CN103305460B - 一种人表皮干细胞的分离和培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种人表皮干细胞的分离和培养方法，涉及细胞的分离和培养。它通过0.25%Try在4℃条件下冷消化4-8小时进行传代培养，与现有技术相比，本发明的有益效果是本发明中的分离和培养方法，得到的细胞活力高，细胞活力由传统消化方法的77%提高到90%以上；而且活细胞数多，活细胞数由传统消化方法的0.9×10⁵/ml提高到1.8×10⁵/ml，传代培养时贴壁效果良好，细胞贴壁率由62%上升至88%；同时，利用传统的消化方法消化表皮干细胞后，细胞一般只能传2-3代；利用本发明后，细胞一般能传6-8代，传代次数也得到了提高。

Description

一种人表皮干细胞的分离和培养方法

技术领域

本发明涉及一种细胞的分离和培养方法，特别涉及一种人表皮干细胞的分离和培养方法。

背景技术

1975年Rheinwald等首次体外培养人表皮细胞获得成功，表皮细胞的培养有了较大的发展，已被广泛应用于皮肤生理学、病理学及药物毒理学的研究。Green和O’Connor将体外培养的自体表皮细胞用于创面覆盖，开创了以组织工程技术治疗皮肤缺损的新方法。但随后的研究和应用发现，表皮细胞体外培养时易于衰老，增殖能力有限，培养至应用的周期较长，且缺乏皮肤附件，制约了皮肤组织工程技术的发展。

随着组织工程皮肤在皮肤及系统性疾病临床应用(烧伤治疗和基因疗法)上的不断发展，种子细胞的选择成为一个关键因素。皮肤组织工程的研究常以快速大量扩增、功能旺盛并能长期传代培养的细胞为种子细胞，人表皮干细胞为皮肤组织特异性的，具有自我更新、高度增殖能力和多向分化潜能的一类细胞，这些机体内的表皮干细胞形态学上具有未分化细胞的特征，因此较其他细胞有更大的优势。

表皮干细胞作为来源于胚胎外胚层的皮肤组织的专能干细胞，位于表皮基底层，可以分化成各种表皮细胞，是优秀的组织工程种子细胞。表皮干细胞在体内受所处的微环境“壁龛”调控，可以保持高增殖低分化特性。Liang等证实表皮干细胞是潜在的多能干细胞，在一定的条件下还可能具有胚胎细胞的多能性。有研究也证实了表皮干细胞在体内能向表皮、皮脂腺及毛囊分化。但是在体外培养时需要把握精确的条件以维持其活力及黏附特性。细胞能否长期存活，首次传代尤为重要，成功传代的关键在于把握好传代时机和消化时间。

在ESC体外培养过程中，原代细胞从包皮分离得到时，细胞活力较低，活细胞数少，而且生长条件要求高，易被混杂的成纤维细胞的过度增殖而掩盖。不但如此，而且按照常规的0.25%Try以及0.25%Try＋0.01%EDTA消化后细胞活力不高，且不能将贴壁细胞完全消化下来，传代培养时细胞贴壁不佳，传代次数较为有限，常规的消化方法对于ESC的应用是难点之一。

发明内容

本发明提出了一种人表皮干细胞的分离和培养方法，解决了现有技术中的不足，本发明中的分离和培养方法，得到的细胞活力高，而且活细胞数多，传代培养时贴壁效果良好，传代次数也得到了提高。

本发明的技术方案是这样实现的：一种人表皮干细胞的分离和培养方法，包括如下步骤：

（1）将取下的人包皮标本用酒精浸泡4-7min，然后用酒精棉球至少轻轻擦拭三遍，再用PBS平衡盐液冲洗，每个角落均要冲洗到，冲洗的次数为2-4次，每次不少于5min，直至冲洗到人包皮标本发白发胀；所述包皮标本取自人体的健康包皮；

（2）将PBS平衡盐液冲洗后的人包皮标本剪去皮下组织，并将人包皮标本剪成长方形的条状，长方形条状的尺寸为0.3cm×2cm；然后进行分离消化；分离消化采用0.25%分离酶，加入的分离酶与人包皮标本的体积比例为5-7:1，加入分离酶后在低温下消化22-26h；

（3）将消化后的人包皮标本用PBS平衡盐液漂洗两次；

（4）将PBS平衡盐液漂洗后的人包皮标本用眼科镊轻轻揭下表皮，完成表皮和真皮的分离；

（5）将分离后所得的表皮进行消化，采用0.25%Try进行消化，加入的Try与表皮干细胞标本的体积比例为3:0.9-1.5，加入分离酶后在35-39℃孵箱中消化25-35min；而分离后的真皮部分可用于分离培养成纤维细胞；

（6）将消化后的表皮取出置于另一培养皿中，加含10%FBS的DMEM终止Try消化，用吸管小心反复吹打，尽量使表皮分散，然后用200目筛网进行离心过滤，弃去上清液，并将离心过滤后的表皮放入K-SFM培养液中，制成细胞混悬液，利用计算细胞活力及细胞数，细胞按5×10⁴/孔接种在预先铺满IV型胶原的24孔培养板中，30min后吸尽未贴壁的细胞，利用计算吸出液中的细胞数和贴壁率，贴壁率=(接种的细胞总数-悬浮的细胞数)/接种的细胞总数，并每天更换K-SFM培养液；

（7）用肉眼判断待细胞融合大于70%后，进行传代培养，传代培养的消化方法包括如下步骤：

a、弃去细胞培养液，磷酸盐缓冲液洗涤2-3遍；

b、在培养板的每孔中分别加入0.25%Try1ml后放入4℃冰箱；

c、待2-12h后将培养板取出，轻轻拍打细胞脱落，加入含10%FBS的DMEM中和；

d、将液体吸入离心管中，用磷酸盐缓冲液轻轻冲洗培养板后移入离心管中，在800-1200rpm/s，离心5-8min；

e、弃去上清液，加入K-SFM培养基重悬细胞，所述K-SFM培养基按K-SFM培养基与细胞的体积比2.5-3.5:1加入，重悬细胞后，计数，将细胞按5×10⁴/孔接种在预先铺满IV型胶原的24孔板中，28-30min后吸尽未贴壁的细胞，利用计算吸出液中的细胞数，计算贴壁率，贴壁率=(接种的细胞总数-悬浮的细胞数)/接种的细胞总数。

在分离培养的过程中需要观察如下指标：

（1）细胞完全脱落时间；

（2）消化后细胞活力、活细胞数量；

（3）消化后细胞黏附率；

（4）传代次数；

（5）次日贴壁培养观察；

（6）原代细胞与4代细胞的细胞表面分子学标记；

（7）原代细胞与4代细胞的基因组差异。

上述的系统分析细胞体积及增殖的方法为：

（1）取CASY测量杯，每杯加入10ml的CASYton；

（2）取实验组细胞吹打均匀后，取100ul加于CASY测量杯中；

（3）将CASY测量杯置于测量毛细管；

（4）将铂电极浸没其中测量各标本的细胞数量与细胞活力。

（5）每标本测量3次，得平均值。

体外培养的人ESC生长分为3期：延缓期、增殖期和停滞期。体外传代消化时应选择增殖早期进行传代，此期细胞生殖旺盛，生理性状稳定，传代对细胞伤害较小。由于在体外分选原代表皮干细胞时，利用ESC对Ⅳ型胶原黏附的特性，在培养板上预先包被了Ⅳ型胶原。若消化时间不够，细胞从贴壁的孔板中不能完全脱落，消化传代所得的细胞数量较少，而未完全脱落的细胞由于经过酶消化后细胞膜部分破坏，继续培养也易坏死脱落。如果消化时间过长，细胞虽能完全脱落，但消化液必然会损伤ESC的细胞膜，从而使消化所得的细胞活力欠佳。在利用人包皮标本获得原代表皮干细胞的实验中，我们利用0.25%的Dis在4℃条件下，从包皮标本中较理想的分离了真表皮。利用这一原理，认为类似的冷消化条件可以作为ESC传代消化的参考。在4℃条件下，消化酶作用缓慢，对细胞膜的破坏较小，消化时间肯定比常温长，具体时间需要实验摸索。为了得到最佳的消化传代ESC的方法，我们比较了在4℃低温条件下三种不同的消化液(0.25%Try、0.25%Try+0.01%EDTA、0.25%Dis)不同时间消化ESC的差异。

Try是常用的消化液，消化常用浓度为0.25%，其作用主要是使细胞间的蛋白质水解，细胞分散脱落，脱离附着物表面成单个细胞。传统Try消化细胞，作用时间较短，操作迅速，为整体实验节省时间。但Try对细胞有损伤，可影响细胞活性，消化ESC后细胞不能完全脱落皿壁，且细胞活力低于80％，传代后贴壁数较低，生长状态一般，细胞传代次数少。而冷消化方法下，细胞4小时即能完全从皿壁脱落，冷消化2至8h后细胞活力均保持在90％以上，活细胞数量大于1×105/ml，且传代贴壁24h后细胞生长良好，部分聚集成片为铺路石样，传代次数也有所增加。但随着消化时间的延长，胰酶对细胞膜的损伤增加，细胞活力及活细胞数量也有所下降。

EDTA常与胰酶联用，本实验室所用EDTA浓度为0.01%，EDTA是一种化学螯合剂，其主要作用是能螯合Ca2+、Mg2+，使细胞分离，目的在于使贴壁的ESC更容易消化脱落，故冷消化2h即可见细胞完全脱落皿壁。但EDTA不能被血清所中和，需要在消化后彻底离心清洗，否则培养的细胞容易脱壁，但反复吹打清洗沉淀细胞对细胞膜伤害较大，细胞活力收到影响。若延长消化时间，细胞能完全从皿壁脱落，但此时细胞膜受损较严重，致使死细胞增多，故0.25%Try＋0.01%EDTA冷消化2至12h，细胞活力及活细胞数量均不稳定，传代培养24h后细胞只部分贴壁，生长缓慢。

中性蛋白酶特异性的作用于基底膜半桥粒结构，选择性地分解纤维连接素和胶原，因而保存了细胞活力及细胞间连接，可以较完整的将表皮与真皮自基底膜处完全分开，但分离消化时间长，故冷消化6h方可见ESC细胞完全脱落皿壁。由于保留了细胞间连接，所以细胞常以细胞团形式成片脱落，反映在计数系统上，细胞活力及活细胞数量上不稳定。此外，将细胞团吹打成单个悬浮细胞时，必将破坏部分细胞的细胞膜，引起细胞的损伤。

计数系统利用的是细胞膜的完整性。死细胞具有一个可渗透的细胞膜，它允许等渗缓溶液CASYton进入。因此，死细胞内的细胞质同胞外的等渗缓冲液具有相同的电导率，可以被电极所忽略，所测得的仅仅是紧密结构的细胞核的体积。而对于拥有完整细胞膜的活细胞，CASY技术分析的则是全细胞的体积。利用两者的相对差异即可区分开死细胞与活细胞。把细胞悬浮于等渗的电解质溶液中后，通过一个精确的测量孔抽提时，在这片低压区域中被每秒1百万次频率的电子脉冲扫描，同时可对每个细胞作大小，重量厚度及时间的分析。这些信号将在一个有512000个通道的多孔径分析器中分离和积累，最后唯一的结果由芯片计算技术即时性的完成。计数系统包含有一个永久性自动校正系统，它能保证计数过程不被干扰，保证结果的高度重复性和一致性。由于采用的是电子背景信号分析，在计数过程中，不必考虑细胞密度过高或过低的情况，该计数方法不会因染色导致细胞伤害，引起结果的偏差。

目前对ESC主要的鉴定方法有：(1)标记滞留细胞分析法，(2)克隆分析法，(3)分子标记法。标记滞留细胞分析法鉴定适用于小动物研究，不适合人类及大动物。克隆分析法适用于三维培养条件下的细胞。分子标记法相对于本实验来讲是个合适的鉴定ESC的手段，双标法鉴定ESC是目前较常用的方法。ESC表面的特异性标记物至今为止尚无严格的统一标准，但比较常用的是应用整合素β1、CK19双标法进行标记。

整合素家族。整合素位于细胞膜上，为一类糖蛋白受体，它们主要介导细胞与细胞外基质的黏附、参与细胞与细胞间的黏附。表皮干细胞能高水平表达整合素，在其增殖分化过程中，胞膜上的整合素表达逐渐下调直至消失，细胞也随之逐渐向皮肤表面迁徙，最终角质化、脱落。各种整合素作为受体分子与基底膜各种成分的配体结合，是干细胞维持其特性的基本条件，如果表皮干细胞对基底膜的失去黏附，则会脱落而进入分化，这是表皮干细胞增殖分化的重要调节机制之一。表皮干细胞和短暂扩增细胞均高表达β1整合素，可区别于终末分化细胞。Jones等人发现，整合素β1表达水平的高低与细胞体外克隆形成能力成正相关，高表达整合素β1的细胞具有更强的克隆形成能力，传代次数显著多于低表达的细胞。整合素β1高表达的细胞中除了表皮干细胞外，还包含了TAC角蛋白系列。角蛋白是表皮细胞的结构蛋白，随着分化程度的不同，表皮细胞表达的角蛋白也不同，这一点被用于鉴别表皮干细胞、短暂扩增细胞和终末分化细胞。表皮干细胞表达角蛋白K19，一般认为K19表达于毛囊的隆突部、胎儿与新生儿表皮基底层、成人无毛发皮肤的干细胞角蛋白19也表达阳性。终末分化细胞表达角蛋白K1和K10，K10是分化程度高的表皮细胞的特征性蛋白，可作为表皮干细胞和短暂扩增细胞的阴性表面分子标志，用于表皮干细胞和短暂扩增细胞的鉴定和分选。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明中的分离和培养方法，得到的细胞活力高，细胞活力由传统消化方法的77%提高到90%以上；而且活细胞数多，活细胞数由传统消化方法的0.9×10⁵/ml提高到1.8×10⁵/ml，传代培养时贴壁效果良好，细胞贴壁率由62%上升至88%；同时，利用传统的消化方法消化表皮干细胞后，细胞一般只能传2-3代；利用本发明后，细胞一般能传6-8代，传代次数也得到了提高。

附图说明

图1为原代ESC的分离培养5天后在倒置相差显微镜下观察(×100)的细胞图；

图2为0.25%Try+0.01%EDTA、0.25%Try、0.25%Dis分别冷消化ESC，三种冷消化方法细胞完全脱落时间比较图；

图3为0.25%Try+0.01%EDTA、0.25%Try、0.25%Dis分别冷消化ESC，三种冷消化方法消化ESC后细胞活力比较图；

图4为0.25%Try+0.01%EDTA、0.25%Try、0.25%Dis分别冷消化ESC，三种冷消化方法消化ESC后活细胞数比较图；

图5为0.25%Try+0.01%EDTA、0.25%Try、0.25%Dis分别冷消化ESC，三种冷消化方法消化ESC后细胞黏附率比较图；

图6为0.25%Try+0.01%EDTA、0.25%Try、0.25%Dis分别冷消化ESC，三种冷消化方法消化ESC后传代次数比较图；

图7为0.25%Try+0.01%EDTA传统消化法消化ESC，培养24小时后在倒置相差显微镜下观察（×100）的细胞图；

图8为0.25%Try传统消化法消化ESC，培养24小时后在倒置相差显微镜下观察（×100）的细胞图；

图9为0.25%Try+0.01%EDTA冷消化ESC2h，培养24小时后在倒置相差显微镜下观察（×100）的细胞图；

图10为0.25%Try冷消化ESC4h，培养24小时后在倒置相差显微镜下观察（×100）的细胞图；

图11为0.25%Dis冷消化ESC6h，培养24小时后在倒置相差显微镜下观察（×100）的细胞图；

图12为原代表皮干细胞整合素β1免疫组化染色情况在倒置相差显微镜下观察(×200)的细胞图；

图13为2代细胞整合素β1免疫组化染色情况在倒置相差显微镜下观察(×200)的细胞图；

图14为4代细胞整合素β1免疫组化染色情况在倒置相差显微镜下观察(×200)的细胞图；

图15为原代表皮干细胞CK19免疫组化染色情况在倒置相差显微镜下观察(×200)的细胞图；

图16为2代细胞CK19免疫组化染色情况在倒置相差显微镜下观察(×200)的细胞图；

图17为4代细胞CK19免疫组化染色情况在倒置相差显微镜下观察(×200)的细胞图；

图18为原代表皮干细胞CK10免疫组化染色情况在倒置相差显微镜下观察(×100)的细胞图；

图19为2代细胞CK10免疫组化染色情况在倒置相差显微镜下观察(×100)的细胞图；

图20为4代细胞CK10免疫组化染色情况在倒置相差显微镜下观察(×100)的细胞图；

图21为原代表皮干细胞和4代细胞基因组表达情况比较。

具体实施方式

下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的其中的几个实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

人包皮标本取自男性健康包皮，包皮标本取材于2009年5-12月在第三军医大学西南医院泌尿外科和重庆大坪医院医学美容中心行包皮环切术的青年男性20例，平均年龄（23.56±2.43）岁，所有取材均取得患者同意并签署知情同意书，实验内容已通过大坪医院伦理委员会审查。人包皮标本取下后浸泡于PBS平衡盐液中，4℃冰箱中保存，也可以直接按下述的步骤进行人表皮干细胞的分离和培养：

（1）将取下的人包皮标本用酒精浸泡5min，然后用酒精棉球至少轻轻擦拭三遍，再用PBS平衡盐液冲洗，每个角落均要冲洗到，冲洗的次数为3次，每次不少于5min，直至冲洗到人包皮标本发白发胀；所述人包皮标本取自人体的健康包皮；

（2）将PBS平衡盐液冲洗后的人包皮标本剪去皮下组织，并将人包皮标本剪成长方形的条状，长方形条状的尺寸为0.3cm×2cm；然后进行分离消化；分离消化采用0.25%分离酶，加入的分离酶与人包皮标本的体积比例为5:1，加入分离酶后在4℃下消化24h；

（3）将消化后的人表皮干细胞标本用PBS平衡盐液漂洗两次；

（4）将PBS平衡盐液漂洗后的人包皮标本用眼科镊轻轻揭下表皮，完成表皮和真皮的分离；

（5）将分离后所得的表皮进行消化，采用0.25%Try进行消化，加入的Try与人表皮的体积比例为3：1，加入分离酶后在37℃孵箱中消化30min；而分离后的真皮部分可用于分离培养成纤维细胞；

（6）将消化后的表皮取出置于另一培养皿中，加含10%FBS的DMEM终止Try消化，用吸管小心反复吹打，尽量使表皮分散，然后用200目筛网进行离心过滤，弃去上清液，并将离心过滤后的表皮放入K-SFM培养液中，制成细胞混悬液，利用计算细胞活力及细胞数，细胞按5×10⁴/孔接种在预先铺满IV型胶原的24孔板中，30min后吸尽未贴壁的细胞，利用计算吸出液中的细胞数和贴壁率，，贴壁率=(接种的细胞总数-悬浮的细胞数)/接种的细胞总数，并每天更换K-SFM培养液；

（7）用肉眼判断待细胞融合约为70%后，进行传代培养，传代培养的消化方法包括如下步骤：

a、弃去细胞培养液，磷酸盐缓冲液洗涤3遍；

b、在其中六个培养板的每孔中加入0.25%Try各1ml后放入4℃冰箱；、同时做对比试验，对比0.25%Try+0.01％EDTA、0.25%Dis的消化效果，于是在另外六个培养板的每孔中加入0.25%Try+0.01％EDTA、还有六个培养板的每孔中加入0.25%Dis加1ml后放入4℃冰箱。

c、待2h，4h，6h，8h，10h，12h后，在每一个时间点三种消化分别取出一个培养板，轻轻拍打细胞脱落，加入含10%FBS的DMEM中和；

d、分别将液体吸入离心管中，用磷酸盐缓冲液轻轻冲洗培养板后移入离心管中，在1000rpm/s，离心5min；

e、弃去上清液，加入K-SFM培养基5ml重悬细胞后，分别计数，再分别将细胞按5×10⁴/孔接种在预先铺满IV型胶原的24孔板中，30min后吸尽未贴壁的细胞，分别利用计算吸出液中的细胞数，计算贴壁率，贴壁率=(接种的细胞总数-悬浮的细胞数)/接种的细胞总数。

在分离培养的过程中观察如下指标：

（1）细胞完全脱落时间；

（2）消化后细胞活力、活细胞数量；

（3）消化后细胞黏附率；

（4）传代次数；

（5）次日贴壁培养观察；

（6）原代细胞与4代细胞的细胞表面分子学标记；

（7）原代细胞与4代细胞的基因组差异。

分离培养的观察结果如下：

一、原代ESC的分离培养：

原代表皮干细胞接种在IV型胶原30min后，吸取未粘附细胞，可见贴壁细胞小而圆，折光强，核浆比大；在K-SFM培养基中培养2天后，克隆生长较快；培养5天后体外聚集融合成片为铺路石样，如图1所示。

二、细胞消化方法的比较

1、冷消化方法消化细胞的完全脱落时间

如图2所示，0.25%Try+0.01%EDTA、0.25%Try、0.25%Dis分别冷消化ESC，细胞完全消化脱落的最短时间分别为2h，4h，6h。

2、不同消化方法消化细胞后细胞活力及活细胞数比较

如图3、图4及下表1、表2所示，常温下的0.25%Try+0.01%EDTA与0.25%Try消化ESC后，细胞活力及活细胞数明显低于三种冷消化方法。传统的常温消化方法消化细胞后，细胞活力低于80%，活细胞数低于1×10⁵/ml；而三种冷消化方法所获得的传代ESC细胞，其细胞活力高于80%，最好的能达到95.0%，活细胞数大于1×10⁵/ml，最好的能达到2×10⁵/ml。

表1  不同消化方法消化后细胞活力的比较(%)

#P﹤0.05与传统0.25%Try消化比较，*P﹤0.05与传统0.25%Try+0.01%EDTA消化比较，实验重复三次。

表2  不同消化方法消化后活细胞数的比较(×10⁵/ml)

#P﹤0.05与传统0.25%Try消化比较，*P﹤0.05与传统0.25%Try+0.01%EDTA消化比较，实验重复三次。

3、不同消化方法消化ESC后细胞黏附率比较

如图5所示，传统的0.25%Try+0.01%EDTA与0.25%Try消化ESC后，细胞黏附率分别为(56.36±2.82)%，(62.2±2.07)%；0.25%Try+0.01%EDTA冷消化2h，0.25%Try冷消化4h，0.25%Dis冷消化6h后的细胞黏附率分别为(50.61±1.88)%，(88.28±2.58)%，(84.72±2.42)%。0.25%Try冷消化4h，0.25%Dis冷消化6h与传统消化方法比较，有统计学意义(P﹤0.05)。

4、不同消化方法消化ESC后传代次数比较：

如图6所示，利用传统的消化方法(0.25%Try+0.01%EDTA与0.25%Try)消化ESC后，细胞一般能传2-3代；利用0.25%Try冷消化4h，0.25%Dis冷消化6h后的细胞一般能传6-8代。

5、不同消化方法消化ESC后24小时观察

如图7到图11所示，传统的消化方法(0.25%Try+0.01%EDTA与0.25%Try)消化ESC后，培养24小时后发现有部分细胞贴壁，细胞生长较差。利用0.25%Try+0.01%EDTA冷消化2h后，培养24小时后同样也有部分细胞贴壁，细胞生长较差。利用0.25%Try冷消化4h，0.25%Dis冷消化6h后，细胞贴壁生长，部分细胞形态似铺路石样。

6、细胞表面标志物整合素β1、CK19、CK10表达情况

如图12-图20所示，原代、2代及4代表皮干细胞均表达干细胞表面特异性分子标志整合素β1(图12-图14)和CK19(图15-到图17),不表达分化标记CK10(图18-图20)。

7、基因组结果

如图21所示，比较了原代ESC、4代两个样本，图中每一行表示一个样本，每一小列表示相同的基因在不用样本中的表达差异。灰色表示基因的表达差异不明显(表达差异变化值为0.5-2)，白色表示基因的表达差异下调(表达差异变化值＜0.5)，黑色表示基因的表达差异上调(表达差异变化值为＞2)。

从图21中结果来看，原代及4代细胞基因组比较结果相近。

从上述免疫组化的结果显示，ESC原代及其传代细胞均表达整合素β1、CK19，不表达CK10，表明其细胞均具有较强的克隆形成能力。基因组结果分析显示，虽然原代ESC与传代的4代细胞在某些基因上的表达有差异，表现在图中即为颜色的差异，在总体上来说，表达模式是相近的；说明利用该方法传代表皮干细胞后，细胞仍能维持表皮干细胞的活性及特性。

综上所述，在4℃条件下冷消化，虽然0.25%Try+0.01%EDTA作用2小时即可将贴壁的完全消化脱落，但次日贴壁情况及细胞生长情况欠佳；0.25%Try、0.25%Dis冷消化时间至少需要4、6小时，但从细胞活力、细胞总数、次日贴壁情况及传代次数上看，均优于0.25%Try+0.01%EDTA；综合考虑消化时间、细胞活力、细胞总数次日贴壁情况及传代次数上看，0.25%Try冷消化4小时为最佳的人表皮干细胞消化传代方法。

综合考虑消化时间、细胞活力、活细胞数、次日贴壁情况及传代次数上看，0.25%Try冷消化4-8小时，消化后细胞活力、活细胞数量、消化后细胞黏附率的数据都很不错，但是从细胞完全脱壁的时间上，4小时的冷消化完全能将培养瓶中的细胞脱落。

实施例2：

人包皮标本取自男性健康包皮，包皮标本取材于2009年5-12月在第三军医大学西南医院泌尿外科和重庆大坪医院医学美容中心行包皮环切术的青年男性20例，平均年龄（23.56±2.43）岁，所有取材均取得患者同意并签署知情同意书，实验内容已通过大坪医院伦理委员会审查。人包皮标本取下后浸泡于PBS平衡盐液中，2℃冰箱中保存，也可以直接按下述的步骤进行人表皮干细胞的分离和培养：

（1）将取下的人包皮标本用酒精浸泡4min，然后用酒精棉球轻轻擦拭四遍，再用PBS平衡盐液冲洗，每个角落均要冲洗到，冲洗的次数为2次，每次不少于5min，直至冲洗到人包皮标本发白发胀；

（2）将PBS平衡盐液冲洗后的人包皮标本剪去皮下组织，并将人包皮标本剪成长方形的条状，长方形条状的尺寸为0.3cm×2cm；然后进行分离消化；分离消化采用0.25%分离酶，加入的分离酶与人包皮标本的体积比例为6:1，加入分离酶后在2℃下消化22h；

（3）将消化后的人表皮干细胞标本用PBS平衡盐液漂洗两次；

（4）将PBS平衡盐液漂洗后的人包皮标本用眼科镊轻轻揭下表皮，完成表皮和真皮的分离；

（5）将分离后所得的表皮进行消化，采用0.25%Try进行消化，加入的Try与人表皮的体积比例为3：1.2，加入分离酶后在39℃孵箱中消化33min；而分离后的真皮部分可用于分离培养成纤维细胞；

（6）将消化后的表皮取出置于另一培养皿中，加含10%FBS的DMEM终止Try消化，用吸管小心反复吹打，尽量使表皮分散，然后用200目筛网进行离心过滤，弃去上清液，并将离心过滤后的表皮放入K-SFM培养液中，制成细胞混悬液，利用计算细胞活力及细胞数，细胞按5×10⁴/孔接种在预先铺满IV型胶原的24孔板中，30min后吸尽未贴壁的细胞，利用计算吸出液中的细胞数和贴壁率，贴壁率=(接种的细胞总数-悬浮的细胞数)/接种的细胞总数，并每天更换K-SFM培养液；

（7）用肉眼判断待细胞融合约为75%后，进行传代培养，传代培养的消化方法包括如下步骤：

a、弃去细胞培养液，磷酸盐缓冲液洗涤3遍；

b、在培养板的每孔中加入0.25%Try各1ml后放入2℃冰箱；。

c、待2h，4h，6h，8h，10h，12h后，在每一个时间点分别取出一个培养板，轻轻拍打细胞脱落，加入含8%FBS的DMEM中和；

d、分别将液体吸入离心管中，用磷酸盐缓冲液轻轻冲洗培养板后移入离心管中，在800rpm/s，离心7min；

e、弃去上清液，加入K-SFM培养基5.8ml重悬细胞后，分别计数，再分别将细胞按5×10⁴/孔接种在预先铺满IV型胶原的24孔板中，30min后吸尽未贴壁的细胞，分别利用计算吸出液中的细胞数，计算贴壁率，贴壁率=(接种的细胞总数-悬浮的细胞数)/接种的细胞总数。

在分离培养的过程中同样观察如下指标：

（1）细胞完全脱落时间；

（2）消化后细胞活力、活细胞数量；

（3）消化后细胞黏附率；

（4）传代次数；

（5）次日贴壁培养观察；

（6）原代细胞与4代细胞的细胞表面分子学标记；

（7）原代细胞与4代细胞的基因组差异。

进行传代培养时，将0.25%Try与0.25%Try+0.01％EDTA、0.25%Dis的消化效果进行对比，会得到实施例1相同的结果。

实施例3：

人包皮标本取自男性健康包皮，包皮标本取材于2009年5-12月在第三军医大学西南医院泌尿外科和重庆大坪医院医学美容中心行包皮环切术的青年男性20例，平均年龄（23.56±2.43）岁，所有取材均取得患者同意并签署知情同意书，实验内容已通过大坪医院伦理委员会审查。人包皮标本取下后浸泡于PBS平衡盐液中，6℃冰箱中保存，也可以直接按下述的步骤进行人表皮干细胞的分离和培养：

（1）将取下的人包皮标本用酒精浸泡7min，然后用酒精棉球轻轻擦拭四遍，再用PBS平衡盐液冲洗，每个角落均要冲洗到，冲洗的次数为2次，每次不少于5min，直至冲洗到人包皮标本发白发胀；

（2）将PBS平衡盐液冲洗后的人包皮标本剪去皮下组织，并将人包皮标本剪成长方形的条状，长方形条状的尺寸为0.3cm×2cm；然后进行分离消化；分离消化采用0.25%分离酶，加入的分离酶与人包皮标本的体积比例为6:1，加入分离酶后在6℃下消化26h；

（3）将消化后的人表皮干细胞标本用PBS平衡盐液漂洗两次；

（4）将PBS平衡盐液漂洗后的人包皮标本用眼科镊轻轻揭下表皮，完成表皮和真皮的分离；

（5）将分离后所得的表皮进行消化，采用0.25%Try进行消化，加入的Try与人表皮的体积比例为3：1.5，加入分离酶后在35℃孵箱中消化26min；而分离后的真皮部分可用于分离培养成纤维细胞；

（6）将消化后的表皮取出置于另一培养皿中，加含10%FBS的DMEM终止Try消化，用吸管小心反复吹打，尽量使表皮分散，然后用200目筛网进行离心过滤，弃去上清液，并将离心过滤后的表皮放入K-SFM培养液中，制成细胞混悬液，利用计算细胞活力及细胞数，细胞按5×10⁴/孔接种在预先铺满IV型胶原的24孔板中，30min后吸尽未贴壁的细胞，利用计算吸出液中的细胞数和贴壁率，，贴壁率=(接种的细胞总数-悬浮的细胞数)/接种的细胞总数，并每天更换K-SFM培养液；

（7）用肉眼判断待细胞融合约为75%后，进行传代培养，传代培养的消化方法包括如下步骤：

a、弃去细胞培养液，磷酸盐缓冲液洗涤3遍；

b、在培养板的每孔中加入0.25%Try各1ml后放入6℃冰箱；。

c、待2h，4h，6h，8h，10h，12h后，在每一个时间点分别取出一个培养板，轻轻拍打细胞脱落，加入含12%FBS的DMEM中和；

d、分别将液体吸入离心管中，用磷酸盐缓冲液轻轻冲洗培养板后移入离心管中，在1200rpm/s，离心5min；

e、弃去上清液，加入K-SFM培养基4.2ml重悬细胞后，分别计数，再分别将细胞按5×10⁴/孔接种在预先铺满IV型胶原的24孔板中，30min后吸尽未贴壁的细胞，分别利用计算吸出液中的细胞数，计算贴壁率，贴壁率=(接种的细胞总数-悬浮的细胞数)/接种的细胞总数。

在分离培养的过程中同样观察如下指标：

（1）细胞完全脱落时间；

（2）消化后细胞活力、活细胞数量；

（3）消化后细胞黏附率；

（4）传代次数；

（5）次日贴壁培养观察；

（6）原代细胞与4代细胞的细胞表面分子学标记；

（7）原代细胞与4代细胞的基因组差异。

进行传代培养时，将0.25%Try与0.25%Try+0.01％EDTA、0.25%Dis的消化效果进行对比，会得到实施例1相同的结果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种人表皮干细胞的分离和培养方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将取下的人包皮标本用酒精浸泡，然后用酒精棉球擦拭，再用PBS平衡盐液冲洗；

(2)将PBS平衡盐液冲洗后的人包皮标本剪去皮下组织，并将人包皮标本剪成长方形的条状，然后进行分离消化；

(3)将消化后的人包皮标本用PBS平衡盐液漂洗；

(4)将PBS平衡盐液漂洗后的人包皮标本的表皮和真皮进行分离；

(5)将分离后所得的表皮进行消化；

(6)将消化后的表皮进行离心过滤，弃去上清液，并将离心过滤后的表皮放入K-SFM培养液中，制成细胞混悬液，计算细胞活力及细胞数，细胞按5×10⁴/孔接种在预先铺满IV型胶原的培养板中，28-32min后吸尽未贴壁的细胞，计算吸出液中的细胞数和贴壁率，并每天更换K-SFM培养液；

(7)待细胞融合大于70％后，进行传代培养，包括下列步骤：

a、弃去细胞培养液，磷酸盐缓冲液洗涤2-3遍；

b、每孔加入0.25％Try各0.8-1.2ml后放入冰箱，保持温度2-6℃；

c、待2-12h后将培养板取出，轻轻拍打细胞脱落，加入含10％FBS的DMEM中和；

d、将液体吸入离心管中，用磷酸盐缓冲液轻轻冲洗培养板后移入离心管中，在800-1200rpm/s，离心5-8min；

e、弃去上清液，加入K-SFM培养基重悬细胞，所述K-SFM培养基按K-SFM培养基与细胞的体积比2.5-3.5:1加入，重悬细胞后，计算细胞数，将细胞按5×10⁴/孔接种在预先铺满IV型胶原的培养板中，28-32min后吸尽未贴壁的细胞，计算吸出液中的细胞数，计算贴壁率；

所述步骤(2)中人包皮标本剪成长方形条状的尺寸为0.3cm×2cm；

所述步骤(2)中采用0.25％分离酶进行分离消化，加入的分离酶与人包皮标本的体积比例为5-7:1，加入分离酶后在2-6℃下消化22-26h；

所述步骤(4)中表皮和真皮进行分离采用眼科镊轻轻揭下表皮即完成表皮和真皮的分离；所述步骤(5)中表皮采用0.25％Try进行消化，加入的Try与表皮的体积比例为3：0.9-1.5，加入分离酶后在35-39℃孵箱中消化25-35min。

2.根据权利要求1所述的一种人表皮干细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述人包皮标本取自人体的健康包皮。

3.根据权利要求2所述的一种人表皮干细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述步骤(1)中酒精浸泡的时间为4-7min，用PBS平衡盐液冲洗的次数为2-4次，每次不少于5min，直至冲洗到人包皮标本发白发胀。

4.根据权利要求1所述的一种人表皮干细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述步骤(6)中和步骤(7)e中的培养板均为24孔培养板。

5.根据权利要求4所述的一种人表皮干细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述步骤(6)和步骤(7)e中利用系统来分析计算细胞活力及细胞数。

6.根据权利要求5所述的一种人表皮干细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述步骤(7)c中0.25％Try在4℃条件下冷消化4-8小时进行传代培养。