CN108004207B - 从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法。一方面，本发明涉及分离和培养脂肪间充质干细胞的方法，步骤为：将通过抽脂获取掺杂有膨胀液的脂肪样本于离心管中，离心；移除最上层油脂，并分别移取悬浮的脂肪颗粒和底层细胞沉淀，备用；向所得脂肪颗粒中加入消化酶混合液，振荡消化，终止消化，重悬细胞沉淀；底层细胞沉淀加红细胞裂解液静置裂解，离心，重悬细胞沉淀；合并细胞悬液，分离出作为原代的脂肪间充质干细胞；进一步将其进行培养繁殖。还涉及由此方法制得的脂肪间充质干细胞制剂，用于分离脂肪间充质干细胞的消化酶混合液，以及用于培养脂肪间充质干细胞的培养基。本发明各方面呈现如说明书所述的优异技术效果。

Description

从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种脂肪间充质干细胞的获取方法，特别是涉及一种自体脂肪间充质干细胞的培养方法。本发明还涉及上述自体脂肪间充质干细胞培养中所用的培养基。使用本发明培养基培养所述自体脂肪间充质干细胞时，能够呈现本发明所述优异技术效果。得到的这些自体脂肪间充质干细胞可以用于自体应用。

背景技术

间充质干细胞(MCS)是成人干细胞具有多向分化潜能的热点细胞，是一种大多数成人器官中发现的具有骨形成能力和造血功能的细胞群体，可以从骨髓、脐血、脂肪中提取，在特定的培养条件下，间充质干细胞可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和肌细胞等。

间充质干细胞是目前组织工程的主要种子细胞。经历了多年多学者的研究后，虽然组织工程已经获得了很大进展，然而，但由于目前缺乏理想筛选方法，间充质干细胞不易获取、体外扩增困难等限制，使其在临床级别回输的应用受到限制。因此，寻找一种易于获得、免疫原性低、易于体外扩增的临床治疗级别的种子细胞是目前组织工程迫切需要解决的问题之一。

人们已经从脂肪组织分离出一类具有多向分化潜能的干细胞，并在体外培养特殊体系中成功地分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞与肌细胞等，这种可分化的干细胞被认可为脂肪来源的间充质细胞，即脂肪干细胞或脂肪间充质干细胞(adipose-derived stemcells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，脂肪干细胞具有分化多胚层全能性特征，其中包括中胚层，内胚层和外胚层分化细胞的能力，能分泌许多潜在的有利的生长因子和细胞活素以细胞为基础的促进创面愈合的治疗方法快速发展。脂肪源性干细胞是一群多功能间充质干细胞，可以分化为其他的细胞系在脂肪组织的非脂肪(间质)碎片中存在大量的脂肪源性细胞，且易于分离获取。

作为各种组织缺损的辅助治疗方法，脂肪源性干细胞被推荐应用。在创面愈合过程中，血管再生是一个重要的步骤新生血管的形成是支持肉芽组织形成和角化细胞存活扩增愈合创伤的的必要条件。因此认为，脂肪源性干细胞是通过快速促血管再生从而促进创面的愈合。另外，脂肪源性干细胞还显示出通过细胞分化以及分泌促进胶原合成和真皮成纤维细胞迁移的长因子来促进创面的愈合

人们已将脂肪源性干细胞与细胞外基质支架成分联合应用于动物的皮肤软组织创面，发现脂肪源性干细胞以促进支架的血管化能力。有研究结果显示，脂肪源性细胞对创面愈合的促进作用与脂肪源性干细胞促进上皮化和肉芽组织的形成有关，并且脂肪源性干细胞有潜在的表皮细胞分化能力研究结果还提示脂肪源性干细胞的远位分化能力是多功能脂肪干细胞对创面的微环境的一个反应。脂肪源性干细胞对局部血管的重塑包括直接分化为血管内皮细胞和分泌血管生长因子，后两者则有益于血管的再生。即是说，脂肪源性干细胞通过细胞分化和血管再生促进创面的愈合。另外，人们将脂肪源性干细胞与血小板源性生长因子，即一种众所周知的参与正常创面愈合过程的因子，联合用于创面的治疗。研究结果显示二者的联合应用有协同作用，即可能通过提高生长因子的水平而促进了创面的愈合。

理论上讲，细胞疗法前景广阔，因为多功能干细胞或祖细胞通过对创面缺失组织的再生和持续提供许多有利因子而促进创面的愈合。尽管如此，关于脂肪源性干细胞对创面愈合的机制的研究仍有待于进一步探索。脂肪源性干细胞对局部血管的重塑包括直接分化为血管内皮细胞和分泌生血管生长因子，后两者则有益于血管的再生。

脂肪间充质干细胞的应用前景已通过在各疾病动物模型上的应用得以验证，其用来干预治疗糖尿病、肝脏损伤修复、膀肌重建、2型糖尿病阳疹、心肌梗死、脑梗、认知功能障碍、中风、椎间盘修复、胶质母细胞瘤治疗、骨缺损、创伤后血管新生、风湿性关节炎、唇愕裂、心力衰竭、结肠炎、尿失禁等。有研究者将脂肪间充质干细胞转变为心肌细胞，既重新编程了成熟的干细胞，又能改善心脏病的治疗。也有人将脂肪间充质干细胞与纤维蛋白胶复合后注射到心肌梗塞大鼠的左心室壁上，ADSCs在临床组织工程治疗心肌梗塞上会有很大的前景。脂肪间充质干细胞作为种子细胞放于网状支架中，成功地修复了狗的颅骨损伤，为临床治疗颅骨损伤。还有研究应用心脏病人腹部脂肪的脂肪间充质干细胞注射进他们的心脏以后，减少了心脏的损伤、同时也增加了血流，干细胞注射进心脏以后经过6个月，病人心脏接受带氧血液的能力提高，心脏左心室送出的血液也增加了3.5倍，SPELT显像证明接受脂肪间充质干细胞注射的病人心泵的能力增加了5.7％，核磁扫描也显示患者的平均心肌疤痕面积由原来的31.6％下降到15.4％，这一研究成果发布在2010年美国心脏协会科学年会上。脂肪间充质干细胞在组织修复过程中可以调节周围组织中的生长激素和细胞因子等防治细胞凋亡，有试验证明脂肪间充质干细胞可以分泌各种皮肤生长因子如纤维细胞生长因子(Basic fibroblastgrowth factor,bFGF)等来促进成纤维细胞繁殖，并具有抗光老化、抗氧化、抗皱、抗紫外辐射等作用。有研究用脂肪间充质干细胞来治疗病人复杂性肛屡已经进入到II期临床实验。还有用人的脂肪间充质干细胞移植入名乳房萎缩、大小不一或需要隆胸的患者乳房中，左右乳房大小均衡对称，乳房X光检测，被修复的乳房自然柔软完全无钙化，无囊肿现象，无明显的注射疤痕。最近的临床研究显示，肌内注射脂肪间充质干细胞对糖尿病足和闭塞性动脉硬化症也有一定的疗效。在注射脂肪间充质干细胞的6个月后，从临床上看，患者的静息疼痛得到了缓解，无痛行走的距离明显延长，而且并未发现任何并发症。有试验显示脂肪间充质干细胞诱导成胰岛样细胞回输糖尿病患者，术后随访23个月，发现患者的外源性胰岛素用量下降，患者的平均体重增加了而且患者无不适或副反应。

有学者研究发现脂肪组织参与创伤修复，当脂肪细胞受到创伤刺激后，基因表达发生应激性分泌TNF-a、IL-1、IL-6、细胞间粘附因子、趋化因子，急性反映蛋白，受体等炎症基质的基因表达都会增加，这些因子调控都是我们了解脂肪细胞参与修复的内在治疗机制，这种调节体系是值得我们思考的精密调控。获得的科研成果是丰富创伤修复的理论基础。临床应用伤及真皮下组织脂肪层的深度皮损创伤，脂肪回输治疗均可以达到加速创面修复的理想治疗效果，国外研究学者也应用脂肪细胞，胶原蛋白与弹性蛋白应用组织工程技术制备含有脂肪细胞的人工皮肤，临床应用发现可减少全层皮肤缺损的组织修复造成的创面收缩，这一现象提示我们脂肪组织中存在具有修复作用的因子与细胞。

脂肪间充质干细胞对细胞外基质的黏附强快速特性，体外筛选培养的人脂肪来源的间充质干细胞得以在国内外方法特异性发展。而干细胞生物学性能，可以做到增进功能、避免潜在有害基因及对干细胞控制分化时间与控制不同分化方向等，在基础科研、临床治疗、干细胞治疗研究方向、皮肤再生损伤修复、高拟组织工程皮肤的构建方面等均有历史时期不可取代的指导意义。

获得脂肪来源的间充质干细胞还可以应用临床相关疾病细胞治疗的回输治疗，以及美容整形注射用填充。

脂肪间充质干细胞(ADSCs)作为来源于脂肪的间充质干细胞，取材方便，其提取效率比骨髓间充质干细胞高40倍，并且体外培养条件下增殖速度更快；具有多向分化能力，可以向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞，甚至神经细胞分化。目前临床Ⅰ期和Ⅱ期实验都证明，ADSCs在心脏、直肠、乳腺等多种器官损伤修复中的应用是安全、有效的，而且已有研究证实ADSCs具有促进皮肤再生修复的作用。

ADSCs在多个方面呈现出其固有的优势。ADSCs属于单核细胞家族，是成体干细胞中的一种。它来自处理过的脂肪组织，培养时在细胞培养皿中以贴壁、粘附方式生长，并具有多样分化的能力，不只分化为脂肪细胞，还可以分化为肌细胞、软骨细胞、神经细胞、血管内皮细胞、骨细胞等，因此它们也在组织工程中被广泛地应用。例如，ADSCs可通过自我复制分化为脂肪细胞，在组织再生中发挥作用；ADSCs可以分化成血管内皮细胞或周围细胞；ADSCs在缺氧或其他条件下，可以分泌血管生长因子；当ADSCs和脂肪细胞一起移植的时候，它能够分化成内皮细胞，阻止纤维化和脂肪坏死的发生，提高脂肪成活率；根据最近的许多具体研究结果表明，ADSCs能表达多种细胞因子VEGF、IGF、TGF-β1、bFGF、EGF等，还通过表达VEGF、IGF-1等血管生长因子，来阻止凋亡的发生，维持脂肪细胞的成活率。

现有技术公开了诸多有关脂肪间充质干细胞的培养方法。例如，CN106479970A(201611050980.1)公开了一种大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法。本发明所述大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法向玻璃培养瓶中加入脂肪间充质干细胞培养基，在湿度95％、5％CO2的培养箱中于35℃温育平衡30分钟；调整脂肪间充质干细胞培养基的温度到35℃，pH7.05，加入预处理的微载体和脂肪间充质干细胞，5RPM～20RPM搅拌2h；升温至37℃于15RPM-40RPM、5％CO2条件下培养96h，期间补加脂肪间充质干细胞培养基。与现有方法相比，据信该发明大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法增殖后获得细胞更多，细胞活力和增殖能力强，且能很好保持脂肪间充质干细胞的形态和良好的干细胞特性。

CN104762260A(201510197879.8)涉及一种脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：获得脂肪，预处理、酶解、离心，收集沉淀，获得脂肪间充质干细胞；步骤2：培养所述脂肪间充质干细胞，当所述脂肪间充质干细胞生长至80％融合时，弃培养液，加PBS清洗，再加EDTA～胰酶溶液消化，终止消化、离心，传代培养。据信该发明具有以下优势：1、培养得到的干细胞纯度高；2、回收脂肪间充质干细胞培养过程中分泌出的各类因子，可以显著促进表皮细胞的增殖，表明能加快表皮细胞的新生和更替，达到显著的抗衰老效果。

CN104974984A(申请号201510173453.9)公开了一种脂肪组织来源的间充质干细胞的扩增培养方法，包括如下步骤：将分离的脂肪组织来源的间充质干细胞用脂肪干细胞培养基进行重悬处理，得到含间充质干细胞的重悬液；将所述重悬液接种至干细胞培养器中进行扩增培养；扩增培养24小时后更换所述脂肪干细胞培养基，之后每两天更换所述脂肪干细胞培养基一次，待生长融合至80～90％时，用胰酶消化处理后进行传代培养；其中，所述脂肪干细胞培养基含有0.1～10v/v％胎牛血清、1～10v/v％庆大霉素和80～98.9v/v％高糖DMEM培养基；所述干细胞培养器为用纤维粘连蛋白包被处理的干细胞培养器。据信该发明脂肪组织来源的间充质干细胞的扩增培养方法采用纤维粘连蛋白包被脂肪间充质干细胞生长依附的固相支持物，利用低浓度胎牛血清和高浓度庆大霉素的协同增效筛选培养，使得脂肪组织来源的间充质干细胞在两周时间内能扩增400-500倍，且纯度高，能定向诱导分化为脂肪组织。

CN106520686A(申请号201610887111.8)提供了一种脂肪间充质干细胞的培养方法。本发明脂肪间充质干细胞培养方法包括如下培养步骤：将获取的原代脂肪间充质干细胞接种至干细胞培养基中进行培养处理，其中，所述干细胞培养基中含有干细胞因子和白介素3因子，且所述干细胞因子与白介素3因子的含量比为(5-20μmol/L):(5-20ug/ml)。本发明培养方法能够提高脂肪间充质干细胞的扩增能力，并获得较高的迁移能力。

CN101984049A(申请号201010580537.1)公开了一种从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)脂肪组织的获得：脂肪组织为专业的医院或者美容院通过肿胀法吸脂手术获得的废弃物，在无菌条件下，4-20℃储存小于48小时；(2)初步去除红细胞：脂肪抽取物静止放置待分层后，小心移除下层液体，用D-Hanks液洗涤多次至洗出液清亮；(3)消化脂肪抽取物：加入以D-Hanks液配制的一型胶原酶至0.01-2g/100ml，37℃下20-400转/min震荡消化15-120分钟；(4)脂肪干细胞的获得：将消化后产物在4℃、离心力450g条件下离心5min，脂肪干细胞培养基重悬，以100μm孔径滤膜过滤去除杂质最终获得脂肪干细胞；(5)再次去除红细胞，利用反复洗涤和红细胞裂解的方式再次去除红细胞；(6)脂肪干细胞计数、活性检测和培养：取100μl分离的细胞以细胞计数板进行细胞计数；同时取出100μl细胞通过苔盼蓝染色的方法进行活细胞计数，根据两个计数的结果按照3*10⁴/cm²的密度接种于T-75培养瓶中，37℃、CO2浓度5％、湿度100％条件下进行培养。据信该发明方法能够利用小量的脂肪组织获得大量的状态良好、保持很好的多向分化能力的脂肪干细胞，并且操作方法简单易行、可重复性强。然而该文献方法中在对细胞进行裂解时同时针对间充质干细胞，这对于干细胞的存活是不利的。

CN106222134A(申请号201610605996.8)公开的高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法中，在对脂肪进行分离时，仅吸取离心后中间层的脂肪粒部分，而未获取离心底部的细胞沉淀。

CN102329783A(申请号201110310461.5)公开了一种从外科吸脂手术中的膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法，由以下步骤组成：(1)膨胀液的收集抽脂前向所要抽取部位灌注过量低渗膨胀液，然后将抽脂过程中获取的脂肪与膨胀液置于室温下放置10min，待脂肪与膨胀液完全分离后，用移液枪吸取黄色脂肪下面部分的红色液体，即为含有脂肪干细胞的膨胀液；(2)膨胀液的处理将收集到的膨胀液分装入50ml离心管，放入离心机以1500rpm离心5min；离心吸取弃掉离心管上面部分的液体，收集沉淀，每管用PBS液悬浮，加入红细胞裂解液室温静置5分钟，以1200rpm离心3min，弃上清液；(3)细胞的洗涤加入5mlDMEM(不含血清)将沉淀吹散，细胞滤器过滤，过滤以后的液体以1200rpm离心3min，沉淀即为要获取的脂肪间充质干细胞，再加入DMEM(不含血清)重复以上的操作洗涤3次；(4)细胞培养：将获取细胞接种至75cm2细胞培养瓶内，接种，加入间充质干细胞培养基，37℃，5％CO2培养。然而该CN102329783A只是针对膨胀液部分中的干细胞进行分离，而不是针对掺杂有膨胀液的脂肪液进行干细胞的分离。

尽管现有技术公开了一些诸如上述的有关脂肪间充质干细胞的培养方法，然而本发明人已经发现这些方法似乎并不适用于从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞，例如这些方法在用于从脂肪获取脂肪间充质干细胞时，其细胞收率低和/或细胞活率低。

因此，本领域仍然期待有新的方法来制备脂肪间充质干细胞，特别是期待有适用于从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的方法来制备脂肪间充质干细胞，特别是提供一种适用于从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法，并且期待这种方法能够呈现出细胞收率高和/或细胞活率高等特性和/或其它优异性能。本发明已经出人意料的发现使用本发明方法能够获得如本发明所述一个或多个方面的技术效果。本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了分离和培养脂肪间充质干细胞的方法，其包括如下步骤：

(1)将通过抽脂获取掺杂有膨胀液的脂肪样本于离心管中，500～1000rpm离心2～5min；

(2)移除最上层油脂，并分别移取悬浮的脂肪颗粒和底层细胞沉淀，备用；

(31)向步骤(2)所得脂肪颗粒中以体积比1：0.8～1.2加入消化酶混合液，在37℃以100rpm振荡消化20～40min；消化结束后，加入等体积的完全培养基终止消化，1000～2000rpm离心3～8min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；

(32)将步骤(2)所得底层细胞沉淀用PBS重悬，加入等量红细胞裂解液静置5～15min进行裂解；红细胞充分裂解后，1000～2000rpm离心3～8min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；

(4)合并步骤(31)和(32)所得细胞悬液，100μm滤网过滤，分离出作为原代的脂肪间充质干细胞；

(5)将分离出的原代脂肪间充质干细胞按照30000细胞/cm^2接种至培养瓶进行培养，加入完全培养基，37℃5％CO2培养；

(6)培养2天后换液，去除非贴壁细胞，待生长到一周时，收获P1代脂肪间充质干细胞；

(7)取少量细胞照步骤(5)和步骤(6)继续传代至下一代直至P5代，收获并观察各代次脂肪间充质干细胞，并进行相关检测。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(7)中，所述相关检测是指检测细胞形态以及免疫表型鉴定。在一个实施方案中，所述免疫表型鉴定是指对CD73、CD90、CD105和CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34进行检测。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(1)中，所述膨胀液包含：0.1mg/ml利多卡因和0.02ug/ml肾上腺素。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(1)中，以800rpm离心3min。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(31)中，脂肪颗粒与混合酶以体积比1：1的比例加入。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述消化酶混合液中包含：0.05％胶原酶I型、0.05％胶原酶II型、0.03％中性蛋白酶、0.03％DNA酶。在本发明中使用上述由四种酶组成的消化酶混合液，可以在步骤(4)中获得非常高的有核细胞收获数量，有核细胞收获数量通常可达(7.5～15)×10^7(以每1ml步骤(2)所得脂肪颗粒计)。已经发现，消化酶的组合对于有核细胞收获数量是非常重要的影响因素，例如包含上述四种酶的消化酶混合液中，如果其中缺少任何一种或两种或三种酶时，有核细胞收获数量无法超过3×10^6(以每1ml步骤(2)所得脂肪颗粒计)。在一个实施方案中，所述消化酶混合液中还添加0.0025％异丙醇；已经出人意料的发现，可能是由于利多卡因的存在(因为，比较发现，当膨胀液中不添加利多卡因时步骤(4)获得有核细胞收获数量可以达到(15～20)×10^7)，在混合酶液中添加异丙醇时可以使有核细胞收获数量达到(55～65)×10^7(以每1ml步骤(2)所得脂肪颗粒计)，但是在不添加异丙醇时(存在利多卡因)有核细胞收获数量无法超过15×10^7(以每1ml步骤(2)所得脂肪颗粒计)。

在本发明中，表示细胞数量时，“10^7”表示10的7次方；在本发明中，表示培养面积时，“cm^2”表示平方厘米；其它涉及“^”符号的情形，均具有类似含义；此符号的含义在本领域中亦是公知的。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(31)中，在37℃以100rpm振荡消化3min。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(31)中，终止消化后，以1500rpm离心5min。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(32)中，加入等量红细胞裂解液静置10min进行裂解。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(32)中，红细胞充分裂解后，1500rpm离心5min。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述完全培养基包含：低糖型DMEM、10％FBS、25mM的HEPES、1μg/ml的EGF、2μg/ml的bFGF、0.02μg/ml的TGF-β、0.05μg/ml的IGF。在本发明中使用包含上述EGF、bFGF、TGF-β、IGF四种细胞因子的完全培养基时，在步骤(6)中收获的细胞以培养瓶每平方厘米计细胞数量可达(90～180)×10^6；但是如果在此完全培养基中不添加任何一种或两种或三种或四种细胞因子时，则在步骤(6)中收获的细胞以培养瓶每平方厘米计细胞数量仅能达到(0.05～0.5)×10^6的范围，可见同时添加上述数量的四种细胞因子对于高产量获得干细胞是必要的。此外，本发明人在补充试验中还发现，当向该完全培养基中添加0.05％山梨醇时，可以进一步提高本发明的脂肪间充质干细胞的收获量，例如特别是在步骤(6)中收获的细胞以培养瓶每平方厘米计细胞数量可达(500～650)×10^6。因此，在本发明的一个实施方案中，所述完全培养基中还包含0.05％山梨醇，鉴于山梨醇的价格远低于上述各种细胞因子，因此添加山梨醇的技术意义是非常显著的。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中还包括使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行制剂的制备步骤。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中还包括使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行细胞冻存的步骤，任选的对所冻存的细胞进行复苏，以及任选的对复苏的细胞进行制剂的制备。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，所述DMEM为低糖型DMEM。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，所述低糖型DMEM配方组成如下：无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，所述完全培养基组成为：100mL的FBS、25mM的HEPES、1μg/ml的EGF、2μg/ml的bFGF、0.02μg/ml的TGF-β、0.05μg/ml的IGF、0.05％山梨醇、无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，所述脂肪是从人体任何部位获取的脂肪。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，所述细胞冻存使用的冻存液组成为：1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基。

进一步的，本发明第二方面提供了一种脂肪间充质干细胞制剂，其是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)将通过抽脂获取掺杂有膨胀液的脂肪样本于离心管中，500～1000rpm离心2～5min；

(2)移除最上层油脂，并分别移取悬浮的脂肪颗粒和底层细胞沉淀，备用；

(31)向步骤(2)所得脂肪颗粒中以体积比1：0.8～1.2加入消化酶混合液，在37℃以100rpm振荡消化20～40min；消化结束后，加入等体积的完全培养基终止消化，1000～2000rpm离心3～8min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；

(32)将步骤(2)所得底层细胞沉淀用PBS重悬，加入等量红细胞裂解液静置5～15min进行裂解；红细胞充分裂解后，1000～2000rpm离心3～8min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；

(4)合并步骤(31)和(32)所得细胞悬液，100μm滤网过滤，分离出作为原代的脂肪间充质干细胞；

(5)将分离出的原代脂肪间充质干细胞按照30000细胞/cm^2接种至培养瓶进行培养，加入完全培养基，37℃5％CO2培养；

(6)培养2天后换液，去除非贴壁细胞，待生长到一周时，收获P1代脂肪间充质干细胞；

(7)取少量细胞照步骤(5)和步骤(6)继续传代至下一代直至P5代，收获并观察各代次脂肪间充质干细胞，并进行相关检测。

(8)使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行制剂的制备；或者，使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行细胞冻存，任选的对所冻存的细胞进行复苏，以及任选的对复苏的细胞进行制剂的制备。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其中步骤(1)中，所述膨胀液包含：0.1mg/ml利多卡因和0.02ug/ml肾上腺素。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其中步骤(1)中，以800rpm离心3min。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其中步骤(31)中，脂肪颗粒与混合酶以体积比1：1的比例加入。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其中所述消化酶混合液中包含：0.05％胶原酶I型、0.05％胶原酶II型、0.03％中性蛋白酶、0.03％DNA酶。在本发明中使用上述由四种酶组成的消化酶混合液，可以在步骤(4)中获得非常高的有核细胞收获数量，有核细胞收获数量通常可达(7.5～15)×10^7(以每1ml步骤(2)所得脂肪颗粒计)。已经发现，消化酶的组合对于有核细胞收获数量是非常重要的影响因素，例如包含上述四种酶的消化酶混合液中，如果其中缺少任何一种或两种或三种酶时，有核细胞收获数量无法超过3×10^6(以每1ml步骤(2)所得脂肪颗粒计)。在一个实施方案中，所述消化酶混合液中还添加0.0025％异丙醇；已经出人意料的发现，可能是由于利多卡因的存在(因为，比较发现，当膨胀液中不添加利多卡因时步骤(4)获得有核细胞收获数量可以达到(15～20)×10^7)，在混合酶液中添加异丙醇时可以使有核细胞收获数量达到(55～65)×10^7(以每1ml步骤(2)所得脂肪颗粒计)，但是在不添加异丙醇时(存在利多卡因)有核细胞收获数量无法超过15×10^7(以每1ml步骤(2)所得脂肪颗粒计)。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其中步骤(31)中，在37℃以100rpm振荡消化3min。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其中步骤(31)中，终止消化后，以1500rpm离心5min。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其中步骤(32)中，加入等量红细胞裂解液静置10min进行裂解。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其中步骤(32)中，红细胞充分裂解后，1500rpm离心5min。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其中所述完全培养基包含：低糖型DMEM、10％FBS、25mM的HEPES、1μg/ml的EGF、2μg/ml的bFGF、0.02μg/ml的TGF-β、0.05μg/ml的IGF。在本发明中使用包含上述EGF、bFGF、TGF-β、IGF四种细胞因子的完全培养基时，在步骤(6)中收获的细胞以培养瓶每平方厘米计细胞数量可达(90～180)×10^6；但是如果在此完全培养基中不添加任何一种或两种或三种或四种细胞因子时，则在步骤(6)中收获的细胞以培养瓶每平方厘米计细胞数量仅能达到(0.05～0.5)×10^6的范围，可见同时添加上述数量的四种细胞因子对于高产量获得干细胞是必要的。此外，本发明人在补充试验中还发现，当向该完全培养基中添加0.05％山梨醇时，可以进一步提高本发明的脂肪间充质干细胞的收获量，例如特别是在步骤(6)中收获的细胞以培养瓶每平方厘米计细胞数量可达(500～650)×10^6。因此，在本发明的一个实施方案中，所述完全培养基中还包含0.05％山梨醇，鉴于山梨醇的价格远低于上述各种细胞因子，因此添加山梨醇的技术意义是非常显著的。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，所述DMEM为低糖型DMEM。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，所述低糖型DMEM配方组成如下：

无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，所述完全培养基组成为：

100mL的FBS、25mM的HEPES、1μg/ml的EGF、2μg/ml的bFGF、0.02μg/ml的TGF-β、0.05μg/ml的IGF、0.05％山梨醇、

无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，所述脂肪是从人体任何部位获取的脂肪。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，所述细胞冻存使用的冻存液组成为：1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基。

进一步的，本发明第三方面提供了一种用于分离脂肪间充质干细胞的消化酶混合液，其中包括：0.05％胶原酶I型、0.05％胶原酶II型、0.03％中性蛋白酶、0.03％DNA酶。任选的，其中还添加0.0025％异丙醇。

进一步的，本发明第四方面提供了一种用于培养脂肪间充质干细胞的培养基，其为完全培养基，其中包括：低糖型DMEM、10％FBS、25mM的HEPES、1μg/ml的EGF、2μg/ml的bFGF、0.02μg/ml的TGF-β、0.05μg/ml的IGF。

根据本发明第四方面任一实施方案所述的培养基，其中，所述低糖型DMEM配方组成如下：无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。

根据本发明第四方面任一实施方案所述的培养基，其中，所述完全培养基组成为：100mL的FBS、25mM的HEPES、1μg/ml的EGF、2μg/ml的bFGF、0.02μg/ml的TGF-β、0.05μg/ml的IGF、0.05％山梨醇、无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。

在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

膨胀吸脂是目前在外科吸脂手术中应用的最为广泛一种技术，主要是在手术前灌注超量低渗膨胀液，该液具有止痛、止血、疏松及裂解脂肪细胞的作用；膨胀液的配方是本领域公知的，并且通常包含利多卡因和肾上腺素。

在本发明中，术语“脂肪间充质干细胞”是指来源于脂肪的间充质干细胞。因此在本发明中，特别是涉及本发明的语境中，术语“脂肪间充质干细胞”可以与“脂肪干细胞”、“干细胞”、“间充质干细胞”互换使用，除非另有明确指明。

在本发明中，术语“PBS缓冲液”或者“PBS”是指磷酸盐缓冲液。本领域技术人员熟知在本发明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它们的一般性质例如pH值或pH范围，并且这些PBS缓冲液通常是可以通过商业途径获得的预配液(或预配粉)，例如用于本发明领域的PBS通常是pH7.4(±0.1)的商品化缓冲液，例如HyClone品牌的PBS缓冲液；本领域经典的应用时的PBS缓冲液组成中包括137mM氯化钠、2.7nM氯化钾和10mM磷酸根，在本发明中如未另外特别说明，所用PBS使用时的组成均为该组成。

本发明方法分离培养脂肪间充质干细胞，所得脂肪间充质干细胞具有非常高的纯度且具有非常高的收率。例如，在本发明实施例1～3中，所述消化酶混合液中包含：0.05％胶原酶I型、0.05％胶原酶II型、0.03％中性蛋白酶、0.03％DNA酶。实施例1～3使用上述由四种酶组成的消化酶混合液，可以在步骤(4)中获得非常高的有核细胞收获数量，有核细胞收获数量通常可达(7.5～15)×10^7(以每1ml步骤(2)所得脂肪颗粒计)。在参考实施例1进行补充的实例中已经发现，消化酶的组合对于有核细胞收获数量是非常重要的影响因素，例如包含上述四种酶的消化酶混合液中，如果其中缺少任何一种或两种或三种酶时，有核细胞收获数量无法超过3×10^6(以每1ml步骤(2)所得脂肪颗粒计)。在参考实施例1进行的补充实施例中已经发现，当向所用的消化酶混合液中再添加0.0025％异丙醇时，可以在步骤(4)中使有核细胞收获数量达到(55～65)×10^7(以每1ml步骤(2)所得脂肪颗粒计)，但是在不添加异丙醇时(存在利多卡因)有核细胞收获数量无法超过15×10^7(以每1ml步骤(2)所得脂肪颗粒计)。另外，在参考实施例1进行的补充实施例中已经发现，有核细胞收获数量的提高可能与膨胀液中利多卡因的存在有关，原因在于，比较发现，当膨胀液中不添加利多卡因时步骤(4)获得有核细胞收获数量可以达到(15～20)×10^7。这些参考实施例1～3进行的补充实施例所得各种脂肪间充质干细胞的性质，除了上述收获数量不同外，其余性质均与实施例1～3相同，例如细胞形态以及流式表型检测结果均与其参考的实施例1～3相同。

又例如，在本发明实施例1～3中，所用的完全培养基的组成为：低糖型DMEM+10％FBS+25mM的HEPES+1μg/ml的EGF+2μg/ml的bFGF+0.02μg/ml的TGF-β+0.05μg/ml的IGF，使用包含上述EGF、bFGF、TGF-β、IGF四种细胞因子的完全培养基时，在步骤(6)中收获的细胞以培养瓶每平方厘米计细胞数量可达(90～180)×10^6；但是，参考实施例1进行的补充试验中发现，如果在此完全培养基中不添加任何一种或两种或三种或四种细胞因子时，则在步骤(6)中收获的细胞以培养瓶每平方厘米计细胞数量仅能达到(0.05～0.5)×10^6的范围，可见同时添加上述数量的四种细胞因子对于高产量获得干细胞是必要的；此外，本发明人在参考实施例1进行的补充试验中还发现，当向该完全培养基中添加0.05％山梨醇时，可以进一步提高本发明的脂肪间充质干细胞的收获量，例如特别是在步骤(6)中收获的细胞以培养瓶每平方厘米计细胞数量可达(500～650)×10^6。鉴于山梨醇的价格远低于上述各种细胞因子，因此添加山梨醇的技术意义是非常显著的，特别是具有显著的经济意义。这些参考实施例1～3进行的补充实验所得各种脂肪间充质干细胞的性质，除了上述收获数量不同外，其余性质均与实施例1～3相同，例如细胞形态以及流式表型检测结果均与其参考的实施例1～3相同。

本发明呈现如下一个或多个方面的优异技术效果：1.本发明经优化的混合酶消化法可从脂肪颗粒中分离获得大量原始的脂肪干细胞，显著高于常规方法(例如单独使用I型胶原酶的情形)，且细胞活性高；2.本发明保留了膨胀液中的脂肪干细胞，进一步增加了原始脂肪干细胞的数量；3.本发明所需脂肪样本量少，根据受者具体情况(细胞应该数量、次数等)可进一步减少采集量，最大程度减小受者创伤；4.本发明优化的脂肪间充质干细胞完全培养基解决了脂肪间充质干细胞分化、形态异常、增殖缓慢、表型异常等常见问题，其中四种生长因子的混合使用起了关键作用，特别是对于细胞增殖速度和量；5.本发明方法培养获得的P0、P1代脂肪干细胞已足够应用于临床治疗，从采集到应用可在10天内完成，及时进行自体间充质干细胞移植可避免错过病人的最佳治疗期。

附图说明

图1：P0至P5代的细胞形态图。

图2：流式表型图。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。

以下试验中，如未特别说明，所述低糖型DMEM配方组成如下：无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。

以下试验中，如未特别说明，所述完全培养基组成为：100mL的FBS、25mM的HEPES、1μg/ml的EGF、2μg/ml的bFGF、0.02μg/ml的TGF-β、0.05μg/ml的IGF、无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。

以下试验中，如未特别说明，所述消化酶混合液中包含：0.05％胶原酶I型、0.05％胶原酶II型、0.03％中性蛋白酶、0.03％DNA酶。以下试验中，如未特别说明，所用红细胞裂解液购自Solarbio。以下试验中，如未特别说明，所用脂肪样本是通过膨胀吸脂方式获得的。

实施例1：分离和培养脂肪间充质干细胞

(1)将通过抽脂获取掺杂有膨胀液的脂肪样本于离心管中，800rpm离心3min；

(2)移除最上层油脂，并分别移取悬浮的脂肪颗粒和底层细胞沉淀，备用；

(31)向步骤(2)所得脂肪颗粒中以体积比1：1加入混合酶(0.05％胶原酶I型+0.05％胶原酶II型+0.03％中性蛋白酶+0.03％DNA酶)，在37℃以100rpm振荡消化30min；消化结束后，加入等体积的完全培养基终止消化，1500rpm离心5min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；

(32)将步骤(2)所得底层细胞沉淀用PBS重悬，加入等量红细胞裂解液静置10min进行裂解；红细胞充分裂解后，1500rpm离心5min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；

(4)合并步骤(31)和(32)所得细胞悬液，100μm滤网过滤，分离出作为原代的脂肪间充质干细胞；

[取样对有核细胞计数(用sysmex血球计数仪)并检测细胞活率(通过台盼兰染色)，并取样用于微生物检测；获得有核细胞数量为7.5×10^7-1.5×10^8(以每1ml步骤(2)所得脂肪颗粒计)，且细胞活率90％以上]

(5)将分离出的原代脂肪间充质干细胞按照30000细胞/cm^2接种至T225培养瓶进行培养，加入完全培养基，37℃5％CO2培养；[完全培养基的组成：低糖型DMEM+10％FBS+25mM的HEPES+1μg/ml的EGF+2μg/ml的bFGF+0.02μg/ml的TGF-β+0.05μg/ml的IGF]

(6)培养2天后换液，去除非贴壁细胞，待生长到一周时(细胞融合率可达90％)以上，收获P1代脂肪间充质干细胞(以培养瓶每平方厘米计细胞数量可达(90～180)×10^6)；

(7)取少量细胞照步骤(5)和步骤(6)继续传代至下一代直至P5代(每传一代，细胞可达13～26倍增长)，收获并观察各代次脂肪间充质干细胞，并进行相关检测。

[检测结果显示：细胞形态活性、增殖能力、流式表型等均稳定，能够满足临床应用；每代次细胞活率均在95％以上，流式表型：CD73、CD90、CD105阳性率均在99％以上，CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34几乎不表达]

本实施例P0至P5代的细胞形态如图1所示，本实施例试验所得流式表型见图2，本发明其它实施例以及补充实施例中，均具有与本实施例基本相同的细胞形态图和流式表型图。

实施例2：分离和培养脂肪间充质干细胞

(1)将通过抽脂获取掺杂有膨胀液的脂肪样本于离心管中，500rpm离心5min；

(2)移除最上层油脂，并分别移取悬浮的脂肪颗粒和底层细胞沉淀，备用；

(31)向步骤(2)所得脂肪颗粒中以体积比1：1.2加入混合酶(0.05％胶原酶I型+0.05％胶原酶II型+0.03％中性蛋白酶+0.03％DNA酶)，在37℃以100rpm振荡消化20min；消化结束后，加入等体积的完全培养基终止消化，2000rpm离心3min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；

(32)将步骤(2)所得底层细胞沉淀用PBS重悬，加入等量红细胞裂解液静置5min进行裂解；红细胞充分裂解后，2000rpm离心3min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；

(4)合并步骤(31)和(32)所得细胞悬液，100μm滤网过滤，分离出作为原代的脂肪间充质干细胞；

[取样对有核细胞计数(用sysmex血球计数仪)并检测细胞活率(通过台盼兰染色)，并取样用于微生物检测；获得有核细胞数量为7.5×10^7-1.5×10^8(以每1ml步骤(2)所得脂肪颗粒计)，且细胞活率90％以上]

(5)将分离出的原代脂肪间充质干细胞按照30000细胞/cm^2接种至T225培养瓶进行培养，加入完全培养基，37℃5％CO2培养；[完全培养基的组成：低糖型DMEM+10％FBS+25mM的HEPES+1μg/ml的EGF+2μg/ml的bFGF+0.02μg/ml的TGF-β+0.05μg/ml的IGF]

(6)培养2天后换液，去除非贴壁细胞，待生长到一周时(细胞融合率可达90％)以上，收获P1代脂肪间充质干细胞(以培养瓶每平方厘米计细胞数量可达(90～180)×10^6)；

(7)取少量细胞照步骤(5)和步骤(6)继续传代至下一代直至P5代(每传一代，细胞可达13～26倍增长)，收获并观察各代次脂肪间充质干细胞，并进行相关检测。

[检测结果显示：细胞形态活性、增殖能力、流式表型等均稳定，能够满足临床应用；每代次细胞活率均在95％以上，流式表型：CD73、CD90、CD105阳性率均在99％以上，CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34几乎不表达]

实施例3：分离和培养脂肪间充质干细胞

(1)将通过抽脂获取掺杂有膨胀液的脂肪样本于离心管中，1000rpm离心2min；

(2)移除最上层油脂，并分别移取悬浮的脂肪颗粒和底层细胞沉淀，备用；

(31)向步骤(2)所得脂肪颗粒中以体积比1：0.8加入混合酶(0.05％胶原酶I型+0.05％胶原酶II型+0.03％中性蛋白酶+0.03％DNA酶)，在37℃以100rpm振荡消化40min；消化结束后，加入等体积的完全培养基终止消化，1000离心8min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；

(32)将步骤(2)所得底层细胞沉淀用PBS重悬，加入等量红细胞裂解液静置15min进行裂解；红细胞充分裂解后，1000rpm离心8min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；

(4)合并步骤(31)和(32)所得细胞悬液，100μm滤网过滤，分离出作为原代的脂肪间充质干细胞；

[取样对有核细胞计数(用sysmex血球计数仪)并检测细胞活率(通过台盼兰染色)，并取样用于微生物检测；获得有核细胞数量为7.5×10^7-1.5×10^8(以每1ml步骤(2)所得脂肪颗粒计)，且细胞活率90％以上]

(5)将分离出的原代脂肪间充质干细胞按照30000细胞/cm^2接种至T225培养瓶进行培养，加入完全培养基，37℃5％CO2培养；[完全培养基的组成：低糖型DMEM+10％FBS+25mM的HEPES+1μg/ml的EGF+2μg/ml的bFGF+0.02μg/ml的TGF-β+0.05μg/ml的IGF]

(6)培养2天后换液，去除非贴壁细胞，待生长到一周时(细胞融合率可达90％)以上，收获P1代脂肪间充质干细胞(以培养瓶每平方厘米计细胞数量可达(90～180)×10^6)；

(7)取少量细胞照步骤(5)和步骤(6)继续传代至下一代直至P5代(每传一代，细胞可达13～26倍增长)，收获并观察各代次脂肪间充质干细胞，并进行相关检测。

[检测结果显示：细胞形态活性、增殖能力、流式表型等均稳定，能够满足临床应用；每代次细胞活率均在95％以上，流式表型：CD73、CD90、CD105阳性率均在99％以上，CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34几乎不表达]

本发明制得的脂肪间充质干细胞(ADSCs)可以自体应用于各种部分例如应用于面部，示例性的应用方法为：在所得脂肪间充质干细胞制剂所有检测均符合标准后，可将ADSCs制剂直接进行面部注射。例如，可以使用1ml医用注射器，使用30GA(外径0.3mm左右)的针头，每个部位建议用量为0.5-1ml，可用于面部皱纹、太阳穴、泪沟等部位的填充。

在本发明上述实施例1中，从原代即P0代开始，所得各代脂肪间充质干细胞中均含有一定量的脂滴，例如对于原代贴壁培养的眼部脂肪间充质干细胞，如图1所示，脂肪间充质干细胞呈长梭形，旋涡状生长，具备典型的间充质干细胞形态。图中较大的圆形为眼部脂肪间充质干细胞上附着的脂滴，可通过反复传代去除。

以上所述实施例仅是为充分说明本申请而所举的较佳的实施例，本申请的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本申请基础上所作的等同替代或变换，均在本申请的保护范围之内。本申请的保护范围以权利要求书为准。

Claims (15)

1.分离和培养脂肪间充质干细胞的方法，其包括如下步骤：

(1)将通过抽脂获取掺杂有膨胀液的脂肪样本置于离心管中，500~1000rpm离心2~5min；

(2)移除最上层油脂，并分别移取悬浮的脂肪颗粒和底层细胞沉淀，备用；

(31)向步骤(2)所得脂肪颗粒中以体积比1：0.8~1.2加入消化酶混合液，在37℃以100rpm振荡消化20~40min；消化结束后，加入等体积的完全培养基终止消化，1000~2000rpm离心3~8min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；

(32)将步骤(2)所得底层细胞沉淀用PBS重悬，加入等量红细胞裂解液静置5~15min进行裂解；红细胞充分裂解后，1000~2000rpm离心3~8min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；

(4)合并步骤(31)和(32)所得细胞悬液，100μm滤网过滤，分离出作为原代的脂肪间充质干细胞；

(5)将分离出的原代脂肪间充质干细胞按照30000细胞/cm²接种至培养瓶进行培养，加入完全培养基，37℃ 5%CO₂培养；

(6)培养2天后换液，去除非贴壁细胞，待生长到一周时，收获P1代脂肪间充质干细胞；

(7)取少量细胞照步骤(5)和步骤(6)继续传代至下一代直至P5代，收获并观察各代次脂肪间充质干细胞，并进行相关检测，

其中，

步骤(1)中，所述膨胀液包含：0.1mg/ml利多卡因和0.02ug/ml肾上腺素；

所述消化酶混合液组成为：0.05%胶原酶I型、0.05%胶原酶II型、0.03%中性蛋白酶、0.03%DNA酶、0.0025%异丙醇；

所述完全培养基组成为：低糖型DMEM、10%FBS、25mM的HEPES、1μg/ml的EGF、2μg/ml的bFGF、0.02μg/ml的TGF-β、0.05μg/ml的IGF、0.05%山梨醇。

2.根据权利要求1的方法，步骤(1)中，以800rpm离心3min。

3.根据权利要求1的方法，步骤(31)中，脂肪颗粒与消化酶混合液以体积比1：1的比例加入。

4.根据权利要求1的方法，步骤(31)中，在37℃以100rpm振荡消化30min。

5.根据权利要求1的方法，步骤(31)中，终止消化后，以1500rpm离心5min。

6.根据权利要求1的方法，步骤(32)中，加入等量红细胞裂解液静置10min进行裂解。

7.根据权利要求1的方法，步骤(32)中，红细胞充分裂解后，1500rpm离心5min。

8.根据权利要求1的方法，其中还包括使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行制剂的制备步骤。

9.根据权利要求1的方法，其中还包括使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行细胞冻存的步骤，对所冻存的细胞进行复苏，对复苏的细胞进行制剂的制备。

10.根据权利要求1的方法，所述低糖型DMEM配方组成如下：无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。

11.根据权利要求9的方法，所述细胞冻存使用的冻存液组成为：1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基。

12.根据权利要求1的方法，步骤(7)中，所述相关检测是指检测细胞形态以及免疫表型鉴定。

13.根据权利要求12的方法，步所述免疫表型鉴定是指对CD73、CD90、CD105和CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34进行检测。

14.用于分离脂肪间充质干细胞的消化酶混合液，其组成为：0.05%胶原酶I型、0.05%胶原酶II型、0.03%中性蛋白酶、0.03%DNA酶、0.0025%异丙醇。

15.用于培养脂肪间充质干细胞的培养基，其为完全培养基，其组成为：低糖型DMEM、10%FBS、25mM的HEPES、1μg/ml的EGF、2μg/ml的bFGF、0.02μg/ml的TGF-β、0.05μg/ml的IGF、0.05%山梨醇；所述低糖型DMEM配方组成如下：无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。

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