CN101314766A - 一种分离培养人脂肪间充质干细胞的方法及其专用培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分离培养人脂肪间充质干细胞的方法及其专用培养基。该人脂肪间充质干细胞的分离培养用培养基，包括动物细胞基础培养基、胎牛血清、表皮生长因子和血小板衍生生长因子；所述胎牛血清的终浓度为1－200mL/L，所述表皮生长因子的终浓度为1－100ng/ml，所述血小板衍生生长因子的终浓度为1－100ng/ml。本发明的脂肪间充质干细胞具有CD31－、CD34－、CD45－和HLA－DR－，且CD29+、CD44+、CD105+和Flk－1+的表型。在体外经诱导可表达骨骼肌细胞和血管内皮细胞的特异性细胞表面标志和相关抗原分子。在药物导致的肌肉损伤模型小鼠体内可分化为肌纤维、血管内皮和有功能的肌肉卫星细胞，并能部分恢复杜氏肌营养不良症(DMD)模型小鼠(mdx)肌膜上抗肌萎缩蛋白的表达，缓解其病理症状。

Description

一种分离培养人脂肪间充质干细胞的方法及其专用培养基

技术领域

本发明涉及一种分离培养人脂肪间充质干细胞的方法及其专用培养基。

背景技术

干细胞是一种具有自我更新能力和多系分化潜能的原始细胞，是细胞移植的理想细胞。在个体发育过程中，存在各种形式的干细胞，如胚胎干细胞，多能干细胞以及各种组织中的定向干细胞如造血干细胞、神经干细胞等。但在实际应用上却面临伦理的挑战或取材的限制。间充质干细胞(MSC)是存在于人体组织中具有多系分化潜能的一种亚全能干细胞群，因其在特定环境下可诱导分化为多种组织细胞，且具有免疫源性低，移植后能形成稳定嵌合等特点，故可作为一种理想的供异基因移植的细胞。以前的研究已经发现，骨髓或脂肪等组织来源的MSC可以在体外经诱导分化为肌肉细胞，为这类细胞用于体内移植提供了理论基础，因为脂肪组织较骨髓更容易取材而且来源更为丰富，所以成体脂肪组织来源的间充质干细胞在临床上具有更高的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种分离培养人脂肪间充质干细胞的方法及其专用培养基。

本发明所提供的人脂肪间充质干细胞的分离培养用培养基，包括动物细胞基础培养基、胎牛血清(FCS)、表皮生长因子(EGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)；所述胎牛血清的终浓度为1-200mL/L，所述表皮生长因子的终浓度为1-100ng/ml，所述血小板衍生生长因子的终浓度为1-100ng/ml。

其中，所述胎牛血清的终浓度优选为10-100mL/L，尤其优选为10-30ml/L，最优选为20ml/L；所述表皮生长因子的终浓度优选为10-30ng/ml，尤其优选为10ng/ml；所述血小板衍生生长因子的终浓度优选为10-30ng/ml，尤其优选为10ng/ml。

所述动物细胞基础培养基可为DMEM/F12、MCDB-201、DMEM、MEM、RPMI 1640、DMEM、M199、BME和IMEM等中的任意一种或其任意组合。

本发明所提供的分离培养人脂肪间充质干细胞的方法，是消化人脂肪组织，收集细胞，将所收集的细胞接种在塑料培养容器中，加入上述任一种培养基进行培养，收集贴壁细胞；将所述贴壁细胞在所述专用培养基中传代2次或2次以上，得到人脂肪间充质干细胞。

上述方法中，所收集的细胞按4×10⁵个/ml-1×10⁷个/ml的接种密度接种在塑料培养容器中；优选的接种密度是2×10⁶个/ml培养基。

上述方法中，所述培养的环境条件为50ml/L CO₂，37℃和95％的相对空气湿度。

本发明的分离培养方法，适合于从各种脂肪组织中分离脂肪间充质干细胞，该分离培养方法简单、效率高。培养得到的脂肪间充质干细胞具有CD31^-、CD34^-、CD45^-和HLA-DR^-，且CD29⁺、CD44⁺、CD105⁺和Flk-1⁺的表型；在体外经诱导可表达骨骼肌细胞和血管内皮细胞的特异性细胞表面标志和相关抗原分子，分化为骨骼肌细胞和血管内皮细胞；在药物导致的肌肉损伤模型小鼠体内可分化为肌纤维、血管内皮和有功能的肌肉卫星细胞，并能部分恢复杜氏肌营养不良症(DMD)模型小鼠(mdx)肌膜上抗肌萎缩蛋白的表达，缓解其病理症状。本发明方法得到的脂肪间充质干细胞可应用于体内治疗外因导致的肌肉损伤和遗传因素导致的肌肉进行性坏死，治疗各种获得性或遗传性肌肉损伤导致的肌纤维及肌肉血管缺损，为治疗肌肉组织相关疾病，包括严重肌肉损伤和以杜氏肌营养不良症代表的遗传性疾病提供了实验依据和临床研究证据，为细胞移植治疗提供了新的途径。

附图说明

图1为脂肪间充质干细胞的形态、免疫表型和细胞周期检测结果

图2为脂肪间充质干细胞体外分化为肌肉细胞和血管内皮细胞的检测结果

图3为脂肪间充质干细胞移植C57BL/6小鼠后4周，免疫荧光检测供体细胞(FITC-β2M)分化情况

图4为供体脂肪间充质干细胞来源肌肉卫星细胞在肌肉再次损伤后被激活

图5为脂肪间充质干细胞移植治疗DMD模型小鼠mdx

A部分重建肌纤维膜上抗肌萎缩蛋白(PE-dystrophin)的表达

B治疗组中心核肌纤维比例显著减少

C治疗组血清肌酸激酶(CK)水平明显降低

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、人脂肪间充质干细胞的分离培养

一、试剂

I型胶原酶购自Sigma公司。胰蛋白酶购自Gibco公司。DMEM/F12(即DF12)、M199、MEM、RPMI1640、BME、IMEM和DMEM购自GIBCO公司。MCDB-201购自Sigma公司。EGF购自Gibco公司。PDGF、VEGF和bFGF购自Sigma公司。氢化可的松购自Sigma公司。FCS和马血清(HS)购自Hyclone公司。

二、人脂肪间充质干细胞的分离培养

分别用下列3种培养基进行分离培养：A、由终浓度为580ml/L DMEM/F12，400ml/L MCDB-201，20ml/L胎牛血清(FCS)，10ng/ml EGF，10ng/ml PDGF组成。

B、由终浓度为580ml/L DMEM/F12，419ml/L MCDB-201，1ml/L胎牛血清(FCS)，1ng/ml EGF，1ng/ml PDGF组成。

C、由终浓度为400ml/LDMEM/F12，400ml/L MCDB-201，200ml/L胎牛血清(FCS)，100ng/ml EGF，由100ng/ml PDGF组成。

采用吸脂术采集出来的脂肪组织，用D-Hank’s洗2遍以稀释麻醉药，0.75g/LI型胶原酶37℃消化1h，用100目筛网过滤后，室温1200g离心10分钟，得到细胞沉淀，之后用D-Hank’s重悬并洗涤2遍以除去胶原酶，室温1200g离心10分钟，收集细胞。细胞以2×10⁶个/ml的密度分别接种于装有上述A至C扩增培养液的T75细胞培养瓶(购自Corning公司)中，在37℃、50ml/L CO₂、空气相对湿度为95％的培养箱培养，24-48小时弃去未贴壁的细胞，并补充相同的扩增培养液，以后每3天半量换相同的扩增培养液。当细胞达70％-80％汇合时，1.25g/L胰蛋白酶(Gibco公司)常规消化，细胞按照1∶3进行传代。

结果表明细胞接种于A扩增培养液中，在接种后7-10天细胞(原代细胞)达70％-80％汇合，有内皮样细胞和成纤维细胞样细胞两种形态。第1代细胞在A扩增培养液中，培养2-3天，达70％-80％汇合，细胞基本为梭形，少数呈内皮细胞样形态，梭形细胞的百分比大于95％。第2代细胞在A扩增培养液中，培养2-3天，达70％-80％汇合，细胞均呈梭形。经鉴定，该梭形细胞即为人脂肪间充质干细胞。

结果表明细胞接种于B扩增培养液中，在接种后10-14天细胞(原代细胞)达70％-80％汇合，有内皮样细胞和成纤维细胞样细胞两种形态。第1代细胞在B扩增培养液中，培养3-4天，达70％-80％汇合，细胞基本为梭形，少数呈内皮细胞样形态，梭形细胞的百分含量约95％。第2代细胞在B扩增培养液中，培养3-4天，达70％-80％汇合，梭形细胞的百分含量大于99％。经鉴定，该梭形细胞即为人脂肪间充质干细胞。

结果表明细胞接种于C扩增培养液中，在接种后5-8天细胞(原代细胞)达70％-80％汇合，有内皮样细胞和成纤维细胞样细胞两种形态。第1代细胞在C扩增培养液中，培养1-2天，达70％-80％汇合，细胞以梭形为主，少数呈内皮细胞样形态，梭形细胞的百分含量约90％。第2代细胞在C扩增培养液中，培养1-2天，达70％-80％汇合，梭形细胞的百分含量约95％。第3代细胞在C扩增培养液中，培养1-2天，达70％-80％汇合，梭形细胞的百分含量大于99％。经鉴定，该梭形细胞即为人脂肪间充质干细胞。

二、人脂肪间充质干细胞的鉴定

1、人脂肪间充质干细胞的免疫表型和细胞周期测定：

用直接免疫荧光法检测步骤一中得到的梭形细胞的表型，细胞用异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)标记的小鼠抗人CD29、CD44、CD105、Flk-1、CD31、CD34、CD45和HLA-DR抗体(上述抗体均购自BD公司)标记后进行流式检测，流式细胞仪为BD FACScan(Becton Dickinson)。

并用流式细胞仪测定细胞周期：细胞用80％的冷乙醇4℃固定1h。PBS洗2遍，0.5ml PBS重悬细胞，加RnaseA(100μg/ml)，37℃温浴30分钟。测定前加碘化丙锭(Sigma，5μg/ml)染色。以ModiFit软件(Becton Dickinson)分析细胞周期。

表型结果显示，A、B和C扩增培养液中得到的梭形细胞的CD29、CD44、CD105和Flk-1均为阳性，CD31、CD34、CD45和MHCII类分子均为阴性。细胞周期测定，结果表明A、B和C扩增培养液中得到的梭形细胞96.2％处在G0/G1期，而处在G2-M期和S期的细胞比例很低。图1中显示的是A扩增培养液中得到的梭形细胞的结果。图1中，A为免疫表型检测结果，横坐标表示细胞荧光强度，纵坐标表示细胞数；P2表示所选细胞群体；B第2代的细胞形态；C为细胞周期检测结果，横坐标表示荧光通道，纵坐标表示细胞数。

2、人脂肪间充质干细胞体外分化为肌肉细胞和RT-PCR及免疫荧光检测：

将A扩增培养液中得到的第2代细胞、B扩增培养液中得到的第2代细胞、C扩增培养液中得到的第3代细胞，在贴壁后，分别换用成肌诱导体系(930ml/L DMEM、20ml/L FCS、50ml/L马血清(horse serum，HS)、50μM氢化可的松)进行诱导培养，每3天半量换液，诱导培养1周后，A、B和C扩增培养液中得到的梭形细胞均具有如下培养特点：部分细胞体积均明显增粗，由原来的梭形变为胖杆妆(图2中A)，诱导2周后，个别细胞开始彼此融合，逐渐形成多核的管状细胞。诱导3周时，形成多核肌管样细胞，PE-抗肌球蛋白重链(MHC)免疫荧光染色显示，部分细胞发红色荧光，呈阳性(图2中C)。半定量RT-PCR分析显示，脂肪间充质干细胞在成肌诱导过程中渐次表达成肌调节因子(myogenic regulatory factors，MRFs)家族中Myf5，MyoD，myogenin等基因和骨骼肌细胞特异性肌球蛋白(myosin)基因(图2中D)。图2中A、B、C和D为A扩增培养液中得到的第2代细胞分化为肌肉细胞的检测结果：A成肌诱导1周形态；B成肌诱导3周形态；C成肌诱导3周的PE-抗肌球蛋白重链(MHC)染色；D半定量RT-PCR，图2中D，1、2、3、4和5分别表示诱导前、诱导1周、诱导2周、诱导3周、阳性对照为胎肌组织。

其中，MHC免疫荧光染色方法如下：成肌诱导3周后，细胞以4％多聚甲醛固定，PBS清洗后以血清封闭，然后用小鼠抗MHC单克隆抗体(myosin heavy chain，SantaCruz，1∶100)室温孵育1小时，PBS清洗后，再以TRITC-标记的大鼠抗小鼠IgG二抗室温孵育30分钟。PBS清洗后用Hoechst 33342(Sigma)复染细胞核(兰色荧光)。荧光显微镜下观察(Olympus)。未诱导的MSC无阳性；而成肌诱导3周的部分细胞有红色荧光，为MHC阳性；C2C12(成肌细胞系)做为阳性对照。

半定量RT-PCR分析中，以人β-actin作为对照，用于扩增人Myf5，人MyoD，人myogenin、人肌球蛋白(myosin)的引物分别如表1所示。

表1扩增Myf5，MyoD，myogenin、肌球蛋白(myosin)的引物

	上游引物	下游引物
			β-actin	5’-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3’	5’-AAT GTC ACG CAC GAT TTC CC-3’
Myf5	5’-CCAGGCTTATCTATCATGTGCTATG-3’	5’-GTTAAGCATTGCAACAAGCTACCC-3’
			MyoD	5’-CGATATACCAGGTGCTCTGAGGG-3’	5’-GGGTGGGTTACGGTTACACCTGC-3’
Myogenin	5’-GTCTTCCAAGCCGGGCATCCTTG-3’	5’-GAGCTGGGGCATACACGAGGGG-3’
			Myosin	5’-ATAGGAACACCCAAGCCATC-3’	5’-TTTGCGTAGACCCTTGACAG-3’

3、脂肪间充质干细胞体外分化为血管内皮细胞和RT-PCR及免疫荧光检测：

用Matrigel胶铺底，分别将A扩增培养液中得到的第2代细胞、B扩增培养液中得到的第2代细胞、C扩增培养液中得到的第3代细胞，接种于24孔板，用内皮诱导体系(980ml/L M199、20ml/L FCS、50ng/ml VEGF、10ng/ml bFGF)培养，A、B和C扩增培养液中得到的梭形细胞均具有如下培养特点：在成内皮诱导最初的12小时内，接种的细胞由圆形逐渐伸展成短梭形，由分散状态逐渐变成一些聚集的细胞群(图2中E)；第24小时，细胞簇变大，簇与簇之间连接，能够看到初步的网格状形成；48小时后，网格之间连线变细，由节点互相连接，形成网格样结构(图2中F)。vWF免疫荧光染色显示，多数细胞呈阳性(图2中G)。RT-PCR显示分化后的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31和CD34(图2中H)。

图2中E、F、G和H为A扩增培养液中得到的第2代细胞分化为血管内皮细胞的检测结果：E成血管内皮诱导12小时；F成血管内皮诱导48小时；G成血管内皮诱导48小时，PE-vWF染色；H半定量RT-PCR，诱导前(1道)、诱导后(2道)、阳性对照为人脐静脉内皮细胞(HUVECs)(3道)。

其中，vWF免疫荧光染色方法如下：成内皮诱导48小时后，用2.4U/ml的di spase消化matrigel收集释放的细胞。之后，将收集到的细胞在明胶包被的盖玻片上贴4小时做细胞爬片。盖玻片用4％的多聚甲醛室温固定10分钟，PBS清洗后，血清封闭10分钟来减少非特异性结合。滴加PE标记的小鼠抗vWF单克隆抗体(BD公司，1∶50稀释)，室温孵育1小时，PBS清洗后用Hoechst33342(Sigma)复染细胞核。荧光显微镜下观察(Olympus)。

半定量RT-PCR分析中，以人β-actin作为对照，用于扩增人CD31和人CD34的引物如表2所示。

表2扩增人CD31和CD34的引物

	上游引物	下游引物
			CD31	5’-TCCGATGATAACCACTGCAA-3’	5’-GTGGTGGAGTCTGGAGAGGA-3’
CD34	5’-AAAGACCCTGATTGCACTGG-3’	5’-GCCCTGAGTCAATTTCACTT-3’

4、骨骼肌损伤模型的建立、脂肪间充质干细胞体移植和体内分化检测：

选用8周龄C57BL/6小鼠(购于中国医学科学院动物研究所)，胫骨前肌(tibialis anterior，TA)单点注射10μM浓度的蛇毒毒素(cardiotoxin，CTX1，购自Sigma公司)，25μl/TA，制成骨骼肌损伤模型。CTX1注射24小时后，将脂肪间充质干细胞(A扩增培养液中得到的第2代细胞)以25μl PBS重悬后原位注射到同一TA肌肉(L.I.)，或以200μl PBS重悬后经尾静脉移植(I.V.)，剂量为1×10⁶个细胞/只。A扩增培养液中得到的第2代脂肪间充质干细胞原位注射5只小鼠的TA，尾静脉移植5只小鼠。

脂肪间充质干细胞原位移植后4周时，取移植细胞的TA肌和对侧TA肌(未移植细胞)，福尔马林固定后，石蜡包埋切片，进行免疫荧光检测：片子脱蜡后以PBS清洗，血清封闭10分钟来减少非特异性结合，然后分别用小鼠抗人MHC、vWF、laminin和Pax7单克隆抗体(均购自Santa Cruz公司，1∶100稀释)与山羊抗人β2M单克隆抗体(Santa Cruz，1∶200稀释)共同进行孵育，室温1小时。这些片子用PBS清洗后，再用TRITC标记的大鼠抗小鼠和FITC标记的兔抗山羊IgG二抗(中杉，1∶50稀释)室温孵育30分钟。PBS清洗后用Hoechst 33342(Sigma)复染细胞核。荧光显微镜下观察(Olympus)。结果表明A扩增培养液中得到的第2代细胞原位移植后4周的TA肌表达人特异β2微球蛋白(β2M)的供体细胞分化为肌球蛋白重链(MHC)阳性的多核肌纤维和vWF阳性的血管内皮细胞，并有部分供体来源的单核细胞位于肌纤维膜和laminin阳性的基膜之间(与肌肉卫星细胞的特异组织定位相符)，且表达Pax7；而未移植细胞的对侧TA肌则检测不到供体来源细胞(人特异β2M为阴性)。图3显示的是A扩增培养液中得到的第2代细胞原位移植后4周的TA肌中供体细胞(即β2M阳性细胞)的分化情况。图

中A，β2M/MHC免疫荧光双染表明植入的脂肪间充质干细胞分化为多核肌管细胞，左为合成图，箭标所示为供体来源的肌纤维(呈黄色荧光)；中为人β2M阳性的供体细胞(呈绿色荧光)，右为MHC阳性的肌纤维(呈红色荧光)。B，β2M/vWF免疫荧光双染表明植入的脂肪间充质干细胞分化为血管内皮细胞，左为合成图，箭标所示为供体来源的血管内皮细胞(呈黄色荧光)，箭头所示为受体自身的血管内皮细胞(呈红色荧光)；中为人β2M阳性的供体细胞(呈绿色荧光)；右为vWF阳性的血管内皮细胞(呈红色荧光)。C，PE-Pax7免疫荧光检测表明植入的脂肪间充质干细胞分化为肌肉卫星细胞，左为合成图，箭标所示为供体来源的肌肉卫星细胞(呈黄色荧光)，箭头所示为受体自身的肌肉卫星细胞(呈红色荧光)；中为人β2M阳性的供体细胞(呈绿色荧光)；右为Pax7阳性的肌肉卫星细胞(呈红色荧光)。D，β2M/laminin免疫荧光双染表明植入的脂肪间充质干细胞来源的单核细胞位于肌纤维膜和laminin阳性的基膜之间，左为合成图，箭标所示为供体来源的肌肉卫星细胞(呈黄色荧光)；中为人β2M阳性的供体细胞(呈绿色荧光)；右为laminin阳性的基膜(呈红色荧光)。

为了探讨供体来源的Pax7阳性细胞是否为有功能的肌肉干细胞，在细胞移植后4周时，移植细胞的TA肌再次以CTX致损，24小时后，进行半定量RT-PCR扩增增殖细胞核抗原(PCNA)和Myf5基因。其中，扩增PCNA的引物，上游引物：5’-GGAGAA CTT GGA AAT GGA AAC-3’，下游引物：5’-CTG CAT TTA GAG TCA AGA CCC-3’；扩增GAPDH基因的引物，上游引物：5’-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3’，下游引物：5’-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3’；扩增Myf5、mh-β-actin基因的引物同表1。

结果表明CTX损伤的植入A扩增培养液中得到的第2代细胞的TA肌高表达人特异的增殖细胞核抗原(PCNA)和Myf5，而作为对照的未损伤的植入A扩增培养液中得到的第2代细胞的TA肌则无表达。这提示植入的部分供体细胞以静止(Myf5阴性)的肌肉卫星细胞形式存在，而在肌肉损伤后被激活(表达活化标记，如Myf5)，并再次参与肌肉修复。图4显示的是A扩增培养液中得到的第2代细胞来源的肌肉卫星细胞在肌肉再次损伤后的PCNA和Myf5的表达情况。图4中，1为未移植细胞的C57BL/6小鼠的CTX损伤TA肌，2为A扩增培养液中得到的第2代细胞，3为移植A扩增培养液中得到的第2代细胞的C57BL/6小鼠再次CTX损伤的TA肌，4为对照，即未损伤的移植A扩增培养液中得到的第2代细胞的TA肌。图4中，h-Myf5表示人Myf5基因；h-PCNA表示人PCNA基因；mh-β-actin表示人鼠通用β-actin基因；GAPDH表示人GAPDH基因。

另外，在脂肪间充质干细胞尾静脉移植4周后，取CTX损伤TA肌、未损伤TA肌和其他脏器，石蜡包埋切片，进行免疫荧光检测(步骤和试剂均如前所述)。结果表明在CTX损伤的TA肌中有供体细胞存在，且分化为MHC阳性的肌管细胞，而未损伤的TA肌中则均没检测到供体细胞，另外，在其他脏器组织中也无供体细胞存在，仅在肺部有少量存在，但并不表达MHC。这表明脂肪间充质干细胞倾向于归巢至损伤肌肉部位，并且其成肌分化具有组织特异性。

5、脂肪间充质干细胞移植后，可部分改善DMD模型小鼠的病理特征

DMD是一种X-性连锁隐性遗传性疾病，由于DMD基因缺陷，导致肌细胞膜上该基因编码的抗肌萎缩蛋白(dystrophin，Dys)表达异常或缺失，从而引起肌膜形态和功能损害，致使肌纤维进行性变性坏死。当其肌肉干细胞(muscle satellitecells，肌肉卫星细胞)库因细胞不断调动而耗竭，就造成肌纤维不可逆的坏死，甚至消失，并为增生结缔组织所替代，最终导致死亡。传统的药物治疗无法从根本上纠正其基因表达缺陷，为了进一步探讨脂肪间充质干细胞移植对于遗传性疾病是否具有疗效，脂肪间充质干细胞经尾静脉移植DMD模型小鼠mdx。

DMD模型小鼠mdx(购自南京模式动物中心)

将脂肪间充质干细胞(A扩增培养液中得到的第2代细胞)以200μl PBS重悬后经尾静脉移植(I.V.)，剂量为1×10⁶个细胞/只，移植20只mdx小鼠，另20只mdx小鼠作为对照。在移植后4周取TA肌肉石蜡包埋切片，进行免疫荧光检测：片子脱蜡后以PBS清洗，血清封闭10分钟来减少非特异性结合，然后用小鼠抗人dystrophin单克隆抗体(购自Santa Cruz公司，1∶100稀释)与山羊抗人β2M单克隆抗体(Santa Cruz，1∶200稀释)共同进行孵育，室温1小时。用PBS清洗后，再用TRITC标记的大鼠抗小鼠和FITC标记的兔抗山羊IgG二抗(中杉，1∶50稀释)室温孵育30分钟。PBS清洗后用Hoechst 33342(Sigma)复染细胞核。荧光显微镜下观察(Olympus)。结果表明细胞移植组(治疗组)的TA肌肉中具边缘核特征的dystrophin阳性的成熟肌纤维成簇存在，并且几乎所有这些肌纤维都为供体细胞来源(人特异β2M阳性)。图5

A显示的是移植A扩增培养液中得到的第2代细胞后4周的TA肌肉的免疫荧光检测结果。左为合成图，供体来源的肌纤维其肌膜上表达抗肌萎缩蛋白(dystrophin)；中为人β2M阳性的供体细胞(呈绿色荧光)；右为dystrophin阳性的肌膜(呈红色荧光)。

骨骼肌中以新生中心核肌纤维为主是DMD一个明显的病理特征，分别在细胞移植(移植A扩增培养液中得到的第2代细胞)后各时间点取mdx治疗组和对照组(未移植脂肪间充质干细胞)的TA肌肉，统计中心核(CN)肌纤维比例(CN肌纤维比例＝CN肌纤维细胞数/总肌纤维数)。每只鼠观察6张片子，每张切片连续取6-10个非重叠视野，用SPSS10.0软件进行统计。统计数据用“均数±标准差”表示，p＜0.05为统计学有差异)。结果表明这两组的中心核比例在移植后2周没有明显差异，而在移植后4周和12周时，治疗组的中心核比例要显著低于对照组(P＜0.05)。图5B显示的是15只治疗组(移植A扩增培养液中得到的第2代细胞)mdx小鼠的TA肌和15只对照mdx小鼠的TA肌的检测结果，Treated mdx表示治疗组mdx，Control mdx表示对照组mdx。

另外高水平的血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)值也是DMD的一个重要特点，按照常规方法检测小鼠血清CK值。结果表明：在脂肪间充质干细胞移植后7天，治疗组和对照组mdx小鼠的CK值都要显著高于正常C57BL/6小鼠的，但在移植后12周时，治疗组的CK值要明显低于对照组(P＜0.05)。这表明脂肪间充质干细胞植入后能发挥治疗作用，有效改善DMD的特异病理指标。图5C显示的是10只治疗组(移植A扩增培养液中得到的第2代细胞)mdx小鼠和10只对照mdx小鼠的血清CK值的检测结果，Treated mdx表示治疗组mdx，Control mdx表示对照组mdx(图

C中UI表示国际单位)。

另外，脂肪间充质干细胞(A扩增培养液中得到的第2代细胞)经尾静脉移植mdx小鼠后，除骨骼肌外，在膈肌和心肌中也检测到了供体来源的肌肉细胞，这提示在脂肪间充质干细胞治疗全身性肌肉损伤疾病时，静脉输注可作为一种操作性更强，更为有效的移植手段。

步骤二证明，步骤一中分离的脂肪间充质干细胞在体外经成肌诱导，可诱导分化为骨骼肌细胞，相继表达成肌调节因子家族中的基因，并表达骨骼肌细胞特异性表面分子肌球蛋白重链。脂肪间充质干细胞移植后，可归巢到损伤的肌肉组织中，参与受体受损肌纤维的重建，并分化为有功能的Pax7+肌肉卫星细胞。在体外经血管内皮生长因子VEGF诱导，步骤一中分离的脂肪间充质干细胞可表达血管内皮细胞特异性表面标志分子和相关抗原，如vWF和CD31。移植后，步骤一中分离的脂肪间充质干细胞在受体内可分化为vWF+血管内皮细胞。步骤一中分离的脂肪间充质干细胞植入疾病模型小鼠(mdx小鼠)后可部分恢复肌膜上抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的表达，并减少骨骼肌中中心核肌纤维比例，降低血清肌酸激酶(CK)值。

Claims (10)

1、人脂肪间充质干细胞的分离培养用培养基，包括动物细胞基础培养基、胎牛血清、表皮生长因子和血小板衍生生长因子；所述胎牛血清的终浓度为1-200mL/L，所述表皮生长因子的终浓度为1-100ng/ml，所述血小板衍生生长因子的终浓度为1-100ng/ml。

2、根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述动物细胞基础培养基为DMEM/F12、MCDB-201、DMEM、MEM、RPMI1640、DMEM、M199、BME和IMEM中的任意一种或其任意组合。

3、根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述胎牛血清的终浓度为10-30mL/L；所述表皮生长因子的终浓度为10-30ng/ml；所述血小板衍生生长因子的终浓度为10-30ng/ml。

4、根据权利要求1至3中任一所述的培养基，其特征在于：所述胎牛血清的终浓度为20ml/L，所述表皮生长因子的终浓度为10ng/ml，所述血小板衍生生长因子的终浓度为10ng/ml。

5、一种分离培养人脂肪间充质干细胞的方法，是消化人脂肪组织，收集细胞，将所收集的细胞接种在塑料培养容器中，加入权利要求1至4中任一所述的培养基进行培养，收集贴壁细胞；将所述贴壁细胞在所述培养基中传代2次或2次以上，得到人脂肪间充质干细胞。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所收集的细胞按4×10⁵个/ml-1×10⁷个/ml培养基接种在塑料培养容器中。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述细胞的接种密度是2×10⁶个/ml培养基。

8、根据权利要求5至7中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括将得到的人脂肪间充质干细胞进行诱导分化的步骤。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述人脂肪间充质干细胞在成肌诱导培养基中诱导分化为肌肉细胞。

10、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述人脂肪间充质干细胞在内皮诱导培养基中诱导分化为血管内皮细胞。

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