充质干细胞的传代培养

以实施例1a所得P0代脂肪间充质干细胞进行传代培养，操作如下：

(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；

(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。

实施例12：脂肪间充质干细胞的传代培养

以实施例2a所得P0代脂肪间充质干细胞进行传代培养，操作如下：

(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；

(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。

实施例13：脂肪间充质干细胞的传代培养

以实施例3a所得P0代脂肪间充质干细胞进行传代培养，操作如下：

(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；

(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。

实施例14：脂肪间充质干细胞的传代培养

以实施例4a所得P0代脂肪间充质干细胞进行传代培养，操作如下：

(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；

(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。

实施例15：脂肪间充质干细胞的传代培养

以实施例5a所得P0代脂肪间充质干细胞进行传代培养，操作如下：

(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；

(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。

实施例16：脂肪间充质干细胞的传代培养

以实施例6a所得P0代脂肪间充质干细胞进行传代培养，操作如下：

(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；

(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。

实施例17：脂肪间充质干细胞的传代培养

以实施例7a所得P0代脂肪间充质干细胞进行传代培养，操作如下：

(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；

(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。

实施例18：脂肪间充质干细胞的传代培养

以实施例8a所得P0代脂肪间充质干细胞进行传代培养，操作如下：

(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；

(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。

对实施例11～18所得P1～P10代细胞通过台盼兰染色法检测细胞活率，结果实施例11所得P1～P10代细胞的细胞活率均在89～96％范围内，实施例12所得P1～P10代细胞的细胞活率均在89～97％范围内，实施例13所得P1～P10代细胞的细胞活率均在87～93％范围内，实施例14所得P1～P10代细胞的细胞活率均在89～94％范围内，实施例15所得P1～P10代细胞的细胞活率均在88～96％范围内，实施例16所得P1～P10代细胞的细胞活率均在89～93％范围内，实施例17所得P1～P10代细胞的细胞活率均在90～95％范围内，实施例18所得P1～P10代细胞的细胞活率均在89～93％范围内，例如实施例11所得P1～P10代细胞的细胞活率分别为94.6％、93.2％、95.4％、91.7％、93.6％、89.2％、89.7％、92.3％、95.4％、93.2％。

实施例21：脂肪间充质干细胞的传代培养

参照实施例11进行脂肪间充质干细胞的传代培养，不同的仅是所用传代完全培养基中添加的硫代甘油的量为0.12％，得到P1～P10代脂肪间充质干细胞，将这些细胞通过台盼兰染色法检测细胞活率，结果P1～P6代细胞的细胞活率均在84～96％范围内且随着代次递增细胞活率降低，例如P1代和P6代的细胞活率分别为95.6％和84.2％；P7～P10代细胞的细胞活率继续降低并均在63～81％范围内且随着代次递增细胞活率降低，例如P7代和P10代的细胞活率分别为80.2％和63.6％。本实施例结果表明传代完全培养基中添加较高量的硫代甘油对细胞活率的影响是不利的。

实施例22：脂肪间充质干细胞的传代培养

参照实施例11进行脂肪间充质干细胞的传代培养，不同的仅是所用传代完全培养基中不添加硫代甘油，得到P1～P10代脂肪间充质干细胞，将这些细胞通过台盼兰染色法检测细胞活率，结果P1～P10代细胞的细胞活率均在66～94％范围内且随着代次递增细胞活率降低，例如P2代和P8代的细胞活率分别为91.3％和72.7％。本实施例结果表明传代完全培养基中不添加硫代甘油对细胞活率的影响是不利的。

实施例23：脂肪间充质干细胞的传代培养

参照实施例11进行脂肪间充质干细胞的传代培养，不同的仅是所用传代完全培养基中不添加果糖，得到P1～P10代脂肪间充质干细胞，将这些细胞通过台盼兰染色法检测细胞活率，结果P1～P10代细胞的细胞活率均在71～95％范围内且随着代次递增细胞活率降低，例如P2代和P8代的细胞活率分别为92.7％和75.3％。本实施例结果表明传代完全培养基中不添加果糖对细胞活率的影响是不利的。

试验例1：间充质干细胞的检测

间充质干细胞的典型特征包括：显微镜下呈梭形并贴壁生长，流式细胞术鉴定CD73、CD90、CD105均呈阳性且CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34均呈阴性，定向分化潜能试验显示细胞呈现成骨、成软骨、成脂的分化潜能。

使用本领域公知的方法对本发明实施例1～8以及它们各自的附属a、b、c实例制得的间充质干细胞进行检测，结果：全部间充质干细胞均呈现梭形并贴壁生长(例如实施例1a所得P0代间充质干细胞的显微镜下细胞形态如图1所示)，全部间充质干细胞的CD73、CD90和CD105均大于98％(例如实施例1a所得一个批次P0代间充质干细胞的CD73＝99.2％、CD90＝99.7％、CD105＝98.8％)，全部间充质干细胞的CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34均小于2％(例如实施例1a所得一个批次P0代间充质干细胞的CD19＝0.25％、CD11b＝0.22％、CD31＝0.06％、CD45＝0.36％、HLADR＝0.2％、CD34＝0.12％)，定向分化潜能试验显示全部间充质干细胞均有成骨、成软骨、成脂的分化潜能(例如实施例1a所得一个批次P0代间充质干细胞的成骨、成软骨、成脂的分化潜能结果如图2所示)。

另外，使用本领域公知的方法对本发明实施例11～18所得8种P10代细胞进行检测，结果：全部间充质干细胞均呈现梭形并贴壁生长，8种细胞的CD73、CD90和CD105均大于98％(例如实施例11的P10代间充质干细胞的CD73＝98.6％、CD90＝99.4％、CD105＝98.9％)，8种细胞的CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34均小于2％(例如实施例11的P10代间充质干细胞的CD19＝0.14％、CD11b＝0.64％、CD31＝0.11％、CD45＝0.23％、HLADR＝0.31％、CD34＝0.52％)，定向分化潜能试验显示全部间充质干细胞均有成骨、成软骨、成脂的分化潜能(未图示)。

以上所述实施例仅是为充分说明本申请而所举的较佳的实施例，本申请的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本申请基础上所作的等同替代或变换，均在本申请的保护范围之内。本申请的保护范围以权利要求书为准。

Claims (15)

1.分离和传代培养脂肪间充质干细胞的方法，其包括(a)分离培养原代脂肪间充质干细胞和(b)传代培养脂肪间充质干细胞两个阶段，其中：

(a)分离培养原代脂肪间充质干细胞的阶段包括如下步骤：

(a1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脂肪样本；

(a2)使脂肪样本离心，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，再次离心，移取脂肪组织，加入1% Ⅱ型胶原酶振荡消化；

(a3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(a4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO₂培养箱中培养；

(a5)培养3d后培养基全换液一次，至细胞融合度达80%以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞，即P0代；

(b)传代培养脂肪间充质干细胞的阶段包括如下步骤：

(b1)按照5000/cm²密度接种原代即P0代间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO₂培养箱中，于5% CO₂、37℃、饱和湿度条件，培养至细胞融合度达70~80%时，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞；

(b2)按照5000/cm²密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO₂培养箱中，于5% CO₂、37℃、饱和湿度条件，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞，

其中，

所述D-Hanks液的配方组成为：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH₂PO₄、0.08g的Na₂HPO₄.12H₂O、0.35g的NaHCO₃、水至1000ml；

所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并且添加：1%血小板裂解物、1%人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12%硫代甘油、1%果糖；

所述传代完全培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并且添加：2.5%血小板裂解物、1%人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、15ng/ml的bFGF、0.04%硫代甘油、1%果糖。

2.根据权利要求1的方法，步骤(a2)中，两次离心均以100xg离心5min的条件进行操作。

3.根据权利要求1的方法，步骤(a2)中，加入2倍体积的1% Ⅱ型胶原酶振荡消化30min。

4.根据权利要求1的方法，步骤(a3)中，离心是以100xg离心5min的条件进行操作。

5.根据权利要求1的方法，步骤(a4)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1~5×10⁴/cm²接种至T75瓶。

6.根据权利要求1的方法，步骤(a4)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量2×10⁴/cm²接种至T75瓶。

7.根据权利要求1的方法，步骤(a4)中，CO₂培养箱中培养的条件为：5% CO₂，37℃，饱和湿度。

8.根据权利要求1的方法，步骤(a5)中，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min。

9.根据权利要求1的方法，步骤(a5)中，每瓶加入10ml的D-hanks液稀释。

10.根据权利要求1的方法，步骤(a5)中，以100xg离心10min。

11.根据权利要求1的方法，其中所述DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22µm微孔滤膜过滤除菌，即得。

12.根据权利要求1的方法，其中还包括对分离培养获得的原代脂肪间充质干细胞进行检测，检测细胞形态和/或免疫表型鉴定。

13.根据权利要求12的方法，所述免疫表型鉴定是指对CD73、CD90、CD105和CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34进行检测。

14.脂肪间充质干细胞传代培养的传代完全培养基，其是以DMEM-F12培养基为基质配制并且添加：2.5%血小板裂解物、1%人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、15ng/ml的bFGF、0.04%硫代甘油、1%果糖。

15.无血清培养基在传代脂肪间充质干细胞中的用途，所述无血清培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并且添加：2.5%血小板裂解物、1%人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、15ng/ml的bFGF、0.04%硫代甘油、1%果糖。

Images