CN112462076B - 应用于微载体的内毒素含量的检测方法 - Google Patents

应用于微载体的内毒素含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于内毒素含量检测领域，尤其是涉及一种应用于微载体的内毒素含量的检测方法，包括下述步骤：1）使用裂解液将微载体进行裂解，使所有微载体完全溶解后取上清液作为待测样品，所述的裂解液为样本释放剂、胰蛋白酶或者3D FloTrix® Digest裂解液中的一种；2）内毒素检测：对阳性对照品、阴性对照品、步骤1）的待测样品、以及阳性供试品进行检测。通过本发明所建立的一整套微载体内毒素含量标准和测定方法，不但为今后微载体内毒素检测工作提供了标准依据，而且可以为今后的日常质量检验工作提供依据和指导，并很好的规范了今后微载体内毒素检验工作的开展，确保持续为顾客提供质量合格且稳定可靠的产品。

Description

应用于微载体的内毒素含量的检测方法
技术领域
本发明属于内毒素含量检测领域，尤其是涉及一种应用于微载体的内毒素含量的检测方法。
背景技术
目前，微载体细胞培养技术使工业化生产细胞的过程简便起来，是目前公认的最有发展前途的一种细胞培养模式。微载体是一种由多个弹性三维可降解的微载体聚集成片剂的微载体聚集体(发明专利：201910079680.3)可用于细胞的3D仿生培养和大规模培养扩增。另外，微载体预定用途之一是用其传输细胞至人体内发挥作用，是微载体的全新应用。
微载体细胞培养用于生产药品，如抗体药、蛋白药、疫苗等，甚至细胞本身也可以作为药物，因此其质量需要严格把控，其中内毒素含量是一个重要指标。内毒素是革兰氏阴性菌，(如伤寒杆菌、结核杆菌、痢疾杆菌等)的菌体中存在的毒性物质的总称，是多种革兰氏阴性菌的细胞壁成分，是由菌体裂解后释出的毒素，又称之为“热原”，单位Eu/ml，其化学成分有磷脂多糖-蛋白质复合物，其毒性成分主要为类脂质A。各种细菌的内毒素的毒性作用大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。目前热原反应的测试以细菌内毒素检测和热原反应检测为主要项目，该方法检测快速、稳定，这也是目前比较认可的评价方法。
现有技术的缺陷和不足：
目前内毒素检测的通用方法是《中国药典》2020年版四部通则1143细菌内毒素检查法，但是由于微载体不溶于水，因此无法使用该方法直接进行检测。为对201910079680.3的微载体中所含有的内毒素水平进行控制，就需要对其建立适当的标准，并找到对微载体中的内毒素水平进行有效检测的适合的方法。本方法参考了《中国药典》2020年版四部通则1143细菌内毒素检查法，并结合本单位产品的实际情况，对微载体检测的前期处理的方法做了详细的规定。
另外由于市面上的微载体大多为不可降解微载体，且用于体外的细胞培养，不进入体内，因此这些微载体的内毒素检测方案采用将浸泡过微载体的液体进行检测以检验从微载体中溶出的内毒素。而如以上所述，发明专利：201910079680.3的微载体属于全新的可降解的微载体，其形态为微载体聚集体。从微载体上收获细胞时，微载体可完全溶解成液体，而当微载体携带细胞进入体内后也会随着时间降解，因此仅仅测试浸泡微载体的液体是不足以来判定微载体内毒素含量，因为经过完全溶解或降解后，会有更多的内毒素从微载体中释放出来。因此要准确地评估可降解微载体的内毒素含量需要更多的研究。而且，目前还没有相关标准对其内毒素限度进行明确的规定，因此需要进行相关研究，找出适合本产品的内毒素含量限度标准。
发明内容
本发明为了有效的解决上述背景技术中的问题，提出了一种应用于微载体的内毒素含量的检测方法，具体技术方案如下；
一种应用于微载体的内毒素含量的检测方法，包括下述步骤：
一种应用于微载体的内毒素含量的检测方法，包括下述步骤：
1)使用裂解液将微载体进行裂解，使所有微载体完全溶解后取上清液作为待测样品，所述的裂解液为样本释放剂、胰蛋白酶或者3D
Figure GDA0003834754450000021
Digest裂解液中的一种；
2)内毒素检测：对阳性对照品、阴性对照品、步骤1)的待测样品、以及阳性供试品进行检测。
具体地，所述的样本释放剂为冻干粉、金属盐以及葡萄糖的混合物，所述的冻干粉为胶原酶I；所述金属盐为氯化钾，氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，碳酸氢钠，乙二胺四乙酸二钠的混合物。
具体地，各组分的比例为：胶原酶I—0.5份；氯化钾0.2份，氯化钠4份，磷酸氢二钠0.02份，磷酸二氢钠0.03份，碳酸氢钠0.175份，葡萄糖0.5份，乙二胺四乙酸二钠0.036份。
具体地，所述的裂解液为样本释放剂时，采用下述步骤对裂解液进行预处理：将样本释放剂配置成1mg/mL，然后将配置好的样本释放剂使用无内毒素纯水稀释50-200倍制成裂解液备用。
具体地，所述的裂解液为胰蛋白酶时，采用下述步骤对裂解液进行预处理：使用超滤对胰蛋白酶进行去内毒素处理，使用可截留≤300KDa分子量的超滤膜过滤。
具体地，步骤1)的具体步骤为：取微载体置于容器中，加入裂解液，混合均匀，置于恒温箱内进行孵育，恒温箱温度为室温至40℃，孵育时间为0-48小时。
步骤2)的具体步骤为：
2.1)取多管鲎试剂，分别加入内毒素检查用水，振摇使鲎试剂完全溶解；
2.2)分别取阳性对照品、阴性对照品、待测样品、供试品阳性对照品置于上述不同管中的鲎试剂中；
2.3)将上述处理好的鲎试剂分别放入水浴锅中保温，观察结果，如发生浑浊记为阳性，未发生浑浊记为阴性；
2.4)阴性对照品和待测样品不得呈阳性，阳性对照品和供试品阳性对照品不得呈阴性。
阳性对照品的准备：内毒素使用内毒素检查用水进行稀释得到，具体包括洗漱步骤：
1)取内毒素工作品(规格25EU/支)1支，加检查用水1mL，震荡15分钟；
2)取上述溶液0.2mL，加内毒素检查用水(内毒素含量低于0.0015EU/mL)1.8mL。
3)取步骤2)溶液0.4mL，加内毒素检查用水1.6mL。(溶液①)
4)取步骤3)溶液1mL，加内毒素检查用水1mL。
待测样品的准备：待测样品使用内毒素检查用水进行稀释得到，具体包括洗漱步骤：
1)取1mL待测样品，加入2mL内毒素检查用水，混合均匀(溶液②)；
2)取1mL上述溶液，加入1mL内毒素检查用水，混合均匀。
供试品阳性对照品的准备：将阳性对照品以及待测样品混合，具体可以采用：取溶液①和溶液②各0.5mL，混合均匀。
优选的，所述的裂解液为样本释放剂时，采用下述步骤对裂解液进行预处理：将样本释放剂配置成1mg/mL，然后将配置好的样本释放剂使用无内毒素纯水稀释100倍制成裂解液备用。
优选的，所述的裂解液为胰蛋白酶时，采用下述步骤对裂解液进行预处理：使用超滤对胰蛋白酶进行去内毒素处理，使用可截留≤300KDa分子量的超滤膜过优选的，所述的超滤膜的可截留分子量为100-300KDa。
优选的，步骤1)的具体步骤为：取微载体置于容器中，加入裂解液，混合均匀，置于恒温箱内进行孵育。
优选的，恒温箱温度为室温至40℃。
优选的，恒温箱温度为37℃。
优选的，孵育时间为0-48小时。
优选的，孵育时间为12小时。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
由于市面上的微载体大多为不可降解微载体，且用于体外的细胞培养，不进入体内，因此这些微载体的内毒素检测方案采用将浸泡过微载体的液体进行检测以检验从微载体中溶出的内毒素。但是发明专利：201910079680.3所生产的微载体为可降解微载体，从该微载体上收获细胞时，微载体可完全溶解成液体，而当微载体携带细胞进入体内后也会随着时间降解，因此内毒素含量关系到最终用户的使用安全，是一个十分重要的指标。通过浸泡微载体并无法将微载体内部的所有内毒素全部释放出来，所以无法判定微载体实际的内毒素含量。而由于微载体可以降解，因此经过完全溶解或降解后，会有更多的内毒素从微载体中释放出来。本发明的优点在于可以更为准确的检测微载体实际的内毒素含量。通过本发明所建立的一整套微载体内毒素含量标准和测定方法，不但为今后微载体内毒素检测工作提供了标准依据，而且可以为今后的日常质量检验工作提供依据和指导，并很好的规范了今后微载体内毒素检验工作的开展，确保持续为顾客提供质量合格且稳定可靠的产品。
附图说明
图1为本发明样本释放剂的内毒素标准工作曲线；
图2为本发明3D FloTrix Digest的内毒素标准工作曲线；
图3为本发明a未裂解的微载体、b样本释放剂裂解后、c胰蛋白酶裂解后，d滤后的3D flotrix digest裂解后的图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明；
实施例1：准备样本释放剂：胶原酶I—0.5g；氯化钾0.2g，氯化钠4g，磷酸氢二钠0.02g，磷酸二氢钠0.03g，碳酸氢钠0.175g，葡萄糖0.5g，乙二胺四乙酸二钠0.036g。
对样本释放剂进行100倍稀释处理，制得无内毒素的样本释放剂。使用内毒素检测鲎试剂盒对稀释后制得的无内毒素的样本释放剂进行检测(试管定量显色基质法)。
按照内毒素检测鲎试剂盒，以内毒素浓度分别为0EU/mL、0.01EU/mL、0.025EU/mL、0.05EU/mL、0.075EU/mL和0.1EU/mL的内毒素工作标准品测量，得到内毒素标准曲线，见图1。
对无内毒素的样本释放剂测定2个平行样本，所测得的OD值(0.116和0.126)回归至所得到内毒素标准工作曲线中，得到其内毒素浓度为0.0126EU/mL和0.0141EU/mL。
经计算其平均值为0.0133EU/mL，由于其远低于所设定的微载体内毒素含量标准0.75EU/mg，故可以用于微载体内毒素检测。
实施例2：裂解液方案2(胰蛋白酶)的具体实施方式：使用超滤对胰蛋白酶进行去内毒素处理，使用可截留300KDa分子量的超滤膜对胰蛋白酶进行处理，制得无内毒素的胰蛋白酶。
使用内毒素检测鲎试剂盒对制得的无内毒素的胰蛋白酶进行干扰验证(凝胶法)。
具体步骤和检测结果：准备内毒素工作品(规格25EU/支)1支，灵敏度为0.125EU/支的鲎试剂28支。将内毒素工作品用检查用水稀释至0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.0625EU/ml。按表1制备A、B、C、D四个系列溶液。A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。
表1
Figure GDA0003834754450000051
Figure GDA0003834754450000061
鲎试剂用0.1ml检查用水溶解，加入A、B、C、D四个系列溶液0.1ml，于37℃水浴锅中保温60分钟。记录结果表2。
表2
Figure GDA0003834754450000062
表中“+”代表检测结果为阳性，“—”代表检测结果为阴性。
按《中国药典》2020年版内毒素检查法关于干扰实验灵敏度的规定，供试品的灵敏度应在0.0625-0.25之间(包括0.0625和0.25)，胰蛋白酶干扰实验灵敏度为0.15，符合规定。
实施例3：裂解液方案3(3D FloTrix Digest)的具体实施方式：
1：对3D FloTrix Digest进行无内毒素化处理，制得无内毒素的3D FloT rixDigest。使用内毒素检测鲎试剂盒对制得的无内毒素的3D FloTrix Digest进行检测(试管定量显色基质法)。按照内毒素检测鲎试剂盒使用说明书的要求，以内毒素浓度分别为0EU/mL、0.01EU/mL、0.025EU/mL、0.05EU/mL和0.075EU/mL的内毒素工作标准品测量，得到内毒素标准曲线，见图2。
对无内毒素的3D FloTrix Digest测定2个平行样本，所测得的OD值(0.135和0.141)回归至所得到内毒素标准工作曲线中，得到其内毒素浓度为0.0184EU/mL和0.0196EU/mL。经计算其平均值为0.0190EU/mL，由于其远低于所设定的微载体内毒素含量标准0.75EU/mg，故可以用于微载体内毒素检测。
实施例4：使用裂解液对微载体进行溶解并检测内毒素：分别使用样本释放剂、0.25％胰蛋白酶溶液和3D
Figure GDA0003834754450000072
Digest对需要进行内毒素检测的微载体进行溶解。图3示出a未裂解的微载体、b样本释放剂裂解后、c胰蛋白酶裂解后，d滤后的3D flotrixdigest裂解后的图；
微载体内毒素含量测定方法：取8支鲎试剂，分别加入0.1mL内毒素检查用水，轻轻振摇使鲎试剂完全溶解；
分别取阳性对照品、阴性对照品、待测样品、供试品阳性对照品0.1mL置于上述8支鲎试剂中，每个样品各做2管，共8管；
将上述8管处理好的鲎试剂分别放入37℃水浴锅中保温60分钟，观察结果，如发生浑浊记为阳性，未发生浑浊记为阴性；
阴性对照品和待测样品不得呈阳性，阳性对照品和供试品阳性对照品不得呈阴性。共检测5组，每组做2个平行样，得到结果如下表3：
表3
Figure GDA0003834754450000071
Figure GDA0003834754450000081
从测试结果可以看出，本方法可以很好地用于微载体的内毒素含量测定，且以样本释放剂处理的微载体样本与使用0.25％胰蛋白酶溶液处理的微载体样本的测试结果完全一致，且成本低廉，说明只要能够选择一种可以完全将微载体溶解的裂解液且不干扰内毒素检测，即可以使用本发明的方法对可降解微载体进行较为准确的内毒素检测，因此可以衍生到应用在除发明201910079680.3的微载体或样本释放剂以外的微载体或裂解液的体系中，在今后的产品检验中可以以此方法作为标准方法来进行微载体内毒素检测，从而大大降低检验成本。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种应用于微载体的内毒素含量的检测方法，其特征在于，包括下述步骤：
1）使用裂解液将微载体进行裂解，使所有微载体完全溶解后取上清液作为待测样品，所述裂解液为样本释放剂；
所述样本释放剂为冻干粉、金属盐以及葡萄糖的混合物，所述冻干粉为胶原酶I；所述金属盐为氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、乙二胺四乙酸二钠的混合物；各组分的质量比例为：胶原酶I 0.5份；氯化钾0.2份，氯化钠4份，磷酸氢二钠0.02份，磷酸二氢钠0.03份，碳酸氢钠0.175份，葡萄糖0.5份，乙二胺四乙酸二钠0.036份；
使用前对所述样本释放剂进行预处理：将样本释放剂配制成1mg/mL，然后将配制好的样本释放剂使用无内毒素纯水稀释50-200倍制成裂解液；
2）内毒素检测：对阳性对照品、阴性对照品、步骤1）的待测样品、以及供试品阳性对照品进行检测；包括下述步骤：
2.1）取多管鲎试剂，分别加入内毒素检查用水，振摇使鲎试剂完全溶解；
2.2）分别取阳性对照品、阴性对照品、步骤1）的待测样品、供试品阳性对照品置于步骤2.1）的不同管中的鲎试剂中；
2.3）将步骤2.2）的处理好的鲎试剂分别放入水浴锅中保温，观察结果，发生浑浊记为阳性，未发生浑浊记为阴性；
2.4）阴性对照品和待测样品不得呈阳性，阳性对照品和供试品阳性对照品不得呈阴性。
2.根据权利要求1所述的应用于微载体的内毒素含量的检测方法，其特征在于，对样本释放剂进行预处理时，将配制好的1mg/mL样本释放剂使用无内毒素纯水稀释100倍制成裂解液。
3.根据权利要求1所述的应用于微载体的内毒素含量的检测方法，其特征在于，步骤1）的具体步骤为：取微载体置于容器中，加入裂解液，混合均匀，置于恒温箱内进行孵育，恒温箱温度为室温至40℃，孵育时间为12-48小时。
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