CN109628373B

CN109628373B - 一种收获三维微载体上的细胞的方法

Info

Publication number: CN109628373B
Application number: CN201910101736.0A
Authority: CN
Inventors: 鄢晓君; 刘伟
Original assignee: Beijing Huakan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Huakan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2039-01-31
Also published as: CN109628373A

Abstract

本发明公开了一种收获三维微载体上的细胞的方法。它包括如下步骤：1)吸附培养细胞的三维微载体自然沉降或离心，去除上清，得到含有细胞的三维微载体；2)将含有细胞的三维微载体中加入裂解液，孵育，裂解其中三维微载体；3)将步骤2)中三维微载体裂解完全后，加入终止液终止裂解过程或直接进行步骤4)终止裂解；4)将步骤3)得到的体系离心，弃去上清，即可收获三维微载体上的细胞。本发明能更温和地收获该载体上的细胞用于后续应用；本发明针对微载体进行裂解，使微载体从固态溶解为液态，从而将载体上的细胞释放到溶液中，通过离心的方式，将溶液与细胞分离，从而获得细胞。

Description

一种收获三维微载体上的细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种收获三维微载体上的细胞的方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术

随着生物医学，材料学，机械学，工程学等交叉学科的快速发展，越来越多的人关注于细胞在体外培养的微环境与体内生存微环境的差异。传统的两维细胞培养(基于商业化的培养皿或多孔板)技术发展已有百余年的历史，在生命科学基础研究、医学研究等领域具有广泛应用。然而随着显微成像技术的快速发展，研究者逐渐发现细胞在两维的培养环境下的生存状态，细胞形态与其在体内真实环境的培养条件下相距甚远。因此这种简化的两维微环境不能很好的模拟和重现体内的三维微环境。而依赖于传统两维环境下培养的干细胞，在干细胞移植治疗过程中，由于体内外生存环境的巨变，导致了干细胞存活率和功能的降低，修复与再生功能的减退，从而制约了干细胞治疗在临床应用的效果。研究表明，相比于细胞的两维培养，体外三维微环境的模拟有利于细胞的增值和分化，保持细胞干性，使体外培养的细胞与体内环境状态下的细胞更加相近。因此三维细胞培养技术在近年来备受关注，并得到了大幅度的发展。

构建细胞体外的三维培养模型，所用的生物材料由于需要在体内与组织直接接触，因此必须具备一定的特殊要求：如材料基质的来源(天然或合成材料)、材料基质的物化性能(化学相容性、机械性能、降解性、结构特性等)、材料基质的生物活性(粘附位点、诱导信号等)，三维培养技术所需的设备、使用条件、适用范围，细胞的吸附方式、粘附方式、培养方式、检测方式等等。理想的三维细胞培养系统能够实现在细胞种植、培养、增殖、传代过程中以及后续的成像与定性上比传统的两维培养方式更加接近于体内状态，并在操作手段上同传统两维细胞培养方式同样简便易行。

目前针对细胞与生物材料相结合的三维培养，收获细胞的方法基本上采用的是胰蛋白酶或其替代物等试剂将细胞与材料之间的粘连的活性成分降解消化，从而使得细胞从三维载体材料上脱离。然而细胞三维培养后，多层或成团的细胞很难被胰酶消化，而长时间的胰蛋白酶或其替代物的消化对细胞本身会造成极大的损伤，因此，需要一种更加温和的方法从三维载体上收获细胞，即通过裂解三维载体材料而不损伤细胞的方法，实现细胞从三维载体材料上的高效收获，进而满足后续的应用。针对细胞培养在三维微载体上，目前还没有一种更温和地收获该载体上的细胞用于后续应用的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种收获三维微载体上的细胞的方法。

本发明提供的一种收获三维微载体上的细胞的方法，包括如下步骤：1)吸附培养细胞的三维微载体自然沉降或离心，去除上清，得到含有细胞的三维微载体；

2)将含有细胞的三维微载体中加入裂解液，孵育，裂解其中三维微载体；

3)将步骤2)中三维微载体裂解完全后，加入终止液终止裂解或直接进行步骤4)终止裂解；

4)将步骤3)得到的体系离心，弃去上清，即可收获三维微载体上的细胞。

上述的方法中，所述裂解液包括裂解微载体与消除细胞连接的活性成分。

上述的方法中，所述活性成分选自胶原蛋白酶、胃蛋白酶、透明质酸酶、分散酶、中性蛋白酶、蛋白酶K、基质金属蛋白酶、柠檬酸钠、胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、胰蛋白酶替代物、蛋白水解酶、乙二胺四乙酸、溶菌酶和谷胱甘肽中至少一种的水溶液。

本发明中，所述裂解液配方：0.1％胶原蛋白酶、0.1％乙二胺四乙酸、0.05％胰蛋白酶。

上述的方法中，所述终止液：根据所选的裂解液组成成分；选自全培养基、含10％血清白蛋白或血清的PBS、胰蛋白酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、PBS和离子螯合剂中的至少一种。所述离子螯合剂具体可为乙二胺四乙酸。

上述的方法步骤1)中，所述离心的速率可为50～1610×g，具体可为200×g，时间可为1～10min，具体可为2min；

所述去除上清步骤如下：离心后吸尽上清；然后加入适量PBS，用手轻轻摇晃20～30s，吸尽上清，重复PBS洗一次。

上述的方法中，所述吸附培养细胞的三维微载体的质量与所述裂解液的体积比可为1mg：0.01～5mL，具体可为20mg：3mL、1mg：0.15～0.5mL或1mg：0.1～2mL；

所述孵育的温度可为4℃～40℃，具体可为37℃，时间可为10s～24h，具体可为30min。具体的实施例里中所述孵育期间每隔10min用1mL移液器轻轻吹打几次。

上述的方法中，所述吸附培养细胞的三维微载体的质量与所述终止液的体积比可为1mg：0.01～50mL，具体可为20mg：3mL或1mg：0.1～25mL。

上述的方法步骤4)中，所述离心的速率为50～1610×g，具体可为400×g，时间为1～10min，具体可为2min或2～8min。

本发明具有以下优点：

本发明方法针对三维微载体上的细胞进行收获。由于细胞培养在三维微载体上，本发明能更温和地收获该载体上的细胞用于后续应用；本发明针对微载体进行裂解，使微载体从固态溶解为液态，从而将载体上的细胞释放到溶液中，通过离心的方式，将溶液与细胞分离，从而获得细胞。本发明裂解液针对微载体设计，可以根据微载体的组成而定制相应的微载体；裂解液裂解的是微载体，因此对细胞温和，保持细胞活性并保留细胞自身分泌的蛋白。

附图说明

图1为本发明实施例1中在显微镜明场下观察微载体裂解情况和在荧光显微镜下进行观察活细胞的情况图。

图2为本发明实施例1中裂解液收获三维微载体(3D FloTrix微载体)上的细胞的活性与通过传统胰酶消化获得培养瓶中的细胞的活性对比结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中细胞为脂肪间充质干细胞；

三维微载体为3D FloTrix微载体，购于北京华龛生物科技有限公司，货号CNF-F01T-50。

实施例1、

1、裂解液配方：0.1％胶原蛋白酶、0.1％乙二胺四乙酸、0.05％胰蛋白酶；终止液：全培养基

2、将20mg的长了脂肪间充质干细胞的三维微载体从培养皿中转移到离心管中，离心400×g，2分钟，吸尽上清，加入适量PBS，用手轻轻摇晃20-30s，尽量吸尽上清，重复PBS洗一次；

3、加入3mL裂解液，放入37℃的细胞培养箱中孵育30min，期间每隔10min用1ml移液器轻轻吹打几次；

4、30min后，微载体裂解完全用，加入3mL全培养基终止裂解过程；

5、离心200×g，5分钟，弃去上清，根据后续应用需求，将细胞重悬。

6、细胞检测的方法：

(1)活细胞原位Calcein-AM/PI染色法：

1)试剂盒：Live&Dead Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Cells货号:KGAF001

2)取20mg含有细胞的三维微载体悬液加入到离心管中；400×g，离心2分钟；

3)尽量去除上清，加入PBS洗一次，2min后尽量去除PBS，加入按照试剂盒使用说明书配置好的染液1mL进行染色，室温避光染色20～30min后，400×g，离心2分钟；

4)弃除上清，加入3mL裂解液，在第0分钟、10分钟和30分钟分别在光镜下观察微载体裂解情况和在荧光显微镜下进行观察活细胞的情况；结果如图1所示。

由图1可知，在光镜明场下观察微载体随着时间，渐渐裂解消失，仅留下细胞。通过荧光显微镜光观察染色后的细胞，发现随着裂解液裂解微载体，细胞从微载体上脱落成单细胞，而死细胞的数量并未增加，细胞仍然保持活性。说明针对微载体进行裂解，能够将细胞从微载体上收获下来且其活性不受影响。

(2)流式细胞仪检测细胞凋亡率的分析方法：

1)细胞收集：将20mg含有细胞的三维微载体悬液进行离心，400×g，2分钟，弃上清，加入3ml 0.1％四型胶原蛋白酶溶液(1g四型胶原蛋白酶(Gibco，17104019)溶于1L PBS里)，放入37℃的细胞培养箱中孵育30min后离心，400×g，5分钟，弃上清。2D细胞的收获则选用常规的胰酶消化处理法，即将细胞培养瓶中的培养基弃除，加入适量PBS润洗2遍，加入适量0.25％胰酶溶液，37℃孵育2分钟或至细胞从培养瓶脱落，加入等量完全培养基终止后，将悬液取出放入离心管中，离心400×g，5分钟，弃上清。

2)细胞洗涤：用4℃预冷PBS重悬细胞一次，400×g离心5分钟，洗涤细胞。

3)细胞染色：使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(新海基因检测有限公司阀公司，S0185)进行细胞染色，即加入300μL的Binding Buffer，后加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15分钟；然后加入5μL的PI染色5分钟；补加200μL的BindingBuffer。

4)细胞流式分析：使用BD FACSAria II流式细胞分选仪对染色后的细胞进行流式分析，通过仪器得出细胞分群分析报告。

5)细胞流式分析报告解读：

a)Annexin-V阴性-PI阴性代表正常细胞，即四格细胞分群图中的左下群，其细胞比例即为活细胞的比例；

b)Annexin-V阳性-PI阴性代表凋亡早期的细胞，即四格细胞分群图中的右下群，其细胞比例即为凋亡早期细胞的比例；

c)Annexin-V阳性-PI阳性代表凋亡晚期的细胞或坏死的细胞，即四格细胞分群图中的右上群，其细胞比例即为晚期细胞的凋亡比例。

由图2中结果可知，通过裂解液收获三维微载体(3D FloTrix微载体)上的细胞的活性与通过传统胰酶消化获得培养瓶中的细胞的活性相似，甚至稍高，说明本发明通过裂解液针对微载体进行裂解，从而收获微载体上的细胞，能够有效收获活性高的细胞。

Claims

1.一种收获三维微载体上的细胞的方法，包括如下步骤：1）吸附培养细胞的三维微载体自然沉降或离心，去除上清，得到含有细胞的三维微载体；

2）将含有细胞的三维微载体中加入裂解液，孵育，裂解其中三维微载体；

3）将步骤2）中三维微载体裂解完全后，加入终止液终止裂解或直接进行步骤4）终止裂解；

4）将步骤3）得到的体系离心，弃去上清，即可收获三维微载体上的细胞；

所述裂解液配方为：0.1%胶原蛋白酶、0.1%乙二胺四乙酸、0.05%胰蛋白酶；

所述三维微载体为3D FloTrix微载体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述终止液：根据所选的裂解液组成成分；选自全培养基、含10%血清白蛋白或血清的PBS、胰蛋白酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、PBS和离子螯合剂中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1）中，所述离心的速率为50~1610×g，时间为1~10min；

所述去除上清步骤如下：离心后吸尽上清；然后加入适量PBS，用手轻轻摇晃20~30s，吸尽上清，重复PBS洗一次。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述吸附培养细胞的三维微载体的质量与所述裂解液的体积比为1mg：0.01~5 mL；

所述孵育的温度为4℃~40℃，时间为10s~24h。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述吸附培养细胞的三维微载体的质量与所述终止液的体积比为1mg：0.01~50 mL。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤4）中，所述离心的速率为50~1610×g，时间为1~10 min。