CN103525752B - 一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法 - Google Patents
一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103525752B CN103525752B CN201310435023.0A CN201310435023A CN103525752B CN 103525752 B CN103525752 B CN 103525752B CN 201310435023 A CN201310435023 A CN 201310435023A CN 103525752 B CN103525752 B CN 103525752B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- mammary epithelial
- tissue
- inoblast
- nutrient solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及组织与细胞工程领域，尤其提供了一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法，该方法主要包括以下步骤：1）组织取样：无菌采集山羊乳腺腺泡组织；2）分离细胞：组织块培养法分离乳腺上皮细胞和成纤维细胞；3）纯化细胞：差速消化法结合差速贴壁法除去成纤维细胞即可得到纯化的乳腺上皮细胞。本发明方法操作简便，通过常规的细胞培养操作即可得到充分纯化的乳腺上皮细胞。采用本发明获得的乳腺上皮细胞形态整齐、增殖旺盛，可应用于乳腺生长发育、泌乳机制以及验证乳腺组织特异性表达载体有效性的研究。
Description
技术领域
本发明涉及组织与细胞工程领域，尤其提供了一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法。
背景技术
乳腺为复管泡状腺，由被膜、间质和实质组成。一般来说，上皮细胞构成了乳腺实质的腺泡和导管系统。多数上皮是内衬于腺泡腔表面，具有分泌功能的腺泡上皮，除此之外还有构成导管系统的导管上皮以及包绕在导管和腺泡外表面的肌上皮。构成间质的主要是脂肪细胞，但是成纤维细胞、造血系统细胞、血管和神经也存在其中。
乳腺上皮细胞是研究乳腺生长发育、泌乳机制以及验证乳腺组织特异性表达载体有效性的体外模型。目前原代乳腺上皮细胞培养大都采用胶原酶消化法和组织块培养法。利用胶原酶消化乳腺组织，再经过密度梯度离心可以得到较纯净的上皮细胞，但此种方法操作复杂，往往因为消化和离心而损失大量细胞，对后期的传代培养和实验造成不利影响。组织块培养法操作过程简单，节约组织样品，而且避免了消化和离心对细胞造成的不良影响。但是细胞从组织块中长出所需的时间较长，成纤维细胞等结缔组织细胞最先长出，上皮细胞大量出现较为滞后。无论是采用胶原酶消化法还是组织块培养法，原代乳腺上皮细胞的培养均得到上皮细胞和成纤维细胞的混合物。
现在研究可知目前没有可用于研究的商品化的反刍动物乳腺上皮细胞系，当前用于研究的乳腺上皮细胞多是由科研人员自行从乳腺组织中分离，主要应用的分离方法是组织块培养法和酶消化法。乳腺组织中细胞类型众多，采用上述方法获得的乳腺上皮细胞都是多种类型细胞的混合体，必须进行纯化培养后才能用于后续实验，但是其分离和纯化效果都难以令人满意，因此需要更加有效的分离和纯化方法。
发明内容
本发明基于上述原因，提供了一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法，该方法主要包括以下步骤：1）组织取样：无菌采集山羊乳腺腺泡组织；2）分离细胞：组织块培养法分离乳腺上皮细胞和成纤维细胞；3）纯化细胞：差速消化法结合差速贴壁法除去成纤维细胞即可得到纯化的乳腺上皮细胞。本发明方法操作简便，通过常规的细胞培养操作即可得到充分纯化的乳腺上皮细胞。采用本发明获得的乳腺上皮细胞形态整齐、增殖旺盛，可应用于乳腺生长发育、泌乳机制以及验证乳腺组织特异性表达载体有效性的研究。
本发明的具体技术方案是：
一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法，该方法主要包括以下步骤：
1）组织取样：无菌采集山羊乳腺腺泡组织；
2）分离细胞：组织块培养法分离乳腺上皮细胞和成纤维细胞；
3）纯化细胞：差速消化法结合差速贴壁法除去成纤维细胞即可得到纯化的乳腺上皮细胞。
更为具体的方法是：
1）组织取样：无菌采集山羊乳腺腺泡组织；发明人发现当选用纯种崂山奶山羊泌乳期30天的乳腺腺泡组织时，可以为后续工作取得更好的效果。
2）分离细胞：组织块培养法分离乳腺上皮细胞和成纤维细胞，具体步骤为：
a.用含有200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素的PBS清洗上述获得的乳腺腺泡组织，并将其分割成0.5-1mm3的小组织块；
b.用高浓度血清培养基浸润a中所述小组织块，以间隔0.5cm接种于培养皿底，在37℃、5vt%浓度CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养4小时，上述高浓度血清培养基为含有50vt%FBS的DF12培养基；
其中所述的高浓度血清培养基为FBS和DF12以体积比1:1配制出的培养基；这也是本发明与现有技术的不同之一，现有技术中一般FBS和DF12是以体积比1:9的配比制备培养基，如下述步骤c中的培养液，但是在该步骤中发明人却采用了这种高浓度的血清培养基，实际上相当于传统方法中在培养皿底包被胶原的步骤，但是步骤没有包被胶原那么繁琐，降低了操作的难度，能够起到较好的效果，主要体现在1.有利于组织块的贴壁，2.有利于组织细胞的游出与生长两个方面；同时，发明人在实验了现有技术中FBS和DF12以体积比1:9的配比制备培养基之后，发现这一培养基难以满足组织贴壁的需要，故而进行了多次实验和调整后，最终确定了采用FBS和DF12以体积比1:1配制出的培养基；采用这种培养基浸润组织块后可以实现快速贴壁，且这种培养基仅作为浸润时使用，并不用于后续的培养，而由于采用了组织贴壁法，相比与现有的酶消化法获得的细胞而言，这种方法避免了长时间酶消化可能对细胞造成的损伤。
c.向上述培养皿中加入培养液，使其刚好覆盖培养皿底，置于37℃、5vt%浓度CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养，12小时后补加培养液至完全浸没组织块为止，2天后更换半量培养液，以后每2天更换半量培养液，总共培养至少8天后即得混合其它细胞生长的乳腺上皮细胞，
上述培养液为体积比FBS：DF12为1:9的溶液，其中还含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10μg/L表皮生长因子和10万IU/L青链霉素双抗；
上述所采用的各种材料均为市场上直接购得，在此不再赘述；
b步骤中，为了达到较好的效果且缩短整个操作的时间，一般将浸润时间控制在2-4min；
3）纯化细胞：差速消化法结合差速贴壁法除去成纤维细胞，得到纯化的乳腺上皮细胞，具体步骤如下：
a.差速消化法：向上述混合其它细胞生长的乳腺上皮细胞的培养物中加入消化液消化细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，待成纤维细胞脱离底壁时，吸弃消化液去除成纤维细胞，利用残留的消化液继续消化1-2分钟，加入培养液终止消化，将剩余的细胞吹打成单细胞悬液；
采用这种差速消化的方式，可以消化去除成纤维细胞，同时保留乳腺上皮细胞。在消化的过程中，成纤维细胞首先脱离底壁，漂浮在消化液中，而此时乳腺上皮细胞还没有被消化脱离底壁，此时将培养皿内的消化液吸弃，从而将成纤维细胞和乳腺上皮细胞分离，由于底壁还会残留少量消化液，而且它足以使乳腺上皮细胞脱离底壁，所以不用再添加新鲜的消化液，此后终止消化、吹打均匀后再传代培养即可。
其中所述消化液为等体积混合的不含钙镁离子的PBS和0.25wt%胰蛋白酶的EDTA溶液，消化条件为室温25℃，成纤维细胞消化时间为1.5-2分钟，其中所采用的0.25wt%胰蛋白酶的EDTA溶液购自gibco公司，其英文名称为0.25%Trypsin-EDTA，一般使用时根据具体使用情况，控制消化液的用量过量即可保证全部消化完成；
所述的培养液为体积比FBS：DF12为1:9的溶液，其中还含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10μg/L表皮生长因子和10万IU/L青链霉素双抗；
b.差速贴壁法：将上述的单细胞悬液移入新的培养皿中培养20分钟，待成纤维细胞贴壁后，转移培养液至另一个新的培养皿中继续培养，原培养皿添加新的培养液继续培养，如此转移3次，每次转移的时间间隔均为20分钟，12小时后更换培养液，以后每2天换液一次；
上述各培养皿培养3-4天后，选择其中纯化程度和生长密度最好的培养皿，重复步骤a和步骤b进行传代纯化，如此传至第4代即得到纯化的乳腺上皮细胞。
之所以采用b步骤这种方法，主要原因在于：由于贴壁速度的差异，通过转移含有细胞的培养液，将贴壁速度快的成纤维细胞留在原先的培养皿中，从而达到纯化乳腺上皮细胞的目的；
而再转移3次的意思是：将a步骤中获得的单细胞悬液依次转移经过4个培养皿，每个培养皿中停留20分钟，每次转移的均是培养皿中的停留20分钟的培养液，这样就使得培养液中的细胞按顺序在4个培养皿中贴壁，由于成纤维细胞贴壁快于乳腺上皮细胞，所以转移经过的前两个培养皿，成纤维细胞贴壁多，而后两个培养皿贴壁得到的是较为纯净的乳腺上皮细胞，每次转移后再在原培养皿中补加新鲜培养液继续培养，2-3天后比较各培养皿细胞形态，选择最佳继续纯化即可，而之所以限定总共转移的次数为3次，主要原因在于如果转移两次可能分离不彻底，转移次数过多贴壁存活的细胞也会大大减少，浪费试剂及实验材料,实验表明转移3次可以充分分离成纤维细胞，得到纯化的乳腺上皮细胞。
而之所以选择培养皿培养3-4天后进行传代纯化，主要原因就是采用本发明的方法后，一般需要上述的时间，才能保证贴壁细胞增殖占据培养皿底壁面积的90%左右，才能达到传代的要求；而如果细胞贴壁很多，两天左右即可传代，如果贴壁较少，则需要生长更长时间才能传代，因此3-4天为一般性选择；
选择其中纯化程度和生长密度最好的培养皿时，一般采用现有技术的常用方法进行判定，如观察细胞形态，本发明的具体做法是：鉴于成纤维细胞和上皮细胞的形态不同，这里选择的标准是显微镜下观察到的成纤维细胞数量最少，细胞形态一致生长密度最佳，选取这种培养皿继续进行纯化培养，其后期获得的乳腺上皮细胞纯化效果最好；
本发明的发明人发现，采用本发明的方法后，一般经过4代的纯化后就得到了形态一致的乳腺上皮细胞，再经过多次传代也没有出现成纤维细胞明显生长的现象，说明纯化4代即可得到充分纯化的乳腺上皮细胞，而低于4代则达不到最佳的纯化效果，故而选择纯化至第4代即可，纯化次数过多则会浪费大量细胞，而且会增加整个方法的成本。
对于本领域而言，本发明的最大进步就在于采用了FBS和DF12以体积比1:1配制出的高浓度血清培养基，浸润小组织块后直接贴壁培养，分离得到乳腺上皮细胞。使用该方法不但避免了长时间酶消化对组织细胞造成的损伤，同时省去了传统方法中制备胶原的步骤，获得了组织贴壁良好，细胞生长旺盛的混合培养体系。纯化法中采用的消化液的浓度、消化成纤维细胞的时间、温度以及差速贴壁时细胞转移的次数和转移时间间隔均为本发明所特有，与现有技术有着较大的差距。本方法在室温条件下采用低浓度胰蛋白酶，快速、有效地消化分离了混合体系中的成纤维细胞，同时降低了胰蛋白酶消化可能对细胞造成的不利影响；根据成纤维细胞和乳腺上皮细胞贴壁时间的差异，采用间隔20分钟连续转移培养皿培养的方法，进一步分离除去成纤维细胞，得到了纯净的乳腺上皮细胞培养体系，本发明方法保证了上皮细胞的纯度、活力以及其本身固有的特性。
综上所述，本发明提供的方法操作简便，通过常规的细胞培养操作即可得到充分纯化的乳腺上皮细胞。采用本发明获得的乳腺上皮细胞形态整齐、增殖旺盛，可应用于乳腺生长发育、泌乳机制以及验证乳腺组织特异性表达载体有效性的研究。
附图说明
图1是培养至第8天的组织块及其周围的细胞；
图2是组织块培养法分离获得的第一代混合生长的乳腺细胞；
图3是纯化的第4代乳腺上皮细胞；
图4是乳腺上皮细胞角蛋白免疫荧光图像；
具体实施方式
下面通过具体的制备实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例和试验例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1山羊乳腺上皮细胞的取样与处理
采用现有技术直接无菌采集青岛奥特种羊场纯种崂山奶山羊泌乳期30天的乳腺组织；
用PBS冲洗采集乳腺组织块，除去其表面的血液和羊奶；冲洗干净后后浸入含有200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素的DF12培养基中，置于冰盒内迅速带回实验室处理，用含有200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素的PBS反复冲洗乳腺组织，直到冲洗液变清亮为止，在超净台上分割修剪，去除脂肪组织和结缔组织并冲洗至冲洗液清亮，即可得到得到的白色颗粒状的腺泡组织。
实施例2组织块培养法分离乳腺上皮细胞和成纤维细胞
a.用眼科剪和眼科镊将上述白色颗粒状的乳腺腺泡组织分割成0.5-1mm3左右的小组织块，同时用含有200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素的PBS漂清获得的小组织块；
b.用FBS和DF12以体积比1:1配制出的培养基浸润所述小组织块2-4分钟，间隔0.5cm接种于培养皿底，置于37℃、5vt%浓度CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养4小时；
c.向上述培养皿中加入培养液，使其刚好覆盖培养皿底，置于37℃、5vt%浓度CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养，12小时后补加培养液至完全浸没组织块为止，2天后更换半量培养液，以后每2天更换半量培养液，5天左右可以看到组织块周围有细胞迁出，8天左右可以看到混合生长的乳腺上皮细胞和成纤维细胞。如附图1所示，阴影部分为为组织块，椭圆形或呈铺路石状的为乳腺上皮细胞，形态为长形或梭形的是成纤维细胞。
将原代细胞消化传代，即可得到更为明显的混合生长的乳腺上皮细胞和成纤维细胞。如图2所示，岛屿状聚集生长的椭圆形或铺路石状细胞为乳腺上皮细胞，乳腺上皮细胞周围游离生长的长形或梭形细胞为成纤维细胞。
上述培养为液体体积比FBS：DF12为1:9的溶液，其中还含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10μg/L表皮生长因子和10万IU/L青链霉素双抗。
实施例3
速消化法结合差速贴壁法除去成纤维细胞，得到纯化的乳腺上皮细胞，具体步骤如下：
a.差速消化法：向实施例2中获得的混合其它细胞生长的乳腺上皮细胞的培养物中加入消化液消化细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，待成纤维细胞脱离瓶壁时，吸弃消化液去除成纤维细胞，利用残留的消化液继续消化1-2分钟，加入培养液终止消化，将剩余的细胞吹打成单细胞悬液；
其中所述消化液为等体积混合的不含钙镁离子的PBS和0.25%Trypsin-EDTA溶液，消化条件为室温25℃，成纤维细胞消化时间为1.5-2分钟；
所述的培养液为液体体积比FBS：DF12为1:9的溶液，其中还含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10μg/L表皮生长因子和10万IU/L青链霉素双抗；
b.差速贴壁法：将上述的单细胞悬液移入新的培养皿中培养20分钟，待成纤维细胞贴壁后，转移培养液至另一个新的培养皿中继续培养，20分钟后再次转移到新的培养皿中，如此转移3次，原培养皿添加新的培养液继续培养，12小时后更换培养液，以后每2天换液一次，直至贴壁生长的细胞占据培养皿底面积的90%左右，时间一般为3-4天；
选择步骤b中纯化程度和生长密度最好的培养皿，重复步骤a和步骤b进行传代纯化，如此传至第4代即得到纯化的乳腺上皮细胞。如图3所示，细胞形态整齐，呈椭圆形或铺路石状，为典型的上皮细胞形态。
实施例4上皮细胞角蛋白免疫荧光鉴定
对传代培养分离纯化的山羊乳腺上皮细胞进行角蛋白18免疫荧光鉴定，所用方法参照武汉博士德生物工程有限公司免疫荧光试剂盒说明书，操作完成后用Hoechst33342复染细胞核，倒置荧光显微镜观察并拍照，其结果如图4所示。图中红色荧光部分为表达于细胞质中的角蛋白18，蓝色部分为Hoechst33342染色的细胞核，本实验结果说明了使用本发明获得了充分纯化的奶山羊乳腺上皮细胞。
Claims (2)
1.一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法，该方法主要包括以下步骤：
1)组织取样：无菌采集山羊乳腺腺泡组织；
2)分离细胞：组织块培养法分离乳腺上皮细胞和成纤维细胞；
3)纯化细胞：差速消化法结合差速贴壁法除去成纤维细胞即可得到纯化的乳腺上皮细胞；
其中所述步骤2)分离细胞：组织块培养法分离乳腺上皮细胞和成纤维细胞，具体步骤为：
a.用含有200U/mL青霉素和200μg/mL链霉素的PBS清洗获得的乳腺腺泡组织，并将其分割成0.5-1mm3的小组织块；
b.用高浓度血清培养基浸润步骤a中所述小组织块，以间隔0.5cm接种于培养皿底，在37℃、5vt％浓度CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养4小时；上述高浓度血清培养基为含有50vt％FBS的DF12培养基；
c.向上述培养皿中加入培养液，使其刚好覆盖培养皿底，置于37℃、5vt％浓度CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养，12小时后补加培养液至完全浸没组织块为止，2天后更换半量培养液，以后每2天更换半量培养液，总共培养至少8天后即得混合其他细胞生长的乳腺上皮细胞，
上述培养液为体积比FBS：DF12为1:9的溶液，其中还含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10μg/L表皮生长因子和10万IU/L青链霉素双抗；
所述步骤3)中纯化细胞：差速消化法结合差速贴壁法除去成纤维细胞，得到纯化的乳腺上皮细胞，具体步骤如下：
a.差速消化法：向步骤2)获得的混合其他细胞生长的乳腺上皮细胞的培养物中加入消化液消化细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，待成纤维细胞脱离瓶壁时，吸弃消化液去除成纤维细胞，利用残留的消化液继续消化1-2分钟，加入培养液终止消化，将剩余的细胞吹打成单细胞悬液；
其中所述消化液为等体积混合的不含钙镁离子的PBS和0.25wt％胰蛋白酶的EDTA溶液，消化条件为室温25℃，成纤维细胞消化时间为1.5-2分钟；
所述的培养液为体积比FBS：DF12为1:9的溶液，其中还含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10μg/L表皮生长因子和10万IU/L青链霉素双抗；
b.差速贴壁法：将上述的单细胞悬液移入新的培养皿中培养20分钟，待成纤维细胞贴壁后，转移培养液至另一个新的培养皿中继续培养，原培养皿添加新的培养液继续培养，如此转移3次，每次转移的时间间隔均为20分钟，12小时后更换培养液，以后每2天换液一次；
上述各培养皿培养3-4天后，选择其中纯化程度和生长密度最好的培养皿，重复步骤a和步骤b进行传代纯化，如此传至第4代即得到纯化的乳腺上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法，其特征在于：所述步骤2)中b步骤中浸润时间控制在2-4分钟。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310435023.0A CN103525752B (zh) | 2013-09-21 | 2013-09-21 | 一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310435023.0A CN103525752B (zh) | 2013-09-21 | 2013-09-21 | 一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103525752A CN103525752A (zh) | 2014-01-22 |
| CN103525752B true CN103525752B (zh) | 2015-02-25 |
Family
ID=49928105
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310435023.0A Expired - Fee Related CN103525752B (zh) | 2013-09-21 | 2013-09-21 | 一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103525752B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104403992A (zh) * | 2014-12-05 | 2015-03-11 | 中华人民共和国泰州出入境检验检疫局 | 一种大鼠乳腺上皮细胞原代培养的方法 |
| CN105132353A (zh) * | 2015-08-25 | 2015-12-09 | 扬州大学 | 一种获取单克隆细胞的方法 |
| CN109468271A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-03-15 | 广州暨大美塑生物科技有限公司 | 一种皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法 |
| CN111117965A (zh) * | 2020-01-08 | 2020-05-08 | 宁波市医疗中心李惠利医院 | 一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法 |
| CN112852717B (zh) * | 2021-04-06 | 2023-10-13 | 河南牧业经济学院 | 一种高效分离培养猪乳腺上皮细胞的方法 |
| CN113215098B (zh) * | 2021-06-04 | 2023-02-24 | 安徽医科大学第一附属医院 | 一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法 |
| CN114717179B (zh) * | 2022-03-21 | 2024-03-15 | 中国科学院亚热带农业生态研究所 | 一种山羊胰腺腺泡细胞的分离培养及鉴定方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101812428A (zh) * | 2010-04-26 | 2010-08-25 | 西北农林科技大学 | 一种乳腺上皮细胞的组织块种植方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101302494A (zh) * | 2008-06-23 | 2008-11-12 | 中国科学院东北地理与农业生态研究所 | 一种奶牛乳腺细胞体外分离培养方法 |
-
2013
- 2013-09-21 CN CN201310435023.0A patent/CN103525752B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101812428A (zh) * | 2010-04-26 | 2010-08-25 | 西北农林科技大学 | 一种乳腺上皮细胞的组织块种植方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 邵桃玉,等.山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的制备和鉴定.《上海畜牧兽医通讯》.2008,(第4期),24-26. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103525752A (zh) | 2014-01-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103525752B (zh) | 一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法 | |
| WO2017096607A1 (zh) | 一种从脐带外层羊膜组织中分离提取hUC-MSC的方法 | |
| CN102191218B (zh) | 一种完全培养基及人羊膜间充质干细胞的培养方法 | |
| CN110317780B (zh) | 一种胎盘底蜕膜间充质干细胞制备方法 | |
| CN105543164A (zh) | 一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法 | |
| CN103484424B (zh) | 一种获得山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的方法 | |
| CN104450611A (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法 | |
| CN104480062A (zh) | 一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法 | |
| CN107354130B (zh) | 一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法 | |
| CN103333854B (zh) | 一种绒山羊毛囊干细胞体外高效培养的技术方法 | |
| CN109628373B (zh) | 一种收获三维微载体上的细胞的方法 | |
| CN104974980A (zh) | 一种人类羊膜上皮细胞的分离方法 | |
| CN103013912A (zh) | 密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞的方法 | |
| CN107236705B (zh) | 一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系 | |
| CN111690686B (zh) | 一种miRNA高表达在促进脐带间充质干细胞体外增殖和成骨分化方面的应用 | |
| CN111235100B (zh) | 一种人脐带血间充质干细胞的培养方法 | |
| CN111363717B (zh) | 壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法和应用 | |
| CN101654667A (zh) | 建立奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的方法 | |
| CN105886462A (zh) | 用于ADSCs培养的组合物及ADSCs培养方法 | |
| CN108660108A (zh) | 一种可增强脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法 | |
| CN103525761B (zh) | 分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法 | |
| CN106867965B (zh) | 一种脂肪干细胞高效诱导分化剂和诱导分化培养基 | |
| CN102041243A (zh) | 一种快速分离骨髓间充质干细胞的试剂盒及方法 | |
| CN104195100A (zh) | 一种乳腺上皮细胞的体外培养方法 | |
| CN110484491B (zh) | 羊膜和羊水来源的内皮祖细胞获取方法及其纯化培养方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150225 Termination date: 20190921 |