CN104974980A - 一种人类羊膜上皮细胞的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人类羊膜上皮细胞的分离方法，包括以下步骤：第一步，采集运输胎盘；第二步，撕取羊膜；第三步，冲洗羊膜；第四步，剪裁羊膜；第五步，消化羊膜上皮面；第六步，终止消化；第七步，离心收集细胞；第八步，羊膜上皮细胞重悬并接种培养。本发明能分离得到高纯度的羊膜上皮细胞，且细胞数量多、活性高，为羊膜上皮细胞的研究和临床应用奠定基础。

Description

一种人类羊膜上皮细胞的分离方法

技术领域

本发明涉及细胞分离方法，具体涉及一种人类羊膜上皮细胞的分离方法。                                                     

背景技术

羊膜是胚胎发育的产物，是一层光滑、无血管和神经的半透明薄膜，其内侧包绕胚胎，外与绒毛膜相延续，其厚度70～180 um，具有较高的韧性。作为胎盘的一部分，羊膜为胎儿提供可调节的符合局部运动的空间和适宜环境，通过滤过和物理缓冲作用，分泌营养因子，保持羊水中水和电解质平衡，抑制母体对胚胎的免疫反应等方式保护发生中的胚胎。

羊膜上皮细胞起源于受精后第8天的上胚层细胞(epiblast)，与最终发育成胎儿的起源相同，并且在发育的时间上早于原肠胚形成，因此理论上讲羊膜上皮细胞更好地保持前原肠胚细胞的可塑性 ，具有类似胚胎干细胞的生物学特性，其分化能力强，可向三个胚层分化，并且无致瘤性及伦理学问题。且羊膜上皮不表达人类白细胞抗原HLA-I及HLA-                                                ，无异体免疫排斥反应^[7]，因此适合用于细胞治疗。

目前广泛使用的酶解法将羊膜剪碎或者剪成小块利用胰蛋白酶进行消化，并将消化产物直接培养获得羊膜上皮细胞。如CN 104371971 A公开 “一种分离获得羊膜上皮细胞的方法”，将羊膜组织加入胶原酶溶液孵育；然后将羊膜组织加入胰蛋白酶溶液进行消化；将上清液离心后获得羊膜上皮细胞。这种方法会将羊膜上的其他细胞一同分离下来，比如说羊膜间充质干细胞，从而导致细胞不纯，需要进一步纯化。从而导致分离步骤繁琐成功率低。采用酶解法分离羊膜上皮细胞细胞没有统一的标准，分离出来的细胞普遍存在活性差、细胞数量不够、细胞纯度不高、羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞混杂生长的情况。而由于两种细胞的生长特性的差异，混杂培养后由于羊膜间充质细胞分裂能力比羊膜上皮细胞强，多次传代培养后，最终因竞争不过而导致羊膜上皮细胞越来越少直至消失。这样就很难保证有足够的数量和纯度的羊膜上皮细胞用于研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种人类羊膜上皮细胞的分离方法，能分离得到高纯度的羊膜上皮细胞，且细胞数量多、活性高，为羊膜上皮细胞的研究和临床应用奠定基础。

本发明所述的一种人类羊膜上皮细胞的分离方法，包括以下步骤：

第一步，采集运输胎盘，先将采集到的新鲜胎盘放入盛有0.9%质量浓度生理盐水的无菌塑料袋中，密封后放入保护盒中；再将保护盒放入温度为2℃～8℃的运输箱中，并在12小时内运输到细胞分离室；此过程保证了胎盘组织的新鲜及羊膜上皮细胞的活性，为接下来的分离培养分离提供质量保证。

第二步，撕取羊膜，细胞分离人员将接收到的新鲜胎盘放置在圆盘中，先用生理盐水冲洗新鲜胎盘表面，再从新鲜胎盘上完整的撕下羊膜；

第三步，冲洗羊膜，先将撕下的羊膜放入肾形盘中展开冲洗，并用止血钳去除羊膜上的血丝，再用生理盐水反复冲洗至少5次，直至羊膜干净；

第四步，剪裁羊膜，先将冲洗干净的羊膜剪裁成圆形，圆形直径大小较相应培养皿直径大3～4cm，将圆形的羊膜上皮面朝上覆盖于培养皿上，并且圆形的羊膜边缘必须在培养皿边缘之上；这样操作为了确保在接下来的消化过程中胰蛋白酶只单独接触羊膜上皮面。

第五步，消化羊膜上皮面，将0.25%质量浓度的胰蛋白酶液加入到覆盖有羊膜的培养皿中，直至胰蛋白酶液接近装满培养皿，在使羊膜上皮面充分接触胰蛋白酶同时，羊膜的其他部位接触不到胰蛋白酶；在37℃恒温静止消化40～80分钟；消化时间的长短因不同个体羊膜的厚度、面积等不同而有所变化。

第六步，终止消化，消化结束后，先用移液管将培养皿中的胰蛋白酶液吸出并弃之，再用移液枪加入含10%体积浓度胎牛血清的EMDM-F12培养液（其中的胎牛血清起到终止残余的胰蛋白酶的消化作用），并用移液枪吹打培养皿中的羊膜上皮面，使上面的经过消化的羊膜上皮细胞脱离羊膜进入到细胞培养液中，经过反复吹打直至细胞培养液变的浑浊，然后，收集细胞培养液置于50ml离心管中；此步骤重复3～5次，以便分离下更多的羊膜上皮细胞。

第七步，离心收集细胞，将收集到的细胞培养液在（Thermo Scientific Sorvall ST16R型号）离心机上，以300～500g离心力（离心力的大小根据液体的粘稠程度在此区间调整，越黏稠需要的离心力越大）离心5～10分钟；

第八步，羊膜上皮细胞重悬并接种培养，离心后弃去上清液，离心管底部的羊膜上皮细胞沉淀用10mlEMDM-F12培养液（含10%体积浓度胎牛血清）重悬，取少量悬液用于细胞计数、活率检测以及流式检测，以1.0～1.3×10⁵/cm²的密度接种细胞。此时得到的羊膜上皮细胞的数量可达到1×10⁸以上，纯度可达到99.9%以上。

    本发明分离得到的是高纯度的羊膜上皮细胞，且保持着较高的分化潜能。培养的原代羊膜上皮细胞形态为典型的上皮细胞形态，且培养后没有出现羊膜间质细胞。分离的羊膜上皮细胞经流式细胞仪检测后，细胞纯度可达到99.9%以上，经多次传代培养后细胞形态一直保持稳定，而且未出现羊膜间充质干细胞。本发明分离成功率高，形成了一套分离、培养、检测的全程质量控制的操作工艺及方法，使羊膜上皮细胞的分离达到标准化要求且极其有利于产业化。                                                                

附图说明

图1是将羊膜从胎盘上撕下的图片；

图2是将羊膜正面朝上置于塑料培养皿中消化的图片；

图3是本发明分离的羊膜上皮细胞原代培养图片（培养一段时间后看不到间质样细胞出现）；

图4是其他方法分离的羊膜上皮细胞原代培养图片（培养一段时间后出现间质样细胞混杂生长的现象）；

图5是流式细胞仪检测本发明分离的羊膜上皮细胞特异性表面抗原SSEA-4，阳性率在90%以上的曲线图；

图6是流式细胞仪检测本发明分离的羊膜上皮细胞表面抗原CD45为阴性，阴性率在2%以下的曲线图；

图7是流式细胞仪检测本发明分离的羊膜上皮细胞表面抗原HLA-DR为阴性，阴性率在2%以下的曲线图；

图8是流式细胞仪检测本发明分离的羊膜上皮细胞表面抗原CD34为阴性，阴性率在2%以下的曲线图；

图9是羊膜上皮细胞裸鼠皮下成骨诱导组织切片图（阿辛蓝染色，箭头所指为软骨组织）；

图10是羊膜上皮细胞的成脂分化图（油红染色，箭头所指为脂滴）。

具体实施方式

下面结合图片对对本发明作进一步的说明。

所述的一种人类羊膜上皮细胞的分离方法，包括以下步骤：

第一步，采集运输胎盘，先将采集到的新鲜胎盘放入盛有0.9%质量浓度生理盐水的无菌塑料袋中，密封后放入保护盒中；再将保护盒放入温度为2℃～8℃的运输箱中，并在12小时内运输到细胞分离室；此过程保证了胎盘组织的新鲜及羊膜上皮细胞的活性，为接下来的分离培养分离提供质量保证。

第二步，撕取羊膜，细胞分离人员将接收到的新鲜胎盘放置在圆盘中，先用生理盐水冲洗新鲜胎盘表面，再从新鲜胎盘上完整的撕下羊膜（参见图1）；

第三步，冲洗羊膜，先将撕下的羊膜放入肾形盘中展开冲洗，并用止血钳去除羊膜上的血丝，再用生理盐水反复冲洗至少5次，直至羊膜干净；

第四步，剪裁羊膜，先将冲洗干净的羊膜剪裁成圆形，圆形直径大小较相应培养皿直径大3～4cm，将圆形的羊膜上皮面朝上覆盖于培养皿上，并且圆形的羊膜边缘必须在培养皿边缘之上；这样操作为了确保在接下来的消化过程中胰蛋白酶只单独接触羊膜上皮面（参见图2）。

第五步，消化羊膜上皮面，将0.25%质量浓度的胰蛋白酶液加入到覆盖有羊膜的培养皿中，直至胰蛋白酶液接近装满培养皿，在使羊膜上皮面充分接触胰蛋白酶同时，羊膜的其他部位接触不到胰蛋白酶；在37℃恒温静止消化40～80分钟；消化时间的长短因不同个体羊膜的厚度、面积等不同而有所变化。

第六步，终止消化，消化结束后，先用移液管将培养皿中的胰蛋白酶液吸出并弃之，再用移液枪加入含10%体积浓度胎牛血清的EMDM-F12培养液（其中的胎牛血清起到终止残余的胰蛋白酶的消化作用），并用移液枪吹打培养皿中的羊膜上皮面，使上面的经过消化的羊膜上皮细胞脱离羊膜进入到细胞培养液中，经过反复吹打直至细胞培养液变的浑浊，然后，收集细胞培养液置于50ml离心管中；此步骤重复3～5次，以便分离下更多的羊膜上皮细胞。

第七步，离心收集细胞，将收集到的细胞培养液在（Thermo Scientific Sorvall ST16R型号）离心机上，以300～500g离心力（离心力的大小根据液体的粘稠程度在此区间调整，越黏稠需要的离心力越大）离心5～10分钟；

第八步，羊膜上皮细胞重悬并接种培养，离心后弃去上清液，离心管底部的羊膜上皮细胞沉淀用10mlEMDM-F12培养液（含10%体积浓度胎牛血清）重悬，取少量悬液用于细胞计数、活率检测以及流式检测，以1.0～1.3×10⁵/cm²的密度接种细胞。此时得到的羊膜上皮细胞的数量可达到1×10⁸以上，纯度可达到99.9%以上。

本发明从胎盘的采集、运输、直到分离细胞的整个过程中都已经拥有一套成熟的操作流程，能能确保胎盘的新鲜以及羊膜上皮细胞的活性。本发明相比现有的技术，其优点是分离的细胞数量更多、纯度更高、活性更强，同时保持了细胞的分化潜能。

采用本发明分离获得的羊膜上皮细胞的检测验证结果可以证明，分离得到的是高纯度的羊膜上皮细胞，且保持着较高的分化潜能。

分离下来培养的原代羊膜上皮细胞形态为典型的上皮细胞形态，与文献描述的一致。且培养后没有出现羊膜间质细胞（见图3）。用其他方法分离的细胞原代培养图片，培养一段时间后出现间质样细胞（见图4）。

采用本发明，一张完整的羊膜可以分离获得2×10⁸以上的高纯度的羊膜上皮细胞，分离得到的羊膜上皮细胞活率在96%以上，经流式细胞仪检测羊膜上皮细胞特异性表面抗原SSEA-4阳性率在95%以上，CD34、CD45、HLA-DR阴性标记物阳性率在2%一下。

流式细胞仪检测本发明分离的羊膜上皮细胞特异性表面抗原SSEA-4，阳性率在95%以上（见图5）。

流式细胞仪检测本发明分离的羊膜上皮细胞表面抗原CD45为阴性，阴性率在2%以下（见图6）。

流式细胞仪检测本发明分离的羊膜上皮细胞表面抗原HLA-DR为阴性，阴性率在2%以下（见图7）。

流式细胞仪检测本发明分离的羊膜上皮细胞表面抗原CD34为阴性，阴性率在2%以下（见图8）。

采用本发明分离获得的羊膜上皮细胞完全能够满足科研或者临床应用的需要，从而解决了羊膜上皮细胞因不易体外培养扩增导致的细胞数量不足的问题。且此方法重复性好，成功率在在98%以上，从而使羊膜上皮细胞的分离达到标准化要求，更易于产业化。

采用本发明获得的羊膜上皮细胞的成骨诱导分化，羊膜上皮细胞裸鼠皮下成骨诱导组织切片，阿辛蓝染色，箭头所指为软骨组织。(见图9)。

采用本发明获得的羊膜上皮细胞的成脂诱导分化，羊膜上皮细胞的成脂分化，油红染色，箭头所指为脂滴(见图10)。

Claims (1)

1.一种人类羊膜上皮细胞的分离方法，包括以下步骤：

第一步，采集运输胎盘，先将采集到的新鲜胎盘放入盛有0.9%质量浓度生理盐水的无菌塑料袋中，密封后放入保护盒中；再将保护盒放入温度为2℃～8℃的运输箱中，并在12小时内运输到细胞分离室；此过程保证了胎盘组织的新鲜及羊膜上皮细胞的活性，为接下来的分离培养分离提供质量保证；

第二步，撕取羊膜，细胞分离人员将接收到的新鲜胎盘放置在圆盘中，先用生理盐水冲洗新鲜胎盘表面，再从新鲜胎盘上完整的撕下羊膜；

第三步，冲洗羊膜，先将撕下的羊膜放入肾形盘中展开冲洗，并用止血钳去除羊膜上的血丝，再用生理盐水反复冲洗至少5次，直至羊膜干净；

第四步，剪裁羊膜，先将冲洗干净的羊膜剪裁成圆形，圆形直径大小较相应培养皿直径大3～4cm，将圆形的羊膜上皮面朝上覆盖于培养皿上，并且圆形的羊膜边缘必须在培养皿边缘之上；这样操作为了确保在接下来的消化过程中胰蛋白酶只单独接触羊膜上皮面；

第五步，消化羊膜上皮面，将0.25%质量浓度的胰蛋白酶液加入到覆盖有羊膜的培养皿中，直至胰蛋白酶液接近装满培养皿，在使羊膜上皮面充分接触胰蛋白酶同时，羊膜的其他部位接触不到胰蛋白酶；在37℃恒温静止消化40～80分钟；消化时间的长短因不同个体羊膜的厚度、面积等不同而有所变化；

第六步，终止消化，消化结束后，先用移液管将培养皿中的胰蛋白酶液吸出并弃之，再用移液枪加入含10%体积浓度胎牛血清的EMDM-F12培养液，并用移液枪吹打培养皿中的羊膜上皮面，使上面的经过消化的羊膜上皮细胞脱离羊膜进入到细胞培养液中，经过反复吹打直至细胞培养液变的浑浊，然后，收集细胞培养液置于50ml离心管中；此步骤重复3～5次，以便分离下更多的羊膜上皮细胞；

第七步，离心收集细胞，将收集到的细胞培养液在离心机上，以300～500g离心力离心5～10分钟；

第八步，羊膜上皮细胞重悬并接种培养，离心后弃去上清液，离心管底部的羊膜上皮细胞沉淀用10mlEMDM-F12培养液重悬，取少量悬液用于细胞计数、活率检测以及流式检测，以1.0～1.3×10⁵/cm²的密度接种细胞。