CN102965337A

CN102965337A - 分离提取人皮下脂肪间充质干细胞的方法和提取专用培养基

Info

Publication number: CN102965337A
Application number: CN2012105103289A
Authority: CN
Inventors: 孙博; 胡飞虎; 肖忠党
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2012-12-04
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2013-03-13

Abstract

本发明公开了一种分离提取人皮下脂肪间充质干细胞的方法和提取专用培养基。人的皮下脂肪组织切碎后4℃下离心去除大块脂肪组织，加入混合的I型和II型胶原酶水浴消化。用提取专用培养基重悬后，37℃水浴。过滤收集细胞后加入提取专用培养基进行原代细胞培养5-7天。原代培养后的细胞可以使用普通培养基培养，且可以进行连续培养。提取专用培养基包含低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基培养基，添加一定浓度的胎牛血清、重组成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素、乙酰半胱氨酸、甲状腺原氨酸。本发明可以从人皮下脂肪中提取大量脂肪来源间充质干细胞，原代培养的细胞内干细胞纯度较高，且干细胞活性较强。

Description

分离提取人皮下脂肪间充质干细胞的方法和提取专用培养基

技术领域

本发明涉及一种分离提取人的皮下脂肪间充质干细胞的方法和提取专用培养基。

背景技术

干细胞按照发育过程分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞中的间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是一种来源于中胚层和外胚层的多潜能干细胞。间充质干细胞存在于多种器官组织中，目前已从心脏、骨髓、脂肪、肌肉等组织中成功获得了间充质干细胞。2001年，祖克（Zuk）从抽脂手术中取得脂肪组织悬液中提取出一种具有自我更新和多向分化能力的间充质干细胞，这类干细胞被命名为脂肪来源间充质干细胞（Adipose-Derived mesenchymal StemCells，ADSCs）。脂肪来源间充质干细胞和其他干细胞一样具有自我更新的能力，同时并具有向多个胚层分化潜能，在特定诱导条件下能在体内和体外分化为骨、软骨、脂肪、神经、肝细胞等多种组织细胞。脂肪来源间充质干细胞同时还具有以下特点：（1）增殖能力强：脂肪来源间充质干细胞和骨髓来源间充质干细胞一样具有较高的细胞增殖能力，在体外培养时，细胞活力较强。（2）免疫原性低：脂肪来源间充质干细胞主要来源于动物体内含量较高的脂肪组织，用于移植时，自体来源的干细胞免疫原性较低。（3）致肿瘤风险低：脂肪来源间充质干细胞具有稳定的端粒酶活性，在维持其增殖性的同时具有较低的致肿瘤性。

近年来研究表明，ADSC细胞由于脂肪组织具有取材方便和组织内干细胞含量较高等优势，同时在分化性能上，和骨髓来源的间充质干细胞基本相同，因此在进行受损组织或器官的修复上具有广阔的应用前景。脂肪来源干细胞在提取时，由于机械设备的使用，使得干细胞在提取过程中容易受到损伤，同时脂肪组织的消化液也会损伤提取出的干细胞。原代培养方法是将干细胞从体内环境移植到体外环境培养，其过程中由于外部环境和体内环境不同，因此需要添加生长因子以及化学成份来模拟体内生长环境，给予干细胞缓冲时间，提取的干细胞被称为原代细胞。因此细胞的提取方法以及使用的提取培养基成分对原代细胞的纯度以及活力有很大影响，对随后的传代培养也有很大的影响，如干细胞的特性，如更新能力，分化能力等。因此需要一种专用的提取方法以及提取专用培养基。

发明内容

技术问题：鉴于国内脂肪来源主要是医院外科手术后取得的皮下脂肪组织。这种皮下脂肪组织取得的量较多，且手术伤害较小。因此本发明提出了一种从人的皮下脂肪组织中提取间充质干细胞，同时发明了一种在提取和原代细胞培养时使用提取专用培养基。本发明涉及的提取方法能在较小损伤的情况下提取大量的脂肪来源的间充质干细胞。同时在提取过程中使用专用提取培养基。使用本发明提取和培养的人的皮下脂肪来源间充质干细胞在原代培养时，细胞损伤和损失较少，提取的干细胞活力较高，同时干细胞的纯度较高。经过本提取方法和提取专用培养基培养的原代干细胞经过传代培养后，使用普通培养基都可以长时间的保持干细胞的活性，以及干细胞增殖能力和多个胚层方向分化潜能。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明公开了一种分离提取人的皮下脂肪间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤：

步骤1：无菌条件下通过外科手术取人皮下脂肪，剪碎成1-3mm³后用冰磷酸盐缓冲液（PBS）混合后离心；

步骤2：用I型和II胶原酶混合物消化、离心；

步骤3：用提取专用培养基重悬单个细胞后水浴，提取专用培养基中含有特定化学成分和生长因子；

步骤4：再次用提取专用培养基重悬、过滤后移入培养瓶中；

步骤5：连续培养5-7天后，干细胞成克隆生长后，用普通培养基可传代持续培养。

优选的，步骤1中，用4℃的冰磷酸盐缓冲液混合切碎的脂肪组织后低速离心。

优选的，步骤2中，使用混合的I型和II型胶原酶消化，I型和II型胶原酶质量比为1：1，混和胶原酶和磷酸盐缓冲液的总体积分数比为1：1000，每克脂肪组织使用1ml胶原酶-磷酸盐缓冲液消化，振荡水浴消化时间为0.5-2小时，消化时水浴温度为37℃。

本发明还提供了一种用于分离提取人的皮下脂肪间充质干细胞的提取专用培养基，提取专用培养基包括低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基、胎牛血清、重组成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素、乙酰半胱氨酸、甲状腺原氨酸。

优选的，提取专用培养基包括低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基体积百分比位89%、添加胎牛血清的体积百分比为10%、抗生素体积百分比为1%、重组成纤维生长因子浓度为5ng/ml、表皮生长因子浓度为5ng/ml、胰岛素浓度为10ug/ml、乙酰半胱氨酸浓度为2mM、甲状腺原氨酸浓度为10ng/ml。

优选的，抗生素包括青霉素和链霉素。

有益效果：本发明提出的提取方法和提取专用培养基能在较小损伤干细胞的情况下，快速获得大量人的皮下脂肪来源带间充质干细胞。所提取的原代脂肪干细胞在传代前的活力较强，干细胞纯度高。经过传代以及普通培养基培养后，干细胞依然具有较高的增殖和分化能力。

附图说明

图1a为原代细胞接种后12h的光学显微镜下的细胞形态图；

图1b为原代细胞接种后7天后的光学显微镜下的细胞形态；

图2a为干细胞表面标志蛋白CD29流式细胞仪检测阳性结果；

图2b为干细胞表面标志蛋白CD44流式细胞仪检测阳性结果；

图2c为干细胞表面标志蛋白CD73流式细胞仪检测阳性结果。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明做进一步说明：

本发明提供的一种分离提取人的皮下脂肪间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤：

步骤2：用I型和II胶原酶混合物消化、离心；

步骤4：再次用提取专用培养基重悬、过滤后移入培养瓶中；

步骤5：连续培养5-7天后，干细胞成克隆生长后，用普通培养基可传代持续培养；

步骤1中，用4℃的冰磷酸盐缓冲液混合切碎的脂肪组织后低速离心；

步骤2中，使用混合的I型和II型胶原酶消化，I型和II型胶原酶质量比为1：1，混和胶原酶和磷酸盐缓冲液的总体积分数比为1：1000，每克脂肪组织使用1ml胶原酶-磷酸盐缓冲液消化，振荡水浴消化时间为0.5-2小时，消化时水浴温度为37℃；

步骤3中，消化后的单细胞用提取专用培养基重悬，放入37℃水浴中静置15分钟；

本发明提供的一种用于分离提取人的皮下脂肪间充质干细胞的专用培养基，提取专用培养基包括低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基、胎牛血清、重组成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素、乙酰半胱氨酸、甲状腺原氨酸。具体成分配比为低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基体积百分比位89%、添加胎牛血清的体积百分比为10%、抗生素（青霉素和链霉素）体积百分比为1%、重组成纤维生长因子浓度为5ng/ml、表皮生长因子浓度为5ng/ml、胰岛素浓度为10ug/ml、乙酰半胱氨酸浓度为2mM、甲状腺原氨酸浓度为10ng/ml。

实施例1：人的皮下脂肪组织来源间充质干细胞的提取培养步骤：

人的皮下脂肪组织来源间充质干细胞的提取专用培养基配制：在445ml低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基中加入50ml胎牛血清、抗生素（青霉素和链霉素）5ml、重组成纤维生长因子2.5ug、表皮生长因子2.5ug、胰岛素5mg、乙酰半胱氨酸（400nM的储存液）2.5ml、甲状腺原氨酸5ug，0.22μm滤器过滤除菌，4℃储存备用。

人的皮下脂肪来源间充质干细胞提取与培养步骤：

1、取人外科手术取出的皮下脂肪组织，质量大概为25g，放入预冷的PBS中，24h内使用。然后用PBS清洗组织数次洗除残留血液，剪碎至1-3mm³的小块；

2、将切碎的脂肪组织转移至50ml无菌离心管中，加入40ml的PBS重悬后，800rmp离心5分钟去除部分大块脂肪组织；

3、加入25ml的I型和II胶原酶以及PBS混合物，密封后放入37℃振荡水浴箱内消化1h，消化过程中不断振荡组织块以促进消化；

4、消化后800rmp离心5分钟去除上部未被消化的脂肪组织（如果组织块较大，可以收集后继续消化提取），加入40ml的PBS重悬后，800rmp离心5分钟；

5、用40ml的提取专用培养基重悬，37℃水浴静置15分钟，

6、800rmp离心5分钟去上清，再用提取专用培养基重悬，经孔径为100um的无菌尼龙网过滤，过滤后单细胞细胞悬液进行计数，按照浓度为10⁵个/ml将单细胞悬液转移到T25培养瓶中放入培养箱温度为37℃、5%CO₂、湿度为95%条件下培养；

7、12h后，更换一半体积的提取专用培养基，1天后全部更换培养基，第4天全部更换培养基。观察细胞生长情况，一般7天后细胞成克隆生长；

8、用0.25%的胰酶消化后，按照1：3的比例正常传代培养，正常培养用常用培养基（DMEM：F12=1：1基础培养基加10%胎牛血清）。

图1：人皮下脂肪来源间充质干细胞12小时（图1a）后，细胞有贴壁，培养7天后干细胞成克隆生长（图1b）。

实施例2：人原代皮下脂肪来源间充质干细胞的细胞纯度鉴定。

1、取原代细胞用0.25%的胰酶消化2分钟后移入2ml离心管，800rmp离心5分钟去除上清；

2、每管加入2ml PBS重悬，800rmp离心5分钟去除上清；

3、加入1ml的PBS重悬细胞，计数，再加入PBS调整细胞数为1×10⁶个/ml；

4、将细胞悬液分成多管，每管500μl，选其中一管作为流式对照组；

5、按组分别加入带有FITC标记的CD29、CD44、CD73流式抗体，4℃避光孵育30分钟，800rmp离心5分钟去除上清；

6、加入1ml PBS重悬，800rmp离心5分钟去除上清；

7、加入500μl PBS重悬细胞；

8、流式细胞仪检测样品。

图2：经流式细胞术检测，使用本发明方法和专用提取培养基所提取的原代脂肪来源间充质干细胞的几个标志物CD29、CD44、CD73阳性表达率很高。表明提取方法和提取培养基可以从皮下脂肪中分离出纯度较高的干细胞。

以上实例说明本专利提供的人皮下脂肪来源干细胞的提取方法以及提取专用培养基可以从脂肪组织中快速提取间充质干细胞，且提取的干细胞的纯度，活力较高。这一发明能有效的丰富脂肪来源干细胞的种类，提高干细胞原代提取的效率，为干细胞的近一步的科学研究和临床应用提供相关依据。

使用本发明所述提取方法以及提取专业培养基可以从人皮下脂肪中提取大量脂肪来源间充质干细胞，原代培养的细胞内干细胞纯度较高，且干细胞活性较强。该干细胞再经过普通培养基多次传代培养后干细胞活力和分化能力依然较强。本发明在人的皮下脂肪中经过特定提取步骤和提取专用培养基提取了皮下脂肪来源的间充质干细胞，在提取的方法可以减少干细胞损伤，同时使用提取专用培养基（添加特定的化学成分和生长因子）可以解决干细胞在体外培养原代细胞培养纯度低、传代后干细胞容易衰老分化、不能长时间连续培养等问题。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明的保护范围并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰或变化，皆应纳入权利要求书中记载的保护范围内。

Claims

1.一种分离提取人皮下脂肪间充质干细胞方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

步骤2：用I型和II胶原酶混合物消化、离心；

步骤4：再次用提取专用培养基重悬、过滤后移入培养瓶中；

2.根据权利要求1所述的分离提取人皮下脂肪间充质干细胞方法，其特征在于：步骤1中，用4℃的冰磷酸盐缓冲液混合切碎的脂肪组织后低速离心。

3.根据权利要求1所述的分离提取人皮下脂肪间充质干细胞方法，其特征在于：步骤2中，使用混合的I型和II型胶原酶消化，I型和II型胶原酶质量比为1：1，混和胶原酶和磷酸盐缓冲液的总体积分数比为1：1000，每克脂肪组织使用1ml胶原酶-磷酸盐缓冲液消化，振荡水浴消化时间为0.5-2小时，消化时水浴温度为37℃。

4.根据权利要求1所述的分离提取人皮下脂肪间充质干细胞方法，其特征在于：步骤3中，消化后的单细胞用提取专用培养基重悬，放入37℃水浴下静置15分钟。

5.一种用于分离提取人皮下脂肪间充质干细胞的提取专用培养基，其特征在于：提取专用培养基包括低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基、胎牛血清、重组成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素、乙酰半胱氨酸、甲状腺原氨酸。

6.根据权利要求5所述的用于分离提取人皮下脂肪间充质干细胞的提取专用培养基，其特征在于：提取专用培养基包括低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基体积百分比位89%、添加胎牛血清的体积百分比为10%、抗生素体积百分比为1%、重组成纤维生长因子浓度为5ng/ml、表皮生长因子浓度为5ng/ml、胰岛素浓度为10ug/ml、乙酰半胱氨酸浓度为2mM、甲状腺原氨酸浓度为10ng/ml。